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Artculo de Revisin

NUEVOS SISTEMAS VIRALES EN TERAPIA GNICA


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A. Talavera1, H. Snchez2 Centro de Biologa Molecular Severo Ochoa (CSIC-UAM). 2Centro Nacional de Biotecnologa.

INTRODUCCIN La transferencia gnica, o transgnesis, consiste en la introduccin de material gentico en clulas apropiadas, con objetivos diversos. El ms simple de stos es la obtencin de copias idnticas del material introducido, generalmente ADN, en cantidades adecuadas para su manejo, modificacin o estudio de su estructura y expresin(1). En su aspecto ms prctico, modificacin o estudio de su estructura y expresin(1). En su aspecto ms prctico, la transferencia gnica busca la fabricacin, con fines industriales o teraputicos, de productos gnicos por parte de las clulas receptoras del gen transferido (denominado, en general, transgn), que pueden ser clulas en cultivo o bien formar parte de un organismo completo modificado genticamente, conocido como transgnico(2). Dos aplicaciones de la transgnesis recientes y relacionadas entre s son la terapia gnica propiamente dicha(3, 4), y la terapia celular(5); tcnicas en las que se utilizan clulas propias del paciente o de un individuo donante capacitadas para producir y suministrar in vivo al paciente un producto gnico curativo. La utilizacin de las clulas como factoras de productos teraputicos ha requerido la optimizacin de los mtodos de transferencia para poder aplicarlos con alta eficiencia y seguridad, as como con la menor dosis de invasividad posible. Mientras que los objetivos ms primarios de la transgnesis pueden llevarse a cabo utilizando clulas en cultivo, con las cuales pueden usarse mtodos tales como la electroporacin o la coprecipitacin del ADN con fosfato clcico, la naturaleza poco fisiolgica y relativamente txica de estos procedimientos impide su uso en el cuerpo humano. Ha sido necesario encontrar, por lo tanto, vas alternativas de transgnesis que no opongan estos inconvenientes, lo que ha llevado al desarrollo de dos grandes tipos de vectores de transgnesis: los que utilizan macromolculas basadas en lpidos o polmeros orgnicos (lipoplejos y poliplejos, respectivamente), capaces de englobar ADN(6-9), y los basados en la modificacin gentica de virus. La idea de utilizar la capacidad natural que tienen los virus para introducir material gentico en sus clulas husped es anterior al nacimiento conceptual de la terapia gnica, y ya se haba aplicado a los dems objetivos de la transgnesis(10-12). Sin embargo, la naturaleza clnica de la terapia gnica condicion la eleccin de capacidad de integrar el material gentico viral en el celular (lo que prometa una estabilidad y permanencia del gen teraputico) o la posibilidad de dirigir la transferencia a tejidos predeterminados. En una previa revisin(13) describamos los principales tipos de vectores virales usados hasta ese momento en protocolos de terapia gnica, es decir, vectores retrovirales, adenovirales, adenoasociados y basados en Herpesvirus. El paso del tiempo ha hecho que estos mismos vectores hayan sido modificados y mejorados, al tiempo que otros nuevos tipos se han ido incorporando al conjunto. La primera de estas irrupciones fue tambin objeto de un artculo en estas pginas(14), y consisti en el uso de retrovirus que forman parte del gnero Lentivirus, entre los que se encuentra el virus del SIDA. Este cambio, que indudablemente aada en aquel momento el riesgo de utilizar como agente curativo elementos de un virus altamente patgeno, se debi a que estos retrovirus eran, a diferencia de los retrovirus clsicos (conocidos genricamente como oncovirus), capaces de infectar y transducir clulas en reposo, estando en el que se encuentran normalmente las clulas ms apropiadas para una terapia gnica duradera, como son las clulas progenitoras de los diferentes tejidos somticos. Cabra preguntarse sin esfuerzos que podran ser aplicados a la mejora de los sistemas de vectores virales ya conocidos deben, en cambio, emplearse en desarrollar nuevos sistemas. La respuesta est en la gran diversidad de los virus y sus modos de replicarse, que abre la posibilidad de nuevos usos teraputicos derivados de diferentes modos de replicacin viral. En el desarrollo de nuevos sistemas pueden aparecer, por otra parte, nuevos problemas cuya solucin requiere estrategias diferentes a las usadas en los sistemas previos. A lo largo de esta revisin vamos a repasar, primeramente,
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Nuevos sistemas virales en terapia gnica

ADN -

2 PPT

CTS

ADN + Normal

ADN + Secundario

Figura 1. Estructura de la parte central del ADN del VIH. La cadena negativa del ADN presenta un tracto de polipurina extra (2 PPT), del que se origina una cadena positiva de ADN (ADN+ secundario). Otra cadena positiva, originada en la PPT normal (fuera de los lmites del esquema), termina su sntesis en la regin CTS, ulterior a la 2 PPT, la zona del ADN comprendida entre ambas regiones de origen y terminacin es, por lo tanto, tricatenaria.

