147 POSTPYBADANIE DZIAANIA CYTOTOKSYCZNEGO 35 2008 SUPLEMENT NR 24 (147163) BIOLOGII KOMRKI TOM SUBSTANCJI CHEMICZNYCH

BADANIE DZIAANIA CYTOTOKSYCZNEGO SUBSTANCJI CHEMICZNYCH

CYTOTOXIC ASSAYS OF CHEMICAL SUBSTANCES Janusz SKIERSKI Pracownia Cytometrii Zakadu Biologii Komrki, Narodowy Instytut Lekw, Warszawa
Streszczenie: W pracy przedstawiono mechanizmy komrkowe procesu apoptozy i nekrozy oraz podstawowe metody badania ilociowego procesu apoptozy. Przedstawiono metody oceny apoptozy przy uyciu testu z dioctanem fluoresceiny (FDA/PI), Aneksyn V, testu PARP i testu TUNEL. Opisano szczegy poszczeglnych testw oraz zalety i wady poszczeglnych metod, a take zasady ich stosowania. Summary: The molecular aspects of the apoptotic and necrotic processes are presented in this paper. The basic methods of apoptosis assays (fluoresceine diacetate/Propidium iodide, Annexin V/PI, PARP cleavage test, and TUNEL test) are also presented in details.

Substancje cytotoksyczno-cytostatyczne (szczeglnie leki onkologiczne) dziaaj wielokierunkowo na yw komrk. Zaburzeniom moe ulega szereg szlakw metabolicznych, w tym szlakw produkcji zwizkw wysokoenergetycznych. Innym bardzo istotnym czynnikiem jest wpyw tych lekw na syntez kwasw nukleinowych, szczeglnie DNA i RNA oraz biaek. Odpowiedzi komrki na dziaanie czynnika cytotoksyczno-cytostatycznego moe by jej zatrzymanie w cyklu yciowym bd indukcja mierci drog apoptozy, lub przy wikszym nasileniu dziaania tego czynnika mier poprzez nekroz. Definicja mierci komrki nastrcza zasadnicze problemy. Niewtpliwie proces mierci komrki koczy si ustaniem jej biologicznej aktywnoci. Komrki zatrzymane (upione) w cyklu yciowym (w fazie G0), maj aktywno biologiczn (biochemiczn) obnion w sposb odwracalny, natomiast zmiany towarzyszce mierci komrki s odwracalne tylko do pewnego momentu. Z teoretycznego punktu widzenia mona wic zdefiniowa komrk martw jako tak, ktra osigna lub przekroczya ten punkt (no-return point). Okrelenie tego punktu jest jednak trudne w praktyce, gdy proces umierania ma charakter cigy, a nie skokowy. Nie wystpuj

148

J. SKIERSKI

rwnie charakterystyczne zjawiska, ktre mogyby zdefiniowa ten punkt. Wyczerpujcy przegld zjawisk zachodzcych w komrce ulegajcej mierci w drodze apoptozy lub nekrozy oraz metody badania obu tych zjawisk przedstawiono w pracy Darynkiewicza [2,5] i Majno [24].

APOPTOZA
Apoptoza jest procesem zaprogramowanym genetycznie i sucym do eliminacji komrek, ktre s w danym momencie zbdne, lub ktre zostay uszkodzone. Proces ten zachodzi w warunkach fizjologicznych, jak rwnie w odpowiedzi na stress (np. wysiek fizyczny [33]). Z morfologicznego punktu widzenia apoptoza charakteryzuje si postpujcym odwodnieniem i obkurczaniem si komrki oraz kondensacj chromatyny, dobrze widoczn w mikroskopie fluorescencyjnym po wybarwieniu DNA (ryc. 1). Pocztkowo kondensacja ta nadaje chromatynie jdrowej ksztat pksiyca. Nastpnie zachodzi fragmentacja DNA i jdra komrkowego. W ostatnim stadium apoptozy fragmenty jdra z pewn liczb organelli zostaj otoczone bon komrkow i tworz ciaka apoptotyczne. Interesujce jest, e ciako apoptotyczne zawiera tylko jeden rodzaj kwasu nukleinowego: RNA lub DNA [16]. W odrnieniu od procesu nekrozy, cytoplazma oraz zawarto organelli komrki ulegajcej apoptozie nie zostaj uwolnione do przestrzeni midzykomrkowej, a ciaka apoptotyczne zostaj sfagocytowane przez otaczajce komrki lub makrofagi. W procesie apoptozy nie dochodzi do naciekania tkanki przez granulocyty i makrofagi i tym samym do procesu zapalnego tej tkanki (przeciwnie ni w przypadku nekrozy komrek) [4,5]. Proces apoptozy podlega precyzyjnej regulacji, niezalenie od czynnikw indukujcych ten proces. Istniej punkty kontrolne, w ktrych ukady enzymatyczne komrki mog zahamowa proces apoptozy lub spowodowa, e proces ten bdzie bieg dalej, a do destrukcji komrki. Zainteresowanie onkologw procesem apoptozy wynika m.in. z faktu, e ta droga mierci komrki jest wyzwalana przez szereg substancji przeciwnowotworowych, promieniowanie jonizujce i hypertermi, a take dlatego, e odpowied apoptotyczna komrek nowotworowych jest modulowana przez szereg czynnikw, takich jak: ekspresja genw bcl-2, bax, c-myc, jak rwnie genu p53. Apoptoza odgrywa istotn rol w przebiegu szeregu chorb odrzucaniu przeszczepw, chorobie przeszczep przeciw gospodarzowi (graft versus host), chorobach autoimmunizacyjnych, chorobie Hodgkina. Wiadomo rwnie, e limfocyty T o fenotypie CD4+ ulegaj apoptozie pod wpywem wirusa HIV [6]. Proces apoptozy moe przebiega dwiema drogami. Jedna z nich zaczyna si od receptorw na bonie komrkowej. W wyniku kolejnej aktywacji szeregu biaek poredniczcych w przekazywaniu sygnau apoptotycznego, aktywacji ulegaj enzymy zwane kaspazami. Dziaanie kaspaz doprowadza do degradacji DNA i ostatecznie do samozniszczenia komrki. Drugi szlak apoptozy zaczyna si od zmian w mitochondriach i prowadzi rwnie do aktywacji kaspaz. Jednym z sygnaw zewntrzkomrkowych, wyzwalajcych proces apoptozy, jest ligand Fas (FasL), ktry wie si z bonowym receptorem Fas (CD-95). Ligand ten, nalecy do rodziny TNF (tumor necrosis factor), znajduje si na powierzchni aktywowanych limfocytw T i komrek NK. Innymi znanymi czynnikami

