AVALIAO TCNICA E FINANCEIRA ENTRE O CHROMAGAR E OS MEIOS USUAIS DE ANLISE MICROBIOLGICA Luiz Antnio Ximenes RESUMO O meio de cultura

cromognico um meio que possuem na sua formulao uma srie de substratos cromognicos. As bactrias possuem enzimas que dividem estes substratos, dando origem a compostos coloridos que diferenciam as colnias pela cor que elas adquirem quando em cultura neste meio. O Chromagar orientation um meio de cultura no seletivo para isolar, identificar diretamente e contar as bactrias presentes em um material biolgico. Como na maioria dos laboratrios de microbiologia a urina representa a maioria dos materiais biolgicos, qualquer economia em trabalho de identificao e economia de reagentes representa um grande efeito em relao rapidez dos resultados e tambm sobre os custos do laboratrio. O Chromagar Orientation permite a identificao de bacilos gram negativos como a Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumonia e Proteus mirabilis, bem como cocos gram positivos como o Estafilococos aureus, Estafilococos epidermidis e o Enterococos faecalis, que causam ITU, com uma nica placa, sem a necessidade de realizar os testes de confirmao. O objetivo deste trabalho prtico foi de avaliar o desempenho do Chromagar Orientation na rotina laboratorial de cultura de urina, bem como o seu custo benefcio em relao aos meios usuais. Para realizar este trabalho usamos cepas de bactrias da ATCC, as quais foram semeadas nos meios Chromagar Orientation, Cled, Mac Conkey e gar sangue e identificadas por dois sistemas de identificao presuntiva no caso dos bacilos gram negativos e testes de confirmao para o cocos gram positivos. A concluso deste trabalho foi de que o Chromagar Orientation possui vantagens em relao aos outros meios de cultura em relao ao isolamento e identificao de bactrias e tambm quanto aos custos para o laboratrio.
Artigo de concluso de curso de ps-graduao em Anlises Clnicas e Moleculares (novembro de 2008 a dezembro de 2009). Endereo para correspondncia: AC&T: Rua Bomf Natale, 1860. CEP 15020-130. So Jos do Rio Preto SP. Email: a.c.t.@terra.com.br

1 Palavras chaves: Chromagar Orientation. Desempenho. Custos.

2 INTRODUO

Os laboratrios de anlises clnicas na sua rotina bacteriolgica utilizam-se diversos meios de cultura para o isolamento de bactrias do trato urinrio. Os meios gar Mac Conkey e Cled so utilizados para o isolamento de bacilos gram negativos e aps este isolamento usa-se meios de cultura de identificao presuntiva ou sistemas de triagem bioqumica para a identificao destes bacilos gram negativos. Os meios de Cled e gar sangue so utilizados para o isolamento de cocos gram positivos e aps este isolamento so usados testes de confirmao para identific-los. A introduo do Chromagar Orientation nesta rotina foi com a finalidade de substituir os meios tradicionais para agilizar o isolamento e a identificao das bactrias bem como verificar o custo do mesmo em relao aos demais meios de cultura. Todos os meios de cultura foram semeados com cepas da ATCC para o seu isolamento e as colnias desenvolvidas foram submetidas identificao presuntiva pelos meios de cultura e sistemas bioqumicos e testes de confirmao para identificar as bactrias das referidas cepas.

3 MATERIAL E MTODOS: CHROMAGAR ORIENTATION - DIFCO. Lote 8350975. Validade 31/10/2010. Modo de preparo: Dissolver 32,2 g em 1 litro de gua destilada. Autoclavar 121 C 15 minutos. Dispensar em placas descartveis de 90 x 4 mm. GAR MAC CONKEY NEWPROV. Cdigo MCF03. Lote 57096. Validade Dezembro 2010. Placas de 90 x 4 mm. GAR CLED NEWPROV. Cdigo MCF01. Lote 57151. Validade Dezembro 2010. Placas de 90 x 4 mm. GAR SANGUE - NEWPROV. Cdigo 724. Lote 20625. Validade. Agosto de 2009. Placas de 90 x 4 mm. CALDO TRPTICO DE SOJA (TSB) NEWPROV. Cdigo MCT26. Lote 19969. Validade Maro 2010. Tubos de 4 ml. GAR BILE ESCULINA NEWPROV. Cdigo MCT01. Lote 16528. Validade Dezembro 2009.Tubos com o gar inclinado. MTS NEWPROV. Cdigo. MCT 34. Lote 19657. Validade. Maro 2010. MEIO DE RUGAI COM LISINA NEWPROV. Cdigo MCT37. Lote 8707. Validade Junho 2009. Tubos com 6,5 ml de meio de Rugai com Lisina.