las modificaciones y mejoras aportadas a los sistemas clsicos de vectores virales de terapia gnica; a continuacin haremos una descripcin de los fundamentos y aplicaciones de nuevos sistemas no tratados en las pasadas revisiones. VECTORES RETROVIRALES Lentivirus y entrada en el ncleo En la citada revisin del 2000(14) se conclua que la entrada en el ncleo del complejo de preintegracin del VIH vena posibilitada por la existencia de seales de localizacin nuclear en las diferentes protenas que forman, junto con el ADN viral recin transcrito, el complejo de reintegracin. Nuevos estudios completaron esta visin, al observarse que tanto en el VIH(15, 16) como en otros lentivirus(17, 18) existe una estructura de ADN tricatenario hacia la zona central del ADN, que contiene una secuencia rica en purinas (PPT) anloga a la que normalmente est presente en la zona subterminal del ARN viral y que sirve, durante la transcripcin inversa, de cebador de la sntesis de la segunda cdena (cadena +) del ADN(13). Esta secuencia, llamada segunda PPT sirve de cebador independiente de un ADN+, y est situada antes de la seal de terminacin (CTS) del ADN+ normal, por lo que se da un solapamiento entre ambos ADN+, que da cuenta de la regin de tres cadenas (Fig. 1). La conformacin impuesta por esta estructura es lo que permite al ADN la entrada al ncleo a travs de los poros nucleares. Como era de esperar, poco tiempo despus de la descripcin de este elemento apareci en la literatura su aplicacin a nuevos vectores basados en lentivirus(19-22). Empaquetamiento transitorio La tecnologa que conduce a la obtencin de retrovirus recombinantes o transductores se basa en la coexistencia en una clula, en un momento determinado, de dos elementos genticos(13): a) Un provirus artificial que en el que los genes estructurales del retrovirus han sido sustituidos por el transgn que se desea transducir; el ARN transcrito a partir de este provirus ha de conservar, entre otros elementos retrovirales, la capacidad de ser encapsidado. b) Genes que expresen las protenas virales necesarias para la formacin de cpsidas donde el ARN del provirus artificial puedan ser encapsidadas. Sin embargo, los ARNs mensajeros correspondientes a estos genes deben ser incapaces (o haber sido activamente incapacitados) para pasar a formar parte de las cpsidas virales que sus genes contribuyen a formar, ya que ello dara lugar a la aparicin, junto a los deseados retrovirus transductores incapaces de formar nueva progenie, de retrovirus normales, que no slo seguiran propagndose una vez que infectasen las clulas blanco, sino que ayudaran a los virus transductores a propagarse con ellos, situacin no deseada en el contexto de la terapia gnica, cuyo objetivo es transportar el gen curativo a las clulas diana y no a sus vecinas. Normalmente, el primero de los elementos se halla en un plsmido retroviral genmico que contiene los LTR y otras regiones de control propias de un provirus, y en el que se ha insertado el transgn(13, 23). Este plsmido se introduce en una estirpe celular, llamada empaquetadora (Fig. 2) en la que previamente, y de forma estable, se ha introducido el segundo de los elementos, generalmente en dos plsmidos independientes, uno de ellos portador de los genes estructurales de la cpsida y nucleocpsida retroviral (genes gag y pol) y el otro portando los genes que dan lugar a las protenas de la envuelta viral (gen env). La fraccin de lulas empaquetadoras que han recibido el plsmido con el transgn, y que
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LTR

Transgn

LTR gag pol env

gag pol
LTR
Tran

env
sgn LTR

Figura 2. Tcnica clsica de preparacin de retrovirus recombinantes. El vector retroviral genmico se introduce en las clulas empaquetadoras, que expresan estable y constitutivamente los genes estructurales del retrovirus. Las clulas obtenidas producen partculas de virus que empaquetan el ARN que contiene el transgn.

LTR
ga p gol

Transgn

LTR

en v

gag pol

env

LTR Transgn LTR

Figura 3. Empaquetamiento transitorio de retrovirus recombinantes. Una estirpe celular normal se cotransfectan con el vector retroviral genmico y con plsmidos que contienen los genes virales estructurales. Las clulas cotransfectadas expresan transitoriamente los productos de todos los genes introducidos, produciendo partculas virales con el ARN recombinante requerido.

ahora pueden ya llamarse clulas productoras de retrovirus recombinantes, han de seleccionarse [usando para ello un gen selector que comnmente acompaa al transgn(13, 24)], y ser usadas como poblacin general para la produccin de virus o, de manera ptima, ser clonadas para elegir los clones que producen ms cantidad de partculas virales recombinantes, produccin que depende, entre otros factores, del locus de la clula empaquetadora en el que el vector retroviral ha quedado integrado(24, 25). Todo el proceso arriba indicado es tedioso y extenso en el tiempo. La aplicacin de genes selectores de accin rpida, como el gen de la protena verde fluorescente (EGFP) de la medusa Aequorea victoria(26, 27), ha posibilitado la preparacin de clulas productoras mediante la tcnica conocida como transfeccin transitoria(28), que consiste en la introduccin simultnea en una poblacin celular de todos los elementos necesarios para la produccin de virus recombinantes (Fig. 3), cuya expresin transitoria es suficiente para la preparacin, durante un tiempo limitado, de virus recombinantes con ttulos tiles para la mayora de los experimentos. La cantidad de la transfeccin puede ser determinada, por medio de citometra, en una fraccin de las clulas transfectadas al cabo de 24 o 48 horas despus de la misma, de manera que si la proporcin de clulas transfectadas (fluorescentes) resultara ser reducida (lo que sera indicativo de una baja produccin de virus) se procedera a una nueva transfeccin sin la larga espera inherente al procedimiento de trans3

