ETANOL Trabalho n.

Doseamento do lcool etlico no sangue (Mtodo de Widmark)

Propriedades fsicas e qumicas

O lcool um lquido incolor, de odor caracterstico. Densidade 0,8 Ponto de Ebulio 78,5 oC Solvel na gua em todas as propores. Formula qumica - CH3CH2OH O etanol, como todos os lcoois, um redutor, podendo ser oxidado de duas formas: directamente por combusto completa, com formao de CO2 + H2O, ou em duas etapas ( POR OXIDAO ENZIMTICA), com formao de aldedo actico seguido do cido actico, conforme o esquema seguinte: CH3CH2OH CH3COH CH3COOH

O LCOOL E O ORGANISMO O TRAJECTO DO LCOOL NO ORGANISMO Absoro O lcool ingerido passa atravs do esfago e chega ao estmago. Se o indivduo est em jejum, a absoro no estmago praticamente nula, atingindo o intestino pouco depois. Se o estmago est cheio, o lcool, em parte absorvido lentamente atravs das suas paredes, uma vez que permanece durante um certo tempo em contacto com os alimentos, o lcool no absorvido passa para o intestino delgado, onde absorvido rapidamente.

Transformaes metablicas do lcool Ao contrrio dos Lpidos, Hidratos de Carbono e Protenas, o lcool no armazenado nos rgos, portanto imediatamente metabolizado. no fgado que cerca de 95% do lcool oxidado, os 5% restantes so metabolizados noutros rgos ( rins, crebro e pncreas). Sabe-se que os efeitos txicos do lcool no fgado esto directamente relacionados com o seu metabolismo, sendo por isso importante compreender as vrias etapas do seu metabolismo. PRIMEIRA ETAPA: Transformao do Etanol em Acetaldedo Existem 3 vias possveis: A) Via da lcool-desidrogenase (ADH) a via principal. A ADH, enzima cujo co-factor o NAD, fica localizada no citoplasma da clula heptica. Em condies normais permite a oxidao de 7 a 8 g de Etanol por hora, ou seja, 100 mg por Kg de peso corporal por hora. A reaco pode ser representada do seguinte modo:
CH3CH2OH + NAD+ CH3COH + NADH

Foram caracterizadas vrias enzimas de ADH. Alm disso possvel distinguir numa populao dois grupos de indivduos geneticamente determinados em funo da ADH tpica e os indivduos com a ADH atpica, que possui in vitro uma actividade quatro a cinco vezes superior. No entanto, in vitro, no h diferenas ntidas na eliminao do Etanol. B) Sistema de oxidao microssomal (SOM) Pensa-se que este sistema oxida sensivelmente cerca de 20% do Etanol ingerido, aumentando esta proporo com a importncia do consumo de lcool. Tal como as outras oxidaes microssomais, este sistema susceptvel de ser induzido. A reaco pode ser representada do seguinte modo:
CH3CH2OH + NADPH + O2 CH3COH +NADP+ + 2H2O

Este sistema (SOM) pouco especfico, permitindo o metabolismo de numerosas substncias, tais como medicamentos ou txicos industriais.

C) Via catalase Esta via intervm pouco frequentemente em indivduos normais, adquirindo maior importncia no alcoolismo crnico, devido a uma adaptao enzimtica induzida pelo Etanol. A reaco pode se representada do seguinte modo:
CH3CH2OH + H2O2 CH3COH + H2O2

SEGUNDA ETAPA : Catabolismo do Acetaldedo O Acetaldedo produzido na oxidao do lcool (1 etapa) em seguida oxidado, transformando-se em cido Actico que se encontra sob a forma de Acetil-CoA. A reaco necessita da presena de ADH ( aldedo desidrogenase) e NAD+.
CH3COH + NAD+ + H2O CH3COOH + NADH + H+

TERCEIRA ETAPA : Degradao do cido Actico O cido Actico , sob a forma de Acetil-CoA, pode seguir duas vias: I)Degradado no ciclo de Krebs com a formao de gua e dixido de carbono II) Utilizado na sntese de colesterol e cidos gordos.
CH3COOH + ATP,CoA AMP,Ppi + CH3CoA (Acetil-CoA)

Ciclo de Krebs CO2 + H2O Sntese de c. gordos e colesterol

ALCOOLMIA A alcoolmia define-se como a concentrao de lcool no sangue, expressa em g/l.

