0604_Diluciones seriadas

Hay muchas situaciones en que las cantidades de microorganismos en las muestras son tan elevadas que el recuento se hace imposible. En esas situaciones se utiliza la muestra directamente (si es una suspensin en medio lquido) o una disolucin preparada con un peso conocido de la misma (si es slida) como solucin madre y a partir de ella se realizan diluciones seriadas. Cmo se preparan las diluciones seriadas? Consiste en realizar diluciones seriadas de la muestra en condiciones de esterilidad con objeto de sembrar despus cantidades conocidas de la misma en placas Petri. Evidentemente alguna de las diluciones ser tal que al distribuir una parte de ella en la placa originar colonias separadas. De igual manera, conocidos el nmero de colonias, la cantidad sembrada y la dilucin correspondiente, esta tcnica permite evaluar el nmero de grmenes viables en la muestra original. Por lo tanto, es una tcnica que sirve para dos propsitos distintos, aislamiento y obtencin de cultivos puros y recuento de microorganismos. El lquido en el que se hacen las diluciones puede ser un caldo de cultivo, en cuyo caso se incuban directamente los tubos. o un simple diluyente que no interfiera con la poblacin microbiana de la muestra, ni comprometiendo su viabilidad, ni fomentando su proliferacin. En este caso, las diluciones debern ser sembradas en medios de cultivo e incubadas. Los diluyentes de uso ms generalizado son: Agua de pepona tamponada (BPW), solucin salina isotnica y caldo de triptona-sal.

Obtencin de las diluciones seriadas

Recomendaciones previas Se deben preparar con antelacin las series de tubos (uno por cada dilucin y serie) con 9 ml cada uno de diluyente o caldo. Se tapan, as ser posible, con tapones de colores siguiendo un cdigo de correspondencia color/dilucin previamente establecido. Esto dificultar que se confundan las diluciones durante el proceso de dilucin y siembra. Se esterilizan todos los tubos en autoclave. Se coloca todo el material que se va a necesitar sobre la mesa de trabajo de forma que se pueda alcanzar fcilmente. Al trabajar con pipetas, es preferible disponer de una automtica y cambiar la punta despus de cada dilucin realizada. Las precauciones en el manejo de pipetas consiten en no tocar la punta con las manos, poner cuidado de que el extremo no toque ningn objeto, ropa o la propia mesa de trabajo, y no dejar descansar la pipeta sobre esta. Las mismas precauciones se aplican a las pipetas de vidrio convencionales y al manejo de los tapones de los tubos. Procedimiento

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1. Tomar con la pipeta en condiciones aspticas 1 ml de la dilucin madre y

transferirlo al primer tubo de la serie, flameando la boca del tubo despus de retirar el tapn y antes de reponerlo. Este primer tubo tiene ahora una dilucin 1/10 (o 10-1) de la dilucin madre. Siguiendo la tcnica asptica habitual los tapones han de mantenerse en la mano y no deben dejarse sobre la mesa durante la operacin. 2. Expulsar la punta de la pipeta en el lugar para material contaminado e insertar otra punta estril, o bien coger una nueva pipeta estril de vidrio o plstico.

3. Agitar bien el tubo con la primera dilucin hacindolo girar entre las palmas de
las manos y transferir 1 ml de esta primera dilucin al segundo tubo de la serie, con lo que resultar la dilucin 1/100 (o 10-2). 4. Repetir los puntos 2 y 3 tantas veces como sea necesario. Por este procedimiento se han obtenido las diluciones 1/10, 1/100, 1/1000, etc. El denominador de estas fracciones recibe el nombre de factor de dilucin. Es posible realizar series de diluciones cuyos factores no sean precisamente los indicados y que no tienen que ser necesariamente decimales. Por ejemplo, podramos generar diluciones "al medio" (1:2), y obtener una serie de soluciones relacionadas por ejemplo por un factor de dilucin 2, es decir 1/2; 1/4; 1/8; 1/16; 1/32 etc. De cualquier modo, las ms utilizadas en microbiologa son las series de diluciones decimales porque facilitan mucho las labores de recuento. Tambin se puede deducir el nmero de tubos empleados para alcanzar un factor de dilucin determinado utilizando un volumen mayor de 9ml de diluyente (vase ejemplo siguiente). En el siguiente esquema se muestra un protocolo en el que se aplican diluciones seriadas y se sealan los factores de dilucin alcanzados en cada caso.