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feccin estable. Para la transfeccin transitoria se utiliz en un primer momento la electroporacin(28). Sin embargo, se ha determinado que para la preparacin de clulas empaquetadoras por transfeccin transitoria es ms conveniente usar el procedimiento clsico de introduccin de material gentico en clulas animales, es decir, la coprecipitacin de ADN con fosfato clcico(29), ya que produce menos mortalidad celular(30). Pseudotipaje La formacin de partculas de retrovirus recombinantes exige la participacin de un gen que codifique las protenas de la envuelta viral. La tecnologa primitiva utilizaba los genes env correspondientes a las estirpes ecotrpica (capaz de infectar exclusivamente ratones y ratas) o anfotrpica (capaz de infectar un rango ms amplio de huspedes, entre los que se cuenta la especie humana) del virus de la leucemia murina de Moloney, dependiendo, en lneas generales, del destino ltimo pensado para los vectores y de la seguridad respecto al experimentador de que se les deseaba dotar(13). La fragilidad que presentan las envueltas que contienen este tipo de protenas haca imposible la concentracin de virus por mtodos mecnicos, tales como la precipitacin y centrifugacin. Este inconveniente, unido al desarrollo posterior de vectores basados en el VIH, condujo a la produccin de partculas virales que contenan envueltas propias de otros virus, procedimiento al que (tomando la terminologa propia de un fenmeno natural conocido durante largo tiempo, merced al cual el virus de determinado tipo serolgico adquiran, independientemente de su genoma, caractersticas inmunolgicas de un tipo diferente) se le conoce como pseudotipaje. El gen normalmente elegido es el correspondiente a la protena G de la envuelta del virus de la estomatitis vesicular, que confiere a las partculas virales la resistencia mecnica suficiente para que puedan ser sometidas a concentracin por los mtodos anteriormente apuntados(31-32). Problemas de mutagnesis integrativa Todas las revisiones sobre vectores retrovirales incluan, hasta ahora, una consideracin terica sobre la posibilidad de que la integracin del provirus causase efectos inesperados e indeseados en el genoma celular, lo que frustara y complicara el propsito curativo perseguido, aunque en casi todos los casos se haca nfasis en que estos efectos no haban sido nunca encontrados. La base principal para este toque de atencin era doble: por una parte, la integracin poda llevarse a cabo en un sitio que interrumpiese un gen esencial para la biologa de la clula(13). En general, este tipo de modificacin implicara nicamente que la supervivencia de la clula que habra recibido el gen teraputico estara seriamente comprometida, conduciendo al fracaso de la terapia gnica sin producir ningn perjuicio adicional al paciente. Sin embargo, si el gen inactivado fuese un gen supresor de tumor, la inactivacin podra implicar la puesta en marcha de un proceso neoplsico. Por otra parte, el hecho de que los provirus retrovirales, naturales o recombinantes, contengan secuencias promotoras a ambos lados abre la posibilidad de que los genes contiguos al provirus, posteriores en cuanto a la direccin de transcripcin de ste, puedan ser anmalamente activados por la propia integracin proviral, lo que en el caso de protooncogenes podra implicar, de nuevo, el disparo de un proceso tumoral. Este efecto fue finalmente detectado en un experimento realizado a principios del 2002 en ratones, por un grupo de investigadores alemanes(33) que usaron un gen marcador, en principio inerte, para marcar clulas de mdula sea de ratn, que fueron transplantadas en animales irradiados sin producir ningn efecto adverso. Sin embargo, cuando las clulas de estos ratones primarios fueron transplantadas a ratones secundarios, muchos de stos desarrollaron leucemia mieloide aguda. Un anlisis exhaustivo llev a los autores a concluir que la integracin del provirus haba activado el gen celular Evi1, que codifica un factor de transcripcin que, en cooperacin con el producto del transgn, contribuy a la aparicin de este tipo de leucemia. Los peligros de que avisaba este artculo se hicieron realidad pocos meses despus en un experimento que implicaba pacientes humanos, y precisamente en un programa teraputico que haba sido calificado como el primero (y por entonces nico) experimento de terapia gnica con xito demostrable. El experimento, llevado a cabo por un grupo francs liderado por A. Fischer, tena por objeto la curacin de un tipo de inmunodeficiencia severa combinada ligada al cromosoma X, en la que el gen inactivado codifica un receptor de citoquinas llamado c, necesario para la diferenciacin de
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Virus auxiliar Emp+ Relleno Transgn Relleno Emp+ Genes virales


LoxP E1

Transfeccin

Infeccin
Virus auxiliar

Genes virales Emp- E1Emp+ Transgn

Virus recombinante

Figura 4. Empaquetamiento de seguridad de adenovirus recombinante. La estirpe celular 293 Cre se transfecta con un plsmido que contiene el transgn flanqueado por los extremos del ADN de adnovirus, incluyendo las ITR y las secuencias de empaquetamiento, adems de secuencias de ADN no expresable cuya misin es que la distancia entre los extremos sea la apropiada para que el tamao del ADN permita su encapsidacin, las clulas transfectadas se infectan con un adenovirus auxiliar cuyo ADN aporta todos los genes virales necesario para la formacin de las cpsidas, pero cuya zona de empaquetamiento est contenida entre dos regiones IoxP. La recombinasa Cre expresada por las clulas promueve la recombinacin entre ambas regiones IoxP, eliminando la regin de empaquetamiento del ADN auxiliar, que no puede entrar a formar parte de la progenie. En cambio, el ADN que contiene el transgn el empaquetado normalmente para dar lugar a partculas de virus recombinante.

