I Wydzia Lekarski II Wydzia Lekarski

16.02.2010/23.02.2010 18.02.2010

wiczenie 15
Wirusy DNA
I. Seminarium: Waciwoci oglne i patogeneza zakae wybranych wirusw DNA w powizaniu z ich chorobotwrczoci

II.

Do wykonania: 1. Izolacja wirusa z materia klinicznego (keratoconjunctivitis) w hodowli komrkowej 2. Diagnostyka mononukleozy zakanej odczyn monospot (wykrywanie przeciwcia heterofilnych nieswoista diagnostyka serologiczna) 3. Diagnostyka mononukleozy zakanej cig dalszy: wykrywanie przeciwcia przeciw antygenom VCA, EA i EBNA-1 wirusa EBV przy uyciu metody ELISA serologiczne odczyny swoiste 4. Diagnostyka serologiczna w przypadku reaktywacji zakaenia EBV 5. Odczyn ELISA w diagnostyce zakae parwowirusem B19 wykrywanie przeciwcia i antygenu wirusa w surowicy krwi 6. Odczyn immunoperoksydazowy w diagnostyce zakae adenowirusami

III.

Demonstracje: 1. Diagnostyka wirusowego zapalenia opon mzgowordzeniowych i mzgu zastosowanie metody multiplex-PCR. Sekwencje starterw, ukady kontrolne. 2. Identyfikacja typu wirusa na podstawie porwnania sekwencji nukleotydw z uyciem programu BLASTN

/dr n. med. Maciej Przybylski/

1. Izolacja wirusa z materiau klinicznego na hodowli komrkowej Opis przypadku: Do okulisty zgosia si 52-letnia kobieta uskarajca si na zaczerwienienie spojwek, zawienie, uczucie piasku pod powiekami. Objawy te pojawiy si u niej poprzedniego dnia. W badaniu przedmiotowym lekarz stwierdzi przekrwienie spojwek, zawienie oraz pojedyncze, punktowe, niecharakterystyczne ubytki nabonka rogwki. Pobrano wymaz ze spojwek. Materia poddano wstpnej obrbce typowej dla bada wirusologicznych. Do wykonania: (Uwaga: wszystkie czynnoci zwizane z hodowlami komrkowymi wykonujemy przy zachowaniu jalowoci) 1. Zla poywk wzrostow znad hodowli komrkowej (Vero hodowla komrek nabonkowych z nerki mapiej, wraliwa na zakaenie zarwno herpeswirusami jak i adenowirusami) 2. Ze stojcych na lodzie probwek z materiaem klinicznym umieszczonym w poywce utrzymujcej pobra 1 ml i przenie do probwki z hodowl 3. Obserwacja efektu cytopatycznego po 24 h (na jutrzejszym wiczeniu)

Do wykrywania antygenw wirusowych w zakaonej hodowli komrkowej mona stosowa odczyn immunoperoksydazowy, odczyn immunofluorescencji lub testy immunoenzymatyczne. 2. Diagnostyka serologiczna mononukleozy zakanej Opis przypadku (pacjent 1): Osiemnastoletni mczyzna zgosi si do lekarza z powodu blw garda, osabienia i wysokiej gorczki. W badaniu przedmiotowym lekarz stwierdzi powikszenie migdakw, powikszenie wzw chonnych szyi, bolesno palpacyjn wtroby oraz powikszenie ledziony. W obrazie krwi stwierdzono umiarkowan leukocytoz (12 500 leukocytw/mm3) oraz obecno limfocytw atypowych. Po rozpoznaniu wstpnym mononukleozy zakanej lekarz zdecydowa si na wykonanie serologicznych testw diagnostycznych, ktre potwierdziyby diagnoz wstpn.

