Pontificia Universidad Catlica de Chile Facultad de Ciencias Biolgicas BIO226E Ao 2013

Informe N1 Confeccin de un Mapa Fsico del plsmido pBR322

Nombre: Nicols Lavandero Curso: Gentica y Evolucin Profesores: Dra. Pilar Carvallo Dr. Sylvain Faugeron Instructora: Patricia Gajardo Ayudante: Juan Gonzlez

Introduccin
Un mapa fsico se basa en el anlisis directo del DNA y ubican a los genes respecto de distancias medidas en nmero de pares de bases (1). La forma ms comn es el que se realiza mediante piezas aisladas de DNA clonado en bacterias. Una tcnica es el mapeo de restriccin. En este mtodo se utilizan enzimas de restriccin. stas son molculas que cortan (o restringen) sitios especficos del DNA. Existen varias enzimas de restriccin, y se sabe en qu secuencias especficas stas cortan (2). Este mtodo permite determinar la posicin de los sitios de restriccin. Las enzimas de restriccin cortan el fragmento de DNA y se pueden separar por electroforesis en gel. De este modo se obtiene el nmero de sitios de restriccin y la distancia entre ellos. Para obtener el mapa gentico se superponen fragmentos producidos por distintas enzimas de restriccin y de este modo se puede formar el mapa fsico del plsmido (3).

Objetivos
Experimentar y familiarizarse con tcnicas para el manejo de cidos nucleicos, el uso se enzimas de restriccin y la interpretacin de la electroforesis en gel de agarosa, para la construccin de un mapa fsico.

Metodologa
Se digiere el plsmido pBR322, utilizando distintas enzimas de restriccin. Se realizaron digestiones simples y dobles (con una sola enzima o dos). Las muestras se entregaron ya preparadas por los ayudantes y se cargan en los pocillos del gel de agarosa 1% mediante micropipeta. Las muestras utilizadas, expresadas en el orden en que se cargan son las siguientes: 8. Estndar peso molecular /HindIII 1. DNA genmico 2. DNA genmico digerido con EcoRI/AvaI 3. DNA plsmido pBR322 4. DNA plsmido pBR322 digerido con EcoRI 5. DNA plsmido pBR322 digerido con EcoRI/AvaI 6. DNA plsmido pBR322 digerido con EcoRI/PstI 7. DNA plsmido pBR322 digerido con PstI/AvaI Luego de cargar, se corre el gel a 0,75-0,83 Volts. En los ltimos minutos, se disminuye a 0,22-0,15 volts. Se procede por ltimo a observar el gel en luz UV.

A partir de este momento en adelante, se trabaja con la fotografa (Fig. 1) de un gel entregado por el instructor, y no con el realizado durante el paso prctico. Para la interpretacin del gel de agarosa, se mide con la ay uda del estndar (/HindIII, pocillo 8) la distancia de cada banda respecto a los pocillos de carga. Del estndar se saben los tamaos en pares de bases (Fig. 2). El clculo de distancias se realiz mediante el Software ImageJ, el cual entrega distancias medidas en pixeles. Luego se confecciona una curva estndar en la que se expresa la distancia recorrida (en pixeles) en funcin del logaritmo de los pares de bases (pb). Se realiza una regresin lineal con los datos obtenidos, de modo que obtenemos una ecuacin de la recta del tipo Y = mx + n. Finalmente, teniendo ya nuestra ecuacin, se mide la distancia de las bandas a los pocillos de carga para el resto de los carriles. Esta distancia se reemplaza en la x de nuestra ecuacin obtenida previamente.

Figura 1. Gel de agarosa 1% una vez realizada la electroforesis. Se observan las bandas para cada carril, de acuerdo a las distintas cargas en cada uno de ellos. Se observa a la izquierda, el estndar /HindIII.

