IBP1058_12 PRODUO DE BIOSSURFACTANTES PARA APLICAO NA REMOO DE CONTAMINANTES AMBIENTAIS GERADOS NA INDSTRIA DE PETRLEO Leonie A. Sarubbo1, Raquel D.

Rufino2, Juliana M. de Luna3, Charles B.B. Farias4, Valdemir A. dos Santos5

Copyright 2012, Instituto Brasileiro de Petrleo, Gs e Biocombustveis - IBP Este Trabalho Tcnico foi preparado para apresentao na Rio Oil & Gas Expo and Conference 2012, realizado no perodo de 17 a 20 de setembro de 2012, no Rio de Janeiro. Este Trabalho Tcnico foi selecionado para apresentao pelo Comit Tcnico do evento, seguindo as informaes contidas no trabalho completo submetido pelo(s) autor(es). Os organizadores no iro traduzir ou corrigir os textos recebidos. O material conforme, apresentado, no necessariamente reflete as opinies do Instituto Brasileiro de Petrleo, Gs e Biocombustveis, Scios e Representantes. de conhecimento e aprovao do(s) autor(es) que este Trabalho Tcnico seja publicado nos Anais da Rio Oil & Gas Expo and Conference 2012.

Resumo
Este trabalho descreve a aplicao de surfactantes microbianos na remoo de petrleo e derivados de ambiente marinho localizado nas proximidades da Termeltrica de Pernambuco. Dois biossurfactantes foram produzidos pelas leveduras Candida sphaerica e C. lipolytica cultivadas em resduos industriais durante 144 e 72 horas, respectivamente. As tenses superficiais das biomolculas foram determinadas (25 mN/m), os rendimentos de produo calculados (8-9g/L) e as CMCs estabelecidas (0,03%). Os biossurfactantes foram aplicados em amostras de gua do mar e de pedras contaminadas com leo de motor e petrleo. Os resultados demonstraram a ao dispersante do biossurfactante de C. sphaerica e emulsificante do biossurfactante de C. lipolytica sobre o leo, bem como remoes de 100% do leo e do petrleo. A possibilidade de aplicao de biossurfactantes na remediao de ambientes poludos por hidrocarbonetos motiva o avano das pesquisas no sentido de desenvolver essa tecnologia alternativa para utilizao efetiva nos sistemas de tratamento da Termope.

Abstract
This paper describes the application of microbial surfactants in removing crude oil and marine environment located in the proximity of the Pernambuco Thermoelectric. Two biosurfactants were produced by yeasts Candida sphaerica and C. lipolytica grown in industrial wastes during 72 and 144 hours, respectively. The surface tensions of the biomolecules (25 mN/m) were determined, the production yields were estimated (8 and 9 g/L) and the CMC determined (0.03%). The biosurfactants were applied to samples of sea water and rocks contaminated with petroleum and motor oil. The results demonstrated the oil dispersant action of the biosurfactant from C. sphaerica and the emulsifying ability of the biosurfactant from C. lipolytica. Percentages removals of 100% of oil and petroleum were obtained for both biosurfactants. The possibility of application of biosurfactants in the remediation of oil polluted environments motivates the advancement of research to develop this alternative technology for effective use in the Termope Thermoelectric treatment systems.

1. Introduo
As refinarias so grandes geradoras de poluio. Elas consomem enormes quantidades de gua e de energia, produzem muitos despejos lquidos, liberam diversos gases nocivos para a atmosfera e produzem resduos slidos de difcil tratamento e disposio. Em decorrncia de tais fatos, a indstria de refino de petrleo, pode ser uma grande degradadora do meio ambiente, pois tem potencial para afetar o mesmo em todos os nveis: ar, gua e solo (Gonzini et al., 2010; Satpute et al., 2010). O Plo Petroqumico de SUAPE tem permitido ao Estado de Pernambuco alcanar nveis de desenvolvimento elevados em virtude da instalao de inmeros empreendimentos econmicos. A instalao da Refinaria Abreu e Lima e do Estaleiro Atlntico Sul, entretanto, tem despertado a preocupao das indstrias instaladas no seu entorno. No caso especfico da Termoelrica de Pernambuco (TERMOPE), com sua localizao em termos de captao de gua para

