Extrao e purificao de plasmdeos

Introduo Os plasmdeos em procariotos, ou epissomos em eucariotos, so molculas de DNA circular com capacidade de replicao independente e estvel, mantendo seu nmero constante atravs de vrias geraes, no estado no integrado ao cromossomo do hospedeiro. Os plasmdeos estringentes ocorrem em pequeno nmero de cpias por clulas, enquanto os relaxados em grande nmero de cpias por clula. Apesar de no serem indispensveis vida das clulas, em determinadas situaes os plasmdeos podem conferir-lhes propriedades essenciais sobrevivncia. Eles so responsveis por inmeros casos de resistncia mltipla a drogas em bactrias e pela estabilidade de importantes microorganismos utilizados na indstria. Genes plasmidiais controlam a codificao de importantes enzimas envolvidas em diferentes etapas da industrializao do leite e do vinho. Os plasmdeos so dependentes da DNA-polimerase ( que duplica o DNA ), da RNApolimerase (que copia as informaes contidas no DNA ) e da maquinaria de traduo ( sntese de protenas ) da clula hospedeira . Devido a sua habilidade de replicao independente e recombinao gnica os plasmdeos so amplamente utilizados em estudos de engenharia gentica e biologia molecular como vetores de genes e/ou fragmentos de DNA dos quais se queira saber as sequncias de bases ou as sequncias de aminocidos. Ao ser inserido no plasmdeo o fragmento passa tambm se replicar seguindo as divises celulares e com isso aumentando exponencialmente seu nmero, fornecendo material suficente para expresso, sequenciamento e manipulao gnica do frgmento. As tcnicas de DNA recombinante permitem a construo de plasmdeos artificiais, nos quais sabe-se exatamente onde se liga o fragmento de interesse. Esses plasmdeos artificiais so usados, por exemplo, para a produo de insulina em bactrias. Por todas estas vantagem a utilizao de plasmdeos de grande interesse. Entretanto para seu uso estes devem ser isolados das clulas hospedeiras. Neste sentido vrias tcnicas especficas para extrao e purificao DNAs plasmidiais foram desenvolvidas.

Durante as aulas prticas foi realizada a extrao de plasmdeos de bactrias ( previamente incubadas para seu crescimento e, consequentemente, aumento do nmero de plasmdeos ) atravs do mtodo de Lise Alcalina, utilizando para tanto o Kit Promega Wizard Minipreps DNA Purification System seguindo o protocolo descrito abaixo: Centrifugar a cultura de clulas em tubos eppendorf de 1,5mL por quatro minutos a 13000 rpm (rotaes por minuto ). Retirar o sobrenadante de modo que apenas a massa de clulas fique no tubo. Ressuspender em 150L do meio 1 e aguardar 5min. O EDTA possui ao quelante aprisionando os ons Ca2+ e Mg2+ o que desestabiliza a membrana celular e promove o inchamento da clula pela entrada de glicose, o Tris funciona como um tampo, Rnase A degrada todo o RNA, impedindo que este possa prejudicar a extrao. Adicionar 150L de soluo 2 de lise e homogeneizar por 5min. O SDS um detergente aninico que promove uma ruptura das ligaes covalentes da membrana e uma retirada de lpides havendo a formao de pequenos poros que permitem a passagem dos plasmdeos para fora da clula sem que saia o DNA cromossomal, o NaOH aumenta o pH o que desestrutura a membrana auxiliando na formao dos poros. Adicionar 150L de soluo de neutralizao e homogeneizar por 4 min. O Acetato de Potssio ir retirar as protenas que envolvem o plasmdeo e voltar com o pH para prximo de 8, impedindo que a soluo dois quebre as ligaes covalentes do plasmdeo. Centrifugar e retirar o sobrenadante. Os vestgios de clula ficaro retidos no pellet. Adicionar 10L de resina e homogeneizar por dez minutos. Durante a homogeneizao o sobrenadante se difunde pela resina. Transportar a mistura para uma coluna aclopada bomba de vcuo. Com a aplicao do vcuo o DNA se precipita na resina ficando retido nesta. Adicionar 2,5mL de etanol 80% na coluna. Retiramos assim o resto das solues. Centrifugar por 20 seg a 14000 rpm. Durante o spin todo o lquido extrado da coluna. Transporta a coluna para um novo eppendorf e adicionar 50L de ddH2O a 70C. Com isso o DNA resolubilizado. Centrifugar por 4 min a 13000 rpm. O DNA resolubilizado pode ento passar pela resina e ficar retido no eppendorf.

