TCNICAS BSICAS DA MICROBIOLOGIA

DUAS OPERAES BSICAS EM MICROBIOLOGIA

ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS Separao de estirpes microbianas especficas a partir de populaes mistas (ex. amostras ambientais, amostras clnicas) CULTURA DE MICRORGANISMOS Crescimento de populaes de microrganismos em meios de cultura laboratoriais (usualmente, em cultura pura)

Tcnicas bsicas da Microbiologia

Preparao de meios de cultura Tcnicas de asspsia e de esterilizao Isolamento de culturas puras Manuteno de clulas viveis no laboratrio Microscopia

Preparao de meios de cultura

A composio de um dado meio de cultura est dependente da espcie que se pretende cultivar.
O conhecimento do habitat natural de um dado microrganismo muitas vezes til na seleco do meio de cultura adequado, j que as suas necessidades nutricionais reflectem esse mesmo habitat.

ELEMENTOS ESSENCIAIS Carbono (C)

(Elemento comum a todos os constituintes celulares ~ 50% do peso seco da clula)

Protenas, cidos nucleicos, polissacridos, lipidos

Oxignio (O)
(~ 20% do peso seco da clula)

Protenas, cidos nucleicos, polissacridos, lipidos Protenas, cidos nucleicos, coenzimas

Azoto (N)
(~ 14% do peso seco da clula)

Hidrognio (H)
(~ 8% do peso seco da clula)

Protenas, cidos nucleicos, polissacridos, lipidos Fosfolpidos, cidos nucleicos, ATP Protenas, coenzimas

Fsforo (P)
(~ 3% do peso seco da clula)

Enxofre (S)
(~ 1% do peso seco da clula)

CATEGORIAS NUTRICIONAIS DOS MICRORGANISMOS

Fontes de Carbono
- CO2 - Compostos orgnicos

Fontes de energia
Maior parte dos microrganismos usam um de trs tipos de fontes de energia

Chlorophyll or bacteriochlorophyll

Macronutrientes ( )
(In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)

Fig. 9.1

Macronutrientes Fontes de elementos principais

(In Brock Biology of Microorganisms, 10th edition, Prentice Hall)

(g/l)

(mg/l)

Micronutrientes ou elementos trao (g/l)

(In Brock Biology of Microorganisms, 10th edition, Prentice Hall)

Vitaminas factores de crescimento essenciais.

(In Brock Biology of Microorganisms, 10th edition, Prentice Hall)

 Meios de cultura sintticos ou definidos meios de cultura cuja composio qumica perfeitamente conhecida. Meios de cultura complexos - meios de cultura cuja composio exacta desconhecida. Podem ter como componentes diversos ingredientes, tais como Peptonas, Extracto de Levedura, Extracto de Carne, etc.

PEPTONAS Hidrolizados de protenas preparados por digesto proteolitica parcial de fontes proteicas (p.ex. extracto de carne, casena, soja, gelatina, etc.). Os aminocidos e pequenos pptidos resultantes servem como fonte de carbono (C), de energia e de azoto (N), para os microrganismos. EXTRACTO DE LEVEDURA (Yeast extract) Obtido a partir da lise de clulas de levedura da cerveja e hidrlise dos seusconstituintes. Fonte de vitaminas, compostos de Carbono (C), de azoto (N) e sais minerais.

Meios de cultura liquidos e slidos Agar

agente solidificante (polissacrido de alga marinha vermelha)

Meios selectivos e meios diferenciais

Os meios de cultura podem ser usados na seleco e crescimento de um determinado microrganismo ou na identificao de uma espcie em particular.

Meios selectivos
suprimem o crescimento de determinados microrganismos em benefcio de outros. (ver aula sobre cultura de enriquecimento)

Meios diferenciais
permitem a distino entre diferentes grupos de microrganismos com base na capacidade de metabolizar componentes especficos presentes no meio de cultura e/ou na morfologia (aparncia) das colnias. Permitem, por vezes, a identificao de microrganismos com base nas suas caractersticas fisiolgicas.

Microrganismos so ubquos (gua, ar, solo, corpo, etc.)

Solo

ar

lngua

(In J. Black, Microbiology, principles and exploration, 6th ed, J Wiley & Sons)

Figura mostra colnias de microrganismos (na superfcie de meio slido)

Pasteur Sec. XIX

. Refutao final da teoria da gerao expontnea . Desenvolvimento de tcnicas de esterilizao eficientes (pasteurizao)

(In Brock Biology of Microorganisms, 10th edition, Prentice Hall)

Crescimento microbiano em meio lquido turbidez

Esterilizao no Laboratrio
ESTERILIZAO Morte ou remoo de todos os organismos vivos, estruturas biolgicas e virus de um material, meio de cultura, etc. (in Brock Biology of Microorganisms)

CALOR

CALOR SECO - em estufa (160C/2horas; 180C/1 hora) - pouco eficiente - em desuso; s aplicvel a material de vidro ou outro resistente a temperaturas altas CALOR HMIDO na AUTOCLAVE

RADIAO Ultra- Violeta ( = 260 nm)

Limitada a superficies (p.ex. salas, pequenos compartimentos, superficie de utenslios (No penetra vidro, filmes sujos, gua, etc.)