______________________________ 1 Doutora, Engenheira Qumica UNIVERSIDADE CATLICA DE PERNAMBUCO 2 Doutora, Biloga UNIVERSIDADE CATLICA DE PERNAMBUCO 3 Doutora, Biloga UNIVERSIDADE CATLICA DE PERNAMBUCO 4 Graduado, Engenheiro Ambiental UNIVERSIDADE CATLICA DE PERNAMBUCO 5 Doutor, Engenheiro Qumico UNIVERSIDADE CATLICA DE PERNAMBUCO

Rio Oil & Gas Expo and Conference 2012 refrigerao de seu sistema gerador, jusante de grandes tanques de armazenagem de derivados de petrleo, encontra-se sujeita ao risco iminente de derramamento ou vazamento desses produtos. Portanto, faz-se necessrio o desenvolvimento de estratgias tecnolgicas para prevenir problemas indesejveis causados por possveis acidentes ambientais. A utilizao de biossurfactantes, agentes anfipticos de origem microbiolgica, tem se destacado como tecnologia alternativa no controle da poluio provocada por hidrocarbonetos do petrleo. Comparados com os surfactantes sintticos, os derivados do petrleo, os biossurfactantes, em geral, exibem forte compatibilidade ambiental, maior atividade superficial, baixa toxicidade e alta biodegradabilidade (Mulligan, 2009), alm de serem produzidos por fontes renovveis (Seydlov e Svobodov, 2008). Nesse trabalho, agentes surfactantes produzidos por espcies microbianas foram utilizados na recuperao de guas marinhas contaminadas por petrleo e derivados.

2. Material e Mtodos
2.1. Micro-organismos As leveduras Candida sphaerica (UCP 0995) e Candida lipolytica (UCP 0998) foram utilizadas como microorganismos produtores dos biossurfactantes. As leveduras foram mantidas em meio YMA (Yeast Mold gar). Repiques foram mensalmente realizados para manter a viabilidade celular.

2.2. Meios de Produo Para a produo do biossurfactante de C. sphaerica foi utilizado o meio contendo 9% de resduo de refinaria da indstria de leo de soja e 9% do resduo milhocina (Luna et al., 2009). A produo do biossurfactante de C. lipolytica foi realizada em meio mineral suplementado com 6% de resduo de refinaria da indstria de leo de soja e 1% cido glutmico (Rufino et al., 2008). Os meios foram esterilizados em autoclave 121C por 20 minutos, sendo o pH final ajustado para 5,3. Os resduos industriais foram gentilmente cedidos por duas Empresas localizadas no Estado de Pernambuco.

2.3. Produo dos Biossurfactantes As fermentaes para produo dos biossurfactantes foram realizadas em frascos de Erlenmeyer com 1000 ml de capacidade contendo 300mL do meio de produo e incubados com as respectivas suspenses celulares (10 4 clulas/mL para o biossurfactante de C. sphaerica e 108 clulas/mL para o biossurfactante de C. lipolytica). Os frascos foram mantidos sob agitao orbital de 150 rpm, durante 144 horas, temperatura de 27C. O biossurfactante de C. sphaerica foi produzido durante 144 horas, enquanto que o biossurfactante de C lipolytica foi obtido aps 72 horas.

2.4. Isolamento dos Biossurfactantes Aps o cultivo da C. sphaerica, o lquido metablico livre de clulas foi submetido ao processo de extrao. O pH foi ajustado para 2 com uma soluo de HCl 6,0M e precipitado com metanol (2:1 v/v). Aps repouso durante 24 horas a -15C, a amostra foi centrifugada 4000g por 30 minutos, lavada com metanol gelado por duas vezes e seca em estufa a 37C por 24-48 h., sendo mantida em dessecador at peso constante. O rendimento em produto isolado foi calculado em g/L (Luna et al., 2009). Aps o cultivo da C. lipolytica, o lquido metablico foi filtrado em papel Whatman N 1 e centrifugado a 2000g por 20 minutos. O filtrado livre de clulas foi submetido a extrao com clorofrmio (1:1 v/v) em funil de separao a 25C. Aps essa etapa a fase aquosa foi liofilizada e o rendimento de biossurfactante determinado por gravimetria (Rufino et al., 2008).

2.5. Determinao da Tenso Superficial e Concentrao Micelar Crtica (CMC) A tenso superficial e a CMC foram medidas em tensimetro automtico (Modelo Sigma 70, KSV Ltd., Finland) utilizando o anel de NUOY. A CMC foi determinada partindo-se de uma soluo de concentrao conhecida do biossurfactante isolado.

