Fuente Original: Revista Enlogos (editada por la Federacin Espaola de Asociaciones de Enlogos y Periodistas Asociados).

Revista Enlogos n 50 Ecologa y prevencin de Brettanomyces/Dekkera durante la elaboracin y crianza de vinos tintos. A. Morata, S. Benito, F. Palomero, F. Caldern y J. A. Surez-Lepe Dpto. Tecnologa de Alimentos. E. T. S. Ingenieros Agrnomos. Universidad Politcnica de Madrid Resumen Brettanomyces spp. es la levadura responsable de la formacin de 4-etilfenoles asociados a aromas animales a cuadra o a establo que deprecian la calidad sensorial de los vinos tintos. Es una levadura de crecimiento lento que se desarrolla de forma adecuada en las condiciones que se producen durante la crianza en barrica. El presente trabajo analiza algunas de las caractersticas ms relevantes de este gnero de levaduras y estudia algunas de las medidas ms eficientes empleadas en su control. 1. Brettanomyces en bodega Brettanomyces o su gnero esporulado Dekkera son levaduras de crecimiento lento, capacidad fermentativa baja, y particulares condiciones fisiolgicas y de crecimiento [1]. Sus clulas poseen geometra ojival y con crecimientos ramificados (pseudimiceliales) en cultivos viejos (Figura 1). Durante la fermentacin vnica son desplazadas por levaduras fermentativas (Saccharomyces cerevisiae o bayanus) pero posteriormente durante la crianza en madera encuentran un medio favorable para su desarrollo. Brettanomyces puede crecer a partir de etanol como nica fuente de carbono por lo que no precisa de ningn azcar residual. Adems se han descrito especies que son capaces de metabolizar incluso celobiosa disacrido origen de la celulosa de la madera. Puede sobrevivir en concentraciones de etanol tan altas como 15 % vol [2, 3]. No se ve afectada de forma directa por los pHs que poseen los vinos ni se ve inhibida por su contenido polifenlico. Es sensible a temperaturas suaves de tal modo que intervalos de 30-35 C que son tolerables por otros gneros de levaduras muchas veces son incompatibles con su desarrollo [3]. La presencia de oxgeno favorece la aparicin de 1

Brettanomyces y por ello la crianza oxidativa en barrica o el uso de tcnicas enolgicas como la microoxigenacin favorecen su desarrollo [1, 4]. En la actualidad Brettanomyces es un problema importante en algunas DOs que se dedican a la elaboracin de vinos de crianza. La tendencia actual de elaborar minimizando procesos de estabilizacin como clarificaciones y filtraciones suponen mayores posibilidades de contaminaciones microbiolgicas en general y en concreto de Brettanomyces. Los pHs elevados del vino de muchas regiones espaolas clidas, los abonados potsicos y las maduraciones prolongadas para conseguir una mayor expresin varietal, hacen que los niveles de sulfuroso libre y molecular sean menores, y por tanto favorables para su crecimiento.

Figura 1. a) Geometra ojival y crecimiento pseudomiceliar en un cultivo viejo de Brettanomyces bruxelliensis. b) Clula de Saccharomyces cerevisiae en gemacin.

La ecologa de Brettanomyces y su origen no estn bien definidos. Resulta lgico pensar que provenga como otras especies del campo y del viedo, y posteriormente se incorpore al proceso enolgico. Sin embargo, hasta la fecha ningn estudio ha constatado su presencia en uva fresca, y cuando se ha conseguido aislar sobre uvas estas haban tenido algn contacto con la bodega, o con material de recoleccin, cajas no limpias, etc. Es frecuente encontrarla en bodega especialmente en equipos de difcil

acceso y esterilizacin como codos de tuberas, grifos, valvulera, bombas, y frecuentemente asociada a condiciones de escasa limpieza [5]. El momento y lugar ms apropiado para el desarrollo de Brettanomyces es la etapa de crianza en barrica de madera (Figura 2) y en ocasiones tras la fermentacin malolctica cuando se producen una serie de circunstacias favorables como: temperaturas ms altas adecuadas para su crecimiento, bajos niveles de SO2 libre y molecular, aumento del contenido de oxgeno y utilizacin de barricas de roble que son recipientes microporosos de difcil limpieza e imposible esterilizacin y que actan de soporte y elemento de transmisin.