Odczyn Monospot (wykrywanie przeciwcia heterofilnych): W przebiegu mononukleozy zakanej wzrost miana przeciwcia heterofilnych czsto wystpuje ju w pierwszym tygodniu od pojawienia si objaww klinicznych. Do wykrywania przeciwcia heterofilnych stosuje si testy aglutynacyjne z uyciem stabilizowanych krwinek baranich zawierajcych antygeny heterofilne (test Paula-Bunnela-Davidsohna - PBD) krwinek koskich (test monospot) lub lateksu opaszczonego antygenem heterofilnym (test MZ). . Do wykonania: Na szkiekach podstawowych sprawdzi reakcje surowic kontrolnych (dodatniej i ujemnej) z lateksem MZ. Nastpnie wykona waciwe badanie z surowic pacjenta.

3. Odczyn ELISA w diagnostyce mononukleozy zakanej poszukiwanie swoistych przeciwcia (c.d. punktu 2.) Wykrycie w surowicy swoistych przeciwcia skierowanych przeciw antygenom wirusa Epsteina-Barr stanowi potwierdzenie zakaenia. W odniesieniu do do objaww klinicznych, wynikw testw laboratoryjnych i wynikw testw nieswoistych (P-B-D, test lateksowy MZ, monospot) uatwia postawienie jednoznacznej diagnozy mononukleozy zakanej.

Swoista odpowied humoralna w mononukleozie zakanej: W przebiegu mononukleozy zakanej jako pierwsze pojawiaj si przeciwciaa anty-VCA (przeciw antygenowi kapsydu), nieco pniej anty-EA (przeciw antygenowi wczesnemu), przy czym przeciwciaa te nie pojawiaj si u wszystkich ludzi, u ktrych wystpuj objawy mononukleozy zakanej. Jako ostatnie pojawiaj si przeciwciaa anty-EBNA (przeciw antygenowi jdrowemu). Utrzymujce si dugotrwale wysokie miano przeciwcia anty-EBNA charakterystyczne jest dla zakae przewlekych wywoanych przez EBV oraz dla zmian limfoproliferacyjnych o etiologii EBV.

4. Zastosowanie odczynu ELISA do wykrywania swoistej odpowiedzi humoralnej (IgM, IgG) wobec antygenw EBV w przypadku reaktywacji zakaenia latentnego (pacjent 2) Oprcz diagnostyki w przypadku podejrzenia mononukleozy zakanej, ktra jest najpowszechniejsz form objawow ostrego pierwotnego zakaenia EBV w populacji immunokompetentnej, swoiste testy serologiczne mog by pomocne w ocenie statusu odpowiedzi humoralnej w przypadkach zakae pacjentw z grup ryzyka w

odniesieniu do cikich postaci zakae EBV. U pacjentw poddanych immunosupresji, z wrodzonymi zaburzeniami immunologicznymi oraz u pacjentw cierpicych na nowotwory, zarwno zakaenia pierwotne jak i wynikajace z reaktywacji latentnego EBV mog prowadzic do szeregu zespow klinicznych takich jak zespoy limfoproliferacyjne, chroniczne aktywne zakaenie EBV lub zespoy zblione do mononukleozy, lecz o ciszym przebiegu.

5. Odczyn ELISA w diagnostyce przeomu aplastycznego zwizanego z zakaeniem parwowirusem B19 Opis przypadku Z powodu powtarzajcych si od kilku dni krwawie z nosa, matka zdecydowaa si przyprowadzic do przychodni 8-letniego chopca. W wywiadzie stwierdzono w okresie ostatnich dwch tygodni postpujce zmniejszenie aktywnoci ruchowej, senno, brak apetytu i utrzymujc si podwyszon temperatur ciaa (37,5C) przy wieczornym pomiarze. W badaniu przedmiotowym z odchyle stwierdzono blado skry oraz drobne wybroczyny na bonach luzowych jamy ustnej i garda. Wykonano badanie laboratoryjne krwi. Stwierdzono niedokrwisto normocytow, znacznie zmniejszon liczb retikulocytw, granulocytopeni z wzgldn limfocytoz oraz maopytkowo. Stwierdzono take znacznie wyduony czas krwawienia, wzrost stenia elaza w surowicy i zwikszone OB. Na podstawie wynikw bada klinicznych i laboratoryjnych stwierdzono zmniejszon czynno krwiotwrcz szpiku. Jako jedn z moliwych przyczyn uznano zakaenie parwowirusem B19. Lekarz zleci wykonanie bada serologicznych: oznaczenie przeciwcia przeciw parwowirusowi B19 w klasach IgM i IgG oraz oznaczenie antygenu wirusa B19 we krwi pacjenta.