BACITRACINA-NEWPROV. Cdigo DR101. Lote 57045. Validade 2011. Frasco com 25 discos. OXIDASE-TIRAS NEWPROV. Cdigo 1022. Lote 57005. Validade Maio de 2010. Frasco com 10 tiras. OPTOQUINA-NEWPROV. Cdigo DRI06. Lote 55610. Validade Novembro 2010. Frascos com 25 discos. NOVOBIOCINA- DME SENSIDISC. Lote 1589. Validade Maio 2010.

4 SLIDEZ STAPH PLUS BIOMRIEUX. Referncia 73115CE. Lote maio 2010. STAPHY TEST PROBAC DO BRASIL. Lote STAF 049. Validade ABRIL 2010. BACTRAY 1 LABORCLIN. Cdigo 880108. Lote 90804026. Validade Julho 2010. BACTRAY 2 LABORCLIN. Cdigo 880109. Lote 90713001. Validade Julho 2010. HIDRXIDO DE POTSSIO-LABORCLIN. Cdigo 880103. Lote 90708049. Validade Julho 2010. LEO MINERAL-LABORCLIN. Cdigo 880104. Lote 90706034. Validade Julho 2010. REATIVO KOVACS-LABORCLIN. Cdigo 571004. Lote 90512039. Validade Maio 2010. CLORETO FRRICO 10 %-LABORCLIN. Cdigo 880102. Lote 90708048. Validade Julho 2010. ALFA-NAFTOL-LABORCLIN. Cdigo 880101. Lote 90708047. Validade Julho 2010. ENTEROBACTER CLOACAE DERIVADA DA ATCC 13043. Cdigo MPE 25. Lote 56508. Validade Maro 2011. KLEBSIELLA PNEUMONIAE DERIVADA DA ATCC 13883. Cdigo MPE 07. Lote 56296. Validade Fevereiro 2011. ESCHERICHIA COLI DERIVADA DA ATCC 25922. Cdigo MPE 01. Lote 56509. Validade Maro 2011. PROTEUS MIRABILIS DERIVADA DA ATCC 25933. Cdigo MPE 12. Lote 56180. Validade Janeiro 2011. PROTEUS MIRABILIS DERIVADA DA ATCC 25933. Cdigo MPE 12. Lote 56180. Validade Janeiro 2011. ENTEROCOCCUS FAECALIS DERIVADA DA ATCC 19433. Cdigo MPE 10. Lote 54545. Validade Junho 2010.

5 STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS DERIVADA DA ATCC 12228. Cdigo MPE 19. Lote 56256. Validade Fevereiro 2011. STAPHYLOCOCCUS AUREUS DERIVADA DA ATCC 25923. Cdigo MPE 04. Lote 56138. Validade janeiro 2011.

A avaliao dos referidos meios de cultura foram feito com cepas de bactrias derivadas da ATCC, conforme descrevemos: Preparao dos inoculo das cepas de Escherichia coli ATCC 25922, Proteus mirabilis ATCC 25933, Enterobacter ATCC13043, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883, Enterococcus faecalis ATCC 19433, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 1 dia: passou-se um liofilizado da cepa, com o auxlio de uma pina esterilizada, para um frasco com 4ml de caldo TSB e incubado por uma noite ( overnight ) a 35C em estufa de cultura. 2 dia: passou-se 1 alada de 1:100 para 4 ml de caldo TSB por uma noite a 35 C em estufa de cultura. 3 dia: repetiu-se a operao anterior por mais uma noite. Semeadura das bactrias nos meios de culturas para seu isolamento e identificao: 4 dia: I) Com uma ala descartvel de 1:100 semeou-se por esgotamento nas placas de gar CLED, Mac Conkey e Chromagar Orientation as bactrias (bacilos ) gram negativas e incubou-se a 35 C por 24 horas em estufa de cultura.