2.6. Aplicao dos Biossurfactantes na Disperso de Poluente Hidrofbico em gua do Mar A disperso de leo lubrificante de motor em gua foi realizada utilizando-se 100 ml de gua do mar, coletada nas proximidades da captao do sistema gerador de energia da Termope, Suape-PE. A contaminao foi realizada com 5% do leo. A amostra de gua do mar previamente contaminada foi submetida aos seguintes tratamentos: adio de 50 mL de gua destilada (controle) e adio de 50 mL de soluo aquosa dos biossurfactantes isolados de C. sphaerica ou C. 2

Rio Oil & Gas Expo and Conference 2012 lipolytica na concentrao de 0,3% (CMC). As capacidades de disperso, aglutinao, emulsificao e solubilizao foram observadas visualmente.

2.7. Aplicao dos Biossurfactantes na Remoo de Poluentes Hidrofbicos em Superfcie Slida A remoo de leo lubrificante de motor e petrleo impregnados em superfcies slidas (pedras) foi realizada utilizando-se solues aquosas contendo as seguintes concentraes dos biossurfactantes: 0,05% (2xCMC), 0,125% (5xCMC) e 0,25% (10xCMC). A quantidade de poluente remanescente foi determinada no slido lavado, por gravimetria, aps extrao com hexano, e expressa em percentual.

3. Resultados e Discusso
3.1. Rendimento em Biossurfactantes A obteno de altos rendimentos de produo em biossurfactantes tem sido considerada um dos obstculos nessa rea da biotecnologia, uma vez que, alm de produtos isolados em pequenas quantidades, gera-se um grande volume residual. Nesse contexto, o uso de biossurfactantes brutos, ou seja, o uso do lquido metablico sem clulas obtido aps a produo, tem sido considerado uma estratgia de aplicao pela indstria petrolfera, a qual no requer formulaes puras, ao contrrio das indstrias alimentcias e farmacuticas (Atlas, 1991). Os rendimentos dos biossurfactantes foram de 9g/L e 8g/L, respectivamente. A despeito da possibilidade de inmeras aplicaes dos biossurfactantes, a indstria petroqumica apresenta maior potencial para essas biomolculas, uma vez que requer especificaes mnimas de pureza, de modo que o lquido metablico possa ser usado, eliminando as etapas de purificao que representam cerca de 60% do custo total de produo (Dubey e Juwarkar, 2001). Vrias pesquisas tm sido desenvolvidas com o objetivo de otimizar os rendimentos de produo de agentes surfactantes. Sarubbo et al. (2007), por exemplo, obtiveram resultados semelhantes aos obtidos nesse trabalho para um biossurfactante produzido por C. lipolytica utilizando leo de canola e glicose como substratos. Estudos realizados por Sobrinho et al. (2008), utilizando dois resduos industriais como fontes de carbono, demonstraram um rendimento de 4,5 g/L de biossurfactante produzido por C. sphaerica.

3.2. Tenso Superficial, Concentrao Micelar Crtica (CMC) dos Biossurfactantes Uma importante propriedade dos surfactantes potentes a habilidade de atuarem na formao de agregados micelares (Hua et al., 2003; Amaral et al., 2006). A formao de micelas est condicionada ao aumento da concentrao do surfactante no meio aquoso at se atingir a Concentrao Micelar Crtica (CMC), definida como a mnima concentrao de surfactante necessria para que a tenso superficial seja reduzida ao mximo. Os biossurfactantes produzidos exibiram excelente capacidade de reduo da tenso, uma vez que a tenso superficial da gua foi reduzida de 70 mN/m para 25mN/m com o aumento da concentrao do biossurfactante de C. sphaerica at 0,025% (Figura 1) e com o aumento da concentrao do biossurfactante de C. lipolytica at 0,03 % (Figura 2). A partir da CMC, o aumento da concentrao das solues dos biossurfactantes no provocou maiores redues na tenso superficial da gua, indicando que a CMC havia sido atingida nessa concentrao. Os biossurfactantes produzidos nas condies estudadas nesse trabalho demonstraram maior capacidade de reduzir a tenso do que os surfactantes de C. lipolytica (32 mN/m) (Rufino et al., 2007), de C. glabrata (31 mN/m) (Sarubbo et al., 2006), de C. antarctica (35 mN/m) [30], e de Yarrowia lipolytica (50 mN/m) [31]. Os biossurfactantes tambm demonstraram uma CMC muito inferior CMC de outros surfactantes de leveduras descritos na literatura, considerando os valores de 2,5 % encontrados para os biossurfactantes de C. lipolytica (Sarubbo et al., 2007) e C. glabrata (Sarubbo et al., 2006) e valores de 1 % para o biossurfactante de C. lipolytica cultivada em resduo de refinaria (Rufino et al., 2007) e valores de 0,08 % para o biossurfactante de C. sphaerica (Sobrinho et al., 2008).

