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ISSN 0301-732x ISSN 0717-6201

Archivos de Medicina Veterinaria


VOL. 41, N 1, 2009

Comit Editor Presidente: Carmen Gallo S., M.V., Ph.D. Jorge Toro Y., M.V., M.Sc., Ph.D. Gustavo Monti, M.V., Mg.Sc., Ph.D. Enrique Paredes H., M.V., Dr. med.vet. Asistente Editorial: Claudia Crdenas A., Ing. Agr. Comit Editor Asesor Arturo Ferreira, M.V., Ph.D. - Universidad de Chile, Chile Carmen Fuentealba, M.V., M.Sc., Ph.D. - University of Calgary, Canad Carlos Hermosilla, M.V., Dr. med.vet., DipEVPC - University of London, UK Oscar Illanes, M.V., Ph.D. - University of Calgary, Canad Ral Mainar, M.V., M.Sc., Dr. Vet., DipECVPH - Centro de Invest. y Tec. Agroalimentaria, Espaa Claudia Muoz-Zanzi, M.V., MPVM, Ph.D. - University of Minnesota, USA Manuel Quezada, M.V., Dr. med.vet. - Universidad de Concepcin, Chile Sergio Recabarren, Lic. Biologa, M.Sc. - Universidad de Concepcin, Chile Gerhardt Schurig, M.V., Ph.D. - Virginia Tech, USA Pedro Smith, M.V., M.Sc.- Universidad de Chile, Chile Francisco Uzal, M.V., M.Sc., Ph.D., Dipl. ACVP - University of California Davis, USA Gerdien van Schaik, M.Sc., Dipl Anim Sci, Ph.D. - Gezondheidsdienst voor Dieren, The Netherlands

Universidad Austral de Chile Facultad de Ciencias Veterinarias Casilla 567 - Valdivia, Chile

VOLUMEN 41, N 1, 2009

CONTENIDOS Editorial................................................................................................................................................................. REVISIN BIBLIOGRFICA Adherencias abdominales postquirrgicas en equinos: patofisiologa, prevencin y tratamiento. M Werner, JS Galecio, H Bustamante. .......................................................................................................................... ARTCULOS ORIGINALES Prevalencia y distribucin espacial de brucelosis, leucosis bovina, diarrea viral bovina y rinotraquetis infecciosa bovina a partir del anlisis ELISA de estanques prediales en lecheras de la IX Regin, Chile. R Felmer, J Ziga, A Lpez, H Miranda. .................................................................................................................... Efecto del grado de competencia por espacio de comedero en el consumo de materia seca y comportamiento del consumo de vacas lecheras. HF Elizalde, CS Mayne................................................................................................................................................ Uso de suplementacin mineral con monensina sdica en corderas Pelibuey durante el crecimiento postdestete. AT Pieiro-Vzquez, J Oliva-Hernndez, JA Hinojosa-Cullar. ................................................................................... Impacto de la exposicin prenatal a testosterona sobre parmetros biomtricos y endocrinos en ovinos recin nacidos. SE Recabarren, PP Rojas-Garca, MP Recabarren, K Norambuena, T Sir-Petermann................................................ Evaluacin de caractersticas clnicas y patolgicas de 155 caninos con tumores mamarios: un estudio retrospectivo. BH Sontas, H Ozyogurtcu, A Gurel, H Ekici............................................................................................................... Estudio comparativo de la prstata en perros mediante ecografa transrectal y transabdominal. J Thibaut, J Santander, M Mieres. ................................................................................................................................. Salmo salar: morfologa ultraestructural de la pared del corion en ovas normales y con problemas de eclosin. R Jaramillo, O Goicoechea, O Garrido, E Molinari..................................................................................................... COMUNICACIONES Frecuencia de comportamientos anormales estereotipados en caballos Chilenos estabulados. L Muoz, J Torres, O Seplveda, C Rehhof, R Ortiz................................................................................................... Concentrados autlogos de plaquetas como tratamiento de lesiones de tejidos blandos del aparato locomotor en caballos. JU Carmona, M Prades, D Argelles............................................................................................................................ Caractersticas citolgicas del lavado bronqueoalveolar y respuesta inmune humoral frente a Aspergillus fumigatus en caballos Chilotes con obstruccin recurrente a las vas areas. G Morn, O Araya, A Ortloff, H Folch......................................................................................................................... Caracterizacin demogrfica de la poblacin de perros de Via del Mar, Chile. MA Morales, C Varas, L Ibarra. .................................................................................................................................... V

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Contents Editorial................................................................................................................................................................. REVIEW ARTICLE Post-surgical abdominal adhesions in horses: pathophysiology, prevention and treatment. M Werner, JS Galecio, H Bustamante. .......................................................................................................................... ORIGINAL ARTICLES Prevalence and space distribution of brucellosis, bovine leukaemia, bovine viral diarrhea and infectious bovine rhinotracheitis by using bulk milk ELISA test in dairy herds of the IX Region, Chile. R Felmer, J Ziga, A Lpez, H Miranda. .................................................................................................................... The effect of degree of competition for feeding space on the silage dry matter intake and feeding behaviour of dairy cows. HF Elizalde, CS Mayne................................................................................................................................................ Use of mineral supplementation with monensin sodium in Pelibuey female lambs during the postweaning growth. AT Pieiro-Vzquez, J Oliva-Hernndez, JA Hinojosa-Cullar. ................................................................................... Impact of prenatal exposure to testosterone in biometrics and endocrine parameters of newborn lambs. SE Recabarren, PP Rojas-Garca, MP Recabarren, K Norambuena, T Sir-Petermann................................................ Evaluation of clinical and pathological characteristics of 155 canines with mammary tumours: a retrospective study. BH Sontas, H Ozyogurtcu, A Gurel, H Ekici............................................................................................................... Comparative study of the canine prostate using transrectal and transabdominal ultrasonographic techniques. J Thibaut, J Santander, M Mieres. ................................................................................................................................. Salmo salar: ultrastructural morphology of chorion, from normal and with hatching problems ova. R Jaramillo, O Goicoechea, O Garrido, E Molinari..................................................................................................... communications Frequency of stereotyped abnormal behaviour in stabled Chilean horses. L Muoz, J Torres, O Seplveda, C Rehhof, R Ortiz................................................................................................... Autologous platelet concentrates as a treatment for soft tissue musculoskeletal lesions in horses. JU Carmona, M Prades, D Argelles............................................................................................................................ Cytologic broncheoalveolar lavage findings and humoral immune response against Aspergillus fumigatus in Chilote horses with recurrent airway obstructions heaves. G Morn, O Araya, A Ortloff, H Folch......................................................................................................................... Demographic characterization of the dog population in Via del Mar, Chile. MA Morales, C Varas, L Ibarra. .................................................................................................................................... V