A alcoolmia varia em funo do tempo, ela aumenta rapidamente medida que se d a absoro, diminuindo depois lentamente durante a degradao do lcool no fgado. A alcoolmia resulta do equilbrio a dado momento entre a absoro, a oxidao e a eliminao do lcool. Observando a curva de alcoolmia pode-se verificar que varia em funo do tempo e aumenta medida que se d a absoro, diminuindo depois lentamente durante a degradao do lcool no fgado.
Alcoolmia

1,0 PERIGO

0,8

0,6

0,4

0,2 0,0 1 2 3 4 5 6 7 Tempo ( horas)

A curva de alcoolmia varia com uma srie de parmetros tais como: variaes individuais (ex.: peso, sexo ou estado geral do indivduo), existncia ou no de alimentos no estmago e com as caractersticas de bebida ingerida. IMPORTNCIA DA DETERMINAO DA ALCOOLMIA

A determinao da taxa de alcoolmia a melhor maneira de apreciar o estado de intoxicao alcolica de um indivduo. Segundo a chamada Lei do lcool(Dec. Lei n. 3782 de 29 de Maro) a determinao da alcoolmia o mtodo oficial de anlise. A lei pune os condutores cuja taxa de alcoolmia for superior a 0,5 g/L.

10

INTOXICAO ALCOLICA AGUDA Aspectos clnicos Esta intoxicao provoca toda uma srie de perturbaes que evoluem em trs fases: I) Fase de Excitao

Esta fase corresponde a um perodo de euforia, ausncia de inibies psquicas e tambm a uma diminuio do prprio controlo. Em alguns casos, a excitao do indivduo corresponde a um exacerbamento da agressividade e do instinto sexual, podendo transformar-se num indivduo perigoso. O indivduo no tem conscincia do seu estado, o que constitui uma fonte de acidentes quer ao volante de um automvel quer no local de trabalho. H na realidade uma diminuio das capacidades visuais e auditivas e do tempo de reaco. II) Fase de incoordenao

Os movimentos voluntrios tornam-se difceis de executar. H incoerncia na conversa e o indivduo apresenta-se em estado de confuso mental. O lcool provoca uma analgesia mais ou menos forte, tornando o indivduo embriagado pouco sensvel a quedas e golpes. O estado de embriaguez pode terminar aqui por uma fase de sono mais ou menos profundo. Ao acordar o indivduo sente dores de cabea, nuseas e indisposio. Se estes sintomas no so observados porque a intoxicao mais grave podendo o quadro clnico alterar-se progressivamente com o aparecimento de palidez com bradicardia e miose. III) Fase de coma

A fase de sono pode ir at ao coma. Nesta altura o indivduo torna-se insensvel s excitaes exteriores, os reflexos desaparecem, pode observar-se midrase, relaxamento dos esfncteres e diminuio da temperatura central. O grau de intoxicao funo da alcoolmia. Para valores muito baixos (0,2 a 0,3 g/L), j aparecem modificaes sensoriais, motoras e psquicas, como se ilustra no quadro seguinte:
TAXA DE ALCOOLMIA 0,1 0,15 0,6 1,0 1,5 2 a 2,2 4,0 5a7 OBSERVAES No se observam alteraes Controlo motor ligeiramente atingido Prolongamento do tempo de reaco Taxa crtica: Prolongamento do tempo de reaco Aparecimento de incoordenao motora Prolongamento do tempo de reaco auditivo e ptico Perturbaes neuro-sensoriais ntidas Embriaguez clnica em 50 % dos indivduos Embriaguez evidente em 100 % dos indivduos Coma Morte
11