BADANIE DZIAANIA CYTOTOKSYCZNEGO SUBSTANCJI CHEMICZNYCH

149

zewntrzkomrkowymi, inicjujcymi apoptoz s TNF, TRAIL, a take glikokortykoidy (szczeglnie w odniesieniu do komrek immunokompetentnych). TRAIL (Tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand), podobnie jak FasL, jest cytokin z rodziny TNF i wystpuje midzy innymi na powierzchni krcych limfocytw i makrofagw [30]. Na powierzchni komrek wystpuj receptory dla TRAIL, z ktrych dwa TRAIL-R1 i TRAIL-R2 zawieraj tzw. domen mierci. Szereg biaek transbonowych peni rol receptorw dla czynnika TNF (np. TNFR1 i TNF-R2). Do tej grupy receptorw naley rwnie receptor Fas/APO-1. Interesujce jest, e receptory z grupy TNF uczestnicz zarwno w przekazywaniu sygnaw prowadzcych do mierci komrki, jak i do jej podziau [15]. Istotn cech wyej wymienionych receptorw jest obecno w ich strukturze charakterystycznej sekwencji 85-aminokwasowej, zwanej domen mierci. Domena ta bierze udzia w tworzeniu kompleksw receptorw i w wizaniu tych receptorw z biakami adaptorowymi, ktre rwnie zawieraj domen mierci. W szlaku apoptozy indukowanej przez receptory z grupy TNF biakami adaptorowymi s FADD i RIP (receptor interacting protein). Proces apoptozy, w ktrym uczestniczy FADD, nie moe zosta zahamowany przez biako Bcl-2. Innym biakiem adaptorowym jest DAXX (FAS death domain associated protein). Wie si ono z domen mierci receptora Fas. Dalszy proces apoptozy moe jednak by zablokowany przez biako Bcl-2. Z receptorem TNF-R1 wi si biaka TRADD, TRAF-2 i FAN, z receptorem TNF-R2 - TRAF 1 i TRAF -2, natomiast z TRAIL-1 biaka TRADD, FADD i RIP. Szlak sygnaowy prowadzi dalej do grupy kaspaz inicjujcych (kaspaza 2, 8, 9 i 10), ktre aktywuj kaspazy wykonawcze (3, 6 i 7) [13,15]. Drugi szlak apoptozy (wewntrzkomrkowy) rozpoczyna si w mitochondriach. Induktorami apoptozy s: promieniowanie UV [34], aktywacja biaek hamujcych wzrost nowotworw, np. biaka p53, stres oksydacyjny, niedobr ATP (jeden z mechanizmw dziaania 2-CdA), obnienie zawartoci glutationu, czy te dziaanie wielu substancji chemioterapeutycznych. Silnymi induktorami apoptozy s rwnie inhibitory transportu elektronw w mitochondriach, np. antymycyna A (AMA) [19]. Zablokowanie transportu elektronw powoduje spadek gradientu protonw na wewntrznej bonie mitochondrialnej DYm i produkcj wolnych rodnikw tlenowych (ROS). Istotn rol w przepuszczalnoci kanaw mitochondrialnych odgrywa stenie jonw wapnia [11, 12, 25, 32]. Zmiany stenia wapnia w komrkach wywoane induktorem apoptozy (Tri-n-butylin) byy badane przez Grundlera [14]. W wyniku otwarcia megakanaw, z mitochondriw z przestrzeni midzybonowej wydostaje si do cytoplazmy wiele biaek: cytochrom c, Smac/DIABLO (Smac: second mitochondria-derived activator of caspases, DIABLO: direct IAPbinding protein with low pI), AIF (apoptosis inducing factor) oraz rne prokaspazy. Uwolniony do cytoplazmy cytochrom c wraz z biakiem Apaf-1 (apoptotic protease activating factor-1) i ATP tworzy struktur zwan apoptosomem. Nastpuje oligomeryzacja biaka Apaf-1 i przyczenie szeregu czsteczek prokaspazy-9. Nastpnie czsteczki prokaspazy-9 ulegaj samoaktywacji, a powstaa w ten sposb nowa struktura jest aktywna katalitycznie przez duszy

150

J. SKIERSKI

czas. Podstawow rol apoptosomu jest aktywacja kaspazy-3, zasadniczego enzymu wykonawczego procesu apoptozy. Skutkiem dziaania kaspaz jest proteoliza lamin jdrowych, histonw, biaka PARP (polimeraza poli ADP-rybozy), topoizomeraz oraz innych biaek w komrce. Nukleazy zalene od kaspaz degraduj DNA na krtkie fragmenty o dugoci 180 par zasad, dajce charakterystyczny obraz elektroforetyczny [15, 18]. Degradacja PARP jest obecnie wykorzystywana do ilociowego oznaczania apoptozy [21, 22]. W innym szlaku apoptozy bezporednio dziaaj dwa biaka mitochondrialne czynnik AIF i endonukleaza G. Oba te biaka migruj z mitochondriw do jdra komrkowego, gdzie zaaktywowana przez AIF endonukleaza G degraduje DNA. DNA-zy aktywowane przez kaspazy degraduj DNA na mniejsze fragmenty, ni czyni to endonukleaza G. Interesujce jest, e ten sam induktor apoptozy, np. flawopirydol, moe wyzwala mier apoptotyczn przez uwalnianie cytochromu c i aktywacj kaspaz bd przez uwalnianie czynnika AIF bez aktywacji kaspaz, w zalenoci od rodzaju komrek poddanych dziaaniu tego induktora [31]. Kluczow rol w regulacji procesu apoptozy odgrywaj biaka z rodziny Bcl-2 (nazwanej tak od biaaczki B-komrkowej (B-cell leukemia/lymphoma)). Rodzina ta jest dzielona, ze wzgldu na dziaanie, na podrodzin Bcl-2 o dziaaniu antyapoptotycznym, (Bcl-2, Bclxl, Bcl-xs, Bcl-w) oraz dwie podrodziny o dziaaniu proapoptotycznym: podrodzin Bax (Bax, Bak, Bok) i podrodzin BH3 (Bad, Bik, Bid). Biaka z podrodziny Bcl-2 charakteryzuj si obecnoci specyficznej domeny umoliwiajcej im zakotwiczanie si w bonach mitochondriw, siateczki rdplazmatycznej, aparatu Golgiego i w otoczce jdrowej. Pod wpywem bodcw apoptotycznych biaka te przemieszczaj si z cytoplazmy do mitochondriw i ulegaj zmianom konformacyjnym umoliwiajcym im oligomeryzacj. Homodimer Bax:Bax zwiksza przepuszczalno wewntrznej i zewntrznej bony mitochondrialnej. Uwaa si, e biaka Bcl-2 i Bax zakotwiczone obok siebie w bonie mitochondrium odgrywaj rol w otwieraniu i zamykaniu megakanaw. Stwierdzono [22], e biako Bax, w zalenoci od stenia moe bd powodowa uwolnienie do cytoplazmy biaek wewntrzbonowych, w tym cytochromu c, bez trwaego obnienia bonowego potencjau DYm. Natomiast przy wyszych steniach (250 nM1 M) biako Bax moe dugotrwale otwiera megakana, co powoduje nieodwracalny spadek tego potencjau i degradacj mitochondriw. Proces apoptozy jest regulowany przez rwnowag dimerw biaek z rodziny Bcl-2. Wiadomo jest, e homodimer Bcl 2:Bcl-2 dziaa silnie antyapoptotycznie, podczas gdy heterodimer Bcl-2:Bax ma dziaanie proapoptotyczne [8]. Zesp Darynkiewicza [22] stwierdzi, e aktywacja kaspaz, oceniana przez pomiar iloci fragmentw polimerazy poli-ADP-rybozy (PARP), jest niezalena w czasie od spadku potencjau bony mitochondrialnej, przynajmniej w przypadku komrek biaaczki HL-60 i choniaka U-937. Stwierdzono rwnie [7], e apoptoza komrek HL-60, indukowana staurosporyn, aktynomycyn D i etopozydem moe zachodzi bez spadku potencjau DYm mitochondriw. Gen bcl-2 jest uwaany za protoonkogen. W wielu nowotworach (np. choniakach nieziarniczych) stwierdza si translokacj tego genu z chromosomu 18 na chromosom 14, czemu towarzyszy nadekspresja tego genu i nadprodukcja biaka Bcl-2. Guzy lite, w ktrych stwierdza si nadprodukcj Bcl-2, s oporne na chemio- i radioterapi [26 29]. Ekspresja genu bcl-2 bya badana przez Steube [36]. Stwierdzi on, e komrki