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Editorial

En el mbito cientfico, la calidad, velocidad y oportunidad con que ocurren las publicaciones y su citacin son cada vez ms valoradas por los autores. Archivos de Medicina Veterinaria busca la calidad y eficiencia, para lo cual ha ido incorporando las caractersticas de las publicaciones cientficas de mayor reconocimiento internacional. Archivos de Medicina Veterinaria contina optimizando sus procesos de edicin, es as como ha logrado acortar los tiempos desde la recepcin de los manuscritos hasta la disponibilidad para el lector. Para seguir avanzando, forma parte del proyecto de red de revistas ISI chilenas denominado eQuipu, lo que pronto permitir la realizacin de todo el proceso editorial online (desde el envo por parte de los autores, hasta la prueba de galera). Esto permitir apoyar el trabajo de los editores y mejorar la calidad de la revista mediante la adopcin de los ms altos estndares de la industria editorial. Uno de los aspectos formales que ayuda a acortar los tiempos editoriales tiene que ver con el estilo, que se define en las instrucciones para autores. Vemos que una cantidad significativa de trabajos son enviados sin cumplirlos, lo que retrasa el proceso, por lo que esperamos que los nuevos trabajos sean enviados segn el estilo definido, lo mismo que las indicaciones enviadas a los trabajos en procesos de arbitraje. Finalmente, nos es grato anunciar que se ha formado un comit editorial asesor integrado por prestigiosos y reconocidos expertos nacionales e internacionales de diversas reas de las ciencias veterinarias, que nos asesorarn y ayudarn en diversos aspectos relacionados con la revista de manera de poder responder acertadamente a los nuevos desafos que nos enfrentamos.

Arch Med Vet 41, 1-15 (2009) REVISIN BIBLIOGRFICA

Adherencias abdominales postquirrgicas en equinos: patofisiologa, prevencin y tratamiento


Post-surgical abdominal adhesions in horses: pathophysiology, prevention and treatment
M Wernerb, JS Galecioa, H Bustamantea, b*
de Ciencias Clnicas Veterinarias, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile. bBiomedical and Veterinary Science Graduate Program, Virginia-Maryland Regional College of Veterinary Medicine, Virginia Tech, USA.
aInstituto

SUMMARY Despite the great number of human and veterinary medicine research, abdominal adhesions are still a big concern and a frequent complication for surgeons. The development of abdominal adhesions is a complex and dynamic process that involves a series of different mechanisms that start with an inflammatory process and tissue damage, followed by a fibrinogenic and fibrinolytic unbalance and ends with a change from fibrin deposit to fibrous tissue. In horses, after small intestine surgeries, adhesion incidence ranges from 14 to 22%. It is the most frequent cause of recurrent abdominal pain and the second cause for repeat celiotomy. Nevertheless, when all equine abdominal surgeries are included, the incidence of postoperative adhesions approximates 5%. A better understanding of the cellular mechanisms of adhesion formation and reformation should help to develop better prevention methods. Currently, a variety of prevention measures and treatments, most of them aiming to reduce or avoid adhesions formation, are used in veterinary medicine. The aim of this review is to gather most of the available information and the latest research explaining the pathophysiology, prevention and treatment of abdominal adhesions in horses. Palabras clave: equinos, adherencias abdominales, postquirrgicas. Key words: equine, abdominal adhesions, post-surgical.

INTRODUCCIN Las enfermedades gastrointestinales continan siendo una de las mayores preocupaciones en la industria de los equinos y una gran proporcin de caballos son derivados a centros quirrgicos debido a desrdenes abdominales (Smith y col 2005). Estas patologas incluyen desrdenes de la motilidad y obstructivos, siendo comunes tanto en medicina humana como en medicina veterinaria. Estas alteraciones tienden a ser clnicamente importantes en ambas disciplinas, con un extensivo impacto en la prctica veterinaria as como tambin en la salud pblica humana (Hudson y Dunlop 2005). Se ha descrito que la formacin de adherencias es la causa ms comn de episodios repetidos de clico luego de cirugas de intestino delgado en caballos y es la segunda causa ms comn de celiotomas repetidas en equinos despus de cirugas de clico por otras causas (Baxter y col 1989, Parker y col 1989, Baxter 1991, Mair y Edwards 2003). Estos estudios contrastan con Gorvy y col (2008), quienes no encontraron evidencia que sugiriera a partir del hecho de que las lesiones de intestino delgado o grueso en una primera ciruga lleven a la formacin de adherencias. Adicionalmente, se detalla que posterior a
Aceptado: 17.12.2008. * hbustamante@uach.cl

cirugas de intestino grueso el 36% de las adherencias produjeron obstruccin de intestino delgado. Varios estudios realizados en los ltimos diez aos describen que las adherencias postquirrgicas se presentan entre un 6% y un 27% en equinos con obstruccin de intestino delgado o como un hallazgo de una segunda ciruga de abdomen (Freeman y col 2000, Mair y Smith 2005, Gorvy y col 2008). En este sentido, estudios realizados previamente indican un 14% de adherencias postquirrgicas (Phillips y Walmsley 1993); por otro lado, Baxter y col (1989) indican que un 22% de adherencias se presentan posterior a cirugas gastrointestinales, detallando adems en su estudio que probablemente se haya subestimado la ocurrencia total de adherencias posterior a cirugas de intestino delgado, producto de que en equinos las adherencias intraabdominales que involucran el intestino grueso, incluyendo el ciego, generalmente no llevan a signos clnicos de dolor abdominal. Por su parte, MacDonald y col (1989) estiman que la causa de muerte ms comn (26%) en casos de cirugas de intestino delgado es la formacin de adherencias y episodios repetidos de clico. Vachon y Fischer (1995) establecen en un 6% la formacin de adherencias en casos en donde el intestino delgado se encarcela en el foramen epiploico. Sin embargo, el diseo de los distintos estudios es tan variado que hace inapropiada una comparacin entre ellos (Gorvy y col 2008). 1