Posteriormente o produto da purificao foi corrido em gel de agarose 1% para a verificao do rendimento do protocolo. O gel foi feito utilizando-se 40mL de tampo TAE 0,5x e 0,4g de agarose. Os dois compostos so misturados em um Elenmeyer e posteriormente aquecidos para que haja uma homogeneizao mais eficiente. Depois de resfriada adicionado 0,5L de brometo de etdeo ( este composto se intercala entre as fitas de DNA e durante a emisso de luz ultravioleta este fluoresce indicando a posio da amostra no gel ) e a soluo transportada para uma cama onde o gel se polimeriza. Para a corrida 2L da amostra junto a 5L de tampo 1 so aplicados na canaleta ( o tampo da amostra mais denso do que aquele utilizado na corrida, isso impede que a amostra se dilua e saia da canaleta ). Em uma outra canaleta aplicado um pool de DNA ( marcador de peso molecular ) que indicar o tamanho aproximado dos fragmentos da amostra, uma vez que o tamanho dos fragmentos deste pool j so conhecidos. O tamanho das bandas da amostra pode ser comparado com as bandas do pool j que o gel forma uma malha que faz os fragmentos migrar de acordo com o tamanho e com a conformao, fig 01. Fragmentos menores ou mais compactados migram com maior facilidade do que fragmentos maiores ou menos compactados. Para que o DNA migre aplicada uma corrente eltrica, ele migrar para o polo positivo, j que carregado negativamente ( graas ao grupo fosfato ). A eletroforese feita a 100volts e aproximadamente 40 miliamperes, durante 20 min.

Resultados e discusso Aps a irradiao do gel com luz ultravioleta pode-se visualizar trs bandas distintas. A banda que correu de forma mais lenta Mais prxima canaleta ) correspondendo ao plasmdeo linearizado, a do meio ao plasmdeo circular relaxado e a banda que correu mais rapidamente ( mais distante da canaleta ) correspondendo ao plasmdeo super-espiralado ou super-coiled, pois este passa com maior facilidade entre as malhas do gel, fig 01. Comparando a distncia percorrida pela amostra com o DNA padro, pode-se estimar o nmero de pares de base da amostra. A intensidade da banda comparada com a de um outro DNA previamente quantificado pode indicar a quantidade de material obtido na extrao. Analisando os resultados obtidos pde-se observar que a quantidade e o tipo de material obtidos foram satisfatrios, indicando sucesso dos procedimentos realizados.

1Kb

Plasmdeo relaxado Plasmdeo linearizado Super coiled

Fig. 01: Resultado da purificao do DNA plasmidial

3054pb 2036pb 1636pb 516pb

Conjugao bacteriana

Introduo As alteraes genticas podem ser resultados de vrios processos, os quais so conhecidos como mutao, recombinao, transposio e rearranjos cromossmicos. A mutao pode ser definida como um evento que d origem a alteraes quantitativas ou qualitativas no material gentico. Uma vez que o DNA uma molcula relativamente estvel as mutaes so fenmenos raros. As mutaes bacterianas espontneas incidem em taxas de 10 -6 a 10-10 por gerao por nucleotdeo, por isso as mutaes so induzidas em laboratrio para serem estudadas. Existem trs processos de troca de material gnico ( no necessariamente relacionados com reproduo ) conhecidos em bactrias: transformao, transduo e conjugao. A transformao foi estudada primeiramente por Griffith, em 1928, quando inoculou em uma populao de camundongos uma mistura de pseudococos vivos e lisos, e em outra pseudococos mortos porm encapsulados. O resultado obtido foi que em ambas as inoculaes no houve morte dos camundongos, entretanto quando se inoculava na mesma populao pseudococos vivos e lisos e pseudococos mortos encapsulados, havia uma alta taxa de mortalidade. Era sabido que estas bactrias quando vivas e encapsuladas so letais ao serem inoculadas em camundongos, com isso pde-se inferir, mais tarde, que as bactrias vivas lisas capturavam o DNA das bactrias mortas o inseria em seu genoma e adquiriam a capacidade de produzir cpsula se tornando patognicas. A este fenmeno de insero de material gentico, ao genoma pr existente, denominou-se transformao ( as bactrias no patognicas foram transformadas em patognicas ). Embora Griffith no conhecesse o DNA seus estudos foram e ainda so de grande relevncia.