BADANIE DZIAANIA CYTOTOKSYCZNEGO SUBSTANCJI CHEMICZNYCH

151

biaaczki HL-60 zawieraj znaczn ilo biaka Bcl-2 i bcl-2 m-RNA, natomiast komrki linii KG-1 iloci znacznie mniejsze. W komrkach linii Jurkat nie wykryto biaka Bcl-2, a zawarto m-RNA bya niewielka. Wydaje si, e ekspresja genw (onkogenw) odpowiedzialnych za produkcj biaek hamujcych apoptoz (np. genu bcl-2 [39]) jest przyczyn rozwoju wielu ludzkich nowotworw. Pene poznanie kaskady zjawisk prowadzcych do apoptotycznej mierci komrki moe w przyszoci doprowadzi do sterowania tym procesem w onkologii i innych dziedzinach medycyny [5].

NEKROZA
Nekroza jest procesem biernym, niezaprogramowanym genetycznie. Proces ten zachodzi w sytuacji, gdy czynnik toksyczny (chemiczny lub fizyczny) dziaa z tak duym nasileniem, e komrka nie ma czasu na uruchomienie mechanizmw naprawczych lub uruchomienia kaskady zjawisk charakterystycznych dla apoptozy. Martwica jest procesem katabolicznym i degeneracyjnym. Charakteryzuje si ona pocztkowo obrzmieniem mitochondriw i innych organelli, a nastpnie pkniciem bony cytoplazmatycznej i uwolnieniem do przestrzeni midzykomrkowej zawartoci komrki wraz z enzymami proteolitycznymi. Chromatyna jdrowa ulega miejscowej kondensacji, a jdro komrkowe rozpadowi (karioliza). Procesowi nekrotycznemu towarzyszy naciekanie objtej tym procesem tkanki przez komrki erne i nastpnie rozwinicie si procesu zapalnego. Zejciem nekrozy jest powstanie blizny cznotkankowej i upoledzenie funkcji narzdu, w ktrym miaa ona miejsce.

METODY BADANIA APOPTOZY I NEKROZY

Znanych jest szereg metod badania dziaania cytotoksycznego substancji chemicznych. Metody te opieraj si na rnych efektach kocowych dziaania tych substancji. Niezalenie od zastosowanej metody wystpowanie lub brak wystpowania apoptozy wymaga potwierdzenia metodami mikroskopowymi (decyduje morfologia komrek) [3]. Na rycinie 1 przedstawiono mikrofotografi komrek choniaka U937 wykonan przy uyciu mikroskopu fluorescencyjnego Olympus BX60 z optyk polaryzacyjno-interferencyjn. Komrki zostay wybarwione roztworem DAPI i sulforodamin, co pozwolio na uwidocznienie chromatyny. Komrka oznaczona A ma prawidow morfologi. Komrka oznaczona B ma wyranie obkurczone jdro i charakterystycznie skondensowan chromatyn w postaci wianuszka. W komrce oznaczonej liter C nastpi rozpad jdra, a skupiska DNA zostan nastpnie wyrzucone z komrki w postaci ciaek apoptotycznych. Midzy komrk A i B wida dwie komrki o rnym stopniu obkurczenia jdra i kondensacji chromatyny. Pokazane na tej rycinie zmiany morfologii komrek s jedynym pewnym dowodem zachodzenia apoptozy. Analogiczne obrazy mona otrzyma uywajc dowolnego mikroskopu fluorescencyjnego ze wzbudzeniem w UV, niezalenie od optyki.

152

J. SKIERSKI

RYCINA 1. Mikrofotografia komrek U937 barwionych DAPI i sulforodamin. Mikroskop fluorescencyjny Olympus BX60. Kontrast interferencyjno-polaryzacyjny + fluorescencja. Wzbudzenie fluorescencji w zakresie wiata nadfioletowego z podwietleniem wiatem biaym. Komrka A komrka o prawidowej morfologii. Komrka B komrka w do wczesnej apoptozie (widoczne obkurczenie jdra komrkowego, kondensacja chromatyny). Midzy komrk A i B dwie komrki w pniejszych stadiach apoptozy (jeszcze bardziej obkurczone jdra, silniejsza kondensacja i zanik struktury chromatyny). Komrka C dezintegracja jdra komrkowego, rnej wielkoci skupiska chromatyny pniejsze ciaka apoptotyczne

Barwienie DAPI i sulforodamin jest proste i szybkie. Polega ono na zmieszaniu na szkieku podstawowym kropli zawiesiny komrek z kropl roztworu DAPI + sulforodamina. Po ok. 5 minutach natenie fluorescencji osiga maksimum. Ze wzgldu na obecno detergentw w roztworze DAPI do badania mog by uyte komrki ywe. Niestety obserwacja mikroskopowa nie moe suy do ilociowej oceny odsetka komrek apoptotycznych, ze wzgldu na zbyt ma liczb komrek, ktre mona w praktycznym czasie przeanalizowa. Jednym z czsto stosowanych testw jest badanie integralnoci bony komrkowej. W tecie tym inkubuje si badane komrki z roztworem barwnika o dodatnim adunku. Klasycznym przykadem jest szeroko stosowane oznaczanie odsetka komrek ywych przy uyciu bkitu trypanu (trypan blue exclusion test). Ten test zawdzicza popularno swojej prostocie i nieskomplikowanej aparaturze potrzebnej do jego przeprowadzenia. Polega on na zmieszaniu zawiesiny badanych komrek z roztworem bkitu trypanu i natychmiastowym policzeniu pod mikroskopem (w czasie nie duszym ni 2 minuty) odsetka niebiesko zabarwionych komrek (martwych). Problemem jest prawidowe zakwalifikowanie komrek bladoniebieskich. Naley tu jednak podkreli, e test ten mierzy odsetek komrek nekrotycznych.