FILTRAO

Esterilizao

na AUTOCLAVE por aco do calor hmido*

* Vapor de gua saturado, sob presso (1 bar) CONDIES DE ESTERILIZAO NA AUTOCLAVE 121C (presso: 1 bar) Durao depende de: Volume de material dentro da autoclave; Grau de contaminao do material a esterilizar (usual 15 min)

APLICADA A:
- Meios de cultura sem componentes termolbeis (p.ex. muitos aucares, aminocidos, vitaminas, no so estveis a 121C) - Materiais de plstico ou vidro
(In Brock Biology of Microorganisms, 10th edition, Prentice Hall)

- Descontaminao de materiais contaminados com clulas viveis

Esterilizao na autoclave

Porqu 121C, durante pelo menos 15 minutos?

Esporos bacterianos (endsporos) so as estruturas biolgicas mais resistentes ao calor

( a sua extrema resistncia que determina quais as condies de funcionamento da autoclave que asseguram uma esterilizao eficiente dos materiais) Bacillus sp. Clula vegetativa

Condies que causam a MORTE CELULAR: Levedura Bolor Bactria Vrus Clulas vegetativas 5 min a 50-60C 30 min a 62C 10 min a 60-70C 30 min a 60C Esporos 5 min a 70-80C 30 min a 80C 2-800 min a 100C ou 0,5-12 min a

Endsporo

121C
-

ENDSPOROS:
- Presentes na gua, solo, etc - Podem permanecer viveis durante muito tempo (dcadas; milhares/milhes(?) de anos encontrados em locais arqueolgicos, no intestino de abelha extinta preservada em ambar) - Algumas bactrias que os produzem so agentes de doenas graves (ex. Ttano, Botulismo)

TESTE QUE PODE SER USADO PARA VERIFICAR O FUNCIONAMENTO EFICIENTE DA AUTOCLAVE

(1) (2)

(Perry, Staley, Lorry, Microbial Life, Sinauer ed.)

Spore strip = Tira de papel esterilizada contendo sobre a superfcie endsporos de uma bactria (p.ex. do gnero Bacillus)

Esterilizao por filtrao

(In J. Black, Microbiology Fundamentals and Applications, J. Wiley and sons)

APLICADA A: Lquidos - Solues de compostos sensveis a temperaturas altas (p.ex. antibiticos, vitaminas, aminocidos, aucares podem sofrer alteraes, incluindo degradao, a 121C) - Meios de cultura liquidos com componentes termossensveis Gases

Esterilizao do AR por filtrao

Mscaras cirurgicas Rolhas de algodo nos frascos onde so cultivados microrganismos Sistemas usados para filtrar ar que entra em bioreactor Filtros HEPA (high-efficiency particulate air filters)
(eficcia de reteno de 99,99% para particulas de 0,3 g)

usados em: - cmaras de fluxo laminar de segurana biolgica - salas limpas

(In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)

Cmaras de Fluxo Laminar de Segurana Biolgica (vrios graus de conteno biolgica)

Segurana Biolgica (nvel de conteno 4)

(In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)

( In Microbiology today, vol 33, pag 18)

Transferncia de culturas de microrganismos - Tcnicas de asspsia Chama do bico de Bunsen

(Vizinhana da chama do bico de Bunsen oferece condies asspticas)

Ansa de repicagem
(filamento metlico)

(In Brock Biology of Microorganisms, 10th edition, Prentice Hall)

Isolamento de colnias em meio slido

A imobilizao das clulas num meio slido torna possvel a visualizao do crescimento em massas celulares homogneas e isoladas denominadas colnias.
Isolamento de colnias pela tcnica de RISCADO EM MEIO SLIDO

(In Brock Biology of Microorganisms, 10th edition, Prentice Hall)

Colnia cultura pura de um microrganismo

A cultura pura de um dado microrganismo uma cultura de clulas gentica e morfologicamente idnticas.

CRESCIMENTO MICROBIANO exponencial

(Inculo inicial num ponto da superfcie de meio de cultura slido)

...

1 gerao

2 gerao

3 gerao

...

Isolamento de colnias de microrganismos Tcnica de ESPALHAMENTO em meio slido

(In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)

Exemplo: Suspenso de solo em gua (Populao mista de microrganismos) Aps incubao T ambiente durante 24 h

COLNIAS COM MORFOLOGIAS DIFERENTES MICRORGANISMOS DIVERSOS (Noo de estirpe)

Morfologia de colnias

forma e tamanho dependem do microrganismo mas, tambm podem depender das condies ambientais,
tais como, quantidade de oxignio e nutrientes disponveis no meio de cultura, pH,etc..