Saccharomyces (ufc ml-1) Bacterias lcticas (ufc ml-1) Trasiego Trasiego Potencial redox (mV)

SO2 libre (mg l-1) Brettanomyces (ufc ml-1)

Fermentacin alcohlica

Fermentacin malolctica

20

40

60 Estabilizacin

80

100 Tiempo (das)

200

300 Crianza oxidativa en barrica

400

Figura 2. Contenido de oxgeno, sulfuroso libre y curvas de crecimiento de levaduras fermentativas, bacterias lcticas y Brettanomyces en funcin del tiempo. Fuente: Elaboracin propia.

2. Defectos sensoriales producidos en vinos por Brettanomyces Brettanomyces es una levadura de contaminacin, perjudicial en enologa ya que produce metabolitos y desarrolla actividades metablicas que afectan a la calidad sensorial de los vinos (Figura 3). La problematica principal es la produccin de etilfenoles, pero tambin puede formar tetrahidropiridinas, y cido actico afectando al sabor y al perfil olfativo del vino. Adems, expresa actividades -glicosidasa que producen la desglicosilacin de antocianos y por tanto su inestabilidad.

Los fenoles voltiles que se asocian al problema Brett en vinos son el 4-etilfenol y el 4etilguaiacol, as como sus precursores intermedios, 4-vinilfenol y 4-vinilguaiacol, aunque estos ltimos son menos importantes por ser muy reactivos y rpidamente convertidos en etilfenoles por Brettanomyces o en su caso condensan con otras molculas como antocianos [6, 7]. Los etilfenoles y especialmente elevadas concentraciones de 4-vinilfenol en vinos se asocian con aromas desagradables asociados a descriptores como fenol, cuero, sudor de caballo, establo o barniz [8, 9]. El umbral sensorial del 4-etilfenol es de 230 g l-1 y el del 4-etilguaiacol es de 47 g l-1 [10]. Pese a su menor umbral sensorial, el 4-etilguaiacol responde a descriptores como bacon o ahumado que a bajas concentraciones aportan complejidad por lo que se puede considerar sensorialmente menos conflitivo que el 4-etilfenol.

CH3O OH
OH

O HO

4-etilguaiacol

cido isovalerinico

4-etilfenol

O N

brett 2-acetil-1,4,5,6-tetrahidropiridina

OH

cido actico

OH OH OMe OH HO O
+

OH CH2OH O OH HO O
+

OMe OH OMe

OMe OH O OH CH2OH O OH

OH
OH

OH

degradacin de antocianos

Figura 3. Defectos sensoriales Brettanomyces/Dekkera.

producidos

en

el

vino

por

Brettanomyces

produce

etilfenoles

partir

de

los

correspondientes

cidos

hidroxicinmicos precursores procedentes de la uva (cido cafeico, ferlico y pcumrico). Para ello utiliza una ruta bioqumica en la que intervienen dos enzimas, hidroxicinamato descarboxilasa y vinilfenol reductasa (Figura 4). La primera transforma los cidos hidroxicinmicos en hidroxiestirenos (vinilfenoles) [11] y la segunda reduce estas molculas a etilfenoles [12]. Es destacable que mientras que la primera enzima la poseen muchas levaduras (incluso algunas cepas de Saccharomyces cerevisiae), la segunda slo se ha descrito en Dekkera bruxelensis, Dekkera anomala, Picchia guillermondi y algunas especies de Candida [13], existiendo gran variabilidad en la capacidad de produccin de etilfenoles entre distintas cepas de Brettanomyces [14].
OH

CINAMATO DESCARBOXILASA HO
OH O

VINIL REDUCTASA HO HO
OH

Acido cafeico
OH

4-vinilcatecol

OH 4-etilcatecol

CINAMATO DESCARBOXILASA CH3O

OH O CH3O

VINIL REDUCTASA
CH3O OH

Acido ferlico
OH

4-vinilguaiacol

OH

4-etilguaiacol

CINAMATO DESCARBOXILASA

VINIL REDUCTASA

OH

Acido p-cumrico

OH

4-vinilfenol

OH 4-etilfenol

Figura 4. Descarboxilacin de cidos hidroxicinmicos a vinilfenoles y reduccin de estos a etil fenoles mediante actividades enzimticas exocelulares de Brettanomyces.