Figura 2. Bandas del Estndar peso molecular /HindIII. Corrido en un gel de agarosa 1%. Cada banda posee a su lado su peso en pares de bases (pb)

Resultados

Franja Franja 1 Franja 2 Franja 3 Franja 4 Franja 5 Franja 6 Franja 7

Distancia recorrida (pixeles) 76 89 98 112 140 149 275

Pares de bases (pb) 23130 9416 6557 4361 2322 2027 564

Log (pb) 4,364175 3,973866 3,816705 3,639586 3,365862 3,306853 2,751279

Tabla 1. Distancia recorrida por Estndar /HindIII para cada franja, en pixeles. Adems su respectivo tamao en pares de bases y el logaritmo para cada tamao de pb.

A partir de la distancia recorrida en funcin de Log (pb) por nuestro estndar /HindIII, se realiza un grfico y su respectiva regresin lineal, con el fin de obtener una ecuacin de la recta (Fig. 3).

Curva de Calibrado estndar /HindIII

5

y = -0,0072x + 4,5618 R = 0,855

4

Log (pb)

0 0 50 100 150 200 250 300

Pixeles
Figura 3. Grfico de distancia recorrida en pixeles, en funcin del Log (pb) para el estndar /HindIII.

Finalmente se obtiene la ecuacin de la recta que nos da y = -0,0072x + 4,5618. Es en sta ecuacin que se reemplaza la distancia recorrida por cada banda en cada carril. Finalmente, se aplica la funcin antilogaritmo, para obtener un resultado expresado como pares de bases. Este proceso se detalla en la Tabla 2. Carril tratamiento Distancia primera franja (pixeles) 131 Tamao primera Franja (pb) 4155,3 Distancia segunda franja (pixeles) Tamao segunda Franja (pb) -

Plsmido

pBR322 4 5 6 7 EcoRI EcoRI/AvaI EcoRI/PstI PstI/AvaI 109 128 115 142 5984,1 4367,2 5417,5 3462,6 176 239 1970,6 693,4 -

Tabla 2.Distancia recorrida para franja en cada tratamiento (carril). Se expresa adems el tamao de la franja en pb, luego ingresar a la ecuacin de la recta la distancia y aplicar antilogaritmo.

Confeccin del mapa fsico

Para la confeccin del mapa fsico, se intentan superponer los distintos tratamientos con enzimas de restriccin. Se ver caso a caso: 1.- DNA plsmido pBR322 digerido con EcoRI/AvaI. Se observan dos bandas, una de 4367 pb y otra de 1971 pb. Esto quiere decir que las enzimas cortaron en dos regiones diferentes y formaron dos fragmentos de distinto tamao. El mayor fragmento representa un 70% del tamao total y el menor un 30%. Grficamente se vera del siguiente modo:

EcoRI

1971

Aval

4367

2.- DNA plsmido pBR322 digerido con EcoRI/PstI. En este caso se observan dos bandas, una de 5418 pb y otra de 693 pb. Del mismo modo que el anterior, se corta en dos regiones diferentes y se forman dos fragmentos de distinto tamao. El fragmento mayor representa un 89% del tamao total y el menor un 11%. Grficamente se vera del siguiente modo: EcoRI

Pstl
693

5418

3.- DNA plsmido pBR322 digerido con PstI/AvaI. Este ltimo caso ocurre que slo se observa una banda. Esto indica que las enzimas cortaron el plsmido dos fragmentos del mismo tamao (3463 pb). Ambos fragmentos representan un 50% del tamao del plsmido. Grficamente se ve de este modo: Pstl

3.463

3463

Aval A partir de los porcentajes expresados, es posible reconstruir el plsmido superponiendo los porcentajes y adecundolos al tamao de plsmido obtenido (6340 pb), se obtiene el siguiente plsmido de la figura 4. Pstl EcoRI
697

3170

pBR322 6340 pb
2473

AvaI Figura 4. Reconstruccin del Mapa Fsico de Plsmido pBR322. Se detalla el tamao en pb del plsmido, as como las zonas de corte por las enzimas de restriccin y el tamao de los fragmentos.