Przebieg zakaenia pierwotnego parwowirusem B19

*)TAC transient aplastic crisis

DO WYKONANIA W ODCZYNACH ELISA (do punktw 3, 4, 5): Do wszystkich opisanych dokw doda po 50 l chromogenu (tetrametylbenzydyny TMB). Nastpnie pasek inkubowa przez 10 min. w temp. pokojowej w ciemnoci. Po inkubacji naley przerwa reakcj enzymatyczn dodajc do wszystkich dokw po 50 l 0,5N roztworu H2SO4. Wynik naley odczyta nie pniej ni p godziny po przerwaniu reakcji.

6. Odczyn immunoperoksydazowy w diagnostyce zakae adenowirusami Opis przypadku: U 20 letniego mczyzny przebywajcego na oddziale chirurgii, w smej dobie po wykonanym zabiegu splenektomii, pojawiy si objawy zapalenia puc. U chorego wystpowa napadowy suchy kaszel, pytki oddech i podwyszona temperatura ciaa (38,8C przy wieczornym pomiarze). Z wywiadu wynika, e pacjent miewa ju zapalenia puc (ostatnio dwa lata temu). Pacjent pali papierosy. W badaniu osuchowym stwierdzono szmery oddechowe w dolnej lewej czci klatki piersiowej. W badaniu radiologicznym w dolnym pacie puca lewego stwierdzono kilka obszarw nacieczonych rdmiszowo. Lekarz, biorc pod uwag wirusow etiologi zakaenia, zleci laboratoryjn identyfikacj czynnika etiologicznego. Pord innych bada mikrobiologicznych, wykonano badanie polegajce na izolacji wirusa z popuczyn oskrzelowych w hodowlach komrkowych. Po obrbce, materia posiano na hodowle komrkowe wraliwe na zakaenie wirusami oddechowymi (paramyksowirusy, ortomyksowirusy, adenowirusy). Po trzech dniach w linii komrkowej A549 (linia wraliwa na zakaenie adenowirusami) pojawi si nasilony efekt cytopatyczny. W pozostaych liniach efekt cytopatyczny nie wystapi. Z komrek hodowli wykonano rozmaz na szkiekach podstawowych, z przeznaczeniem do odczynu immunoperoksydazowego z uyciem surowicy wzorcowej (przeciwciaa monoklonalne przeciw biakom heksonw adenowirusw, swoiste wobec wszystkich typw adenowirusw wywoujcych zakaenia u czowieka)

Wykonanie odczynu: UWAGA: Na kadym stole jest przygotowany preparat z utrwalonymi komrkami zakaonymi adenowirusem. Wirus zosta poddany inaktywacji. Uwaga! Dotknicie okrgego pola na szkieku doprowadzi do starcia komrek! Nie dotyka! 1. 2. 3. Na preparat utrwalony na szkieku podstawowym nakropli 20 l wzorcowej surowicy (Buteleczka z ciemnego szka podpisana Chromogen IP). Inkubowa przez 10 minut w 37C w komorze wilgotnej Szkieko umieci w szklanym kominku do pukania, zala zbuforowanym roztworem soli fizjologicznej (PBS), puka przez dwie minuty, delikatnie poruszajc szkiekiem. Po wyjciu z kominka szkieko delikatnie osuszy bibu. Na preparat nakropli 20 l chromogenu, inkubowa przez 5 minut w komorze wilgotnej w temperaturze pokojowej. Powtrzy punkt 3. Odczyta pod mikroskopem wietlnym (w pow. 400x)

4. 5. 6.