Los primeros estudios sobre formacin de etilfenoles en vinos atribuan este problema a las bacterias lcticas, sin embargo aunque Aunque estos microorganismos pueden producir cantidades significativas de etilfenoles no son capaces de hacerlo en condiciones enolgicas. En la actualidad se est considerando como relevante tambin

otra molcula como el 4-etilcatecol cuyo precursor el cido cafeico se encuentra en cantidades elevadas en algunas variedades de uva tinta como la Pinotage. Otro molcula que produce Brettanomyces a partir de ciertos aminocidos y que tiene un perfil organolptico negativo asociado a descriptores como gusto a ratn, got de souris o mousy wine es la 2-acetil-1,4,5,6-tetrahidropiridina (Figura 3). Las distintas cepas difieren en la concentracin que producen de esta molcula, ms incluso que para el caso de los etilfenoles [15]. El gusto a ratn es muy persistente y se acenta en la boca por el efecto neutralizante de la saliva. Brettanomyces y Dekkera son productores de cido actico y elevan el contenido de los vinos anormalmente en condiciones de aerobiosis. En condiciones de anaerobiosis producen concentraciones bajas o nulas de cido actico. Tambin produce cido isovalerinico aunque sus concentraciones no conllevenen impactos odorferos tan importantes como los etilfenoles. Finalmente, Brettanomyces tambin afecta al color de los vinos ya que expresa actividad -glicosidasa que puede hidrolizar la molcula de glucosa que posee la antocianidina en posicin 3 (Figura 3) generando una molcula ms inestable, y produciendo el color anaranjado que poseen algunos vinos muy contaminados. 3. Factores que afectan a la formacin de fenoles voltiles. La formacin de fenoles voltiles es directamente proporcional al tamao de la poblacin de Brettanomyces/Dekkera [16] y a la concentracin de precursores (cidos hidroxicinmicos), razn por la que prcticas enolgicas que favorezcan la extraccin de precursores de las partes slidas (maceraciones intensas, elevadas temperaturas de maceracin o utilizacin de enzimas pectolticas) pueden favorecer una mayor formacin de etilfenoles [1]. Sin embargo, en la prctica este hecho es poco significativo, ya que al tener los etilfenoles umbrales sensoriales tan bajos, las concentraciones de cidos hidroxicinmicos presentes normalmente en vinos son suficientes para producir el defecto organolptico. La capacidad de Brettanomyces para producir etilfenoles es ms rpida a baja concentracin de etanol [1], de tal modo que se produce mucho ms a 12 % v/v que a 14% v/v, existiendo un lmite de 15-15,5% v/v por encima del cual es inviable la produccin de etilfenoles por Brettanomyces [17].

