Bioqumica II

Extraccin y cuantificacin de protena total y albmina

Facultad de Medicina, Universidad San Sebastin

Docente: - Estela Prez Integrantes: - Luis F. Concha Manrquez - Daniel Coria Guzmn - Pablo Gysling Merino Grupo B 16/11/2012

INDICE

1. Resumen.... pg. 2 2. Introduccin y objetivos... pg. 3 3. Mtodos...... pg. 4 4. Significado de los resultados anormales . pg. 5 5. Paso experimental.. ... pg. 6 6. Resultados... pg. 7-8 7. Discusin...... pg. 9 8. Conclusin... pg. 10 9. Bibliografa.. pag. 11

1. Resumen:
Las protenas son molculas formadas a partir de secuencias aminoacdicas. Estas son un componente fundamental para el correcto funcionamiento del organismo y sus actividades. Dentro de las diferentes funciones que tiene las protenas en el organismo se destacan algunas como: funciones enzimticas, energticas, de transporte, inmunolgicas, estructurales y contrctiles. Por esta polifuncionalidad que tienen las protenas para los organismos, podemos afirmar que son esenciales en el metabolismo, crecimiento y desarrollo celular. La falta de protenas tiene como consecuencia un grupo de diversos problemas, como lo pueden ser una hepatitis, que por ejemplo, tiene un pronstico positivo si es diagnosticada a tiempo y puede ser tratable. Por otro lado, hay enfermedades en que no tienen cura es decir, son irreversibles ante cualquier tipo de tratamiento. Por ejemplo , la anemia falciforme en la cual una protena encargada del transporte de oxgeno (hemoglobina) posee una estructura alterada la cual no le permite transportar el oxgeno de forma eficiente, generando as problemas a las personas que padecen esta mutacin, sin embargo, a pesar de la baja eficiencia en el transporte de oxgeno, la hemoglobina en la anemia falciforme tiene una actividad importante en la supervivencia en pases donde hay alta incidencia de malaria, ya que la forma de la protena a su vez no permite el alojamiento de la enfermedad. Entonces, al determinar la ausencia o presencia de ciertas protenas en individuos problema, se puede determinar la incidencia de diversas patologas por mutaciones genticas, o por infecciones, entre otros. En este trabajo prctico se determin la concentracin de protena total de una muestra problema con el mtodo de biuret, el cual se caracteriza por una reaccin de los enlaces peptdicos en un medio alcalino con sulfato de cobre para formar un compuesto coloreado estable por cierto tiempo para la determinacin de concentracin por espectrofotometra. En el segundo experimento se determin la concentracin de albmina (protena principal del plasma sanguneo) presente en un muestra problema. En este caso utilizamos el mtodo del verde bromo cresol, el cual hace que la protena se una a un compuesto coloreado con el que es posible determinar la concentracin de la protena por espectrofotometra. El rango normal de protena total oscila entre 6.0 a 8.0 gm/dL

2. Introduccin:
El examen de protena total consiste en medir cantidad total de dos clases de protenas: albmina y globulina. Ambas se encuentran en la porcin liquida de la sangre. Como se nombro anteriormente, la albmina es la principal protena de la sangre, y una de las ms abundantes en el ser humano. Es sintetizada en el hgado y est constituida por 585 aminocidos con 17 puentes disulfuro entrecruzados en su molcula, y tiene un peso molecular de 67.000 Dalton. Cabe mencionar que posee carga negativa.

Existen diferentes tipos de Albuminas: Seroalbmina: Es la protena del suero sanguneo. Ovoalbmina: Es la albmina de la clara del huevo. Lactoalbmina: Es la albmina de la leche.

