UNIVERSIDAD DEL META LABORATORIO 3 COLORACIONES INTRODUCCIN El tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resultan difciles

de ver con el microscopio ptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la clula y el medio que la rodea, y el medio ms simple de aumentar el contraste es la utilizacin de colorantes. Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de clulas o para revelar la presencia de determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cpsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc. Las clulas generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teirlas, proceso llamado fijacin. Para bacterias, la fijacin por el calor es lo ms corriente, aunque tambin puede fijarse con sustancias qumicas como formaldehido, cidos y alcoholes. Despus de la fijacin, si se aade el colorante, no se producen ulteriores cambios estructurales en el protoplasma. La fijacin se realiza habitualmente en clulas que han sido fijadas sobre un portaobjetos, tratando despus ste con el agente fijador, y siguiendo inmediatamente el proceso de tincin. La fijacin produce habitualmente el encogimiento de las clulas; la tincin, por el contrario, hace que las clulas aparezcan mayores que lo que son realmente, de manera que las medidas de las clulas que han sido fijadas o teidas no pueden realizarse con mucha precisin. La mayora de los colorantes son compuestos orgnicos que tienen alguna afinidad especfica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son molculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los cidos nucleicos y los polisacridos cidos. Ejemplos de colorantes catinicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros colorantes son molculas cargadas negativamente (aniones) y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas protenas. Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina cida y el rojo Congo. Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles; los colorantes de este grupo se combinan con los materiales lipdicos de la clula, usndose a menudo para revelar la localizacin de los depsitos de grasa. Un ejemplo de colorante liposoluble es el negro Sudn. Algunos colorantes teirn mejor slo despus de que la clula haya sido tratada con otra sustancia qumica, que no es un colorante por s mismo. Esta sustancia se Carolina Mndez MAV Pgina 1

denomina mordiente; un mordiente habitual es el cido tnico. El mordiente se combina con un constituyente celular y lo altera de tal modo que ahora s podr atacar el colorante. Si se desea simplemente incrementar el contraste de las clulas para la microscopa, son suficientes los procedimientos simples de tincin. El azul de metileno es un buen colorante simple que acta sobre todas las clulas bacterianas rpidamente y que no produce un color tan intenso que oscurezca los detalles celulares. Es especialmente til para detectar la presencia de bacterias en muestras naturales, puesto que la mayor parte del material no celular no se tie. Los mtodos de tincin son de gran utilidad, pero deben usarse siempre con precaucin, ya que pueden conducir a errores. Las molculas de colorante forman en ocasiones precipitados o agregados que parecen estructuras celulares autnticas, pero que son formaciones completamente artificiales inducidas por el mismo colorante. Tales estructuras se denominan artefactos, y deben tomarse muchas precauciones para tener la seguridad de que no nos estamos equivocando al creer que un artefacto es una estructura realmente existente. Relacin de las bacterias con el oxgeno Ref. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (9th ed., 1994). En base a la relacin de las bacterias con el oxgeno, estas se pueden clasificar en : Aerobio estricto : Un organismo el cual requiere utilizar el oxgeno como aceptador terminal de electrones , puede tolerar un nivel del oxgeno equivalente o mayor de una atmsfera de aire (oxgeno del 21%), y tiene un tipo terminantemente respiratorio de metabolismo. Anaerobio facultativo: Un organismo que puede crecer bien en ausencia del oxgeno y en la presencia de un nivel de oxgeno equivalente a una atmsfera del aire (oxgeno de 21%). Microaeroflico : Un organismo que es capaz de un crecimiento oxgenodependiente, pero no puede crecer en la presencia de un nivel del oxgeno equivalente a una atmsfera de aire (oxgeno de 21%). Anaerobio estricto : Un organismo que es incapaz de crecimiento oxgenodependiente y no puede crecer en la presencia de una concentracin de oxgeno equivalente a una atmsfera de aire (oxgeno de 21%). Flora anaerbica normal Las bacterias anaerobias forman parte de la microbiota normal del cuerpo humano y de los animales. Se encuentran como comensales, en algunos casos con funciones fisiolgicas importantes. No obstante, tambin pueden dar lugar a procesos infecciosos graves. Aunque el hombre es un aerobio, ms del 99.9% de la flora humana normal son anaerobios estrictos y facultativos. stos incluyen: Piel Boca Intestino grueso Vagina Propionibacterium spp Produce cido propinico Actinomyces, Prevotella, Porphyromonas, Peptostreptococcus Bacteroides spp, Bifidobacterium spp, Clostridiu m perfringens, Peptostreptococcus Lactobacillus, Prevotella spp