Rio Oil & Gas Expo and Conference 2012

80 70
Tenso superficial (mN/m)

60 50 40 30 20 10 0 0 0,5 1 1,5 2 2,5 Concentrao de biossurfactante (%)

Figura 1. CMC do biossurfactante produzido pela C. shaerica cultivada em meio contendo 9% de resduo de refinaria de leo de soja e 9% de milhocina
80 70
Tenso Superficial (mN/m)

60 50 40 30 20 10 0 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 Concentrao (%)

Figura 2. CMC do biossurfactante produzido pela C. lipolytica cultivada em meio contendo mineral suplementado com 6% de resduo de refinaria de leo de soja e 1% cido glutmico

3.3. Aplicao dos Biossurfactantes na Disperso de Poluentes Hidrofbicos em gua do Mar Os biossurfactantes podem aumentar a remoo de poluentes hidrofbicos atravs dos processos de solubilizao e mobilizao. A capacidade de solubilizao depende da habilidade do surfactante em aumentar a solubilidade dos constituintes hidrofbicos na fase aquosa. Um grande aumento desta capacidade observado acima da CMC, a qual atribuda partio do hidrocarboneto no stio hidrofbico das micelas surfactantes (Dubey e Juwarkar, 2001). O biossurfactante L apresentou elevada atividade dispersante do leo lubrificante de motor, o que poderia facilitar o direcionamento de manchas oleosas no oceano, enquanto que o biossurfactante R apresentou atividade emulsionante sobre o leo, sugerindo a solubilizao do leo com formao de pequenas gotculas que facilitariam o acesso de microorganismos degradadores de hidrocarbonetos e a consequente acelerao do processo de biorremediao. Os resultados obtidos foram observados quando baixas quantidades dos biossurfactantes foram utilizadas, demonstrando assim o potencial desses compostos no deslocamento e na solubilizao de manchas de leos em ambiente aqutico marinho.

3.4. Aplicao dos Biossurfactantes na Remoo de Poluentes Hidrofbicos Adsorvidos em Superfcies Slidas As tabelas 1 e 2 apresentam os resultados de remoo dos compostos oleosos adsorvidos em superfcies slidas pelos biossurfactantes produzidos. O biossurfactante L foi capaz de remover todo o petrleo e o leo lubrificante de motor quando usado na maior concentrao testada; entretanto, a soluo do biossurfactante isolado na concentrao de 0,125% tambm se mostrou efetiva nas remoes de ambos os poluentes. J o biossurfactante R removeu percentuais elevados dos contaminantes quando usado na maior concentrao, isto , 0,3%.

Rio Oil & Gas Expo and Conference 2012 Tabela 1. Remoo de leo lubrificante de motor presente em pedra pelo biossurfactante isolado de Candida sphaerica UCP0995

Tratamentos (solues aquosas) Biossurfactante a 0,05% Biossurfactante a 0,125% Biossurfactante a 0,25%

leo de motor (%) 46 64 100

Petrleo (%) 43 100 100

Tabela 2. Remoo de leo lubrificante de motor presente em pedra pelo biossurfactante isolado de Candida lipolytica UCP0998

Tratamentos (solues aquosas) Biossurfactante a 0,06% Biossurfactante a 0,15% Biossurfactante a 0,3% 4. Concluses

leo de motor (%) 51 77 100

Petrleo (%) 13 26 70

Os resultados obtidos demonstram o potencial dos biossurfactantes na remediao de ambientes marinhos poludos por petrleo e derivados. Estudos esto sendo conduzidos para caracterizar novas biomolculas e assegurar a ausncia dos efeitos toxicolgicos desses agentes, bem como as melhores condies de obteno de um produto comercializvel.

5. Agradecimentos
Os autores agradecem o apoio financeiro da Termoeltrica de Pernambuco (TERMOPE), do Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico (CNPq), da Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal de Nvel Superior (CAPES) e da Fundao de Amparo Cincia e Tecnologia do Estado de Pernambuco (FACEPE).

6. Referncias
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