La concentracin normal de albmina en la sangre humana flucta entre 3,5 y 5,0 g/dL. Constituyendo esta un 54,31% de la protena plasmtica. El resto de protenas presentes en el plasma se llaman en conjunto globulinas. Esta protena es esencial en la correcta distribucin de los fluidos corporales entre el sistema vascular (Vasos sanguneos) y el extravascular. Por esto, la disminucin de esta traer como consecuencia el desplazamiento del lquido intravascular hacia afuera, invadiendo el espacio tisular generando hinchazn en los individuos. Dentro de las funciones que posee la albmina dentro del organismo se destaca su papel en el control del pH y es utilizada por el mismo organismo como molcula transportadora. Se ha observado que la albumina puede transportar vitaminas, bilirrubina, lpidos, hormonas, etc. En cambio, las globulinas constituyen el 46% restante de las protenas del plasma sanguneo. Se caracterizan por ser un grupo de protenas solubles en agua presentes en animales y vegetales. Se dividen en tres grupos de acuerdo a su funcin en el organismo: alfa, beta y gammaglobulinas, estas ltimas constituyen ciertos anticuerpos. (Sistema inmunitario). Niveles normales de globulinas en el plasma: 2.0 a 3.5 g/dL.

3. Mtodo
Para este trabajo experimental se utilizo el mtodo de reaccin de Biuret, en el cual los enlaces peptdicos de la protena reaccionan con el reactivo a pH bsico para formar un complejo colorido azul-violeta. Este complejo azulvioleta es directamente proporcional a la concentracin de protena presente en las muestras a estudiar en el ensayo.

La protena de la muestra de plasma sanguneo reacciona con el cobre del reactivo de Biuret causando un aumento en la absorbancia. Esto siempre teniendo un medio alcalino para realizar esta reaccin. Esta reaccin se realiza en exmenes para as poder diagnosticar enfermedades que involucren a los riones y al mismo hgado.

Previo a su utilizacin, el reactivo biuret debe ser preparado en base a los siguientes elementos: 1. Tartrato de sodio y potasio....70mM 2 .Sulfato de cobre II 15mM 3. Hidrxido de sodio.. 200mM 4. Ioduro de potasio.. 10mM 5 . Surfactantes y preservantes El producto final debe ser claro, si este es turbio debe repetirse la preparacin.

4. Significado de los resultados anormales:

Los niveles superiores a los niveles normales pueden deberse a:

Inflamacin o infeccin crnica, incluyendo VIH y hepatitis B o C Mieloma mltiple Enfermedad de Waldenstrom

Los niveles inferiores a los normales pueden deberse a:

Agamaglobulinemia Hemorragia Quemaduras Glomerulonefritis Enfermedad heptica Malabsorcin Desnutricin Sndrome nefrtico Enteropata por prdida de protena

Las mediciones de protenas totales se pueden incrementar durante el embarazo. Con respecto la medicin de albumina en el plasma sanguneo, el fundamento se basa en la unin de albmina a colorantes o marcadores (en nuestro caso al verde de bromo cresol). El aumento de color es proporcional a la concentracin de Albumina presente. Los rangos normales son 3.5 a 5.0 g/dL Los niveles inferiores de lo normal indican:

Enfermedades renales. Enfermedad heptica (por ejemplo, hepatitis, cirrosis o ascitis).

5. Paso experimental:

EXPERIMENTO N1: DETERMINACIN DE PROTEINA TOTAL Se preparo 3 soluciones, la primera, solucin blanco con 1000 l de reactivo (RGT), la segunda, muestra estndar con 1000 l de reactivo (RGT) y 20 l de estndar (STD) y la tercera, muestra problema con 1000 l de reactivo (RGT) y 20 l de muestra (las pipetas deben estar limpias y libres de residuos para evitar la contaminacin de las soluciones). Como se muestra en la tabla N1: Blanco 1000 l RGT ------------Estndar 1000 l RGT 20 l STD ------Muestra 1000 l RGT ------20 l muestra

Luego de preparadas las soluciones, se incub durante 10 minutos a temperatura ambiente (20 a 25 C) y finalmente se ley la absorbancia a 540 nm, llevando a cero el espectrofotmetro con el blanco de reactivo.