ciertos tipos de linfocitos(34). El gen teraputico se suministraba ex vivo, a clulas madre hematopoyticas de los pacientes por medio de un vector retroviral; los primeros resultados positivos, referidos a dos pacientes, fueron comunicados en el 2000. Sin embargo, unos dos aos ms tarde, cuando se haban tratado 10(35) u 11(36, 37) pacientes, apareci entre stos un caso de leucemia, cuyo anlisis demostr que era debida a proliferacin desmesurada de los linfocitos T que haban recibido el transgn(35), y en los cuales el provirus recombinante apareca integrado en el cromosoma 11, cerca de un gen del que previamente se saba que estaba implicado en la aparicin de leucemias juveniles. A este caso se sum poco ms tarde otro con las mismas caractersticas(36) de entre el grupo de pacientes. Finalmente apareci un tercer caso que contena el provirus integrado en el mismo sitio, aunque en este caso el paciente no exhiba sntomas de leucemia(37). Afortunadamente, el seguimiento exhaustivo de todo el grupo de pacientes ha permitido el tratamiento inmediato de aqullos que han desarrollado leucemia, pero estos resultados han hecho reconsiderar, y an detener, numerosos protocolos clnicos que implicaban el uso de vectores retrovirales. ADENOVIRUS: NUEVAS GENERACIONES DE VECTORES A lo largo de los ltimos aos se han desarrollado nuevas generaciones de vectores adenovirales: a) Vectores con genes inactivados, tambin denominados vectores de primera generacin, fue el primero en ser desarrollado con esta clase de virus. En la anterior revisin(13) se trat de la base del diseo de vectores adenovirales de esta generacin, consistente, originalmente en la delecin de la regin temprana E1 del genoma. Ms tarde se aadieron deleciones en otras regiones tempranas, principalmente la regin E3, para aumentar la seguridad de estos vectores. b) Vectores vacos. Las deleciones citadas resultaron no ser suficientes para evitar el elevado riesgo de inmunotoxicidad de estos vectores, debido a la expresin remanente de protenas virales. Consecuentemente se desarrollaron los denominados vectores vacos en los que slo se mantienen las secuencias necesarias en cis, incluyendo los dos orgenes de replicacin en los extremos del genoma, as como las secuencias de empaquetamiento. La produccin de estos vectores requiere el uso de adenovirus auxiliares, que pueden ser separados mediante tcnicas biofsicas gracias a su diferente contenido en ADN. Un mecanismo adicional de seguridad que evita la produccim de stos consiste en el flanqueamiento de la regin de empaquetamiento de los virus con la secuencia IoxP, que, en presencia de la recombinasa Cre se escinde, evitando la encapsidacin del genoma del virus auxiliar(38) (Fig. 4). En la actualidad, se estn llevando a cabo mejoras en las lneas productoras de estos vectores que permitan su produccin a gran escala en biorreactores(39).
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La eficacia de estos vectores est siendo evaluada en tratamientos tan diversos como la disfuncin erctil, mediante la transferencia del gen de la sintetasa de NO neuronal (nNOS) en el pene de ratas envejecidas(40), o la hemofilia A con un vector que contiene el gen del factor de coagulacin VIII y cuya administracin intravenosa en ratones permite una expresin mantenida durante nueve meses frente a los tres obtenidos con un vector de primera generacin(41), as como la prdida visual debida a retinopatas de origen diabtico tras la inyeccin intraocular de adenovirus vacos que expresan el gen de la endostatina, un inhibidor de la vascularizacin coroidal(42). c) Adenovirus oncolticos. El descubrimiento en 1996(43) de que ciertas estirpes de adenovirus con mutaciones en la zona E1B del genoma (gen que codifica una protena capaz de inactivar el gen supresor de tumor p53), podan replicar y lisar clulas humanas deficientes en p53, condujo al desarrollo de nuevas estrategias antitumorales. Los xitos obtenidos con este nuevo tipo de virus denominado ONYX-015(44) en ensayos clnicos de fase I y II ha permitido la realizacin de ensayos clnicos en fase III para el tratamiento de carcinoma de clulas escamosas de cuello y cabeza(45). Sin embargo, no todos los protocolos clnicos ensayados han tenido el xito que cabra esperar. Una de las razones de ello estriba en la ausencia de un receptor celular adecuado para estos vectores en las clulas tumorales(46). Entre los tratamientos que s parecen estar funcionando, cabe destacar los protocolos en fase II aprobados para pacientes de cncer colorrectal(47), con tumores hepatobiliares(48), o con carcinomas pancreticos no extirpables(49). VECTORES ADENOASOCIADOS Los vectores basados en virus adenoasociados (AAV) han sufrido en los ltimos aos un intenso desarrollo encaminado a mejorar las ya de por s ventajosas caractersticas que poseen, siendo una de ellas el alto contenido de partculas transductoras por unidad de volumen (ttulo) que se puede conseguir en su preparacin. En la citada publicacin(13) se describe la estructura de los vectores basados en virus adenoasociados y la tecnologa empleada para la obtencin de virus recombinantes, que requiere el uso de adenovirus auxiliar. La dependencia de este ltimo y el riesgo de contaminacin que conlleva ha conducido al desarrollo de diferentes estrategias para conseguir su eliminacin, una de las cuales se basa en sustituir el virus auxiliar por un plsmido que aporte exclusivamente los genes del adenovirus que realizan tal misin (E2a, E4orf6 y VA), conjuntamente con la utilizacin de la lnea celular HEK293, que expresa los genes adenovirales E1a y E1b(50). Se han desarrollado mtodos que permiten incluso rastrear la presencia de contaminantes, incorporando protenas fluorescentes fusionadas a los genes auxiliares(51). Otro de los problemas asociado a este tipo de vectores es la dificultapara generar lneas productoras debido a la toxicidad de la protena replicativa rep(13) en la mayora de las lneas eucariticas. Para solucionar este inconveniente se han desarrollado vectores basados en el virus herpes deficientes en replicacin, que contienen los genes rep/cap de AAV; este sistema hbrido permite, tras la infeccin con el vector basado en herpes de una clula que contenga el genoma del AAV recombinante, la generacin de los vectores buscados(52). Aunque, tras la demostracin de que es posible el empaquetamiento in vitro de partculas AAV, es muy probable que, en el futuro, la generacin de estas clulas empaquetadoras/productoras sea innecesaria(53, 54). Una de las grandes limitaciones de los vectores AAV es la cantidad de material gentico que es capaz de albergar la cpsida (< 5kb). Para aumentar esta capacidad de empaquetamiento se ha hecho uso de la propia biologa del virus, ya que su genoma es capaz de dimerizar y permannnecer en la clula transducida como concatmero(55) (Figs. 5, A y B). Este hecho ha permitido transducir genes de mayor tamao dividindolos en dos mitadas para ser introducidos por sendos vectores. Para eliminar la ITR (repeticin terminal invertida) del genoma del virus que queda entre los dos segmentos del transgn se puede hacer uso de secuencias de splicing de manera que se produzca el ARN mensajero buscado(56, 57) (Figs. 5, C y F). Esta estrategia ha sido probada recientemente para probar su eficacia en la retina. En la actualidad se conoce la base molecular de numerosas patologas oculares, lo que las convierte en candidatas a terapia gnica, mediante, por ejemplo, la transduccin de fotorreceptores o pigmentos retinales. En experimentos preliminares se ha demostrado que la retina puede ser transducida con este tipo de vectores y de expresar el transgn al menos durante un mes(58).
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Promotor ITR

Transgn ITR
ITR ITR

Trans...

SD

SA

...gn

Trans...

SD

SA

...gn ...gn

B
ITR ITR SD ITR SA ITR ITR

Promotor

Figura 5. Vectores adenoasociados de capacidad aumentada. A) Vector adenoasociado. Todos los genes virales han sido sustituidos por el transgn y su promotor, conservndose solamente las repeticiones terminales invertidas (LTR) y zonas adyacentes a stas propias del genoma viral. B) El ADN adenoasociado, tras replicarse forma concatmeros. Obsrvese que los monmeros pueden disponerse en tndem o de modo opuesto entre s. C) Vectores de capacidad aumentada, conteniendo, respectivamente, el promotor y la parte proximal del transgn Trans...) o la parte distal del mismo (...gn) seguida de una seal de poliadenilacin. En sitios convenientes se han colocado seales donante (SD) y aceptora (SA) de corte y empalme (splicing). D) La coinfeccin con ambos vectores produce concatmeros; en ocasiones, dos monmeros contiguos corresponden a ambas mitades del transgn, dispuestas convenientemente (zona cercada y ampliada). E) ARN transcrito a partir del promotor, antes de sufrir el corte y empalme. F) El ARN mensajero, tras ser procesado contiene la secuencia ininterrumpida del transgn, de donde se traducir el correspondiente producto gnico.