ALCOOLISMO CRNICO O alcoolismo crnico mais discreto que o agudo. No incio ignorado ou inconsciente, mas uma forma particularmente perigosa para a sade. O alcoolismo crnico ou etilismo pode resultar da repetio de crises de embriaguez, ou do consumo excessivo de bebidas alcolicas durante numerosos anos. Enquanto que a intoxicao ocasional reversvel, a absoro regular de lcool pelo organismo durante um longo perodo, vai originar graves repercusses metablicas e leses em numerosos rgos, como o aparelho digestivo, sistema nervoso, aparelho cardiovascular, pulmes, glndulas hormonais e sexuais. No aparelho digestivo observam-se efeitos negativos a nvel do esfago, estmago, fgado e pncreas. A absoro do lcool atravs da mucosa estomacal vai intervir sobre a motricidade e secreo do estmago. No fgado, uma sobrecarga dos hepatcitos conduz a necrose celular e a perturbao no metabolismo dos hidratos de carbono, de protenas e dos lpidos. O etanol desempenha ainda um importante papel nas pancreatites crnicas. No que respeita ao sistema nervoso, as consequncias do alcoolismo crnico so igualmente bastante graves. O alcoolismo crnico responsvel por uma alterao progressiva da personalidade, por leses e perturbaes enceflicas, polinevrites e leses oculares. O conceito e funo da bebida alcolica tm evoluido ao longo dos tempos, actualmente o aumento do consumo de lcool a nvel da populao mundial tem levantado diversos problemas de ordem social que se tornaram num tema de debate frequente, tal como o consumo de drogas de abuso. As tabelas seguintes tm por objectivo informar da percentagem de lcool existente nas bebidas de maior consumo.
BEBIDAS Cerveja de barril Cerveja de garrafa Vinhos correntes Licores Brandy Whisky Rum % DE LCOOL 2,5 a 3 3,5 a 5 10 a 16 39 a 43 40 a 47 45 a 50 50 a 55

12

TIPO DE RECIPIENTE Imperial Garrafa de cerveja Copo de vinho tinto Copo de Whisky Copo de Cognac

CAPACIDADE (ml) 200 200 70 60 35

CONTEDO DE LCOOL (ml) 5 8 9 30 14

Toxicologia analtica
A determinao de lcool etlico das anlises mais frequentes solicitadas nos laboratrios de Toxicologia. O seu interesse situa-se em trs mbitos diferentes: I) II) Estas determinaes interessam aos agentes da autoridade para controlo do estado de sobriedade dos condutores e assim sancionar aqueles cuja taxa de alcoolmia seja superior a 0,5 g/L. Interessam s empresas, quer as que utilizam como anlise de rotina para terem conhecimento se os seus funcionrios esto ou no a trabalhar sob influncia do lcool, quer s que as utilizam somente em casos de distrbios e acidentes de trabalho. O apuramento da taxa alcoolmia interessa sobretudo Toxicologia Forense.

III)

Recolha da amostra Para determinar a concentrao de lcool no sangue recorre-se normalmente colheita de 3 tipos de amostra: sangue, ar expirado e urina SANGUE No que diz respeito recolha desta amostra biolgica temos que destacar dois casos: Recolha de sangue em condutores de veculos ou funcionrios de empresas; Recolha de sangue post-mortem. Em qualquer dos casos, antes da recolha da amostra de sangue, a rea da pele deve ser desinfectada com um anti-sptico, como por exemplo, uma soluo aquosa de cloreto de mercrio1:1000. O lcool, como evidente, no deve ser utilizado. Depois de recolhida, adicionado um anticoagulante amostra de sangue. Se a amostra no analisada imediatamente, o anticoagulante a usar o fluoreto de sdio, pois alm de ser um anticoagulante tambm um conservante. A amostra deve ser mantida temperatura de 4 oC.