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Se ha mencionado una serie de factores de riesgo en la formacin de adherencias; cualquier condicin inflamatoria dentro de la cavidad peritoneal puede afectar el sistema que deposita y lisa la fibrina y de esa manera predisponer a la formacin de adherencias fibrosas (Hay y Mueller 1998). Dentro de los factores que determinan la presentacin de adherencias se encuentra el manejo de la tcnica anastomtica de intestino (Southwood y col 1997). Al respecto, Sullins y col (1985) determinaron que la eversin de la mucosa aumenta la formacin de adherencias durante el perodo postoperatorio inicial. Otros factores que predisponen a la formacin de adherencias son el leo paraltico postquirrgico y laparotomas repetidas (Parker y col 1989, Mair y Smith 2005). Por otra parte, Gorvy y col (2008) observaron que el riesgo de desarrollar adherencias disminuye cuando existe un aumento en el volumen globular aglomerado (VGA) y frecuencia cardiaca, lo que sugiere que la formacin de adherencias no estara relacionada con endotoxemia. En el mismo sentido, Collatos y col (1994) reportaron que eventos ocurridos en el sistema vascular no se ven reflejados en la cavidad peritoneal. Otra variable que podra relacionarse con la formacin de adherencias son las protenas totales, las cuales muestran una relacin no lineal con el riesgo de formacin de adherencias. Esto sugiere que una concentracin ptima de protenas plasmticas de aproximadamente 63 g/L minimiza el riesgo de adherencias, con un incremento en el riesgo de presentacin de ellas cuando las concentraciones son mayores o menores a lo reportado como normal para la especie (Gorvy y col 2008). Otro factor de riesgo es la edad de animal, sugirindose que los potrillos son ms susceptibles de desarrollar adherencias (Lundin y col 1989). Cable y col (1997) estiman en su estudio que un 33% de los potrillos examinados despus de la ciruga original presentaron evidencia de adherencias intraabdominales y un 16% present adherencias que causaron problemas clnicos. Adems, Singer y Livesey (1997) indican que un 10% de muertes postoperatorias se debera a la formacin de adherencias, valor de mortalidad menor al indicado para potrillos por Vatistas y col (1996), el cual sera de aproximadamente un 17%. De manera interesante, cabe mencionar que las adherencias abdominales se conocen por al menos 1.500 aos, siendo descritas por Talmud en Babilonia en el 440 a.C. Algunos datos sugieren que los antiguos egipcios, conocidos por sus detalladas descripciones de la anatoma humana, habran descrito la presentacin de adherencias plvicas siglos antes que esto. A partir de 1880, comienzan a aparecer las primeras publicaciones sobre el uso de adyuvantes para la prevencin de adherencias. Lo que sigue en los siguientes 100 aos es una pltora de reportes cientficos y ancdotas que describen el uso de fluidos amniticos, rumen bovino, peritoneo de tiburn, vejiga de peces, humor vtreo de terneros, variadas gomas, lubricantes, fluidos, geles, polmeros, barreras fsicas y una serie de mtodos 2

de separacin mecnica para prevenir las adherencias. El objeto de esta detallada descripcin histrica es el de enfatizar que las adherencias son descritas desde hace mucho tiempo y los avances que se estn haciendo son para entender la fisiologa bsica de su formacin (Becker y Stucchi 2004). Las membranas serosas de las cavidades peritoneal, pleural y pericrdica son derivaciones embriolgicas similares y se encuentran recubiertas por una capa de clulas mesoteliales, las cuales se mantienen unidas a una membrana basal (Cheong y col 2001). La membrana peritoneal est compuesta por una monocapa de clulas mesoteliales de origen mesenquimal sobre una membrana basal continua anclada en el submesotelio (van der Wal y Jeekel 2007). Este ltimo consiste en una matriz extracelular (MEC) compuesta de diferentes tipos de colgeno, glicoprotenas, glicosaminoglicanos y proteoglicanos (Cheong y col 2001). Las clulas mesoteliales presentan una poblacin homognea con apariencia aplanada, estirada y escamosa o cuboidal (van der Wal y Jeekel 2007). La superficie luminal de las clulas mesoteliales presenta numerosos microvellos, los cuales aumentan la superficie funcional para el intercambio entre clulas mesoteliales y la cavidad peritoneal. Sin embargo, estos microvellos son estructuras lbiles y el nmero de stos presentes en cada clula vara dependiendo de las condiciones fisiolgicas y patolgicas (Mutsaers y col 1996). Las clulas mesoteliales poseen adems cilios en su superficie apical, los cuales son cinco veces ms largos que los microvellos adyacentes; la cantidad de cilios en la superficie mesotelial aumenta con incrementos en la densidad celular, lo cual sugiere que ellos juegan un rol esencial en la polaridad de las clulas mesoteliales y en la adhesin clula-clula (van der Wal y Jeekel 2007). Clsicamente, las funciones primarias atribuidas al mesotelio son proveer una barrera de proteccin e interfase sin friccin para movimientos libres de aposicin de rganos y tejidos. Recientemente, se ha descubierto que este tejido juega un rol en el transporte de fluidos y clulas, iniciacin y resolucin del proceso inflamatorio, reparacin tisular, lisis de depsitos de fibrina y proteccin contra microorganismos invasores y, posiblemente, diseminacin de tumores (Mutsaers 2002, 2004). La parte intermedia y visceral de las membranas serosas no slo provee de un mecanismo de suspensin elstico y adaptable, sino que tambin forma un lecho para estructuras sanguneas, linfticas y nerviosas, las que proporcionan vascularizacin e inervacin, encontrndose estas estructuras en el espacio subseroso (Cheong y col 2001, Foley-Comer y col 2002). La superficie libre de las membranas serosas es lisa y est lubricada por una pequea cantidad de lquido seroso; de aqu que las vsceras se puedan deslizar sobre la pared de las cavidades o unas sobre otras, con la menor cantidad posible de friccin (Didio 1994). La difusin y reabsorcin del fluido ocurre libremente a travs del mesotelio y estroma submesotelial (Cheong y col 2001).