A transduo foi descrita por Zinder e Lederberg, em 1952, ao estudarem conjugao entre espcies de Salmonella. Utilizando bactrias resistentes, bactrias no resistentes a determinadas drogas, bacteriofagos, e observando a aquisio de resistncia pelas bactrias no resistentes, eles observaram que fagos podem incorporar parte do genoma de uma bactria hospedeira e transport-lo para outra e desta forma capacitar as mesmas a resistirem a determinadas alteraes e composies do meio. A conjugao bacteriana foi observada por Lederberg e Tatum, em 1946. Combinando duas amostras auxotrficas de Escherichia coli e encubando as duas juntas verificaram que, algumas colnias haviam adquirido a capacidade de se desenvolver em meio mnimo. Concluram que teria havido uma complementao ou aquisio de algum elemento que tornava as bactrias antes auxotrficas em prototrficas. Este elemento foi denominado Fator F. Hoje se sabe que o Fator F um plasmdeo conjugativo e que somente clulas F+ podem atuar como doadoras para clulas receptoras ou F-, desta forma o processo de conjugao depende do Fator F, tambm denominado epissoma. Os epissomas so peas de DNA ligadas membrana citoplasmtica, podem replicar de forma autnoma ou integrar ao DNA cromossomal replicando com ele. A clula doadora forma uma ponte protica denominada Pili, a qual se liga na clula receptora estabelecendo contato citoplasmtico entre as duas clulas. H uma ruptura do plasmdeo conjugativo que se lineariza e inicia sua duplicao permitindo que o novo plasmdeo formado possa ser transportado atravs do Pili para a clula receptora.

Material e mtodos Foram utilizadas duas linhagens de E. coli, previamente incubadas em caldo nutriente a 37C por 24 horas, as quais eram resistentes a antibiticos diferentes: BH100 ( Lac+, resistente ampicilina, canamicina, mercrio , clorofenol e tetraciclina ) K12 ( Lac-, resistente estreptomicina ) Ambas as cepas foram submetidas individualmente aos mesmos tratamentos descritos abaixo ( para o repique foi utilizado um basto de platina ): gar EMB ( controle positivo ) gar EMB- soluo estoque de estreptomicina 200ng/mL gar EMB- soluo estoque de tetraciclina 20ng/mL gar EMB- soluo estoque de estreptomicina 200ng/mL, soluo estoque de tetraciclina 20ng/mL De uma cultura de 0,2mL de BH100 com 0,8mL de K12, inoculadas em 2mL de caldo nutriente incubadas a 37C por 24 horas, foi retirada uma alquota de 0,1mL. A alquota foi ento semeada, com o auxilio de um basto de vidro, em uma placa de gar EMB - soluo estoque de estreptomicina 200ng/mL, soluo estoque de tetraciclina 20ng/mL e incubada junto s demais a 37C por 24 horas.

BH 100

K12

Resultados Nos meios onde as diferentes linhagens de E. coli foram semeadas observamos crescimentos e aspectos diferenciados, como esquematizados na tabela 01:

Tabela 01: Resultado da encubao das duas linhagens de E. coli em diferentes meios E. coli BH100 E. coli K12 EMB Colnias verdes brilhantes Colnias EMB Sm No houve crescimento Colnias EMB Tc Colnias verdes brilhantes No houve crescimento EMB Sm - Tc No houve crescimento No houve crescimento

transparentes transparentes Sm estreptomicina, Tc tetraciclina

No meio onde as linhagens foram semeadas juntas houve o crescimento de colnias transparentes.

Discusso EMB um meio rico, ou seja, contm todos os nutrientes necessrios para o crescimento das colnias bacterianas, servindo assim como controle positivo. A cor verde brilhante apresentada pelas colnias de E. coli BH100 indica que estas bactrias utilizam a lactose como fonte de carbono, ou seja, so Lac+ ao contrrio da linhagem K12 que se mostraram transparentes, Lac-. O fato da linhagem BH100 no crescer em meio com estreptomicina indica que estas bactrias no so resistentes a este antibitico, entretanto, seu crescimento em meio com tetraciclina indica resistncia ao mesmo. A linhagem K12 no foi capaz de crescer em meio com tetraciclina crescendo, entretanto, em meio com estreptomicina indicando uma resistncia a este ltimo antibitico. Na placa onde as linhagens foram semeadas juntas, as colnias apresentaram o aspecto da linhagem K12, transparentes. O fato destas bactrias terem crescido em meio com tetraciclina indica que elas adquiriram a capacidade de resistncia a este antibitico. Esta capacidade pode ter sido adquirida atravs de conjugao entre as duas linhagens de modo que K12 foi a linhagem