JODEK PROPIDYNY
Do przeprowadzenia testu z jodkiem propidyny (PI) konieczny jest mikroskop fluorescencyjny (ryc. 2) lub cytometr przepywowy. Jodek propidyny (PI) nie przenika przez nieuszkodzon bon komrkow. W przypadku naruszenia cigoci bony komrkowej, PI wnika do wntrza komrki barwic kwasy nukleinowe i powoduje, e po wzbudzeniu w wietle niebieskim komrka ta wieci na czerwono-pomaraczowo [40]. Wynik testu z PI jest bardziej jednoznaczny ni testu z bkitem trypanu, gdy nie wystpuj komrki sabo barwice si PI. W obu wyej omwionych testach, poprzez badanie integralnoci bony komrkowej, mierzy si odsetek komrek nekrotycznych. Na rycinie 2 (mikrofotografia z mikroskopu fluorescencyjnego) wida

BADANIE DZIAANIA CYTOTOKSYCZNEGO SUBSTANCJI CHEMICZNYCH

153

RYCINA 2. Mikrofotografia komrek biaaczki barwionych dioctanem fluoresceiny i jodkiem propidyny (FDA/PI). Mikroskop fluorescencyjny Olympus BX60. Wzbudzenie fluorescencji wiatem niebieskim. Komrka jasnozielona oznaczona A (i inne tej samej jasnoci fluorescencji zielonej) ywa; komrka czerwona, oznaczona B nekrotyczna; komrka bladozielona, oznaczona C /0 apoptotyczna. Komrki oznaczone B, nekrotyczne, barwi si w tecie z bkitem trypanu na niebiesko

komrki ywe (komrka A), komrki we wczesnej apoptozie, bladozielone (komrka C) i nekrotyczne, czerwone (komrka B).

DIOCTAN FLUORESCEINY/JODEK PROPIDYNY (FDA/PI)

W tecie z dioctanem fluoresceiny (FDA) i jodkiem propidyny (FDA /PI) [17] wykorzystuje si lipofilno FDA. Substancja ta swobodnie przechodzi przez nienaruszon bon komrkow. W ywej komrce ulega ona rozkadowi przez esterazy cytoplazmatyczne do fluoresceiny (substancji o waciwociach lipofobowych), ktra gromadzi si w cytoplazmie. Fluoresceina, w odrnieniu od FDA jest zwizkiem fluoryzujcym. W mieszaninie inkubacyjnej znajduje si zarwno FDA, jak i PI, tak wic mona rozrni trzy populacje: a) komrki barwice si na zielono fluorescein (ywe), b) niebarwice si lub sabo barwice si fluorescein i niebarwice si PI (martwe apoptotyczne) i c) barwice si na czerwono jodkiem propidyny i niebarwice si fluorescein (martwe nekrotyczne) (ryc. 2). Komrki ulegajce apoptozie wykazuj sabsze dziaanie esteraz i, co za tym idzie, sabsz zielon fluorescencj. Ryciny 3 i 4 przedstawiaj wyniki pomiaru przeywalnoci dwch populacji komrkowych kontrolnej (ryc. 3) i poddanej dziaaniu substancji o waciwociach cytotoksycznych (ryc. 4). Interpretujc, uzyskane przy uyciu testu FDA/PI, wyniki naley pamita, e nie jest waciwe nazywanie komrek w kwadrancie dolnym lewym komrkami apoptotycznymi, gdy zmniejszenie aktywnoci esteraz nie jest cech charakterystyczn dla apoptozy. Analizujc wic wyniki przedstawione na rycinach 3 i 4 naley powiedzie: przeywalno badanych

154

J. SKIERSKI

RYCINA 3. Test FDA/PI. Wynik badania w cytometrze przepywowym. Populacja prawidowo rosnca. O odcitych natenie fluorescencji fluoresceiny, o rzdnych natenie fluorescencji jodku propidyny. Kwadrant dolny prawy komrki ywe (97%). Kwadrant grny lewy komrki nekrotyczne (1,5%). Kwadrant dolny lewy komrki prawdopodobnie apoptotyczne (1,3%)

komrek zmniejszya si z 97,1% do 34,9%. Innymi sowy analizujemy jedynie odsetek komrek w prawym dolnym kwadrancie. Porwnujc wyniki uzyskane przy uyciu metody bkitu trypanu, samego PI i metody FDA/PI mona powiedzie, e odsetek komrek ywych mierzony metod FDA/PI jest z reguy nieco niszy ni przy uyciu pozostaych metod, gdy mierzony jest zarwno odsetek komrek nekrotycznych, jak i apoptotycznych. Odczynniki i przebieg barwienia Roztwr zapasowy FDA: 0,5 mg/ml FDA w acetonie lub DMSO Roztwr roboczy FDA: 4 l roztworu zapasowego FDA + 10 ml PBS Roztwr roboczy PI: 1 mg PI rozpuci w 50 ml PBS UWAGA! roztwr roboczy FDA przygotowywa za kadym razem na wieo, nie przechowywa. Roztwr zapasowy FDA i roboczy PI s trwae przez ok. 6 miesicy w ciemnoci i w lodwce. Przebieg barwienia 1. Uzyska zawiesin komrek w HBSS lub PBS. 2. Pobra 0,2 ml tej zawiesiny do probwki pomiarowej (ok. 2 105 komrek).

BADANIE DZIAANIA CYTOTOKSYCZNEGO SUBSTANCJI CHEMICZNYCH

155

RYCINA 4. Test FDA/PI. Wynik badania w cytometrze przepywowym. Populacja traktowana substancj cytotoksyczn. O odcitych natenie fluorescencji fluoresceiny, o rzdnych natenie fluorescencji jodku propidyny. Kwadrant dolny prawy komrki ywe (34,9%). Kwadrant grny lewy komrki nekrotyczne (59,6%). Kwadrant dolny lewy komrki prawdopodobnie apoptotyczne (4,4%)

3. Doda 0,1 ml roztworu roboczego (0,02 g) FDA i 0,03 ml (0,6 g) PI. 4. Inkubowa 3 min w temperaturze pokojowej i nastpnie umieci probwki na lodzie. 5. Mierzy fluorescencj w cigu godziny. 6. Wysokie napicie fotopowielacza FL1 zmniejszy w razie potrzeby tak, aby klaster komrek ywych znajdowa si w okolicach wartoci 103 lub midzy 103 i 104 (w czwartej dekadzie). 7. Krzy kwadrantu ustawi tak, aby granice kwadrantu prawego dolnego obejmoway symetrycznie od lewej i grnej strony klaster komrek. Populacja kontrolna (komrki nietraktowane adnym czynnikiem toksycznym) powinna charakteryzowa si przeywalnoci w granicach 95% (warto statystyki w kwadrancie LR).