EQUINOS, ADHERENCIAS ABDOMINALES, POSTQUIRRGICAS

El peritoneo que recubre el interior del abdomen est compuesto por tejido conectivo bajo una capa simple de clulas mesoteliales, separado por una membrana basal. Estas capas proveen un soporte externo a la capa muscular del intestino y mantienen una capa lubricada en la superficie serosa (Eggleston y Mueller 2003). En equinos, el lquido peritoneal es un transudado simple y de poco volumen, el cual es producido por el peritoneo semipermeable. Aproximadamente 60 ml de lquido peritoneal son producidos por hora, pero la cavidad peritoneal normalmente contiene slo una pequea cantidad de este lquido (Browning 2005). El lquido peritoneal normalmente contiene muchas de las protenas plasmticas, dentro de las cuales el fibringeno interviene durante el proceso inflamatorio intraperitoneal, especialmente en el perodo intra y postoperatorio, en donde se forman las adherencias (Duron 2007). De acuerdo a Hanson y col (1992), el lquido peritoneal refleja el estado patofisiolgico de las superficies mesoteliales parietales y viscerales, por lo cual manipulaciones adicionales del peritoneo asociadas a reseccin y anastomosis de dos segmentos de intestino tendran pequeas consecuencias comparado con el trauma inducido en una celiotoma exploratoria. El peritoneo se invierte sobre s mismo para formar dos estructuras, el omento y el mesenterio, los cuales contienen una gran cantidad de vasos linfticos y sanguneos. En mamferos machos, forman un espacio cerrado, mientras que en hembras existe una potencial comunicacin al exterior va cuernos uterinos. El peritoneo parietal se encuentra inervado por ramas de nervios espinales y contiene nociceptores trmicos, qumicos y mecnicos (Duron 2007), los cuales son capaces de procesar estmulos dolorosos agudos localizados (Hollinshead 1953, Browning 2005). El peritoneo visceral, en contraste, est inervado por aferentes simpatticos y reacciona a estmulos producidos por distensin, estiramiento, isquemia e inflamacin (Browning 2005). Las adherencias se encuentran bien vascularizadas, independiente de su madurez, ubicacin o patologa intraperitoneal. Las fibras nerviosas, consistentes en axones mielnicos y amielnicos, son comunes de encontrar en las adherencias. El rol de las adherencias en la etiologa del dolor abdominal es an controversial, pero la presencia de fibras nerviosas dentro de stas sostiene la teora de que ellas son capaces de conducir estmulos nociceptivos (Herrick y col 2000). La mayora de los eventos patofisiolgicos relacionados con el desarrollo de las adherencias intraabdominales se encuentran poco descritos para la especie equina en particular; debido a esta razn la mayor parte de la informacin presentada a continuacin hace referencia a diversos estudios, principalmente llevados a cabo tanto in vitro como in vivo en animales de experimentacin y humanos. Estos resultados son extrapolados a la especie equina de la mejor forma posible de acuerdo a lo reportado por la literatura cientfica veterinaria para dicha especie (Fubini 1990, White 1993, Mueller 2002).

PATOFISIOLOGA

Las adherencias son bandas de material fibrinoso que se originan en la superficie de una membrana serosa y forman una conexin con una superficie opuesta (Semrad 1999); se clasifican bsicamente en adherencias de tipo inflamatorio y postquirrgicas. Las adherencias inflamatorias se presentan despus de procesos inflamatorios intraabdominales. En cambio, las adherencias postquirrgicas son la consecuencia resultante de un dao a la superficie tisular, que posterior a incisiones, cauterizacin, sutura u otras formas de trauma se fusionan para formar tejido cicatrizal (Liakakos y col 2001). No obstante, las adherencias pueden ser beneficiosas debido a su habilidad de proveer una fuente adicional de sangre a la serosa o intestino isqumico (Baxter 1991). Igualmente, adherencias perianastomticas pueden prevenir fugas desde las lneas de sutura y aislar desechos inflamatorios, previniendo as una peritonitis generalizada (Mueller y col 2000b). Diversas alteraciones inflamatorias del mesotelio peritoneal promueven el proceso de formacin de adherencias a travs del inicio de un estado procoagulativo inmediato, caracterizado por la secrecin de exudado serofibrinoso y deposicin de fibrina (Ellies 1962, Holmdahl 1997). La formacin de adherencias finalmente es el resultado de un desbalance entre los procesos de fibrinognesis y fibrinlisis. La prevalencia de una de stas sobre la otra produce la variabilidad de la respuesta a adherencias por parte de diferentes pacientes (Di Filippo y col 2006). Durante una ciruga, el dao mesotelial inicial expone una superficie limpia y acelular que sirve como nido para la formacin de adherencias del tipo tejido-tejido. Este dao y la ruptura de la matriz submesotelial ocurren junto con la activacin de la cascada de la coagulacin y la deposicin de fibrina en el sitio daado (Boland y Weigel 2006). Las injurias quirrgicas del tejido reducen o eliminan el flujo sanguneo, produciendo isquemia, lo cual lleva a la persistencia de la matriz de fibrina, siendo gradualmente reemplazada por tejido de granulacin, el cual atrae la presencia de macrfagos, fibroblastos y clulas gigantes. Durante este proceso el tejido de granulacin se caracteriza por poseer variables cantidades de eritrocitos separados por bandas o masas condensadas de fibrina, las cuales se encuentran cubiertas con dos o tres capas de clulas aplanadas que contienen un infiltrado de clulas mononucleares (diZerega y Campeau 2001). El mecanismo involucrado en la regeneracin mesotelial es controversial y muchas hiptesis se han propuesto para el origen de las clulas del mesotelio en regeneracin (Foley-Comer y col 2002). Actualmente, Duron (2007) seala que se manejan cuatro hiptesis al respecto, las cuales son: a) crecimiento de clulas perifricas, b)transformacin de clulas mesenquimales totipotenciales subyacentes o clulas perivasculares en el mesotelio, c) trasplante de clulas mesoteliales provenientes del mesotelio de estructuras adyacentes o de 3

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clulas mesoteliales de libre flotacin y d) transformacin de clulas del lquido peritoneal. Se ha establecido experimentalmente que el dao en el tejido peritoneal produce una reduccin en la capacidad fibrinoltica y como consecuencia la formacin de adherencias intraabdominales (Thompson 1998). Este sistema fibrinoltico extravascular, independiente de la circulacin de la cavidad peritoneal, difiere del sistema fibrinoltico plasmtico, en donde un tipo celular (clulas endoteliales vasculares) secreta un activador de plasmingeno tipo tejido (t-PA) y otros tipos celulares (hepatocitos, clulas endoteliales y clulas de Kpffer) son responsables de la depuracin de t-PA desde la circulacin sangunea (Sitter y col 1999). Una gran variedad de estmulos inflamatorios pueden resultar en dao peritoneal, lo cual se ha asociado a cambios histopatolgicos que demuestran una clara secuencia de eventos desde el dao a la formacin de adherencias (Thompson 1998). La injuria peritoneal quirrgica, procesos inflamatorios o isqumicos llevan a una sustancial disminucin del flujo sanguneo y al crecimiento patolgico de vasos sanguneos (Cheong y col 2001), adems causa la descamacin de clulas mesoteliales, dejando un rea desnuda (van der Wal y Jeekel 2007); esta fase coincide con un aumento en la permeabilidad de los vasos (Duron 2007), lo que lleva a la liberacin de clulas y exudado inflamatorio, el cual es organizado. La invasin de fibroblastos es seguida por deposicin de colgeno y formacin de tejido fibroso permanente. El organismo, igualmente, posee mecanismos que contrarrestan esta deposicin de fibrina, ya que las superficies mesoteliales, tales como el peritoneo, poseen actividad fibrinoltica, la cual, de no ser daada, produce lisis de fibrina dentro del exudado inflamatorio antes de que este ltimo se organice (Thompson 1998). Las clulas mesoteliales son clulas metablicamente activas que participan en la inflamacin serosa a travs de la secrecin de varios mediadores pro, anti e inmunomoduladores, dentro de los cuales se pueden incluir prostaglandinas y prostaciclinas, quemoquinas, xido ntrico (ON), especies nitrgeno y oxgeno reactivas, enzimas antioxidantes, citoquinas, factores de crecimiento, matriz extracelular (MEC), molculas y productos de la cascada de la coagulacin (Mutsaers 2002). Cultivos celulares mesoteliales humanos han demostrado producir grandes cantidades de activador de plasmingeno (PA), tipo tejido (t-PA) y tipo uroquinasa (u-PA), as como tambin su inhibidor especfico, el inhibidor del activador de plasmingeno tipo 1 (PAI-1). Se reporta que las clulas mesoteliales no slo sintetizan activamente PA, sino que tambin internalizan y degradan eficientemente t-PA y u-PA va endocitosis mediada por receptores (Sitter y col 1999). El funcionamiento del sistema fibrinoltico tiene como base la conversin de una proenzima, el plasmingeno, a su enzima proteolticamente activa, la plasmina, capaz de degradar el cogulo de fibrina. La transformacin de 4

