Amadeusz Czarnecki Kierunek: Lenictwo Rok: I Grupa: I

Sprawozdanie nr II
TEMAT WICZENIA: Metody przygotowania preparatw mikroskopowych i mierzenie drobnoustrojw. Metody barwienia.
Cel wiczenia: zapoznanie ze sprztem do wykonywania preparatw z procedur wykonania oraz metodami barwienia.

Metoda prosta mierzenia drobnoustrojw:

- polega na przerysowaniu obiektu widzianego w mikroskopie w danym powikszeniu, z wiernym zachowaniem jego wymiarw.
Zadanie do wykonania: Wybranie 10 artrospor i przerysowanie ich z wiernym zachowaniem wymiarw

Wielko rzeczywist oblicza si wedug wzoru:

Wrz=a1000/p

Wrz wielko rzeczywista wyraona w mikrometrach [m] a wielko przedmiotu odczytana z rysunku w milimetrach [mm] p powikszenie mikroskopu przelicznik na mikrometry [ m]

Metoda mikrometryczna mierzenia drobnoustrojw:

- na pocztku, naley znale tzw. wartoci mikrometryczne. Do tego celu potrzebne s dwa mikrometry: mikrometr przedmiotowy i mikrometr okularowy. a) mikrometr przedmiotowy to szkieko podstawowe z wycechowan w rodku podziak, z odstpami co 10 m (0,01mm) b) mikrometr okularowy to szkieko z podziak o odstpach co 100 m (0,1mm) - mikrometr okularowy umieszcza si wewntrz okularu, przedmiotowy na stoliku, tak jak preparat. Warto mikrometryczn oblicza si wedug wzoru:

Wm= a10m /b
Wm warto mikrometryczna a - liczba podziaek mikrometru przedmiotowego ( na szkieku) b liczba podziaek mikrometru okularowego

Lp.

Metoda prosta
Mm z rysunku

Metoda mikrometryczna
Wielko rzeczywista [m]

Wielko Odczyt z rzeczywista [m] mikrometru

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
_ X

3 2 3 3 4 3 4 3 3 2

mm mm mm mm mm mm mm mm mm mm

6,25 m 4,2 m 6,25 m 6,25 m 8,3 m 6,25 m 8,3 m 6,25 m 6,25 m 4,2 m 6,23 m

3 3 3 3

mm mm mm mm

4,98 4,98 4,98 4,98

m m m m

4 mm 3 mm 4 mm 3 mm 3 mm 3 mm 3,2 mm

4,98 m 4,98 m 4,98 m 4,98 m

5,31 m 6,64 m

6,64 m

3 mm

Wnioski

Z oblicze wykonywanych na zajciach dotyczcych zalecanego powikszenia wiem jakiego okularu naley uy przy danym obiektywie, aby dobrze widzie ogldany obiekt na zajciach. Rwnie na zajciach wykonywalimy obliczenia przy pomocy dwch metod: prostej i mikrometrycznej, aby obliczy wielko altrospory. Dla metody prostej wynik wynosi 6,27m, a dla metody mikrometrycznej 5,31m. Wyniki wic s porwnywalne dla obu metod. Wady: metoda prosta daje wyniki orientacyjne i nie jest zbyt dokadna, z kolei metoda mikrometryczna jest bardzo pracochonna i wymaga duej wprawy i precyzji. Zalety: metoda prosta jest atwiejsza i szybsza w wykonaniu ni mikrometryczna lecz daje tylko wynik w przyblieniu, z kolei mikrometryczna daje precyzyjniejsze wyniki badanego obiektu.

Sprzt niezbdny do wykonania preparatu.

Szkieko podstawowe- warunkiem uzyskania preparatu dobrej jakoci jest oczyszczenie i odtuszczenie szkieka podstawowego. Zanieczyszczenia fizyczne usuwa si z powierzchni szkieka przez potarcie such bawenian szmatk. Szkieka odtuszczamy poprzez 2-3-krotne opalenie nad pomieniem palnika. Eza- prosty przyrzd uywany w laboratoriach mikrobiologicznych do przenoszenia materiau mikrobiologicznego (zawiesiny bakterii lub prbki pobranej z kolonii bakteryjnej) z jednego podoa mikrobiologicznego na inne. Palnik jest urzdzeniem technicznym, przeznaczonym do wytwarzania wysokich temperatur poprzez spalanie gazu, wzgldnie innego paliwa. apa laboratoryjna drewniana- suy podstawowego nad pomieniem palnika. do utrzymywania szkieka

Fiolet krystaliczny- jest zasadowym, sabo rozpuszczalnym barwnikiem, ktry w roztworze tworzy kationy. atwo penetruje przez cian komrkow i bon cytoplazmatyczn bakterii Gram-ujemnych i Gram-dodatnich wnikajc do wntrza komrki. Na tym etapie wszystkie komrki wybarwione s na fioletowo.

Czynnoci trwaego.

przygotowania preparatu przyyciowego oraz

Barwienie przyyciowe gdy na ywe komrki mikroorganizmw naniesione na szkieko podstawowe dziaamy barwnikiem np. oznaczanie przeywalnoci drody, ktre polega na barwieniu przyyciowym komrek drody barwnikiem w duym rozcieczeniu (bkit metylenowy w rozcieczeniu 1:10000).

Zabarwieniu ulegaj jedynie komrki martwe lub bdce w stanie subletalnym o zdegenerowanej cianie komrkowej (barwnik atwiej przenika przez cian). ywe komrki drody pozostaj bezbarwne.Preparaty przyyciowe wykonuje si na szkieku podstawowym (w kropli spaszczonej), a w przypadku badania ruchliwoci bakterii lub prowadzenia obserwacji nad sposobem ozmnaania drody preparaty wykonujemy na szkieku z wgbieniem zwanym komor Lindnera (w kropli wiszcej).

Barwienie preparatw utrwalonych gdy barwieniu poddaje si utrwalone komrki drobnoustrojw. Utrwalanie polega na termicznym lub chemicznym zabiciu mikroorganizmw i przytwierdzeniu ich do powierzchni szkieka podstawowego. Celem utrwalania jest uatwienie stosowanym barwnikom penetracji przez cian komrkow i ich wniknicie do wntrza komrki oraz odsonicie w cianach komrkowych mikroorganizmw zwizkw, z ktrymi wi si barwniki. Chemiczna metoda utrwalania polega na naniesieniu na wysuszony rozmaz mikroorganizmw odpowiedniego odczynnika (np. formaliny, alkoholu, eteru). Po kilku minutach preparat wysycha i jest przygotowany do barwienia. Termiczna metoda utrwalania polega na 2-3-krotnym przecigniciu szkieka podstawowego z wysuszonym rozmazem mikroorganizmw w pomieniu palnika. Szkieko podczas utrwalania powinno by zwrcone rozmazem ku grze.

Czynnoci zwizane z przygotowywaniem mikrobiologicznego do barwienia:

preparatu

A) Odtuszczanie szkieka podstawowego; B) Pobranie nieznacznej iloci bakterii do wykonania rozmazu C) Wykonanie rozmazu D) Pozostawienie szkieka z rozmazem do wyschnicia E) Przecignicie szkieka z rozmazem nad palnikiem F) Dodanieodrobiny Fioletu Krystalicznego G) Zmycie pozostaoci Fioletu z powierzchni szkieka H) Gotowe! Szkieko z rozmazem jest ju przygotowane do obserwacji.