DEMONSTRACJA:

1. Diagnostyka wirusowego zapalenia opon mzgowo-rdzeniowych i mzgu zastosowanie testu multiplex PCR (demonstracja) Opis przypadku: Do izby przyj szpitala rejonowego przywieziono 37-letniego mczyzn z temperatur 39C, dreszczami, silnym blem gowy, nudnociami i wymiotami. W badaniu przedmiotowym stwierdzono zamroczenie, zaburzenia rwnowagi, lekki niedowad poowiczy oraz tachykardi. Pobrano krew i pyn mzgowo-rdzeniowy do bada oglnych imikrobiologicznych. Badanie laboratoryjne pynu mzgowo-rdzeniowego wykazay umiarkowan pleocytoz, poziom glukozy i biaka w normie. Na podstawie wynikw bada zdecydowano si wykona rwnie badanie wirusologiczne pynu mzgowo-rdzeniowego metod multiplex-PCR pod ktem wirusa opryszczki.

Badanie wykonano wg. procedury: I. II. III. Ekstrakcja DNA z prbki materiau klinicznego (200 l pynu mzgowo-rdzeniowego) Amplifikacja DNA metod reakcji acuchowej polimeryzacji Detekcja zamplifikowanych fragmentw DNA (rozdzia elektroforetyczny produktw PCR w elu agarozowym)

Zdjcie elu po elektroforezie:

Oznaczenia: 100 bp M: znacznik dugoci produktu - 100 par zasad K (-): kontrola ujemna (DNA czowieka, wolne od DNA HSV) HSV 1 TK-, HSV 2 TK-: wzorcowe szczepy wirusa opryszczki zawierajce zmutowany gen kinazy tymidynowej, oporne na acyklowir HSV 1 TK+, HSV 2 TK+: wzorcowe szczepy wirusa opryszczki zawierajce prawidowy gen kinazy tymidynowej, wraliwe na acyklowir P M-R: badany pyn mzgowo - rdzeniowy

Dugo produktw:

HSV-1 (gen polimerazy DNA): 469 pz HSV-2 (gen polimerazy DNA): 390 pz Kinaza tymidynowa: 1200 pz

3. Identyfikacja typu wirusa na podstawie porwnania sekwencji nukleotydw z uyciem programu BLASTN 1. W komputerze na sali wicze: w programie notatnik otworzy plik sekwencji adenowirus.fas zawierajcy sekwencj produktu PCR przeprowadzonego ze starterami swoistymi dla adenowirusw (plik znajduje si na pulpicie). 2. 3. Zaznaczy ca sekwencj nukleotydw i skopiowa j (ctrl+c). Otworzy okno przegldarki. Powinna by widoczna strona internetowa NCBI BLAST (basic local alignment search tool podstawowa wyszukiwarka lokalnych sekwencji komplementarnych). 4. 5. 6. W sekcji Basic BLAST wybra program nucleotide blast Wklei skopiowan sekwencj do okna Enter accesion number, gi or FASTA sequence (ctrl+v) Sprawdzi, czy: a. b. c. 7. Wybrana jest baza danych nucleotide collection (nr/nt) Zaznaczono opcj highly similar sequence Zaznaczono opcj Show results in a new window

Nacisn przycisk BLAST, w przegladarce pojawi si okno wynikw. Poczeka, a program przeszuka baz danych.

8.

Na podstawie podobiestwa sekwencji badanej i zestawu sekwencji z bazy danych zidentyfikowa typ wirusa. Okreli stopie podobiestwa najbardziej zblionej sekwencji.

Zidentyfikowany typ adenowirusa: Podobiestwo: [%]