plasmingeno en plasmina activa se produce mediante la accin proteoltica de dos enzimas activadoras de plasmingeno (PA), denominadas respectivamente activador tisular de plasmingeno (t-PA) y activador del plasmingeno de tipo uroquinasa (u-PA) (Hellebrekers y col 2000, Cheong y col 2001, Mutsaers 2002, Gilabert 2005). Se cree que el t-PA es responsable primariamente de la remocin de fibrina dentro de la vasculatura a travs de su especfica afinidad por la fibrina. Alternativamente, u-PA se une a receptores celulares y ha sido tradicionalmente asociado con protelisis pericelular va degradacin de componentes de la matriz celular y activacin de proteasas latentes y factores de crecimiento en sitios extravasculares (Sulaiman y col 2002). A esta tendencia profibrinoltica se opone una antifibrinoltica, la cual est mediada por la accin de los inhibidores naturales de los PA, los cuales se denominan inhibidor del activador del plasmingeno tipo1 (PAI-1) y tipo 2 (PAI-2). Existe un tercer inhibidor denominado inicialmente PAI-3 y que ms tarde fue identificado como uno de los inhibidores de la protena C reactiva en su forma activada (Hellebrekers y col 2000, Cheong y col 2001, Mutsaers 2002, Gilabert 2005, Renckens y col 2005). Se ha sugerido que los componentes del sistema plasmina, particularmente PAI-1, pueden ser usados como marcadores tisulares de la propensin a desarrollar adherencias postquirrgicas, por lo que podra ser un potencial identificador de pacientes de alto riesgo (Di Filippo y col 2006). El inhibidor de PA tipo-2 (PAI-2), a diferencia de PAI-1, no es detectable en plasma y por lo tanto PAI-1 es reconocido como el mayor inhibidor sistmico de fibrinlisis (Ritchie y Booth 1998). Por otro lado, PAI-2 ha sido detectado en epidermis, tejido inflamado y placenta, siendo los tipos celulares que expresan PAI-2 queratinocitos, monocitos y trofoblastos respectivamente. Adems, otros tipos celulares expresan PAI-2, incluyendo clulas endoteliales, clulas de msculo liso, fibroblastos y muchas lneas celulares transformadas. La ubicacin de PAI-2 parece ser especfica del tipo celular y las clulas endoteliales y fibroblastos mantienen PAI-2 casi exclusivamente como molcula intracelular, en cambio los monocitos tienen ambas PAI-2, intracelular y secretoria. La doble ubicacin de PAI-2 refleja diferentes funciones en ambos sitios. PAI-2 secretada por monocitos modula eficientemente la migracin de clulas mediada por u-PA, a diferencia de PAI-2 intracelular que ha demostrado prevenir la apoptosis celular (Ritchie y col 1999). El principal PA en el peritoneo es t-PA, el cual es inhibido cuando se forma un complejo 1:1 con inhibidor de PA PAI-1. El trauma quirrgico ha demostrado deteriorar la actividad fibrinoltica peritoneal a travs de la reduccin de la actividad de PA y/o aumentar la actividad de PAI-1 y PAI-2, siendo estas sustancias encontradas slo en peritoneo inflamado (Holmdahl 1997, Wang y col 2003, Reed y col 2004, Memisoglu y col 2006, Polubinska y col 2006). El tiempo que toman los cambios fibrinolticos, posterior a un dao quirrgico, en pacientes sin inflamacin peritoneal

EQUINOS, ADHERENCIAS ABDOMINALES, POSTQUIRRGICAS

preexistente, ha sido analizado usando drenajes de lquido peritoneal, encontrndose que ste rpidamente pierde actividad del PA y esta prdida de actividad se encuentra asociada a una deteccin de altos niveles de PAI-1 y 2 (Thompson 1998). La actividad fibrinoltica es t-PA dependiente y su prdida es el resultado de la produccin de PAI-1 y 2 por el tejido mesotelial y submesotelial. Esta produccin de PAIs parece ser el resultado del estmulo de citoquinas proinflamatorias de clulas mesoteliales y mediadores tales como lipopolisacridos (LPS), factor de necrosis tumoral- (TNF-) e interleuquin-1 (IL-1), adems de mediadores fibrognicos, tales como factor de crecimiento transformante- (TGF-) y trombina (Thompson 1998, Sitter y col 1999, Mutsaers 2002). En el peritoneo normal y en reparacin, un diverso grupo de factores de crecimiento son la llave determinante en la composicin de la MEC, y muchas de estas protenas, tales como TGF-, factor de crecimiento epitelial (EGF), factor de crecimiento tipo insulina (IGF), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) y factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF), se encuentran implicadas en la formacin de adherencias. La actividad coordinada de estos factores de crecimiento y molculas bioactivas es responsable de la capacidad metablica y proliferativa de las clulas fibroblsticas durante la formacin de las adherencias y, por lo tanto, son un blanco atractivo para intervenciones teraputicas (Cahill y col 2006, Boland y Weigel 2006). Holmdahl (1997) determin en su estudio la expresin diferencial de PA y PAI tanto en mesotelio como submesotelio peritoneal. En el mesotelio normal, t-PA, u-PA y PAI-1 se encontraron presentes, a diferencia del submesotelio, donde slo se encontr PAI-1 y u-PA pero no t-PA. En peritoneo inflamado, la expresin de t-PA en el mesotelio se encontr sustancialmente reducida, mientras que la expresin de PAI-1 en el submesotelio estuvo intensificada. La expresin de t-PA en el mesotelio pero no en el submesotelio sugiere que t-PA es el responsable de la depuracin de fibrina en la cavidad peritoneal. Estudios que prueban el efecto teraputico de t-PA en la formacin de adherencias postoperatorias han demostrado que la administracin de ste en la cavidad peritoneal durante el perodo postoperatorio disminuye la formacin de adherencias (Boland y Weigel 2006). Igualmente, en estudios experimentales en ratas se ha descrito un aumento en la sntesis intraperitoneal de t-PA durante los das posteriores a la ciruga, lo cual fue interpretado como una reaccin compensatoria para aumentar la deposicin de fibrina (Polubinska y col 2006). Esto, debido a que en la cavidad abdominal t-PA sera responsable del 95% de la conversin de plasmingeno (Holmdahl y col 1997); sin embargo, cirugas intraabdominales perturban el balance entre t-PA y PAI-1, lo que lleva a una disminucin en la actividad fibrinoltica, a un aumento en el exudado fibrinoso y eventualmente a un aumento en la formacin de adherencias (Scott-Coombes y col 1995).