VECTORES BASADOS EN EL VIRUS DE LA VACUNA Y OTROS POXVIRUS Entre los grupos de virus que recientemente han ingresado en las filas de los vectores de transgnesis aplicados a la terapia gnica se encuentran los Poxvirus, cuyo representante ms utilizado es el virus Vaccinia, o virus vacunal. Este virus tiene una larga historia teraputica, al ser el primero que se us con tal fin, an antes de conocer su existencia como tal virus. La tcnica de vacunacin, ideada por Edward Jenner a finales del siglo XVIII con el fin de defender a la poblacin humana frente a la viruela, consista en la inoculacin en humanos de exudados de pstulas de viruela vacuna (que slo causa en nuestra especie infecciones localizadas). La infeccin conseguida, cuyo efecto desapareca en una semanas, causaba, debido a lo que hoy se conoce como una reaccin inmune cruzada entre virus emparentados, la inmunidad de los individuos tratados frente a la viruela humana, enfermedad que en aquellos momentos era causa de gran mostalidad y de graves secuelas. Esta tcnica se utiliz durante ms de siglo y medio en todo el mundo hasta que la Organizacin Mundial de la Salud declar la enfermedad erradicada en 1979. A esta erradicacin contribuy Espaa con la vacunacin llevada a cabo por la Real Expedicin de la Vacuna por todos los territorios hispanos de Ultramar entre 1803 y 1810, es decir, pocos aos despus del descubrimiento de la vacuna. El segundo centenario de esta Expedicin se celebra este ao, pudindose obtener informacin sobre la misma en la pgina de Internet: http://www2.cbm.uam.es /sev/WEBVAVI/CartaPresen.htm. A lo largo de todo ese perodo, en que los procedimientos de preparacin y conservacin de la vacuna eran empricos, el virus original presente en las pstulas del ganado vacuno debi acumular o, en algn momento, contaminarse con algn otro tipo de poxvirus, ya que una vez desarrollada la virologa y analizado el virus vacunal result, por una parte, no ser igual al de la viruela vacuna, siendo incluso ms semejante, aunque no idntico, al de la viruela equina. De todos modos, no se ha encontrado en la naturaleza un virus idntico al vacunal, que puede ser as considerado un virus cultivado(59-61) de la misma manera que, por ejemplo, el maz o la alpaca, especies domsticas cuyo antecedente silvestre se ha extinguido. El virus Vaccinia tiene una estructura compleja, oblongo, cuyo eje mayor mide unos 300 nm, mientras que su anchura es de 180-230 nm (Fig. 6A). Es un virus con envuelta, dentro de la cual se encuentra un nucleoide rodeado de una membrana, y el conjunto, a su vez, est rodeado por una capa lipdica; entre ambas capas se hallan unas estructuras lla7

ITR

ITR

E F
Trans...
An

Trans...

...gn

PollA

ARNm

Transgn

An

Nuevos sistemas virales en terapia gnica

RTI
Figura 6. A) Micrografa electrnica del virus Vaccinia, obtenida por F. Fenner (ICTVdB - The Universal Virus Database, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb /ICTVdB/). B) Esquema del ADN de Vaccinia, mostrando la polaridad de las cadenas y su unin en horquilla por los extremos. RTI: repeticiones terminales invertidas.

madas cuerpos laterales, cuya funcin es desconocida. El nucleoide contiene el material gentico, un ADN de 180.000 pares de bases (pb) en el que las dos cadenas se hallan conectadas entre s por lazos terminales formados por unas pocas bases no apareadas, en ambos extremos (Fig. 6B). Los 10.000 pb de ambos extremos son idnticos, pero dispuestos inversamente, por lo que esas secuencias reciben el nombre de repeticiones terminales invertidas (RTI), que contienen, a su vez, secciones repetidas en tndem, con una misin especfica en la replicacin del ADN viral. El ciclo completo del virus Vaccinia tiene lugar en el citoplasma, lo que implica que la partcula viral haya de aportar los enzimas necesarios para la expresin temprana del genoma viral de manera independiente del ncleo. Los productos de los genes tempranos son responsables de la replicacin del ADN viral como de la expresin de los genes tardos, que incluyen las protenas estructurales. stas se ensamblan entre s y con el nuevo ADN viral, en unas estructuras perinucleares llamadas factoras virales, para dar lugar al virus progenie. A principios de los aos 1980, dos grupos(62, 63) abordaron la tarea de adaptar este virus para su utilizacin como vector infectivo de clonaje y expresin de genes exgenos, con la idea de que el virus que haba dado la vacuna de la viruela sirviese tambin para vacunar contra otros microorganismos, ya fuese por expresin de los correspondientes antgenos en las clulas infectadas por el vector recombinante, como por la posibilidad de que las propias partculas virales fuesen portadoras de los antgenos de inters. Ms tarde, los vectores basados en Vaccinia se han usado para otros propsitos, tales como identificacin de receptores o correceptores para otros virus(64) o el efecto antiviral de algunas citoquinas(65). La insercin de un transgn en un genoma tan complejo como el de Vaccinia no es posible in vitro, y es necesario usar tcnicas de recombinacin in vivo (Fig. 7): un plsmido en el que se ha insertado el transgn en el centro de un gen viral previamente clonado [el gen temprano tk que codifica una timidina kinasa (TK) es muy conveniente para este fin], se introduce por transfeccin en clulas que subsiguientemente se infectan con Vaccinia. Mediante recombinacin homloga se logra as que algunos de los virus progenie contengan el transgn interrumpiendo el gen viral elegido para tal fin. En el caso del gen tk estas partculas virales recombinantes pueden ser seleccionadas por formacin de placas sobre monocapas de clulas TK en presencia de 5-bromodeoxiuridina, que mata las clulas infectadas por virus normal, pero no las no infectadas ni las infectadas por virus recombinante, que son, por lo tanto, los nicos capaces de formar placas de lisis de las que se pueden extraer virus recombinantes puros(59, 66). La aplicacin de Vaccinia a la terapia gnica se ha centrado principalmente en su vertiente antitumoral. Los primeros xitos se consiguieron transduciendo genes de citoquinas en tumores murinos(67, 68), lo que llev a efectuar un ensayo clnico en fase I(69) en pacientes con melanomas, consiguindose regresin total de los tumores en algunos casos.
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RTI