receptora, uma vez que passou a apresentar uma nova caracterstica, e BH100 a doadora, j que esta possua a caracterstica adquirida pela outra linhagem. Atravs destes experimentos relativamente simples pode-se observar o fenmeno da conjugao em bactrias, ou seja a aquisio de material genmico, que foi evidenciada pela apario de uma nova caracterstica, resistncia a tetraciclina.

Mtodo de Boiling
Tem como principal vantagem a rapidez com que o DNA obtido, porm a quantidade extrada pouca, sendo a rentabilidade pior do que a lise alcalina. usado para a lise, das paredes bacterianas, um detergente no-inico lisozima e calor. Os vestgios de membrana e o DNA cromossomal se precipitam no fundo do tubo. Para a precipitao do plasmideo presente no sobrenadante utiliza-se isopropanol. O protocolo do mtodo est descrito abaixo: Inocular 5mL de meio LB esterilizado com uma nica colnia bacteriana. Incubar a 37C over nigth. Transferir 1,5mL de cultura saturada para um tubo eppendorf, centrifugar por 2min. As clulas iro se depositar no fundo do tubo. Descartar o sobrenadante. Concentrao das clulas.

Ressuspender as clulas em 300L de soluo STET contendo 200g de lisozima. Agitar no vortex at a homogeneizao completa. A lisozima ir desestruturar a membrana celular, por isso quanto mais expostas as clulas maior a eficincia do processo. Transferir o tubo par o gelo por 10min e depois em gua fervente por 2min. O detergente e o choque trmico lisam a parede bacteriana permitindo a liberao dos plasmdeos mas no o cromossomo bacteriano que permanece ligado as clulas bacterianas. Centrifugar por 20 min. O sedimento contm restos bacterianos e o DNA cromossomico, o sobrenadante contm os plasmdeos e RNA. Transfirir o sobrenadante para um novo tubo sem transportar o sedimento. Misture o sobrenadante com 200L de isopropanol gelado. Incubar a -20C por 15 a 30 min. Centrifugar por 15min. O isopropanol gelado precipita DNA e RNA. Retirar o sobrenadante. Deixar o sedimento secar por alguns minutos. Ressuspender o sedimento em 50L de TE contendo 1g/L de Rnase. Degradao do RNA. Usar 5L para digesto com enzima de restrio. Liberao do inserto.

MAXI PREP
um mtodo utilizado para a extrao de material gnico de grandes quantidades de amostra. O resulta um material livre de contaminantes, porm requer o uso de Brometo de Etdio que altamente carcinognico e o uso de longas corridas em um aultra centrfuga para estabilizar o gradiente de densidade. A massa de clulas bacterianas lisadas misturada a ClCs ( promove o gradiente ) e EtBr sendo centrifugada at o equilbrio. Esse gradiente o principio bsico da tcnica, pois consegue isolar o DNA cromossomal do plasmdeo. O DNA cromossomal se liga ao agente intercalante ( Brometo de Etdio ) e diminui de densidade ficando na parte superior do gradiente enquanto o plasmdeo se mantm, por estar mais denso, na parte inferior do mesmo. Com o uso de uma seringa possvel coletar todo o plasmdeo extrado, fig

02. O EtBr removido passando o plasmdeo em uma coluna de troca de ctions e o ClCs removido por precipitao com o uso de etanol.

DNA cromossomal

Plasmdeo

Fig 02: Coleta do DNA plasmidial de um gradiente de Cloreto de Csio

PEG ( Polietileno glicol )

PEG precipitao um mtodo rpido, adequado e conveniente para purificao de plasmdeo. Pode ser interrompido em qualquer passo sem que o DNA plasmidial seja afetado. No h necessidade do uso de ultracentrfuga nem de Brometo de Etdio. RNA e DNA cromossomal so removidos do pellet por resuspenso com RNase, NaOH/SDS e acetato de potssio. O plasmdeo extrado do sobrenadante e precipitado com PEG. um mtodo para a

preparao de plasmdeos utilizados em procedimentos que necessitem de plasmdeos livres de qualquer contaminante.