La actividad fibrinoltica peritoneal y la formacin de adherencias postoperatorias pueden estar reguladas, en parte, por la sustancia proinflamatoria peptdica P (SP) (Hkfelt y col 2001). Esta SP es un neuropptido, neurotransmisor, neuromodulador y posee funciones endocrinas; adems se le ha implicado en reacciones inflamatorias. SP es conocida por jugar un importante rol en el proceso de inflamacin, proliferacin y reparacin de heridas. Los efectos conocidos de SP van desde favorecer la transcripcin de cido ribonucleico mensajero (mRNA) para favorecer la sntesis de citoquinas proinflamatorias hasta estimular la angiognesis y proliferacin de fibroblastos (Reed y col 2002). Las estructuras neuronales son la fuente primaria de SP, pero linfocitos (Lai y col 1998), monocitos, macrfagos (Ho y col 1997) y eosinfilos (Metwali y col 1994) han sido identificados como fuentes adicionales. La SP se encuentra en lquido peritoneal (Sanfilippo y col 1992) y neuronas sensitivas que contienen SP han sido encontradas en adherencias peritoneales (Sulaiman y col 2001). La multiplicidad de funciones y localizaciones celulares documentadas de SP sugiere un significativo rol en la formacin de adherencias (Reed y col 2002). El hecho de que las adherencias se encuentren inervadas con neuronas sensitivas que contienen SP sugiere que son capaces de generar estmulos dolorosos y con esto favorecer el dolor visceral asociado a las adherencias (Becker y Stucchi 2004). La distincin entre reparacin peritoneal normal y formacin de adherencias recae en el balance entre la deposicin y degradacin de fibrina. Se ha hipotetizado que la actividad fibrinoltica peritoneal juega un importante rol en la formacin de adherencias. Si la fibrinlisis local es adecuada, las adherencias fibrinosas son lisadas llevando a una restauracin normal del tejido. Sin embargo, si la fibrinlisis es insuficiente, la fibrina persistente se infiltra de fibroblastos y capilares llevando a adherencias fibrosas permanentes (Mueller 2002). La reparacin peritoneal difiere de la reparacin de la piel. La reepitelizacin de la piel ocurre a travs de proliferacin de clulas epiteliales desde la periferia hacia el centro de la herida. En contraste, el peritoneo se mesoteliza, independiente del tamao del dao, con nuevo mesotelio desarrollado a partir de islas de clulas mesoteliales, las cuales proliferan en capas celulares (Liakakos y col 2001). De manera interesante, cabe mencionar que, en el abdomen, la velocidad de reperitonealizacin es igual (7-10 das) independiente del tamao inicial del dao; no se encuentra limitado el grado de migracin de clulas desde la periferia (Boland y Weigel 2006). Leucocitos peritoneales, clulas mesoteliales y macrfagos son importantes componentes celulares en la reparacin peritoneal. Este proceso est caracterizado por infiltracin celular y una respuesta de crecimiento por parte de las clulas mesoteliales en el rea daada. En respuesta al dao inicial, las clulas residentes del peritoneo tales como macrfagos y clulas mesoteliales producen mediadores celulares, los cuales sirven para 5

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modular y ordenar la subsecuente respuesta de las otras clulas involucradas en la respuesta inflamatoria (Cheong y col 2001). Las clulas mesoteliales secretan interleuqun 1 (IL-1), 6 (IL-6), 8 (IL-8), factor de necrosis tumoral alfa (TNF-) y factor de crecimiento transformante (TGF)- al ser estimuladas in vitro, adems de factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) y miembros de la familia de factores de crecimiento endotelial (EGF) regulando este proceso (Cheong y col 2001, Mutsaers 2002). En gran parte del proceso de reparacin de heridas (incluidas aquellas en la cavidad peritoneal), la primera fase iniciada por el dao del tejido lleva a la activacin de la cascada de la coagulacin. La respuesta vascular primaria al dao directo es la vasoconstriccin, la cual es una respuesta local vasoactiva. El corto perodo de vasoconstriccin es seguido por vasodilatacin y prdida de tono, permitiendo que factores sanguneos entren en la herida. Las clulas invasoras son llevadas por gradiente de quimiotcticos y cambios bioqumicos en el ambiente local, mientras que el ambiente mismo es modificado por varios factores solubles circulantes que se encuentran disponibles en el sitio del dao (Boland y Weigel 2006). Las primeras clulas en aparecer en el peritoneo daado son mayormente neutrfilos polimorfonucleares (PMN), los cuales persisten por 1-2 das. Esto es seguido por monocitos, los cuales se diferencian posteriormente en macrfagos que se adhieren a la superficie de la herida peritoneal (DiZerega 1990, DiZerega y Campeau 2001). Se ha demostrado tambin que el aumento de macrfagos disminuye marcadamente la formacin de adherencias postoperatorias. Adicionalmente, se ha reportado que la inhibicin en la capacidad de adherencia de los PMN resulta en un aumento en la formacin de adherencias (Vural y col 1999). Las plaquetas son un importante componente del exudado inflamatorio en el momento inicial del dao tisular. Poseen la habilidad de adherirse a los sitios de unin de la matriz extracelular (MEC). Las plaquetas provienen de megacariocitos de la mdula sea y contienen varios tipos de grnulos que liberan protenas bioactivas en el sitio del dao. En la degranulacin de las plaquetas, los grnulos alfa liberan factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y TGF-, mientras que los cuerpos densos liberan epinefrina y serotonina, contribuyendo a la produccin de prostaglandinas y leucotrienos. En el peritoneo existen una serie de vas que llevan a deposicin de fibrina posterior a la injuria; sin embargo, mucha de esta fibrina proviene de la deposicin y degranulacin de plaquetas. La fibrina depositada acta como un puente o andamio provisional que facilita la conexin entre las superficies superpuestas. Se cree que esta accin de puente forma la arquitectura inicial de la subsecuente formacin de adherencias (Boland y Weigel 2006). Para prevenir este proceso, la actividad fibrinoltica lisa y remueve los depsitos de fibrina intraperitoneal; adems, es bien conocido que los macrfagos 6