Siembra de las dilucionses

Procedimiento 1. La siembra se puede realizar en placas Petri por extensin o por inclusin segn la tcnica habitual en cada caso. Si las diluciones se hicieron usando como diluyente un caldo (por ejemplo caldo nutritivo o caldo de triptona-soja) se incubaran directamente los tubos en la estufa. En la transferencia de las diluciones a las placas es posible emplear tan slo una pipeta o punta si se comienza por la dilucin del factor de dilucin ms alto (la ms diluida). En caso contrario habr que emplear una pipeta para cada dilucin. 2. Incubar las placas a la temperatura necesaria, siempre en posicin invertida. 3. Despus del perodo de incubacin examinar las placas, las colonias aparecern sobre la superficie del agar. Cada colonia representa los descendientes de una bacteria o, lo que es ms correcto, de una unidad formadora de colonias (UFC). Resultados

1. Si el objetivo es un aislamiento. Una vez que dispongamos de colonias

aisladas, es preciso cerciorarse de que cada una representa un nico tipo de microorganismos. Para ello realizaremos un examen macroscpico de la colonia, una tincin e incluso un agotamiento por estras de la propia colonia

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sobre una nueva placa Petri. Verificada as la pureza de la colonia, procederemos a aplicar las tcnicas correspondientes para su conservacin y posterior estudio.

2. Si el objetivo es realizar un recuento. Se cuentan las placas que presenten un

nmero entre 30 y 300. Un nmero menor de 30 no se considera representativo por motivos estadsticos. Por otro lado, un nmero mayor de 300 puede ser excesivo para poder contar con precisin. o Con los datos obtenidos se calcula el nmero de unidades formadoras de colonias (UFC) iniciales mediante la frmula: UFC/ml = n colonias x factor de dilucin / ml sembrados en placa o Es necesario indicar que no se estn contabilizando las bacterias totales, sino slo de las que desarrollan una colonia en las condiciones de cultivo. Tampoco es un recuento de bacterias individuales puesto que una colonia aislada tambin la forman determinadas agrupaciones de bacterias como los diplococos o los estafilococos. o El nmero de UFC se expresa en UFC/ml en muestras lquidas y UFC/g de muestra si es slida. o En ocasiones puede ocurrir que no crezca ninguna colonia en las placas. En ese caso no existe seguridad de que en la muestra problema no hubiera bacterias, por lo que el resultado no se debe expresar como ausencia total o cero UFC/ml o g. Hay que tener en cuenta la dilucin ms baja que se sembr y expresar el resultado indicando que hay menos UFC en la muestra que las necesarias para que aparecieran colonias en esa dilucin. Por ejemplo, si se hace una serie de diluciones decimales y se siembran placas de las 3 diluciones, 10-2, 10-4 y 10-6 y tras la incubacin en ninguna de las placas hay crecimiento, la expresin de resultados sera <100 UFC/ml o g. o Otro caso distinto es que no aparezcan colonias cuando se siembran muestras que han sido sometidas a un preenriquecimiento de un determinado microorganismo. En ese caso, lo que busca el anlisis es confirmar la presencia o ausencia del mismo en la muestra. Un resultado negativo en los cultivos se debe expresar como ausencia en los ml o g que se sometieron a preenriquecimiento. Por ejemplo, si se pesan 25 g de carne y se someten a preenriquecimiento para analizar la presencia/ausencia de Salmonella, y tras sembrar e incubar en

medios selectivos no hay crecimiento, el resultado ser "Ausencia de Salmonella en 25g". o Al analizar los resultados de los recuentos, hay que tener en cuenta que las cifras significativas son las potencias de 10. La diferencia entre 1,78 x108 y 5,34x108 UFC/ml no se considera relevante porque siguen siendo "centenares de millones". Si se pasan las dos cifras a unidades logartmicas desaparece la diferencia (8,25 y 8,73). Lo verdaderamente significativo es pasar de una unidad logartmica a la siguiente, es decir, pasar por ejemplo de 'cientos de miles' a 'millones' de UFC/ml o g de muestra inicial. -oOo-

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