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Transgn

Figura 7. Obtencin de virus Vaccinia recombinante. Una estirpe celular capaz de ser infectada por el virus se transfecta con un plsmido que contiene el transgn, flanqueado por secuencias de un gen viral dispensable. Las clulas transfectadas se infectan con virus Vaccinia. Las ADNs plasmdico y viral recombinan por las zonas de homologa, con lo que el transgn se inserta en el ADN viral, que es empaquetado en las cpsidas virales producidas por la propia infeccin.

Tambin se ha aplicado Vaccinia en la tcnica antitumoral de suicidio por sistemas enzima-prodroga. Naturalmente, esta tcnica requiere un direccionamiento previo del vector, para no comprometer la supervivencia de tejidos ajenos al tumor. Afortunadamente, Bartlett y colaboradores describieron en el 2000 que una estirpe de Vaccinia que haba sido desprovista del gen de la timidina kinasa viral se replicaba selectivamente en clulas tumorales(70). Esta estirpe fue, por lo tanto, provista de los genes de enzimas correspondientes a dos sistemas enzima-prodroga: 1) citosina deaminasa, que metaboliza la prodroga 5-fluorocitosina(71); 2) purina nucletido fosforilasa que metaboliza la prodroga 6-metilpurina desoxirribsido(72). Este grupo est, por otra parte, utilizando este mismo tipo de mutantes de Vaccinia con el fin de desarrollar virus de naturaleza oncoltica, anlogos a los adenovirus citados anteriormente(44,61,73). Un direccionamiento Vaccinia de diferente naturaleza, aplicado a la potenciacin del sistema inmune contra clulas tumores, ha sido desarrollado por el grupo de Kieny(74), mediante insercin en Vaccinia del gen de un anticuerpo monoclonal capaz de reconocer antgenos presentes en la superficie de clulas de tumor de carcinomas gastrointestinales. En este caso, las clulas infectadas con el virus recombinante no eran las del tumor, sino clulas efectoras del sistema inmune (macrfagos y linfocitos T citotxicos), cuya accin citoltica se rediriga hacia las clulas cancergenas. La permanencia en la poblacin mundial de individuos que fueron sometidos a la vacunacin contra la viruela ha hecho temer que Vaccinia no pueda ser usado en estos pacientes con otros fines, debido a un rechazo inmune. Por ello se ha comenzado a investigar sobre la posibilidad de usar poxvirus alternativos. Uno de ellos es el virus de la enfermedad Yaba-like o anloga a Yaba detectaba en humanos que actuaban como cuidadores de primates en centros de investigacin en 1965, y que causaba, como Vaccinia, una enfermedad breve y benigna(75). El virus ha sido clasificado en el gnero Yabapoxvirus, donde se encuentran otros virus Yaba de tumores de monos. VECTORES BASADOS EN ALFAVIRUS Los alfavirus son virus con ARN monocatenario de polaridad positiva (es decir, la misma polaridad que el ARN mensajero) como material gentico, incluido en una nucleocpsida sencilla, formada por una sola protena viral. Es un virus con envuelta, que incluye, en forma de espculas, dos protenas, asimismo, codificadas por el virus. Se trata de virus esfricos de unos 60 nm de dimetro, y constituyen un gnero dentro de la familia de los Togavirus. El prototipo de los
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Nuevos sistemas virales en terapia gnica

cap

RNA Genmico (Cadena Positiva)


Genes no estructurales

P
Genes estructurales

PollA

Promotor Transgn Genes no estructurales

RNA copia (cadena negativa)

RNA genmico (cadena positiva) RNA subgenmico

Empaquetamiento Protenas estructurales

Figura 8. Vectores basados en alfavirus. A) Mapa gentico de un alfavirus. Los genes no estructurales se traducen directamente del ARN viral a su entrada en la clula para dar lugar a los componentes de la replicasa, que se encarga de la sntesis de la forma replicativa del ARN y del ARN subgenmico, que es traducido en componentes de la cpsida viral. B) Vector basado en alfavirus. La construccin contiene, en forma de ADN, los genes de la replicasa, precedidos de un promotor y, sustituyendo a los genes estructurales, el transgn. Cuando este ADN es introducido en las clulas la replicasa es traducida inmediatamente, produciendo gran cantidad de ARN subgenmico, de donde se traduce el producto del transgn.