EXPERIMENTO N2: DETERMINACIN DE ALBUMINA Al igual que en el ensayo anterior, se prepar 3 soluciones de la forma como se presenta en la tabla N2: Blanco 1000 l RGT ------------Estndar 1000 l RGT 20 l STD ------Muestra 1000 l RGT ------20 l muestra

Posteriormente se incub durante 10 minutos a temperatura ambiente (20 a 25 C) y luego se midi la absorbancia a 540 nm, llevando a cero el espectrofotmetro con el blanco de reactivo.

6. Resultados:

EXPERIMENTO N1: PROTEINAS TOTAL

Absorbancia protena total

Blanco Estndar Muestra Clculos:

0 0,553 0,301

Concentracin

8 x (abs muestra abs blanco) [g/dL] (abs STD abs blanco)

8 x (0,301 - 0) [g/dL] (0,553 0)

4,354 g/dL

Observaciones: Se observ diferencias de color entre las sustancias: Muestra Blanco Estndar color lila color celeste color morado

Los colores se potenciaron levemente luego de los 10 minutos de incubacin.

EXPERIMENTO N2: ALBUMINA

Absorbancia albumina

Blanco Estndar Muestra

0 0,376 0,129

Clculos: 8 x (abs muestra abs blanco) (g/dL) (abs STD abs blanco)

Concentracin:

8 x (0,129 0) (g/dL) (0,376 0)

2,745 g/dL

Observaciones: Se observaron diferencias de color entre las sustancias: Muestra color morado Blanco color celeste Estndar color morado Los colores se acentuaron luego de los 10 minutos de incubacin.

7. Discusin: En el presente paso prctico se observ un nivel de protena total de 4,35 d/dL, o que se traducen en un bajo nivel de concentracin protica a nivel de plasma sanguneo respecto a los niveles normales de 6.0 a 8.0 g/dL en adultos. Por lo tanto se puede asumir que nos encontramos frente a un paciente con posible patologa heptica, desnutricin, sndrome nefrtico o enteropata por mala absorcin. Sin embargo, no tan solo la protena total nos dir de qu patologa se trata, sino que se necesitar de exmenes an ms precisos los cuales determinen la cantidad concreta de protenas especficas para asegurar dnde se presenta la patologa. En base al segundo ensayo, se observa que la concentracin de albmina corresponde a 2,74 g/dL, por lo que se asume que el individuo problema est en una condicin patolgica de dficit de albmina y de protenas totales. El dficit de esta protena observado en el ensayo refleja la posibilidad de enfermedad renal o heptica, como tambin puede ser producto de problemas de absorcin de nutrientes a nivel entrico. Por ejemplo, enfermedad de Whipple, luego de una ciruga para reducir peso, cambio dietario por dietas bajas en protenas, entre otros.

8. Conclusin: Para finalizar, es posible concluir que los objetivos clave del presente paso prctico fueron cumplidos exitosamente, permitiendo establecer los niveles de concentracin proteica total y de albmina en un individuo problema. Al mismo tiempo, permite internalizar una de las metodologas utilizadas en la determinacin de las protenas en solucin, para su posterior anlisis respecto a los niveles normales de stas y as determinar el estado de salud del individuo problema. Gracias a los resultados obtenidos, y la investigacin de los significados patolgicos de los niveles anormales para las variables en estudio, se pudo deducir la naturaleza de los resultados obtenidos para el individuo estudiado.

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9. Bibliografa: 1. Bazari H. Approach to the patient with renal disease. In: Goldman L, Ausiello D, eds. Cecil Medicine. 23rd ed. Philadelphia, Pa: Saunders Elsevier; 2007:chap 115. 2. Riegler, E., A Colorimetric Method for the Determination of Plasma Albumin, Z. Anal. Chem. 53, 242 (1914). 3. Tricot G. Multiple myeloma. In: Hoffman R, Benz EJ Jr, Shattil SJ, et al, eds. Hoffman Hematology: Basic Principles and Practice. 5th ed. Philadelphia, Pa: Churchill Livingstone Elsevier; 2008:chap 87. 4. 5. http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/article/003544.htm 6. http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/article/003483.htm

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