secretan activador de plasmingeno y al ser las clulas ms comunes del lquido peritoneal exudativo, proveen la mayor fuente de esta enzima (ArRajab y col 1995). A partir del tercer da, las clulas mesoteliales comienzan a cubrir los macrfagos peritoneales de la superficie de la herida y stos van quedando cada vez ms profundos en la herida. En el da 4-7, las clulas predominantes en la superficie del peritoneo son clulas mesoteliales. Despus del da 5 postquirrgico, el mayor tipo celular en el lquido peritoneal son los macrfagos, pero comienzan a declinar en nmero (DiZerega 1990). En el da 5, las adherencias estn pobladas mayormente por racimos de fibroblastos organizados con canales vasculares endoteliales lineales detectables y la matriz extracelular comienza a hacerse ms densa y mejor organizada. Por lo tanto, al da 5 el rol local de las clulas inflamatorias en dirigir y/o modular la formacin de adherencias disminuye y los fibroblastos son ahora el tipo celular primario. Estas clulas son similares a los miofibroblastos encontrados en heridas en otras reas y expresan marcadores tales como actina muscular lisa alfa (-SMA) (Boland y Weigel 2006). Luego, estas clulas mesoteliales proliferan a travs de la base de la herida y forman mltiples islas de clulas. La confluencia de estas islas de clulas permite que grandes heridas reparen en el mismo tiempo que una de menor tamao. Esta forma de reparacin contrasta con la de la piel en donde la reparacin comienza desde los bordes de la herida, es por esto que las grandes lesiones demoran ms en sanar que las pequeas (DiZerega 1990, DiZerega y Campeau 2001). Foley-Comer y col (2002) pudieron demostrar que las clulas mesoteliales de libre flotacin son el origen del mesotelio en regeneracin, requiriendo del reclutamiento de clulas inflamatorias hacia la superficie de la herida y la liberacin de citoquinas mitognicas que activen y estimulen la proliferacin de clulas mesoteliales que rodean la herida. Estas clulas mesoteliales activadas rompen su contacto clula-clula y migran a la superficie de la herida.
PREVENCIN Y TRATAMIENTO

Acorde con Mueller (2002), el nfasis debe ser la prevencin de la formacin de adherencias, ya que el tratamiento despus de formadas es complicado y costoso, asociado adems a una alta morbilidad y mortalidad de los pacientes. La prevencin en la formacin de adherencias durante una ciruga exige reducir el trauma quirrgico y evitar la contaminacin de la cavidad abdominal con materiales extraos (Vrijland y col 2002). Sin embargo, el mtodo ms efectivo para prevenir las adherencias es una tcnica quirrgica excelente que minimice la inflamacin peritoneal (Hay y col 2001). Esto coincide plenamente con Gorvy y col (2008), quienes sealan que el trauma quirrgico es el estmulo ms importante en la formacin de adherencias, por lo tanto el manejo estricto de los principios de ciruga moderna de Halsted, incluyendo un manejo atraumtico de los tejidos, hemostasis

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meticulosa, minimizar la contaminacin del tejido por exposicin a bacterias de la mucosa, minimizar la exposicin a material extrao y disminuir el tiempo de la ciruga son esenciales para reducir la formacin de adherencias postoperatorias (Mueller 2002). Estudios en ratones y humanos han demostrado que el talco de almidn usado en guantes quirrgicos induce inflamacin peritoneal y aumenta significativamente la formacin de adherencias de una manera dependiente de la dosis (Chegini y Rong 1999, Sjsten y col 2004). Los objetivos primarios en la prevencin de adherencias son los siguientes: a)minimizar la inflamacin de la serosa, b) minimizar la produccin de fibrina, c) estimular una motilidad intestinal adecuada y d) separar las superficies cubiertas por fibrina mecnicamente (Mueller y col 1998). Las investigaciones acerca de la prevencin y tratamiento de las adherencias postoperatorias se han focalizado en mejorar las tcnicas quirrgicas (Gorvy y col 2008), administracin sistmica de frmacos antiinflamatorios no esteroidales (AINES) (White 1993), dimetil sulfxido (DMSO) (Sullins y col 1991), antimicrobianos (White 1993), administracin de heparina (Parker y col 1987), lavados peritoneales (Valdez y Wallace 1980, Hague y col 1998), administracin intraperitoneal de soluciones de alto peso molecular y omentectoma (Baxter 1991, Murphy y col 2002), as como tambin la utilizacin de biomateriales naturales como peritoneo, omento, amnios, gelatina, colgeno y cido hialurnico en ratas y conejos (Young y col 1991, Edwards y col 1997, Hellebrekers y col 2000, Matsuda y col 2002, Liu y col 2007). Sin embargo, los agentes teraputicos que promueven la actividad fibrinoltica para prevenir la formacin de adherencias deben ser usados durante la ciruga o posterior a ella; de acuerdo con Hellebrekers y col (2000), el tratamiento con estos promotores por 24 a 36 hrs previno la formacin de adherencias postquirrgicas en un modelo murino. Terapia analgsica. El grupo de analgsicos ms utilizados para el tratamiento del dolor en patologas quirrgicas y no quirrgicas en equinos es el de los antiinflamatorios no esteroidales (AINES) (White 1999), sustancias diferentes a los esteroides que inhiben ciertas etapas y componentes de la cascada de la inflamacin (Moses y Bertone 2002). De acuerdo a Hall y col (2001), son ampliamente usados en equinos para proveer analgesia en dolor agudo, debido a su accin antiinflamatoria, antiendotxica y por adems proveer analgesia en casos de dolor crnico. Los AINES difieren tremendamente en potencia y eficacia dependiendo del tipo de dolor e inflamacin presentes, siendo lo ms importante el realizar una adecuada seleccin clnica del frmaco a utilizar basndose en la sintomatologa y objetivo clnico deseado (Clark y Clark 1999). Los AINES adems pueden ser utilizados como agentes profilcticos en contra de la formacin de adherencias por su habilidad de suprimir la respuesta inflamatoria fibroproliferativa, aumentar la capacidad fagoctica y la actividad fibrinoltica