13

Quando a determinao do lcool feita em cadveres (ex.: caso de mortes na estrada), a recolha de sangue feita a partir do corao, normalmente sem ser feita na autpsia. A amostra recolhida nestas condies pode ser realmente sangue do corao ou somente um fluido do organismo resultante de danos que provocaram a morte, os resultados podem assim ser totalmente falsos. Obviamente, quanto maior for o traumatismo sofrido, incluindo ruptura de rgos, maior ser o erro cometido ao analisar a tal amostra de sangue. Neste caso, e acompanhando a determinao da concentrao de lcool no sangue deveria ser feita uma anlise da composio total da amostra, ou testes que confirmem que se trata de uma amostra normal de sangue que vai ser analisada. Mesmo quando so executadas autpsias, pratica comum a recolha de uma nica amostra de sangue, proveniente do corao intacto. A prtica que seguida e aconselhada pelos patologistas a recolha de vrias amostras de sangue. Assim, deveria ser recolhido sangue do lado esquerdo do corao quando intacto e das veias femural e cubital, para que possa ser confirmada a distribuio de lcool no sangue atravs do organismo. Um alto teor de lcool no estmago de um cadver pode causar difuso do mesmo a partir do contedo estomacal, para o fludo pericardial e algumas vezes para o sangue do corao. Analisando os resultados de vrios estudos feitos, verificamos que as opinies no coincidem. Enquanto que alguns autores concluem que h um aumento ntido de lcool no fludo pericardial e no sangue do corao proveniente de uma difuso do estmago, outros h que afirmam que esta migrao post-mortem do lcool pouco significativa. As amostras de sangue devem ser recolhidas do cadver o mais cedo possvel, ou, caso contrrio, este deve ser armazenado imediatamente em cmara frigorfica. Este princpio deve ser sempre cumprido a fim de obtermos os resultados que correspondam ao valor inicial da alcoolmia. Se estas condies no forem verificadas vo aparecer alteraes deste valor devido a uma destruio ou neoformao de lcool post-mortem resultante da fermentao nos vrios tecidos. URINA A determinao da concentrao de lcool na urina poder ter interesse nos casos em que no seja possvel a obteno de uma amostra de sangue, como o caso de indivduos para quem esta recolha possa ser gravemente prejudicial sade AR EXPIRADO medida que os aparelhos de anlise de ar expirado se vo aperfeioando, vai havendo crescente confiana nos resultados dos novos analisadores. Antes da recolha da amostra de ar expirado recomenda-se a lavagem da boca com gua. Esta amostra normalmente analisada imediatamente depois da recolha, mas pode ser armazenada durante cerca de duas horas num saco de cloreto de polivinilo ou de alumnio flexvel.

14

Determinao da alcoolmia Podemos considerar dois grupos de tcnicas: Mtodos directos (anlise de sangue); Mtodos indirectos (anlise de outros produtos biolgicos, principalmente ar expirado). Mtodos directos Dentro destes mtodos podemos distinguir: Mtodos clssicos; Mtodos recentes. Mtodos clssicos A reaco de ANSTIE a base de numerosos mtodos para doseamento do lcool, mais conhecidos por Mtodos do Dicromato. Em 1863, Anstie reparou que o reagente que veio mais tarde a adoptar o seu nome (1g de K2Cr2O7 dissolvido em 300 ml de H2SO4 concentrado) virava de amarelo para verde azulado temperatura ambiente, quando se faz borbulhar atravs dele ar que passou primeiro atravs de uma soluo aquosa diluda de lcool ou uma urina de um indivduo obtida pouco depois da ingesto de uma bebida alcolica. Esta mudana de cor consequncia da reduo do dicromato, cujo io crmio sofre uma variao de valncia +6 para +3, devido oxidao do lcool a cido actico. Mais tarde surgiram uma srie de variaes do mtodo de Anstie, variaes essas que envolviam o uso de cido sulfrico (em diversas concentraes), com o aumento da temperatura inicial e finalmente a determinao quantitativa do dicromato ou do cido actico. De entre os mtodos que se baseiam na reaco de Anstie, talvez o mais conhecido seja o MTODO DE WIDMARK. Este mtodo vai ser efectuado durante as aulas prticas e ser discutido com mais pormenor no final desta introduo. Os mtodos da CLULA DE CONWAY tambm se fundamentam na mesma reaco. Esta reaco passa-se numa clula (clula de Conway) em que na parte central colocado o dicromato e na parte lateral o sangue e uma soluo saturada de carbonato de sdio. O lcool existente no sangue separado deste por um processo de difuso, sucedendo depois a reaco j descrita anteriormente.

