PRACTICA DE LABORATORIO DE BIOQUMICA II ELIMINACIN DE NITRGENO EN DIFERENTES ESTADOS FISIOLGICOS

OBJETIVO: Cuantificar el nitrgeno total presente en la orina de estudiantes voluntarios y correlacionarlo con el consumo de dietas pobres y ricas en protena. INTRODUCCIN. Se recurrir al mtodo de que utiliza la especificidad de la reaccin de la ureasa con un procedimiento colorimtrico (reaccin de Berthelot) muy sensible para la determinacin de amoniaco. PROCEDIMIENTO. Para la muestra M1, ser un estudiante voluntario que consumir solamente sales de rehidratacin durante las 24 horas anteriores a la toma de la muestra, para tal efecto, al comenzar el da anterior a la prctica desde el momento de levantarse no deber consumir ningn alimento, solo suero casero durante todo ese da. Finalmente al levantarse el da de la prctica, recolectar una muestra de unos 20 mL de orina aproximadamente y la mantendr en la nevera a 4C hasta que sea procesada en el laboratorio, despus de esto podr desayunar normalmente. Componente (ml) Ureasa Agua Orina Patrn 1 N ureico Patrn 2 N ureico Patrn 3 N ureico Patrn 4 N ureico T1 1.00 0.01 T2 1.00 0.01 T3 1.00 0.01 T4 1.00 0.01 B 1.00 0.01 La muestra M2, ser la de un estudiante que haya consumido dieta rica en protenas durante las 24 horas anteriores a la prctica, Para este efecto el estudiante voluntario comer una clara de huevo por cada 12 kg de peso corporal con el desayuno normal, una clara de huevo por cada 10 kg de peso corporal con el almuerzo normal y otra clara de huevo por cada 12 kg de peso corporal con la comida normal (adicionalmente a lo que normalmente come).. Al da siguiente recoger 20 mL de muestra de orina, la guardar n la nevera a 4C hasta que sea procesada en el laboratorio y volver a su dieta normal. La muestra M3 ser la de un estudiante que haya consumido su dieta normal (sin excederse en el consumo de protenas como huevos, carne, pescado o leguminosas como frijol, arveja, lenteja o garbanzos) y el da de la practica recoger su muestra de orina al levantarse y la mantendr en la nevera a 4C hasta que sea procesada en el laboratorio.. 1. Para determinar en N ureico + N amoniacal se diluye la orina 1:10 con agua. (1 ml de orina + 9 ml de agua) 2. Se toman 8 tubos de ensayo y se procede como indica la siguiente tabla M1 1.00 0.01 M2 1.00 0.01 M3 1.00 0.01

3. Todos los tubos, se incuban durante 15 minutos a 37C. 4. Se aade a todos los tubos en rpida sucesin 4 ml de solucin de fenol-nitroprusiato y 5 ml de solucin alcalina diluida de hipoclorito. Se agregan en orden y se mezclan bien al terminar. 5. se colocan los tubos en el bao a 37C durante 20 minutos para que se desarrolle el color 6. Se lee absorbancia a 560 nm contra el blanco de referencia. INFORME (para bitcora) Sustente debidamente las respuestas a los siguientes interrogantes A. Anlisis de resultados. 1. Grafique los resultados correspondientes a la determinacin espectrofotomtrica 2. Realice los clculos respectivos y determine la concentracin de nitrgeno ureico en la muestras de orina que le correspondi analizar. 3. Estn estos valores de acuerdo con lo esperado? De las explicaciones correspondientes 4. Que resultados esperara en un paciente que presente insuficiencia renal? B. Cuestionario 1. Describa el fundamento del mtodo de Berthelot para la determinacin de nitrgeno ureico y amnico. 2. Cul es la diferencia entre nitrgeno ureico y nitrgeno amoniacal 3. Que significado biolgico tiene el encontrar elevados niveles de nitrgeno ureico y/ nitrgeno amoniacal en la orina 4. Describa en que forma el organismo humano produce y excreta nitrgeno ureico y nitrgeno amoniacal 5. Describa la patognesis de dos enfermedades relacionadas con la excrecin urinaria de nitrgeno 6. En qu consiste el coma hiperamonmico y de que patologas es un signo? 7. Que destinos metablicos tiene la protena dietaria consumida en exceso? 8. Explique en qu casos el organismo humano puede retener mas protena de lo normal?

PREPARACIN DE REACTIVOS (SLO PARA LABORATORISTAS). Solucin de fenol-nitroprusiato. Se colocan unos 250 ml de agua destilada en un matraz aforado de 500 ml y se aaden 7 g de fenol analtico y 0.035 g de nitroprusiato sdico -Na3Fe(CN)5NO.2H2O-. Se diluye con agua destilada hasta el enrase y se envasa en frasco mbar. Se puede conservar a 4C hasta por dos meses. Solucin alcalina de hipoclorito. Se colocan unos 300 ml de agua destilada en un vaso de precipitados y se disuelven en ellos 2.5 g de NaOH en perlas. Cuando la solucin se enfra se trasvasa a un baln aforado de 500 ml y se agregan 4 ml de hipoclorito de sodio al 5% y se enrasa con agua destilada. La solucin se guarda en frasco mbar a 4C donde es estable hasta por 1 mes. Solucin de EDTA al 1%, pH 6.5. Se disuelven 2.5 g de EDTA disdico en 150 ml de agua destilada. Se ajusta el pH a 6.5 con solucin de NaOH 1N y se completa con agua hasta 250 ml. Solucin de ureasa. Se disuelven 10 mg de ureasa de elevada pureza (3500-4100 U/g) en 0.5 ml de agua y se le aade 0.5 ml de glicerina. A esta solucin se la diluye y enrasa hasta 100 ml con solucin de EDTA al 1%. La misma es estable hasta 3 semanas si se la mantiene a 4C. Al comienzo de la prctica se debe separar en un frasco la cantidad de solucin que se vaya a emplear, desechando la que sobre. Patrones de nitrgeno ureico. T1: (100 mg/100ml): Se seca previamente la urea analtica en un desecador de vaco. A continuacin se disuelven 0.10717 g de urea en agua destilada y se colocan en un matraz aforado de 50 ml. Se le aade 0.05 g de azida de sodio y se diluye con agua destilada hasta enrasar, conservndola a 4C. T2: (50 mg/100ml): Diluya 25 ml de la anterior solucin hasta 50 ml con agua destilada T3: (25 mg/100ml): Diluya 25 ml de la anterior solucin hasta 50 ml con agua destilada T4: (10 mg/100ml): Diluya 20 ml de la anterior solucin hasta 50 ml con agua destilada Patrones de nitrgeno amoniacal. T5: (100 mg/100ml): Se disuelven en agua destilada 0.23581 g de sulfato de amonio desecado y se completa hasta 50 ml T6: (50 mg/100ml): Diluya 25 ml de la anterior solucin hasta 50 ml con agua destilada T7: (25 mg/100ml): Diluya 25 ml de la anterior solucin hasta 50 ml con agua destilada T8: (10 mg/100ml): Diluya 20 ml de la anterior solucin hasta 50 ml con agua destilada