La temperatura de envejecimiento en madera tambin afecta a la produccin de etilfenoles de modo que temperaturas de 18 C son ms favorables que 13 C para la formacin de estas molculas. El pH no es una condicin directamente limitante para el crecimiento de esta levadura, en los rangos normales de vinos, y al poder crecer utilizando etanol como nica fuente de carbono presencia de azcares residuales no es imprescindible para su desarrollo. 4. Mtodos fsicos para el control de Brettanomyces en vinos El contenido de clulas de Brettanomyces presentes en el vino puede ser reducido de forma importante mediante tratamientos de clarificacin, filtracin o ambos aplicados de forma sucesiva. Lo ideal es realizar el tratamiento al vino previamente a depositarlo en la barrica que es la situacin ms peligrosa para el desarrollo de esta levadura. Tambin se puede aplicar a barricas en las que se haya detectado crecimientos de Brett con anterioridad a su trasiego a barricas desinfectadas. Mediante protenas clarificantes se puede reducir hasta 2000 veces una poblacin de Brettanomyces en vinos, y a veces con tratamientos con gelatina lquida [18]. Sin embargo, en la elaboracin de vinos tintos de alta expresin, que frecuentemente se someten a crianzas largas en barrica, el enlogo descarta el uso de clarificaciones o filtraciones que producen mermas en el color y aroma del vino favoreciendo de este modo el desarrollo de Brettanomyces [1]. La filtracin amicrbica reduce totalmente la poblacin de levaduras presente en un vino. La utilizacin de membranas de 0,45 m es suficiente para la retencin de clulas adultas, sin embargo, clulas jvenes de pequeo tamao procedentes de gemaciones o clulas alargadas de cultivos envejecidos podran atravesar este tamao de poro. Por tanto una efectividad del 100 % slo se puede obtener con membranas de 0,22 m. En la elaboracin de vinos tintos es poco viable la aplicacin de estos tipos de membranas ya que reducen el color, contenido polifenlico y la estructura de los vinos de forma muy notable. Tratamientos con placas filtrantes de celulosa con tamaos de poro entre 1 y 2 m no garantizan un 100 % de efectividad pero reducen de forma importante el contenido de microorganismos por lo que van a garantizar una mayor proteccin contra este tipo de levaduras sin afectar tanto a la calidad sensorial [1]. Tratamientos de clarificacin proteica asociados a filtraciones mediante placas pueden ser muy efectivos

en el control de Brettanomyces y en el tratamiento del vino procedente de barricas en las que se haya detectado esta levadura. La flash-pasteurizacin es otra alternativa muy interesante ya que permite la eliminacin de Brett de forma eficaz a temperaturas no muy altas por la baja termotolerancia de esta levadura en condiciones enolgicas. Es una tcnica poco utilizada en bodega, pese a la seguridad microbiolgica que aporta, ya que los vinos as tratados presentan a corto plazo mejor perfil sensorial en ocasiones por la ligera aireacin que produce, pero luego evolucionan peor, alcanzando aromas de oxidacin y un ligero deterioro del color. Otro aspecto muy importante a controlar es la temperatura de la nave de barricas, temperaturas prximas a 13 C dificultan el desarrollo de Brett mientras que las prximas a 18 C son muy apropiadas para su crecimiento. En muchas bodegas los equipos de climatizacin consiguen temperaturas adecuadas en invierno, otoo y primavera, pero en verano es ms difcil el control, especialmente en zonas clidas, lo que crea situaciones propicias para el desarrollo de Brett. 5. Aditivos qumicos para el control de Brettanomyces El aditivo ms utilizado y efectivo en enologa para el control de microorganismos es el anhdrido sulfuroso, molcula que inhibe el crecimiento de Brettanomyces, levadura mucho ms sensible a este agente microbicida que el gnero Saccharomyces. Su problematica radica en que el contenido de sulfuroso no es estable en vinos, especialmente el libre y el molecular que son los verdaderamente efectivos, situacin que se acenta en las condiciones oxidativas de la crianza en barrica (Figura 2). Contenidos de 30 mg l-1 de SO2 libre fcilmente evolucionan a menos de 10 mg l-1 despus de 6 meses de crianza en madera; adems aunque el pH no afecta al crecimiento de Brettanomyces, si afecta a la cantidad de sulfuroso molecular en el vino [1] y es bueno recordar que 30 mg l-1 de SO2 libre suponen 0,8 mg l-1 de SO2 molecular a pH 3,4 pero slo 0,4 a pH 3,7. Son recomendables dosis de 0,5-0,8 mg l-1 de SO2 molecular para el control de Brett [19]. Otro producto interesante en el control de Brettanomyces es el Dimetil dicarbonato o DMDC (Figura 5) conocido comercialmente como Velcorin (Scott Laboratories, Petaluma, California) [1]. La reciente legislacin de la UE permite utilizar dosis de hasta 400 mg l-1. Dosis de 250 a 400 mg l-1 inhiben el crecimiento de la mayor parte de

las levaduras fermentativas, evitando eficazmente los problemas de refermentacin en vinos semisecos y abocados.