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Distribucin de anaerobios en muestras clnicas:

Origen de las infecciones anaerbicas Las bacterias anaerobias son la causa de una gran diversidad de enfermedades en el hombre y en los animales. Estas bacterias pueden proceder de fuentes exgenas o endgenas. Las bacterias anaerobias de la microbiota del hombre y de los animales, son comensales o saprofitas con carcter de oportunistas. Por tanto, son invasores secundarios, siendo el acontecimiento primario la difusin de la flora normal ms all de los lmites de sus barreras mucocutneas. Los cuadros que originan estas bacterias son inespecficos, pudiendo afectar a cualquier rgano o tejido y casi siempre son polimicrobianos. Adems, con bastante frecuencia son procesos de etiologa mixta, en ellos tambin estn involucradas de forma simultnea bacterias aerobias. INFECCIN ANAERBICA DE ORIGEN EXGENO Botulismo Gastroenteritis por Clostridium perfringes Mionecrosis (Gangrena gaseosa) Ttano Infeccin seguida de mordedura de animal o humana Aborto sptico INFECCION ANAERBICA DE ORIGEN ENDGENO Absceso en cualquier rgano Actinomicosis Complicacin de apendicitis Mionecrosis clostridial Endocarditis Infeccin periodontal Meningitis seguida de un absceso cerebral Osteomielitis MATERIALES 4 hisopos 4 bajalenguas 2 asas bacteriolgicas 10 portaobjetos 2 pinzas

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REACTIVOS 20 ml de cristal violeta 25 ml de fushina 30 ml de alcohol acetona 20 ml de lugol 1 ml de tinta china 20 ml de verde malaquita 0,5 ml de aceite de inmersin

TINCION DE GRAM. Tincin empleada en microbiologa para la visualizacin de bacterias en muestras clnicas. Tambin se emplea como primer paso en la diferenciacin bacteriana. El examen con microscopio ptico de preparacin con tincin de Gram se emplea de rutina para determinar la forma de las bacterias. Las formas comunes son cocos (esfricas), bacilos (alargadas) y formas espiraladas. Las bacterias pueden diferenciarse con esta tincin en dos grupos. Los microorganismos Gram positivos se tien de azul, mientras que aproximadamente un tercio de los cocos, la mitad de los bacilos y todos los organismos espira lados se tien de rojo y se dice que son gram negativos. Las aplicaciones ms comunes de la coloracin de Gram son las siguientes: La presencia de cocos gram positivos agrupados sugiere estafilococos; en cadenas sugiere estreptococos; en forma de lanceta a los diplococos La presencia de diplococos gram negativos son caractersticas de especies de Neisseria sp. Los bacilos Gram positivos grandes sugieren especies de Bacillus o clostridium, los bacilos Gram positivos pequeos sugieren especies de Listeria o una de las corineiformes ( difteroides) Los bacilos Gram negativos son las bacterias ms comunes halladas en los laboratorios clnicos e incluyen a Enterobacteriaceae, bacilos no fermentados y especies de Haemophilus. El valor diagnstico de esta tincin es variable; normalmente permite una buena orientacin al microbilogo para seleccionar las tcnicas de cultivo ms adecuadas y tambin tiene valor en orientar hacia un diagnstico etiolgico, en especial para instaurar un tratamiento inicial.

PROCEDIMIENTO a. Observar caractersticas macroscpicas de las diferentes cepas que se van a trabajar b. Realizar la coloracin de Gram para: Sthaphylococcus aureus, Bacillus cereus, Escherichia coli, Pseudomona aeruginosa, Klebsiella pneumoniae.

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A)

TINCIN DE GRAM 1. Realiza la preparacin del frotis bacteriano como se explic en el paso anterior 2. Teir con cristal violeta 1min. 3. Lavar con abundante agua el exceso de colorante. 4. Cubrir con Lugol 1min. 5. Lavar con agua el exceso de Lugol. 6. Decolorar con alcohol-acetona o simplemente con alcohol hasta que la preparacin deje de perder color (30seg) 7. Lavar con abundante agua para eliminar el resto de disolvente. 8. Teir con safranina o fushina 1min. 9. Lavar con agua para eliminar el colorante de contraste. 10. Secar la preparacin. 11. Examinar al microscopio con aceite de inmersin y fijndose sobre todo en el color de cada preparacin. TINCION DE ACIDO ALCOHOL RESISTENTE ZIELH NIELSEN