ANEKSYNA V/PI
Komrki nienaraone na dziaanie czynnikw toksycznych wykazuj asymetri bony komrkowej. Asymetria ta polega na tym, e czsteczki fosfatydyloseryny znajduj si wycznie na wewntrznej powierzchni bony komrkowej. Jednym z

156

J. SKIERSKI

RYCINA 5. Test z aneksyn V i PI. Wynik badania w cytometrze przepywowym. Populacja kontrolna. O odcitych natenie fluorescencji FITC zwizanej z aneksyn V, o rzdnych natenie fluorescencji jodku propidyny. Kwadrant dolny lewy (LL) komrki ywe (96,98%). Kwadrant grny lewy (UL) komrki nekrotyczne (0,03%). Kwadrant dolny prawy (LR) komrki we wczesnej apoptozie (1,14%). Kwadrant grny prawy (UR) komrki w pnej apoptozie (1,84%)

pierwszych etapw procesu programowanej mierci komrki (apoptozy) jest wydostawanie si tych czsteczek na zewntrzn stron bony. Aneksyna V (zwizana chemicznie z tioizocyjanianem fluoresceiny FITC) jest biakiem, ktre w obecnoci jonw wapnia wie si specyficznie z fosfatydyloseryn, pozwalajc na detekcj wczesnych etapw apoptozy. Dodanie do mieszaniny inkubacyjnej jodku propidyny pozwala jednoczenie bada integralno bony komrkowej. W wyniku testu moemy wic rozrni 4 populacje komrek: niebarwice si adnym z odczynnikw (ywe), kwadrant dolny lewy; barwice si jedynie jodkiem propidyny (komrki nekrotyczne), kwadrant grny lewy; barwice si w rnym stopniu aneksyn V (komrki apoptotyczne w rnych, pocztkowych stadiach apoptozy), kwadrant dolny prawy i wreszcie komrki barwice si jednoczenie oboma odczynnikami (komrki w stadium pnej apoptozy), kwadrant grny prawy (ryc. 5 i 6) [1, 20]. W szczeglnoci moliwo odrnienia komrek obumierajcych drog apoptozy od komrek obumierajcych w wyniku nekrozy ma due znaczenie praktyczne.

BADANIE DZIAANIA CYTOTOKSYCZNEGO SUBSTANCJI CHEMICZNYCH

157

RYCINA 6. Test z aneksyn V i PI. Wynik badania w cytometrze przepywowym. Populacja inkubowana z substancj cytotoksyczn. O odcitych natenie fluorescencji FITC zwizanej z aneksyn V, o rzdnych natenie fluorescencji jodku propidyny. Kwadrant dolny lewy (LL) komrki ywe (80,4%). Kwadrant grny lewy (UL) komrki nekrotyczne (0,37%). Kwadrant dolny prawy (LR) komrki we wczesnej apoptozie (4,85%). Kwadrant grny prawy (UR) komrki w pnej apoptozie (14,38%)

Do barwienia komrek Aneksyn V i jodkiem propidyny su zwykle gotowe zestawy, zawierajce wszystkie potrzebne odczynniki, jakkolwiek jest moliwe zakupienie samej Aneksyny V znakowanej FITC, jodku propidyny i sporzdzenie buforw. Autor uywa najczciej zestawu zwanego Annexin-V FITC Apoptosis Kitfirmy BioSource Int. W skad tego zestawu wchodzi rekombinowana Aneksyna V skoniugowana z FITC w buforze Tris z BSA i azydkiem sodu, bufor zawierajcy jodek propidyny (50 g/ml) i bufor wicy oparty na HEPES z dodatkiem NaCl i CaCl2 (mona rwnie uy PBS z wapniem i magnezem). Proces barwienia przebiega nastpujco: 1. Badane komrki przepuka dwukrotnie PBS i zawiesi w steniu 23 106 komrek/ml w buforze wicym. 2. Odpipetowa 100 l zawiesiny do probwki pomiarowej. 3. Do kadej probwki doda 5 l roztworu Aneksyny V i 10 l roztworu PI. 4. Inkubowa w ciemnoci w temperaturze pokojowej przez 15 minut. 5. Doda do kadej probwki 400 l buforu wicego.

158

J. SKIERSKI

6. Mierzy fluorescencj w kanaach FL1- i FL-3 natychmiast, nie pniej jednak ni w cigu 1 godziny od zakoczenia procesu barwienia.

METODA PARP
Inn metod badania apoptozy jest detekcja specyficznych biaek enzymatycznych zaangaowanych w procesie apoptozy kaspaz (proteazy cysteinowe). Kaspazy s syntezowane w komrce w nieaktywnej postaci proenzymw i nastpnie po zapocztkowaniu apoptozy ulegaj bd autoproteolizie, bd proteolizie pod wpywem innych kaspaz. Aktywne formy enzymw degraduj lub aktywuj szereg biaek cytoplazmatycznych lub jdrowych, w tym PARP, D4-GDI, DFF, MEKK i inne. Wytworzenie przeciwcia monoklonalnych przeciwko aktywnej kaspazie-3 pozwala na wykrywanie aktywnego procesu apoptozy w pniejszych jego stadiach. Dowiadczenie autora z wykorzystaniem tych przeciwcia jest jednak negatywne. Ostatnio pojawiy si prace wykorzystujce fluoryzujce (po rozciciu przez aktywn kaspaz) peptydy o sekwencji podobnej do PARP (polimerazy poli-ADP-rybozy) naturalnego substratu kaspazy 3 [37], a take wykorzystujce specyficzne, fluoryzujce inhibitory kaspaz FLICA (fluorochrome-labelled inhibitors of caspases) [21, 22, 35]. Dostpne s rwnie przeciwciaa monoklonalne rozpoznajce odcity fragment biaka PARP. Te ostatnie s dostpne w postaci zestawu (np. Anti-PARP CSSA FITC apoptosis detection kit firmy BioSource). W zestawie tym jest: krlicze przeciwciao poliklonalne rozpoznajce miejsce rozcicia PARP (antiPARP cleavage site specific antibody), roztwr zawierajcy BSA i azydek sodu; roztwr paraformaldehydu do utrwalenia komrek; roztwr permeabilizujcy bon komrkow, zawierajcy saponin; peptyd (o sekwencji rozcitego PARP) blokujcy reakcj wizania antygen-przeciwciao (kontrola negatywna). Barwienie przebiega nastpujco: 1. Uzyska zawiesin badanych komrek. W przypadku komrek rosncych na powierzchni uy do ich oderwania od powierzchni naczynia hodowlanego 2 mM EDTA (nie trypsyny). 2. Wirowa komrki przy 300 g przez 5 minut. 3. Utrwali osad komrek w paraformaldehydzie (20 minut w 4oC). 4. Zwirowa komrki i przepuka dwukrotnie PBS. 5. Zawiesi komrki w buforze permeabilizujcym i doprowadzi do stenia 1 106 komrek na 50 l zawiesiny (ok. 20 milionw komrek na mililitr!). 6. Odpipetowa po 50 l zawiesiny do probwek pomiarowych. 7. Doda po 10 l przeciwciaa do kadej probwki i inkubowa 30 minut w temperaturze pokojowej. 8. Dwukrotnie przepuka komrki 2 ml buforu permeabilizujcego. 9. Przepuka w PBS i zawiesi komrki w 0,5 ml PBS. 10. Kontrola negatywna: zamiast dodania przeciwciaa (punkt 7) zmiesza 10 l tego przeciwciaa z 10 l peptydu blokujcego, inkubowa nieco duej ni 30 minut w temperaturze pokojowej i nastpnie doda cae 20 l do zawiesiny komrek i inkubowa 30 minut w temperaturze pokojowej. Dalsze czynnoci (punkty 8 i 9) jak wyej.