15

Os dois tipos de mtodos que utilizam a clula de Conway podem ser: Semi-quantitativos teste diz-se positivo se se verificar uma mudana de colorao na soluo de dicromato existente na parte central da clula; Quantitativo L-se no espectrofotmetro a absorvncia do dicromato. O MTODO DO PERMANGANATO DE FRIEDMAN E KLAAS outro mtodo clssico. Neste mtodo o lcool separado por intermdio de uma destilao. Parte do destilado misturado com permanganato de potssio e hidrxido de sdio e aquecido a 100 oC durante 20 minutos. Depois de arrefecido e acidificado, o excesso de permanganato determinado por iodometria. MTODOS RECENTES Mtodo Enzimticos Estes mtodos baseiam-se na oxidao do etanol na presena de uma enzima lcooldesidrogenase (ADH) e de difosfopiridina nucletido (DPN) segundo a reaco:
CH3CH2OH + DPN

CH3CHO + DPNH2

Para impedir a reversibilidade da reaco pode ser adicionada semicarbazina (NH2NHCONH2) para combinar com o acetaldedo e um tampo para manter o pH entre 8,6 e 9,6. O DPNH2 formado depois determinado no espectrofotmetro. Quanto preparao da amostra, podemos referir que o soro pode ser utilizado directamente, mas o sangue total tem de ser primeiro destilado ou desproteinizado. O mtodo enzimtico apesar de ser considerado um mtodo especfico, no apresenta uma especificidade absoluta, pois a enzima ADH, para alm de reagir com o etanol, reage tambm com o isopropanol e com o butanol, embora com estes ltimos a taxa de oxidao seja muito menor do que com o etanol.

16

Cromatografia de fase gasosa A cromatografia de fase gasosa um mtodo analtico em que possvel a determinao do lcool por diversas tcnicas: Injeco lquida(aps desproteinizao ou diluio do sangue); Injeco gasosa(Headspace). Na tcnica de headspace, a concentrao de lcool na fase gasosa est correlacionada com a concentrao do mesmo no sangue, segundo a lei de Henry. Depois de conhecida a concentrao de lcool na fase gasosa e sabendo o coeficiente de partilha, facilmente se calcula a concentrao do mesmo no sangue.

O frasco colocado em banho-maria a uma determinada temperatura, durante um intervalo de tempo, de modo a que o lcool existente na amostra entre em equilbrio com a fase gasosa. A cromatografia de fase gasosa um mtodo altamente especfico e de grande sensibilidade e rigor, sendo o mais utilizado em estudos de avaliao da credibilidade quer de tcnicas mais recentes quer dos mtodos clssicos.

Clula de Combustvel Este aparelho (Alcometro AE-DI) utiliza uma clula electroqumica de combustvel para detectar e medir a concentrao de lcool no vapor de headspace acima da amostra de sangue ou no ar expirado. Neste sistema, o lcool existente na amostra electro-quimicamente oxidado a cido actico em presena do elctrodo de platina, na clula de combustvel. Esta reaco liberta electres a partir da molcula do lcool, formando um fluxo de electres que produz uma variao de voltagem atravs de uma resistncia externa. Esta voltagem directamente proporcional concentrao de lcool no vapor headspace, o qual, por sua vez, est em equilbrio com a concentrao do lcool no fludo, segundo a lei de Henry. O resultado fornecido em termos de taxa de lcool no sangue em unidades escolhidas at um mnimo de 0,01 mg/ml. Esta tcnica tem ainda a vantagem de ser rpida, uma vez que no necessita de tratamento prvio da amostra e requer apenas 1 a 2 minutos entre amostras sucessivas.