(In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)

Robert KOCH (1876) primeiro cientista a definir CULTURA PURA e a isolar COLNIAS de bactrias em meios de cultura slidos.
R. Koch Microfotografia de bactrias provenientes de uma colnia isolada (confirmao de ser um nico tipo morfolgico)

Bacillus anthracis (desenhos de R. Koch, sec XIX)

(In Brock Biology of Microorganisms, 10th edition, Prentice Hall)

Isolamento de colnias e enumerao de Unidades Formadoras de Colnias (UFC) clulas viveis

Passo 1.

(p.ex. numa amostra de solo)

Solo populao mista - vrios trilies de clulas de microrganismos diversos

Suspenso de solo em gua (10g / 100 ml)

0,1 ml Passo 2.

Passo1. Diluies sucessivas da suspenso de solo (10-1 ou 1: 10; 10-2 ou 1: 100; 10-3 ou 1: 1000; 10-4 ou 1: 10000; ...)

Passo 3a

Passo 3b

Passo 4.
(In R. Maier, I L Pepper, C P Gerba, Environmental Microbiology, Academic Press)

Diluio

10-2

10-3

10-4

(In R. Maier, I L Pepper, C P Gerba, Environmental Microbiology, Academic Press)

50 colnias (diluio 10-3) N de colnias em cada placa de Petri est relacionado com o tamanho da POPULAO CULTIVVEL presente na amostra original de solo 50 x 10 x 103 UFC / ml suspenso de solo (A) 50 x 106 UFC / 100 ml de suspenso de solo /10 g de solo

Tipos morfolgicos diferentes das colnias em cada placa relacionado com a diversidade de microrganismos cultivveis presentes no solo.

Bactrias

Fungos miceliais (bolores)

CULTURA DE ENRIQUECIMENTO
Isolamento de microrganismos pouco abundantes e com requerimentos nutricionais especficos, a partir de populaes mistas
(p.ex. bactrias que so capazes de degradar benzoato, i.e. usam benzoato como fonte de C e energia).

(adaptado de Perry, Staley, Lory, Microbial Life, Sinauer ed.)

PRESSO SELECTIVA presena de fonte de C e energia nica (neste caso, benzoato)

Crescimento em meios de cultura selectivos 1) enriquecimento em meio liquido (nas bactrias em causa) 2) isolamento de colnias em meio slido

Outros exemplos: - Isolamento de bactrias que degradam um certo pesticida ou hidrocarbonetos do petrleo ou outros poluentes orgnicos do Ambiente.

LIMITAO DAS TCNICAS DE ISOLAMENTO DE COLNIAS

Clulas viveis, mas no cultivveis

Estima-se que que somente 1-10% dos microrganismos funcionais presentes nos ambientes naturais (p.ex solo, gua, amostras clnicas) so cultivveis em meios de cultura laboratoriais conhecidos

versus

vs
4.2 x 10
6

UFC de bactrias / g solo

Bactrias observveis numa amostra de solo (observao directa atravs de microscpio de fluorescncia)

UFC=CFU Unidades Formadoras de Colnias (Colony Forming Units)

4.2 x 10

10

Clulas totais / g solo

Diversidade microbiana no solo uma fonte importante para explorao biotecnolgica de NOVOS microrganismos, produtos e processos

(Prescott, Harley e Klein, Microbiology, 5th edition)

Explorao das potencialidades dos microrganismos no-cultivveis nos meios de cultura laboratoriais conhecidos
- Desenvolvimento de mtodos moleculares (no dependentes do cultivo) para pesquisa e identificao ( ex. Anlise de DNA, RNA, protenas) -Procura de novas frmulas para cultivo de microrganismos

Procura de microrganismos adequados para um processo industrial:

- a partir da Natureza / Ambiente (solo, gua, etc.)

- so frequentemente sujeitos a processos de melhoramento

(Engenharia Gentica; mutao)

Maximizar o rendimento do processo Novos produtos

Estirpes adequadas (estirpes selvagens, mutantes ou geneticamente manipuladas) so conservadas em colecces de culturas nacionais e internacionais
(por ex. Micoteca da Universidade do Minho, American Type Culture Collection ATCC, National Collection of Industrial Cultures - UK)

Manuteno de microrganismos viveis no Laboratrio e em Coleces de Culturas Vrias metodologias permitem a manuteno de culturas viveis, no contaminadas e inalteradas nas suas propriedades durante perodos de tempo mais ou menos longos, nomeadamente:
. Em rampas ou placas de Petri contendo meio slido
(viabilidade das clulas: dias ou semanas)

. Congelao
(clulas suspensas em meio de cultura + glicerol (anti-criognico) (viabilidade das clulas: anos)

- em Azoto lquido (-196C) - em Arcas congeladoras (-70C)

. Liofilizao
(liofilizao - desidratao das cluas por sublimao de gua congelada, sob vcuo) (viabilidade das clulas: anos; dcadas)