BADANIE DZIAANIA CYTOTOKSYCZNEGO SUBSTANCJI CHEMICZNYCH

159

RYCINA 7. Test PARP. Histogramy fluorescencji FL-1 (przeciwciao anty-PARP skoniugowane z FITC), o odcitych. Panel A - kontrola negatywna, panel B kontrola negatywna z przeciwciaem zablokowanym peptydem blokujcym, panel C prba badana wykazujca ok. 40% komrek w apoptozie

11. Mierzy fluorescencj w kanale FL-1 (zielona fluorescencja FITC). Na rycinie 7 przedstawiono przykadowe wyniki oznaczenia rycina pochodzi z ulotki firmy BioSource. Panel A przedstawia histogram fluorescencji FITC (FL-1), z ktr zwizane jest przeciwciao anty-PARP. Na histogramie ustawia si dwa regiony (M1 i M2), przylegajce do siebie. Region M1 obejmuje to (w tym autofluorescencj) i siga od 100 do ok. 101. Odsetek komrek w regionie M2 powinna wynosi od 0 do 5% dla prawidowo rosncej populacji komrek. Panel B przedstawia kontrol negatywn z przeciwciaem anty-PARP zablokowanym specyficznym peptydem (patrz punkt 10 powyej). Metoda PARP jest czua, precyzyjna i swoista i jest czsto stosowana przez autora.

TUNEL
Jedn z istotnych cech pniejszych stadiw apoptozy jest fragmentacja DNA przez jdrowe endonukleazy. Stwierdzenie tego zjawiska jest moliwe dziki istnieniu szeregu testw. Jednym z nich jest opisana przez Darynkiewicza [4, 5, 6] elucja drobnoczsteczkowego DNA w buforze cytrynianowym. Po inkubacji w tym buforze, komrki apoptotyczne cechuj si nisz ni charakterystyczna dla fazy G1 zawartoci DNA i znajduj si na histogramach DNA w regionie sub-diploidalnym (sub-G1). Podobny wynik mona otrzyma znakujc DNA dowolnym, specyficznym barwnikiem (np. DAPI) i mierzc zawarto DNA w komrkach bez uprzedniej

160

J. SKIERSKI

elucji DNA. Odsetek komrek w zakresie poniej piku G1 na histogramie przedstawiajcym profil DNA moe rwnie suy jako orientacyjny wskanik cytotoksycznoci. Test ten nie moe jednak suy do oceny ilociowej. Naley bowiem pamita, e komrki majce zawarto DNA poniej 10% zawartoci komrek w fazie G1 s ciakami apoptotycznymi! Innym testem jest elektroforeza elowa DNA (w elu agarozowym), ktra pozwala na stwierdzenie obecnoci niskoczsteczkowych (o dugoci ok. 300 par zasad) fragmentw. Metoda ta jest jednak trudna do ilociowej analizy. Obecno fragmentw DNA (pkni nici) mona rwnie stwierdzi przy uyciu metody zwanej TUNEL [2, 9, 10, 23]. Polega ona na doczaniu nukleozydw (bromodeoksy-urydynotrifosforanu, deoksyurydynotrifosforanu lub innych) do wolnych kocw 3'-OH podwjnej lub pojedynczej nici DNA przez enzym TdT (kocow transferaz deoksynukleozydw). Trifosforany nukleozydw zostaj wbudowane do nici DNA w miejscach jej pkni, a przeciwciao przeciwko doczanemu nukleozydowi, skoniugowane z fluorochromem, pozwala na ilociow ocen stopnia degradacji DNA. Zestawy do metody TUNEL s dostpne komercyjnie (np. APO-BrdU Kit, BD Pharmingen). Powyszy zestaw zawiera: przeciwciao monoklonalne anty-BrdU znakowane FITC; bufor barwicy z PI i RNA-z; bufor reakcyjny zawierajcy kwas kakodylowy; bufor do pukania; bufor myjcy. W osobnym opakowaniu, przesyanym w temperaturze 80oC (w suchym lodzie), znajduje si Br-dUTP; utrwalone komrki kontroli negatywnej; utrwalone komrki do kontroli pozytywnej; enzym TdT. Barwienie przebiega nastpujco: 1. Komrki powinny by uprzednio utrwalone w paraformaldehydzie i przechowywane w 70% alkoholu etylowym w 20oC. 2. Zwirowa komrki (300 g, 5 min), odrzuci etanol. 3. Dwukrotnie zawiesi osad w 1 ml buforu myjcego, zwirowa i odessa supernatant. 4. Zawiesi ok. 106 komrek w 50 l roztworu znakujcego DNA (przygotowanego ex tempore z odczynnikw zawartych w zestawie (bufor reakcyjny, enzym TdT, Br-dUTP, woda destylowana). 5. Inkubowa w 37oC przez 60 min, w ani wodnej, potrzsajc co 15 minut. 6. Doda 1 ml buforu puczcego, zwirowa (300 g, 5 min). 7. Powtrzy pukanie. 8. Zawiesi osad komrek w 0,1 ml roztworu przeciwciaa anty-BrdU i inkubowa w ciemnoci, w temperaturze pokojowej przez 30 minut. 9. Doda 0,5 ml buforu barwicego zawierajcego PI i RNA-z; inkubowa nastpne 30 minut w ciemnoci i w temperaturze pokojowej. 10. Mierzy fluorescencj. Natenie fluorescencji zielonej FITC (FL-1) jest zalene od liczby pkni nici DNA, natomiast wartoci natenia wiata w kanale FL-3 (jodek propidyny, wzmocnienie liniowe!!!) daje obraz cyklu komrkowego. To podwjne barwienie pozwala na stwierdzenie istnienia (lub nieistnienia) wspzalenoci mierci komrek i fazy cyklu komrkowego. Ryciny 8 i 9 przedstawiaj cytogramy komrek kontrolnych (ryc. 8) i komrek traktowanych substancj cytotoksyczn (ryc. 9), niewykazujc specyfiki w stosunku do fazy cyklu komrkowego. Na obu rycinach naniesiono opisy faz cyklu komrkowego (fazy G1, S i G2+M).