CLED

MAC CONKEY

CHROMAGAR ORIENTATION

Verificao das caractersticas das colnias: Aps anlise do crescimento nos diferentes meios de cultura empregados, observamos as caractersticas das colnias nesses meios. Caractersticas das bactrias gram negativas no meio de CLED: Bactrias Escherichia coli Proteus mirabilis Enterobacter cloacae Klesiella pneumoniae Caractersticas das colnias grandes, onduladas, amarelas,secas e opacas mdias, onduladas, azuis e translcidas grandes, onduladas, amarelas, mucides brilhantes grandes, amarelas, onduladas, mucides e brilhosas

Caractersticas das bactrias gram negativas no meio de Mac Conkey: Bactrias Escherichia coli Proteus mirabilis Enterobacter cloacae Klesiella pneumoniae Caractersticas das colnias grandes, rseas, secas e opacas incolores, onduladas e translcidas grandes, amarelas, onduladas, mucides e brilhosas grandes, rseas , mucides e translcidas

Caractersticas das ORIENTATION: Bactrias Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Enterobacter cloacae Proteus mirabilis

bactrias

gram

negativas

no

meio

CHROMAGAR

Caractersticas das colnias Colnias grandes, rseas,onduladas Colnias grandes, verde escuras Colnias grandes, verde azuladas Colnias pequenas, translucidas

Escherichia coli

klebsiella pneumoniae

Enterobacter cloacae

Proteus mirabilis

PROVA DA OXIDASE: para identificao das colnias de Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis e Enterobacter cloacae das placas semeadas para confirmao que pertencem a famlia das enterobacteriaceae: Todas as colnias deram resultado : Negativo

Identificao presuntiva das colnias das bactrias presentes nas placas de gar MAC CONKEY, CLED e CRHOMAGAR ORIENTATION: 1) Identificao com o meio de Rugai com Lisina:

Inoculao: Com uma ala bacteriolgica coletou-se a colnia de cada uma das placas e inoculou-se atravs de uma picada at o fundo e estrias na superfcie do meio de Rugai: a) Identificao de colnias de Escherichia coli de crescimento nos meios de Mac Conkey,Cled e Chromagar Orientation:

O comportamento bioqumico da Escherichia coli no meio de Rugai com Lisina foi idntico para as colnias dos meio de Mac Conkey, Cled e Chromagar Orientation. b) Identificao de colnias de Enterobacter cloacae de crescimento nos meios de Mac Conkey, Cled e Chromagar Orientation

O comportamento bioqumico da Enterobacter cloacae no meio de Rugai com Lisina foi idntico para as colnias dos meios de Mac Conkey, Cled e Chromagar Orientation. c) Identificao de colnias de Klebsiella pneumoniae de crescimento nos meios de Mac Conkey, Cled e Chromagar Orientation:

O comportamento bioqumico da Klebsiella pneumoniae no meio de Rugai com Lisina foi idntico para as colnias dos meios de Mac Conkey, Cled e Chromagar Orientation

d) Identificao de colnias de Proteus mirabilis de crescimento nos meios de Mac Conkey,Cled e Chromagar Orientation:

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2) Identificao com o sistema de identificao Bactray I e Bactray II : a) Identificao das colnias de Escherichia coli dos meios de Cled, Mac ConKey e Chromagar Orientation

11 b) Identificao das colnias de Proteus mirabilis dos meios de Cled, Mac Conkey, Chromagar orientation

3) Identicao das colnias de Klebsiella pneumoniae dos meios de Cled, Mac Conkey, Chromagar Orientation.

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4) Identificao das colnias de Enterobacter cloacae dos meios de Cled, Mac Conkey, Chromagar Orientation.

13 A identificao presuntiva das colnias de Escherichia coli, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae e Enterobacter cloacae pelo sistema Bactray I e II apresentaram os mesmos resultados. II) As bactrias gram (cocos) positivas foram semeadas em gar sangue, Cled e Chromagar Orientation com ala descartvel de 1:100 por esgotamento e incubadas a 35 C por 24 horas em estufa de cultura.

gar sangue

Cled

Chromagar Orientation

Verificao das caractersticas das colnias: Aps anlise do crescimento nos diferentes meios de cultura empregados, observamos as caractersticas das colnias nesses meios:

Caractersticas dos cocos gram positivos no meio de Cled: Bactrias Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Enterococcus faecalis Caractersticas das colnias Pequenas a mdias e amarelas Pequenas a mdias, amarelas e opacas Pequenas,amarelas e opacas

Caractersticas dos cocos gram positivos no meio de gar sangue: Bactrias Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Enterococcus faecalis Caractersticas das colnias Pequenas, brancas, com hemlise beta Pequenas, brancas e no hemolticas Pequenas, brancas , hemlise alfa,gama

14 Caractersticas dos cocos gram positivos no meio de Chromagar Orientation: Bactrias Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Enterococcus faecalis Caractersticas das colnias Pequenas e brancas Pequenas e brancas Pequenas e azuis