17

Este o mtodo que foi aprovado para a determinao directa de alcoolmia no mbito da lei Portuguesa.

MTODOS INDIRECTOS Todos os testes do lcool no ar expirado se baseiam no princpio de que a distribuio do lcool entre o sangue e o ar alveolar obedece lei de Henry. Estes testes compreendem tcnicas rpidas, no invasivas e que tm a vantagem de poderem ser utilizadas na estrada por agentes da autoridade, no necessitando da presena de mdicos ou tcnicos de laboratrio. Os analisadores de ar expirado podem ser classificados em 2 grupos. Esta classificao est relacionada com a preciso, especificidade e rigor dos resultados obtidos, assim temos os Analisadores de Triagem e os Analisadores Formais. Analisadores de Triagem So sistemas simples, cmodos e geralmente portteis, mas os resultados podem conter uma margem de erro que os torna inadequados na prova legal definitiva da taxa real de alcoolmia. So utilizados na vigilncia das estradas, tornando-se necessrio a utilizao de mtodos mais rigorosos sempre que o ar expirado do condutor revelar um teor de lcool superior taxa limite.

Analisadores Formais Estes aparelhos, embora alguns deles se baseiem em princpios idnticos aos dos Analisadores de Triagem, so mais rigorosos pois sofrem alguns aperfeioamentos tcnicos. Apesar do maior rigor, no so normalmente utilizados na vigilncia das estradas, pois a maioria requer fornecimento externo de energia.

Metodologia a utilizar na aula prtica

Mtodo de Widmark um micro-mtodo valorosssimo quando se tem que trabalhar com pequenos volumes de sangue. Neste mtodo, o lcool separado do sangue por intermdio de difuso no frasco de Widmark, em banho-maria temperatura de 60 oC e durante duas horas. Depois de

18

retirado o frasco do banho, o excesso de dicromato que no reduzido pelo lcool titulado por Iodometria. O mtodo de Widmark no especfico, h centenas de compostos orgnicos que podero causar a reduo do dicromato na presena de cido sulfrico concentrado. No entanto, grande parte destes compostos no so volteis. Os que so volteis, como o ter, clorofrmio e alguns solventes industriais reduzem o dicromato muito lentamente, e, para alm deste facto, a concentrao destes compostos no sangue, provocaria no indivduo uma grave intoxicao ou mesmo a morte. REACES: 3 C2H5OH + 2 K2Cr2O7 + 8 H2SO4 H 2O 3 CH3COOH + 2 Cr2(SO4)3 + K2SO4 + 11

(x2) K2Cr2O7 + 6 KI + 7 H2SO4 Cr2(SO4)3 + 4 K2SO4 + 7 H2O +3 I2 (x2) 3 I2 + 6 Na2S2O3 3 Na2S4O6 + 6 NaI Apuramento de resultados 3 C2H5OH 12 Na2S2O3 C2H5OH 4 Na2S2O3 Na2S2O3 PM C2H5OH / 4 3 4
PM (Etanol) =46 PM Etanol / 4=46/4=11,5 Soluo de Hipossulfito 0,01 N 0,01 eq Na2S2O3 1000 ml 1 eq V ml 1 equivalente de Na2S2O3 em V= 105 ml

105 ml Na2S2O3 (N /100) 11,5 g V B - VA X

( VB ml - VAml) Na2S2O3 X g/lcool em 0,2 ml de sangue X g 0,2 ml (toma de ensaio) Y 1000 ml Y = Quantidade de lcool em g /L

19