BADANIE DZIAANIA CYTOTOKSYCZNEGO SUBSTANCJI CHEMICZNYCH

161

Dobr zastosowanej metody zaley od wielu czynnikw. Pamita naley, e wynik negatywny uzyskany ktrkolwiek metod jest bez wartoci, natomiast wynik pozytywny wiadczy o wystpowaniu w danej prbie apoptozy. Jedyn metod pewn jest stwierdzenie lub nie stwierdzenie w prbce wybarwionej barwnikiem DNA (PI lub DAPI), w mikroskopie fluorescencyjnym, charakterystycznych zmian morfologicznych w komrce obkurczenia komrki, obkurczenia jdra komrkowego i charakterystycznej kondensacji chromatyny i wreszcie tworzenia si ciaek apoptotycznych (ryc. 1). W praktyce autora badanie wpywu cytotoksycznego substancji chemicznych rozpoczynamy od najprostszego i najtaszego testu z FDA/ PI. Nastpnie stosujemy test z Aneksyn V i PI i w wybranych przypadkach test

RYCINA 8. Test TUNEL. Cytogram FL-1/FL-3. O odcitych natenie fluorescencji jodku propidyny (FL-3) zawarto DNA; o rzdnych natenie fluorescencji FITC (FL-1) ilo pkni nici DNA. Region R1 zawiera komrki w pnej apoptozie. Populacja kontrolna (ok. 1% komrek w apoptozie). Na osi odcitych zaznaczono fazy cyklu komrkowego. W kanale ~200 faza G1, dalej faza S, w kanale ok. 400 fazy G2 i M. Naley zwrci uwag, e wzmocnienie fluorescencji FL-3 jest liniowe!

RYCINA 9. Test TUNEL. Cytogram FL-1/FL-3. O odcitych natenie fluorescencji jodku propidyny (FL-3) zawarto DNA; o rzdnych natenie fluorescencji FITC (FL-1) ilo pkni nici DNA. Region R1 zawiera komrki w pnej apoptozie. Populacja traktowana substancj cytotoksyczn (ok. 45% komrek w apoptozie). Na osi odcitych zaznaczono fazy cyklu komrkowego. W kanale ~200 faza G1, dalej faza S, w kanale ok. 400 fazy G 2 i M. Naley zwrci uwag, e wzmocnienie fluorescencji FL-3 jest liniowe!

PARP. Dla potwierdzenia pnej apoptozy stosujemy TUNEL, ktry jest najbardziej pracochonny i kosztowny. Inne metody jak badanie potencjau bony mitochondrialnej lub badanie zawartoci aktywnej kaspazy 3 przy uyciu specyficznego przeciwciaa nie s w naszej Pracowni w rutynowym uyciu. Na zakoczenie naley doda uwag na temat planowania dowiadczenia. Czas trwania ekspozycji komrek na substancj cytotoksyczn powinien by co najmniej rwny rzeczywistemu czasowi podwojenia populacji (czasowi trwania cyklu komrkowego). W przypadku dziaania przez czas krtszy, szczeglnie jeeli badana substancja dziaa w okrelonej fazie cyklu komrkowego (np. pochodne nukleozydw dziaaj w fazie S), nie wszystkie komrki s poddane temu dziaaniu i wyniki ilociowe mog by niepoprawne. Wiele cennych uwag na ten temat znajdzie czytelnik w fundamentalnej pracy Franka Traganosa [38], a w szczeglnoci rozwaania dotyczce okrelania czasu trwania cyklu komrkowego i poszczeglnych jego faz (tzw. metoda statmokinetyczna opracowana przez Darynkiewicza) [38, str. 289].

162

J. SKIERSKI

LITERATURA
[1] CLODI K, KLICHE KO, ZHAO S, WEIDNER D, SCHENK T, CONSOLI U, JIANG S, SNELL V, ANDREEF M. Cell-Surface Exposure of Phosphatidylserine Correlates With the Stage of FludarabineInduced Apoptosis in Chronic Lymphocytic Leukemia and Expression of Apoptosis-Regulating Genes. Cytometry 2000; 40: 1925. [2] DARZYNKIEWICZ Z, BEDNER E. TRAGANOS F. Difficulties and pitfalls in analysis of apoptosis. w: Methods in Cell Biology. Cytometry. Tom 63, wyd, 3. 2001. [red.] Z. Darzynkiewicz, HA Crissman, J.P. Robinson. Academic Press. [3] DARZYNKIEWICZ Z, BRUNO S, DEL BINO G, GORCZYCA W, HOTZ MA, LASSOTA P,TRAGANOS F. Features of apoptotic cells measured by flow cytometry. Cytometry 1992; 13: 795808. [4] DARZYNKIEWICZ Z, GORCZYCA W, ARDELT B, HALICKA D, JUAN G, TRAGANOS F. Cytometria apoptozy i martwicy. Central Eur J Immunol 1996; 21: S156S170. [5] DARZYNKIEWICZ Z, JUAN G, XUN LI, GORCZYCA W, MURAKAMI T, TRAGANOS F. Cytometry in Cell Necrobiology: Analysis of Apoptosis and Accidental Cell Death (Necrosis). Cytometry 27: 1 - 20, 1997. [6] DARZYNKIEWICZ Z, XUN LI, GONG J. Assays of Cell Viability: Discrimination of cells Dying by Apoptosis. W: Methods in Cell Biology. [red] Z. Darzynkiewicz, J. P. Robinson, H.A. Crissman. Academic Press, San Diego, 1994; 41: 1639. [7] FINUCANE DM, WATERHOUSE NJ, AMARANTE-MENDES GP, COTTER T, GREEN DG. Collapse of the inner mitochondrial transmembrane potential is not required for apoptosis of HL60 cells. Exp Cell Res 1999; 251: 166174. [8] GODLEWSKI MM, MOTYL MA, GAJKOWSKA B, WARSKI P, KORONKIEWICZ M, MOTYL T. Subcellular redistribution of BAX during apoptosis induced by anticancer drugs. AntiCancer Drugs 2001;12: 607617. [9] GORCZYCA W, BRUNO S, DARZYNKIEWICZ R, GONG J, DARZYNKIEWICZ Z. DNA strand breaks occuring during apoptosis: Their early in situ detection by the terminal deoxynucleotidyl transferase and nick translation assays and prevention by serine protease inhibitors. Int J Oncol 1992; 1: 639 648. [10] GORCZYCA W, GONG J, DARZYNKIEWICZ Z. Detection of DNA strand breaks in individual apoptotic cells by the in situ terminal deoxynucleotidyl transferase and nick translation assays. Cancer Res 1993; 52: 19451951. [11] GRDZKA I. Apoptoza: decyzja naley do mitochondrium. Post Bioch 2000; 46: 216. [12] GREEN DR, REED JC. Mitochondria and apoptosis. Science 1998; 281: 13091312, [13] GRUBER BM. Samobjcza mier komrek mechanizm i rola w powstawaniu i leczeniu chorb czowieka. BIL 2002; 46: 155174. [14] GRUNDLER W, DIRSCHERL P, BEISKER W, MARX K, STAMPFL A, MAIER K, ZIMMERMANN I, NSSE M. Early Functional Apoptotic Responses of Thymocytes Induced by Tri-n-butylin. Cytometry 2001; 44: 4556. [15] GRZELAKOWSKA-SZTABERT B. Molekularne mechanizmy apoptozy indukowanej poprzez aktywacj bonowych receptorw z nadrodziny TNF-R. Post Biochem 1998; 44: 821. [16] HALICKA HD, BEDNER E, DARZYNKIEWICZ Z. Segregation of RNA and separate packaging of DNA and RNA in apoptotic bodies during apoptosis. Exp Cell Res 2000; 260: 248256. [17] JONES KH, SENFT JA. An improved method to determine cell viability by simultaneous staining with fluorescein diacetate-propidium iodide. J Histochem Cytochem 1985; 33: 7779. [18] KILIASKA ZM, MIKIEWICZ A. Kaspazy krgowcw; ich rola w przebiegu apoptozy. Post Biol Kom 2003; 30: 129152. [19] KING MA, RADICCHI-MASTROIANI MA. Antimycin A-induced apoptosis of HL-60 cells. Cytometry 2002; 49: 106112. [20] LECOEUR H, PRVOST MC, GOUGEON ML. Oncosis is Associated with Exposure of Phosphatidylserine Residues on the Outside Layer of the Plasma Membrane: A Reconsideration of the Specificity of the Annexin V/Propidium Iodide Assay. Cytometry 44: 65 - 72, 2001. [21] LI X, DARZYNKIEWICZ Z. Cleavage of poly(ADP-ribose) polymerase measured in situ in individual cells: relationship to DNA fragmentation and cell cycle position during apoptosis. Exp Cell Res 2000; 255: 125132.