Estafilococos aureus

Estafilococos epidermidis

Enterococos faecalis

Testes de confirmao para a identificao de cocos gram positivos: I) Prova da Catalase

Prova da catalase:Positiva: para estafilococos aureus e epidermidis

Negativa: para enterococos faecalis

II) Teste da coagulase:

15 Testes de resultados idnticos para as colnias e estafilococos aureus dos meios de Cled,gar Sangue e Chromagar Orientation III) Teste da Novobiocina:

Teste confirmatrio de estafilococos epidermidis, idnticos para as colnias de estafilococos epidermidis dos meios de gar sangue, Cled e Chromagar Orientation

I) Teste da Bile esculina:

Teste confirmatrio de Enterococos faecalis para todas as colnias de enterococos faecalis dos meios de Cled, gar Sangue e Chromagar Orientation.

16 CONCLUSO:

Os resultados deste trabalho prtico mostram que o Chromagar Orientation uma alternativa eficiente rotina para a cultura de amostras de urina. Em relao a infeco urinria por Escherichia coli, Klebsiela pneumoniae, Enterobacter cloacae e Proteus mirabilis a identificao feita pela simples anlise da cor das colnias no havendo necessidade de teste confirmatrios. O que gera uma economia de 24 horas no tempo de identificao

Em relao a infeco urinria por estafilococos aureus, estafilococos epidermidis , h a necessidade de testes confirmatrios. Para estafilococos faz-se uma bacterioscopia pelo gram, prova da catalase, prova da coagulase e prova da novobiocina. O enterococos faecalis identificado facilmente por apresentar colnias pequenas e azuis.

17 Conclumos que em relao ao tempo de identificao destas bactrias o Chromagar Orientation apresenta uma economia de 24 horas. Quanto anlise de custos, foram calculados, para a identificao pelos meios convencionais e pelo Chromagar Orientation, obtendo-se os seguintes resultados: a) b) c) d) e) f) g) h) i) j) k) l) m) Identificao de bacilos gram negativos fermentadores pelo meio de Cled e pelo meio de Rugai com Lisina: R$ 6,43. Identificao de bacilos gram negativos fermentadores pelo meio de Mac Conkey e pelo meio de Rugai com Lisina: R$ 6,45. Identificao de bacilos gram negativos fermentadores pelo meio de Cled e pelo Bactray I e II: R$ 16,23. Identificao de bacilos gram negativos fermentadores pelo meio de Mac Conkey e Bactray I e II: R$ 16,25. Identificao de bacilos gram fermentadores negativos pelo meio de Chromagar Orientation: RS 2,00. Identificao de cocos gram positivos pelo meio de Cled e testes confirmatrios para Estafilococos aureus: R$ 5,06. Identificao de cocos gram positivos pelo meio de Agar Sangue e testes confirmatrios para Estafilococos aureus: R$ 6,10 Identificao de cocos gram positivos pelo meio de Cled e testes confirmatrios para Estafilococos epidermidis : R$ 5,29. Identificao de cocos gram positivos pelo meio Agar Sangue e testes confirmatrios para Estafilococos epidermidis : R$ 6,33. Identificao de cocos gram positivos pelo meio de Cled e testes confirmatrios para Enterococos : R$ 3,84. Identificao de cocos gram positivos pelo meio de Agar Sangue e testes confirmatrios para enterococos: R$ 4,88. Identificao de cocos gram positivos pelo meio de Chromagar Orientation e testes confirmatrios para estafilococos aureus: R$ 4,95. Identificao de cocos gram positivos pelo meio de Chromagar Orientation e testes confirmatrios para Estafilococos epidermidis: R$ 5,18

18 n) Identificao de cocos gram positivos pelo meio de Chromagar Orientation para enterococos: RS 1,95. Alm da economia de tempo para identificao, o Chromagar Orientation apresenta um custo mais econmico que os demais meios. Portanto, para um servio microbiologia que possui um movimento razovel, a implantao do Chromagar Orientation representa uma alternativa eficiente rotina.

19 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS:

Koneman, Diagnstico Microbiolgico, Guanabara Koogan, So Paulo, 6 edio, 2008. Trabulsi Alterthum F., Microbiologia, Atheneu, So Paulo, 4 edio, 2004 Manual Newprov de Microbiologia, Microscience, Curitiba, 2002, Albini C.A.; Souza H.A.P.M.; Pereira S.M.