alfavirus es el virus Sindbis, pero entre ellos se encuentran otros como el del Bosque de Semliki y el de la encefalitis equina venezolana(76). El genoma viral contiene dos fases abiertas de lectura (open reading frames-ORF); la ms prxima al extremo 5' (ORF de genes no estructurales o de la replicasa), ocupa los 2/3 de la longitud, situndose en el tercio restante la segunda ORF, o estructural(76, 77). La entrada del virus en la clula es mediada por receptor, y tiene lugar por un endosoma que al acidificarse permiten la fusin de la envuelta viral con la membrana del endosoma, con lo que la nucleocpsida ingresa en el citoplasma. All el ARN genmico, en su calidad de ARN mensajero, traduce, a partir de la ORF de la replicasa (en forma de una poliprotena que se autoprocesa proteolticamente), 4 protenas que se ensamblan para ejercer diversas funciones, entre las que se encuentra la que da el nombre a la ORF, ya que copia el ARN genmico para dar formas replicativas de ARN de doble cadena (Fig. 8A). Estos ARNs presentan, en la zona que separa ambas ORFs, un promotor (P, en la figura) de donde la replicasa copia pequeos ARNs de polaridad positiva y de secuencia idntica al tercio 3' del ARN genmico, conteniendo, por lo tanto, la ORF estructural, de donde se traducen (y de ah el nombre) las protenas estructurales del virin, tanto las de la nucleocpsida como las de la envuelta. Aqullas se ensamblan en nuevas partculas que engloban ARNs positivos de longitud genmica, tambin sintetizados por la replicasa, y que, a diferencia de los ARNs subgenmicos poseen una secuencia empaquetadora. El virus emerge de la clula por gemacin, en sitios de la membrana plasmtica en donde previamente se acumulan protenas virales de la envuelta, que han sido procesados a lo largo de su paso por el retculo endoplasmtico. Una copia en forma de ADN bicatenario puede servir como vector basado en alfavirus una vez clonada en un plsmido y provista de un promotor capaz de ser reconocido por la ARN polimerasa II celular. La parte correspondiente a los genes estructurales es sustituida por el transgn (Fig. 8B). A la entrada de este ADN en la clula se transcribe un ARN autorreplicativo capaz de expresar el transgn muy activamente merced al efecto amplificador de la replicasa, que sintetiza gran cantidad de ARNs subgenmicos a partir del promotor P, conservado en la construccin plasmdica, de los cuales se traduce el transgn. REDIRECCIONAMIENTO DE VECTORES La terapia gnica in vivo, sea cual sea el tipo de vector usado, se enfrenta con el problema de que el transgn puede ser introducido en clulas diferentes de aqullas en que su accin ha de ejercerse de manera ptima(78). Por una
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parte, la transduccin de clulas inespecficas puede tener efectos inesperados debidos a la expresin ectpica del gen teraputico. Esto es especialmente cierto cuando la terapia gnica consiste en la introduccin de un gen suicida, buscando eliminar selectivamente clulas tumorales o infectadas por virus, por ejemplo. En este caso, la desviacin del gen a otros tejidos podra causar la innecesaria y contraproducente destruccin de stos(79). Por otra parte, lo bajo de los bajos ttulos de virus recombinantes a menudo alcanzados hacen deseable que la mayora de stos alcancen las clulas blanco deseadas, sin que haya una diseminacin estril de los mismos. Aunque en algunos casos el tropismo natural de un vector determina que la administracin sistmica del mismo sea suficiente para que alcance mayoritariamente el tejido deseado (como es el caso de los adenovirus y los hepatocitos o los AAV y el msculo esqueltico)(80), la situacin normal es que los vectores virales sean capaces de infectar un amplio rango de tejidos, por lo que conviene que sean manipulados a fin de que esta capacidad quede restringida(81). Los esfuerzos encaminados a limitar la expresin del transgn portado por un vector viral a un tejido determinado han tomado dos vas alternativas. La primera de ellas (direccionamiento transduccional) se basa en dirigir la infectividad del vector hacia las clulas deseadas; la segunda, o direccionamiento transcripcional, limita la transcripcin del transgn a una estirpe celular determinada, sin tratar de evitar que sea introducido en otros tejidos en los que su transcripcin y, por lo tanto, expresin es imposible. El mecanismo de redireccionamiento ms sencillo se basa en el pseudotipaje, ya mencionado en una seccin previa, aunque, en general, lo que hace este tipo de redireccionamiento es extender, en lugar de restringir, el rango de tejidos que puede infectar un determinado vector viral. Se ha usado, de todos modos, con el propsito de dotar a los vectores basados en el virus de Moloney de la especificidad por las clulas que presentan en superficie el receptor CD4 (linfocitos T4 y macrfagos, principalmente), es decir, la especificidad propia del VIH(82). El redireccionamiento de la infectividad requiere la manipulacin del mecanismo de entrada en los virus, que puede conseguirse o bien mediante la manipulacin gentica de los componentes virales encargados del mismo, tales como el pentn en adenovirus(83, 84) o la protena de superficie de la envuelta de los retrovirus(81, 82), incluyendo en ellos pptidos especficos de determinados ligandos(85) o anticuerpos de cadena simple (pequeas molculas proteicas que comprenden la parte del anticuerpo que reconoce y se une al antgeno)(86), de manera que, en lugar de reconocer el receptor que les es propio, reconozcan componentes que slo estn presentes en la clula blanco elegida. Es necesario resaltar en este punto que el mecanismo de entrada de los virus no consiste, de ordinario, en una simple aproximacin de las partculas virales a la superficie celular, sino que en muchos casos cuenta, para la internalizacin, la presencia de otros componentes celulares, tales como correceptores, etc., por lo que el cambio de receptor no siempre garantiza la infectividad del vector manipulado. Un mtodo alternativo de cambiar la especificidad del ligando lo ofrece el uso de molculas bifuncionales que, por un extremo se unan a ste (e impidan, de paso, la interaccin de ste con su receptor natural) y por el opuesto a una protena de la superficie de la clula blanco. Este tipo de molculas pueden ser parejas de anticuerpos monoclonales biotinilados, capaces de unirse entre s por medio de estreptavidina(87), o bien protenas de fusin (qumica o producto de manipulacin gentica) que contengan los dos sitios de unin requeridos(83). Una extensin de este mtodo se basa en la presencia de proteasas en ciertos tejidos. En este caso se utiliza una molcula bifuncional que ligue el virus a un componente de la membrana celular cercano al receptor natural, pero que le impida unirse a l, a menos que en la superficie del tejido haya una proteasa capaz de romper la molcula bloqueante y dejar el ligando viral libre para unirse al receptor(88). El segundo tipo de direccionamiento se consigue acompaando el transgn de elementos que le impidan expresarse en las clulas no deseadas. Se han usado para este fin dos tipos de elementos genticos de control: promotores y regiones de control de locus (LCR)(89). Un ejemplo de los primeros lo constituye el promotor del gen de la alfa-fetoprotena, que no se expresa en el tejido adulto, pero s en muchos tipos de tumores, lo que hace de este promotor un elemento idneo para dirigir la expresin del transgn en la terapia gnica tumoral de suicidio. En lugar de usar un promotor especfico de tejido, puede conseguirse un efecto anlogo mediante modificacin de los promotores propios del vector. As, Vile y colaboradores(90) sustituyeron las secuencias promotor-inten11