BADANIE DZIAANIA CYTOTOKSYCZNEGO SUBSTANCJI CHEMICZNYCH

163

[22] LI X, DU L, DARZYNKIEWICZ Z. During apoptosis of HL-60 and U-937 cells caspases are activated independently of dissipation of mitochondrial electrochemical potential. Exp Cell Res 2000; 257: 290 297. [23] LI X, MELAMED MR, DARZYNKIEWICZ Z. Detection of apoptosis and DNA replication by different labeling of DNA strand breaks with fluorochromes of different color. Exp Cell Res 1996; 222: 2837. [24] MAJNO G, JORIS I. Apoptosis, Oncosis, and Necrosis. An overview of Cell Death. Am J Pathol 1995; 146: 316. [25] MIGNOTTE B, VAYSSIERE JL. Mitochondria and apoptosis. Eur J Biochem 1998; 252: 115. [26] MOTYL T. Regulation of apoptosis: involvement of Bcl-2-related proteins. Reprod Nutr Dev 1999; 39: 4959. [27] MOTYL T. Apoptoza mier warunkujca ycie. Post Biol Kom 1998; 25: 313334. [28] MOTYL T, GAJKOWSKA B, POSZAJ T, WARSKI P, ORZECHOWSKI A, ZIMOWSKA W, WOJEWDZKA U, RYNIEWICZ Z, REKIEL A. Rola bax i bcl-2 w regulacji apoptozy komrek nabonka gruczou mlekowego. Post Biol Kom 2000; 27: 3151. [29] MOTYL T, GRZELKOWSKA K, ZIMOWSKA W, SKIERSKI J, WARSKI P, POSZAJ T, TRZECIAK L. Expression of bcl-2 and bax in TGF-1-induced apoptosis of L-1210 leukemic cells. Eur J Cell Biol 2000; 75: 367374. [30] MRZ P, MYNARCZUK I. Mechanizmy indukcji apoptozy i zastosowanie TRAIL w terapii nowotworw. Post Biol Kom 2003; 30: 113128. [31] NEWCOMB EW, TAMASDAN C, ENTZMINGER Y, ALONSO J, FRIEDLANDER D, CRISAN D, MILLER DC, ZAGZAG D. Flavopiridol induces mitochondrial-mediated apoptosis in murine glioma GL261 cells via release of cytochrome c and apoptosis inducing factor. Cell Cycle 2003; 2: 243250. [32] PEREZ-GALN P, MARZO I, GIRALDO P, RUBIO-FELIX D, LASSIERRA P, LARRAD L, ANEL A, NAVAL J. Role of caspases and apoptosis - inducing factor (AIF) in cladribine-induced apoptosis of B-cell chronic lymphocytic leukemia. Leukemia 2002; 16: 21062114. [33] PHANEUF S, LEEUWENBURGH C. Apoptosis and exercise. Med Sci Sports Exerc 2001; 33: 393396. [34] RADZISZEWSKA E, PIWOCKA K, SKIERSKI J, SIKORA E. UVC-induced cell death of IL-2-dependent human lymphocytes. Cell Biol Int 1999; 23: 97103. [35] SMOLEWSKI P, BEDNER E, DU L, HSIEH T-C, WU JM, PHELPS DJ, DARZYNKIEWICZ Z. Detection of Caspases Activation by Fluorochrome-Labelled Inhibitors: Multiparameter Analysis by Laser Scanning Cytometry. Cytometry 2001; 44: 7382. [36] STEUBE KG, JADAN A, TEEPE D, DREXLER HG. Expression of bcl-2m-RNA and protein in leukemia-lymphoma cell lines. Leukemia 1995; 9: 18411846. [37] TELFORD WG, KOMORIYA A, PACKARD BZ. Detection of localized Caspase activity in early apoptotic cells by laser scanning cytometry. Cytometry 2002; 47: 8188. [38] TRAGANOS F. Mechanism of antitumor drug action assessed by cytometry. W: Methods in Cell Biology [red.] Z. DARZYNKIEWICZ, M. ROEDERER and H. TANKE. Elsevier, San Diego 2004; 75: 257305. [39] TSUJIMOTO Y, IKEGAKI N, CROCE CM. Characterization of the protein product of bcl-2, the gene involved in human follicular lymphoma. Oncogene 1987; 2: 37. [40] ZAMAI L, CANONICO B, LUCHETTI F, FERRI P, MELLONI E, GUIDOTTI L, CAPPELLINI A, CUTRONEO G, VITALE M, PAPA S. Supravital Exposure to Propidium Iodide Identifies Apoptosis on Adherent Cells. Cytometry 2001; 44: 5764.

Janusz Skierski Pracownia Cytometrii Zakadu Biologii Komrki, Narodowy Instytut Lekw, 00-725 Warszawa, ul. Chemska 30/34 e-mail: jskierski@aol.pl