Esta tincin permite diferenciar micobacterias, bacterias con cidos miclicos en su pared celular pertenecientes a los gneros Mycobacterium y Nocardia. Los cidos miclicos hacen que las microbacterias resistan, no slo la decoloracin con alcohol como las Gram positivas sino la decoloracin con una mezcla de cido y alcohol capaz e decolorar al resto de las Gram positivas La tincin primaria se realiza con Fuscina bsica que tie las clulas de rojo. La decoloracin se realiza con una solucin de cido clorhdrico en etanol. Esta mezcla elimina la fuscina de todas las clulas excepto de las micobacterias, que la retienen debido a su superficie crea, de cidos miclicos. Como colorante de contraste se utiliza Azul de metileno que tie las clulas previamente decoloradas de azul. TINCIN DE ESPORAS (TCNICA DE SHEAFFER Y FULTON) 1-Prepare un dos extendidos del microorganismo aislado del microorganismo uno de Bacillus Subtillus y otro de Bacillus cereus cultivo de

2-Fijar por calor y cubrir todo el portaobjeto con una solucin de verde de Malaquita. 3-Calentar hasta emisin de vapores y seguir dicho calentamiento durante 3 minutos (no permitir que se seque el colorante. Si esto ocurriera, agregar colorante, sobre el preexistente y no sobre la parte seca, hasta cubrirlo nuevamente.) 4-Lavar con agua y cubrir con solucin de Safranina. Dejar actuar 30 segundos. Lavar con agua, secar y observar con objetivo de inmersin. 5-Informar: morfologa, color y tipo de espora. TINCIN DE ESPORAS (TCNICA DE COLORACIN DE GRAM) 1.- Hacer un frotis de B.subtilis de la forma usual y otra de B. cereus 2.- Teir con la coloracin de Gram Carolina Mndez MAV Pgina 5

Localizacin y morfologa de las esporas en Bacillus

3.-Observar al microscopio con el objetivo de inmersin las esporas se pueden observar sin teir o si se encuentra dentro del bacilo, la espora no se tie y el citoplasma se ve de color morado

RESULTADOS a. Escriba caractersticas macroscpicas de cada mo: Bacterias Caracteristicas Staphylococcus aureus Escherichia coli Bacillus cereus Pseudomona aeruginosa Klebsiella pneumoniae b. Dibuje todas las observaciones de cada mo que hizo al observarlos al microscopio.

CUESTIONARIO 1. Que es un frotis 2. Con que finalidad se fija la muestra del microorganismo en el portaobjetos

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3. Qu importancia tiene teir las muestras bacterianas 4. Porque es necesario el uso de aceite de inmersin para la observacin de los microorganismos 5. De los reactivos que utiliza para la tincin de gram, cual es el que funciona como colorante primario. 6. Explique la funcin de cada uno de los colorantes mencionados en la gua 7. dibuje y describa las caractersticas ms importantes entre las gram positivas y gran negativas. 8. Investigue 5 microorganismos gram + y gram (caractersticas macroscpicas y microscopicas, medios de cultivo) 9. Qu tcnicas permiten colorear Rickettsias y Clamidias? 10. Qu coloraciones se utilizan para observar mohos y levaduras? Por qu las tcnicas de observacin de hongos no deben fijarse? 11. Defina colorante 12. Qu ventajas se tienen en una preparacin entre porta y cubre objetos y que desventajas? 13. Por qu hay que evitar la formacin de burbujas de aire en el mtodo de la cmara hmeda? 14. Cmo se puede comprobar la movilidad de un microorganismo? 15. Por qu razn deben estar muy diluidos los colorantes vitales? 16. Cita las diferencias entre tincin y coloracin vital. 17. Qu efecto produce el papel de filtro utilizado en el mtodo de la cmara hmeda? Sabras 18.explicar la razn por la que se produce este efecto BIBLIOGRAFIA Cappuccino, James G. and Sherman Natalie. 2005. Microbiology: a laboratory manual. 7th edition. Pearson/Benjamn Cummings. USA. QR63 C36 2005. Leboffe Michael J. and Burton E. Pierce. 2006. Microbiology laboratory theory and application. 2nd edition, Morton Publishing Co. USA. QR63 L43 2006. Madigan, M. T. and J. M. Martinko. 2006. Brock Biology of microorganisms. 11th edition.

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