O H3C O O H3C O O
Figura 5. Estructura qumica del dimetil dicarbonato.

El DMDC es un lquido incoloro de olor ligeramente picante y que no es detectable en la degustacin de los vinos ya que evoluciona rpidamente a molculas que a las concentraciones a las que se aplica no resultan txicas (Figura 6). Su efectividad antimicrobiana est probada, aunque recientemente se ha publicado algn trabajo en el que dosis de 400 mg l-1 no son capaces de inhibir completamente B. anomalus sino solo ralentizar su crecimiento. Ello es debido a que evoluciona muy rpidamente a molculas no txicas y es preciso un rpido contacto con las clulas de Brettanomyces para que resulte efectivo. El DMDC se degrada en aproximadamente 2 horas.
O H3C O O H3C O O DMDC O

CH3CH2-O-H Etanol

H3C O O H3C O O

OCH2CH3 H

CH3

H O

co2

CH3OH Metanol

O O

H3C O O OCH2CH3 Etilmetilcarbonato

Figura 6. Evolucin del DMDC en el vino. Las molculas resultantes a las concentraciones que se producen resultan inocuas.

La forma ms adecuada de aplicar el DMDC es en la lnea previa al embotellado mediante dosificacin volumtrica ya que se consigue un buen contacto del producto con el volumen a tratar y una efectividad mxima, aunque las bombas que permiten una

dosificacin correcta para volmenes de 400 mg l-1 tienen un elevado coste lo que encarece la instalacin de tratamiento. Otro producto ensayado es el quitosan, se trata de un polisacrido derivado de la quitina que forma el exoesqueleto de los crustceos, con carga neta positiva y que se puede utilizar en clarificacin de productos alimentarios complementando a otros coloides de carga negativa como bentonita o gel de slice. Adems tiene un cierto efecto inhibitorio sobre Brettanomyces causando un retraso selectivo en su fase de latencia cuando se aplica sobre cultivos mixtos con Saccharomyces cerevisiae [20]. Dosis de 3-6 g l-1 de quitosan impiden el crecimiento de B. bruxellensis y B. intermedius sin afectar al de Saccharomyces cerevisiae. Quitosan a dosis de 0,05-0,1% retrasa el crecimiento de levaduras alterantes a 25 C, e inactiva algunas especies [21].

CH2OH O OH OH NH2

CH2OH O OH NH2

O
n

CH2OH O OH OH NH2

Figura 7. Quitosan. Polmero de unidades de -(1-4)-D-glucosamina.

El cido srbico (E200) es un conservante con actividad antifngica, que inhibe el crecimiento de levaduras y cuyo uso se permite para evitar refermentaciones en vinos dulces en dosis de hasta 200 mg l-1. Aunque retrasa el desarrollo de levaduras tipo Brett no es muy efectivo para su control, ya que a pH 3,5 es capaz de crecer a concentraciones de hasta 950 mg l-1 [22].

O HO

Figura 8. cido srbico (E200).

10

El cido benzoico se ha descrito como inhibidor de Brettanomyces/Dekkera para dosis comprendidas entre 100 y 200 mg/l en funcin de la especie en bebidas refrescantes [23]. 6. Conclusiones El control de Brettanomyces en vinos pasa por el establecimiento y mantenimiento oportunos de medidas higinicas, una rpida deteccin poblacional de esta levadura especialmente durante la crianza, y el tratamiento de los vinos afectados antes de que comience la produccin de etilfenoles. Los tratamientos fisicoqumicos, especialmente la filtracin, son adecuados para vinos de alta calidad, y las flash pasterizaciones para elaboraciones ms tipo estndar de vinos de mesa. Es aconsejable mantener los niveles de sulfuroso molecular entre 0,5 y 0,8 mg l-1 durante el proceso de elaboracin. Aunque el DMDC constituye una alterantiva interesante cuando se aplica previamente al embotellado.

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