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sificador propias del virus de la leucemia murina de Moloney (Mo-MLV) por secuencias de accin anloga correspondientes al gen de la tirosinasa, consiguiendo que el transgn transducido mediante el vector modificado (el gen de la interleuquina 2) se expresase preferentemente en clulas de melanoma, respecto a su expresin en clulas normales. En un enfoque anlogo se ha reemplazado la misma zona del Mo-MLV con un intensificador autorregulativo del gen del factor de transcripcin especfico de clulas eritroides GATA-1, consiguindose este tipo de especificidad de expresin(91). En cuanto a las LCR, se trata de regiones que suelen estar situadas distantes al gen que controlan, pero su presencia determina que la expresin de ste sea independiente de su localizacin en el genoma, y proporcional al nmero de copias translucidas. Las LCR confieren, adems, especificidad de tejido, que es lo ms relevante en cuanto al contexto que nos ocupa. La LCR ms conocida y primeramente estudiada(92) es la que corresponde al gen de la -globina que, consecuentemente, ha sido incluida en vectores retrovirales y adenoasociados, consiguindose expresin especfica en tejido eritroide(89). Ambos tipos de direccionamiento, transduccional y transcripcional, pueden, por supuesto, ser combinados, como demostraron Reynolds y colaboradores(93) usando un vector adenoviral que fue dirigido por medio de un anticuerpo monoclonal a un marcador de superficie exclusivo de clulas endoteliales pulmonares. En este caso, el gen testigo usado (el correspondiente a la luciferasa) fue dotado del promotor del gen fit-1, que codifica un receptor especfico de clulas endoteliales. Este doble direccionamiento consigui una expresin del gen esencialmente nula en el hgado, que es el rgano en que usualmente los vectores adenovirales quedan secuestrados. SISTEMAS VIRALES MIXTOS Cada grupo de virus presenta, a la hora de disear vectores, caractersticas diferentes que pueden ser ventajosas o desventajosas respecto al tipo de terapia gnica deseada(13). En un intento de optimizacin, se han abordado repetidamente el diseo de sistemas de vectores que combinan aspectos ventajosos de dos grupos de virus, habindose llegado, como enseguida veremos, a la incorporacin de elementos virales en vectores no basados en virus. Un sistema hbrido es el citado anteriormente para evitar, en el proceso de produccin de vectores adenoasociados, la citotoxicidad debida a la protena rep(52). Sin embargo, el sistema mixto desarrollado primeramente(94), utiliz vectores adenovirales para transducir, in vivo, los elementos constitutivos de un empaquetamiento retroviral transitorio (Fig. 3): un adenovirus recombinante aportaba en su genoma los genes gag, pol y env retrovirales. Otro adenovirus recombinante transduca, del mismo modo, el conjunto de LTRs, zona de empaquetamiento y transgn caractersticos del vector retroviral genmico (Fig. 9). Cuando ambos adenovirus infectaban simultneamente in vivo una clula, sta se constitua en empaquetadora de retrovirus recombinantes capaces de transducir las clulas contiguas. Este doble sistema rene las ventajas de la estabilidad integrativa propia de los retrovirus con la alta capacidad de transduccin de los adenovirus (mucho ms eficiente, desde luego, que la transfeccin con ADN desnudo utilizada en los sistemas clsicos de empaquetamiento de vectores retrovirales). El papel que juegan en este sistema mixto los adenovirus puede ser desempeado, sin embargo, por otros tipos de vectores, como Vaccinia(95), alfavirus(96) o herpes(97). Aparte de los sistemas referidos, en los que el vector final es un retrovirus, otros sistemas hbridos combinan adenovirus y adenoasociados(98, 99), o stos o baculovirus(100, 101). El diseo de sistemas compuestos o hbridos no se ha limitado al uso conjunto de componentes de diferentes grupos de virus, sino que ha aplicado las posibilidades de direccionamiento de vectores propias de los virus al suministro de genes mediante vectores de naturaleza artificial. De esta manera, se ha aadido a liposomas catinicos componentes de la envuelta del paramixovirus hemaglutinante del Japn, tambin llamado virus Sendai, para formar los que han sido denominados virosomas(102), que al dirigir al liposoma directamente al citoplasma, evitando la endocitosis, impide la destruccin del ADN a su entrada en los lisosomas. Otros sistemas anlogos han usado componentes del virus Influenza, la protena G del virus de la estomatitis vesicular e incluso con componentes de la envuelta del VIH, o del virus de la hepatitis B(102, 103).
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LTR

Transgn

LTR

P ITR ITR

gag-pol env

ITR

ITR

Protenas retrovirales
Transgn

U5

U3

RNA retroviral

Retrovirus recombinante

Figura 9. Sistema viral mixto AdenovirusRetrovirus. Dos vectores adenovirales diferentes, uno de ellos conteniendo el transgn en una construccin anloga a un vector retroviral genmico, y el otro los genes estructurales de un retrovirus bajo el control de un promotor, se usan para infectar simultneamente, in vivo un conjunto de clulas, en las que transitoriamente se expresan tanto los genes estructurales, dando protenas retrovirales, como el ARN retroviral con el transgn. Todos estos productos interactan para dar lugar a retrovirus recombinantes que emergen de las clulas doblemente infectadas para transducir las clulas vecinas.

CONCLUSIONES Desde la ltima revisin aparecida en estas pginas, hace ya siete aos, la evolucin de la virologa aplicada a la transgnesis clnica, es decir, a la terapia gnica, ha experimentado, lgicamente, una profunda evolucin debida al progreso en el conocimiento de la biologa de los diferentes virus. El cambio ha afectado principalmente al aspecto tcnico de la vectorologa viral pero, aunque en menor medida, tambin al aspecto conceptual, lo que se refleja, por ejemplo, en el desarrollo de vectores adenovirales oncolticos, o en el regreso al estudio y desarrollo de vectores virales capaces de replicacin, cualidad que haba sido precisamente considerada como la principal caracterstica que era preciso abolir antes de que el uso de un vector viral fuese aceptable en aplicaciones clnicas de la terapia gnica. AGRADECIMIENTOS Los autores desean mostrar su agradecimiento a la Fundacin Ramn Areces por la ayuda institucional concedida al Centro de Biologa Molecular Severo Ochoa. BIBLIOGRAFA
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