Discusiones
El plsmido pBR322, proveniente de Eschericha coli, posee un tamao de 4361 pb (4). El resultado obtenido es de 6340 pb. El porcentaje de error de este clculo es de un 45%. La gran diferencia entre el valor real y el calculado mediante la regresin, se puede explicar por varias razones. En primer lugar, la resolucin de la fotografa es baja, por lo tanto es difcil reconocer exactamente el pocillo y la banda. Se esper que mediante el uso de un programa de anlisis de imgenes, como ImageJ, se pudiese limitar errores de medicin asociados al uso de regla o de un pie de metro, ya que entrega valores en pixeles. Aun as, producto de lo mencionado anteriormente, se puede caer en errores durante la medicin, producto de la baja resolucin de la fotografa. De este modo, no es posible aprovechar la gran precisin en la medicin otorgada por el programa. Respecto al pocillo 3, el cual estaba cargado con el plsmido sin digerir, se pueden apreciar tres bandas. La explicacin a este fenmeno es producto que el Plsmido sin digerir puede tener distintas conformaciones. Las formas denominadas como superenrollada, relajada y lineal de longitud completa (5), son la misma molcula (y por lo mismo, el mismo nmero de pb). La diferencia radica en la distinta conformacin espacial, que afecta el volumen de la molcula y por lo tanto, la velocidad a la que avanzan por el gel. En el pocillo 4, se soluciona el problema anterior, ya que al cortar la enzima en alguna zona especfica del plsmido, se obtiene una molcula lineal. De este modo, todos los fragmentos avanzan a la misma velocidad, y al poseer todos una misma conformacin, dejan una sola franja en el gel. En el pocillo 5, donde se tiene DNA plsmido pBR322 digerido con EcoRI/AvaI, estas dos enzimas cortan en zonas especficas y distintas para cada enzima. Al obtener 2 franjas en este carril, se deduce que cada plsmido es cortado en 2 zonas, quedando 2 fragmentos de distinto tamao en pb. En el pocillo 6, donde se tiene DNA plsmido pBR322 digerido con EcoRI/PstI, ocurre algo parecido al anterior. Se obtienen 2 franjas, evidenciando que cada enzima corta una sola vez en zonas especficas y distintas, formando dos fragmentos de distinto tamao. Por ltimo, en el pocillo 7, donde se tiene DNA plsmido pBR322 digerido con PstI/AvaI, ocurre algo diferente. Se obtiene una sola banda. Una explicacin para esto es que ambas enzimas corten el plsmido en zonas diferentes, pero se obtengan dos fragmentos de tamao muy similar (lo suficiente como para que aparezca una sola banda en el gel). Para la confeccin del mapa fsico del plsmido, se debe lidiar con la diferencia en el tamao total del plsmido para cada tratamiento. Se intenta evitar este problema trabajando con porcentajes, de este modo podemos superponer los tratamientos para as construir el mapa fsico. Es por esto que los valores en pb en la reconstruccin final difieren de los calculados para cada tratamiento.

Conclusin
Se pudo trabajar exitosamente con enzimas de restriccin, adems de aprender a interpretar geles de electroforesis. Un aspecto importante trabajado fue el anlisis posterior del gel, aprender a hacer una curva de calibracin y la interpretacin de las bandas obtenidas. Finalmente, se pudo reconstruir el mapa fsico del plsmido a partir de la digestin con enzimas de restriccin.

Bibliografa
1.- Gentica. B. Pierce. (2009) 3 Edicin. Editorial Mdica Panamericana. Pg. 549-550 2.- Manual de Practicas Biologa Molecular de la Clula I. C. Segal, G. Ortega. (2005) 1 Edicin. Editorial Publidisa. Pg. 91 3.- Introduccin a la Microbiologa. G. Tortora, B. Funke, C. Case. (2007) 9 Edicin. Editorial Mdica Panamericana. Pg. 258 4.- Proteins. Structure and Function. D. Whitford. (2005) 1 Edicin. Editorial Wiley. Pg. 316 5.- Gene Cloning & DNA Analysis. T. A. Brown (2010) 6 Edicin. Editorial Wiley-BlackWell. Pg. 36