de macrfagos, as como reducir y mejorar la organizacin de fibrina (Semrad 1999). El resultado final depende de la severidad de la lesin, tiempo y cantidad de frmacos administrados y de cada paciente en forma individual (Sullins 1990). El flunixin meglumine es, por lejos, el AINE ms efectivo y ms utilizado para tratar dolor visceral en caballos. Este frmaco ha demostrado aliviar clicos experimentales dentro de los diez minutos posteriores a su administracin endovenosa, proveyendo de una a ocho horas de analgesia (Morris 1988, Clark y Clark 1999). Sin embargo, estudios desarrollados en equinos han revelado que la administracin de flunixin meglumine en dosis de 1,1 mg/kg retarda la recuperacin de la funcin de la barrera intestinal del yeyuno isqumico y daado (medido in vitro utilizando parmetros como resistencia elctrica transmucosa y comparado con hallazgos en tejido no tratado) (Blikslager y col 1997, Campbell y Blikslager 2000, Tomlinson y col 2004). Asociado a esto, algunos AINES tambin pueden contribuir al dao isqumico durante la reperfusin tisular a travs de la disminucin del flujo sanguneo local causado por la menor produccin de PG (Tomlinson y Blikslager 2003). Little y col (2007) reportan en su estudio de meloxicam, un AINE con mayor afinidad por ciclooxigenasa 2 (COX-2), que su administracin no afecta la recuperacin del yeyuno daado e isqumico, lo que, de acuerdo a los autores, podra deberse a que este frmaco, al no inhibir masivamente la enzima ciclooxigenasa 1 (COX-1), permite su suficiente actividad asociada a procesos de reparacin, mediada por prostaglandinas (PG). Esta reparacin de la funcin de barrera intestinal, inhibiendo los efectos perjudiciales de las PG, elaboradas por COX-2, adems de los signos clnicos de endotoxemia y dolor, hace que su uso sea considerado por los autores como una buena alternativa al flunixin meglumine en equinos ya que provee un adecuado nivel de analgesia, efectos benficos sobre variables clnicas, adems de permitir la recuperacin intestinal. Lavados peritoneales. El peritoneo, especialmente su porcin visceral, es una barrera semipermeable con difusin bidireccional de agua y solutos. Las soluciones administradas en la cavidad peritoneal rpidamente se equilibran con el plasma. Consecuentemente, la administracin de frmacos intraperitoneales tiene una absorcin similar a la administracin intramuscular (Bowman 1990). Con objeto de reducir el riesgo de peritonitis bacteriana, los lavados peritoneales o lavados locales de una porcin intervenida quirrgicamente son realizados posterior a intervencin quirrgica del tracto gastrointestinal (Schneider y col 1988). Los beneficios del lavado peritoneal se pueden atribuir a eliminacin de sangre acumulada en la cavidad peritoneal, reduccin del nmero de bacterias, remocin de toxinas y enzimas bacterianas en un rea de gran absorcin, remocin de materiales extraos (Valdez y Wallace 1980), adems de la remocin fsica de fibrina desde las superficies 7

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serosas, separacin de las asas intestinales y remocin de mediadores inflamatorios (Hague y col 1998). Los lavados intraabdominales postquirrgicos han demostrado minimizar la incidencia de adherencias en abrasin de serosa experimental en caballos. La tcnica descrita consiste en la infusin de aproximadamente 10L de suero Ringer lactato tibio en el abdomen a travs de un catter fenestrado 32F puesto en el abdomen ventral derecho previo al acto quirrgico. El lavado se realiza a las 12, 24 y 36 horas posteriores a la ciruga y luego el catter es removido (Hague y col 1998). Los anticoagulantes, en especial heparina, han sido los agentes ms investigados para la prevencin de adherencias, administrados tanto por va peritoneal como sistmica (Gupta y Jain 1985, Trkapar y col 1995, Arikan y col 2005). La heparina es un proteoglicano natural y ha sido descrito como un reductor en la formacin de adherencias en modelos de isquemia-reperfusin en ponies (Parker y col 1987). La heparina acta como un cofactor de antitrombina III para aumentar el grado de antitrombina II, inactivando el factor de coagulacin serina proteasa. El resultado es la disminucin en la produccin de trombina, la cual es la responsable de la conversin de fibringeno en fibrina y finalmente de las adherencias fibrosas. Es por esto que la heparina realza la fibrinlisis a travs del estmulo de la actividad del PA (Eggleston y Mueller 2003). Igualmente, el efecto de disminucin en la formacin de adherencias de la heparina de bajo peso molecular puede explicarse por los diferentes mecanismos de accin de la molcula de heparina, la cual al formar el complejo con antitrombina III in vivo previene la formacin de trombina, adems de aumentar la degradacin de trombina (Rosenberg y Damus 1973). Adems la heparina posiblemente estimula la secrecin de activador de plasmingeno (PA) por parte de macrfagos (Markwardt y Klocking 1977) y tambin estimula directamente la actividad de PA, por lo tanto, aumenta la accin de plasmingeno (Orita y col 1986). De acuerdo a esto, la deposicin de fibrina durante la segunda fase de la formacin de adherencias disminuye, lo que resulta en una menor formacin de adherencias (Arikan y col 2005). Sin embargo, Sullins y col (2004) establecen en su estudio en potrillos que el rol de la heparina en la prevencin de inflamacin serosa inducida por isquemia es limitado, ya que los segmentos de intestino delgado tratados con heparina desarrollaron fibrosis aumentada y el mesotelio no regener, lo que indicara que la respuesta inflamatoria no mejora o que el exudado de fibrina aument en los segmentos experimentales, los cuales despus se organizaron en tejido fibroso, el cual obstaculiza la migracin de nuevas clulas mesoteliales. De igual forma, la heparina ha demostrado ser til en presencia de sepsis por dos razones, la primera es que hay una directa actividad antibacteriana in vitro de mecanismo desconocido (Rosett y Hodges 1980) y la segunda es que disminuciones en la formacin de fibrina resultan en menor formacin de abscesos y adherencias, 8

previniendo el secuestro y aumento de eliminacin de microorganismos en perros y ratas (Hau y Simmons 1976, Hau y col 1979, Vela y col 1999). Las dosis recomendadas en equinos y la(s) va(s) de administracin continan siendo controversiales. Dosificaciones sistmicas de 20 a 100 UI/kg cada 6 a 12 horas, por 48 a 72 horas en el perodo postoperatorio, han sido usadas incluso para lavados peritoneales (Mueller 2002). Ya en 1940, Lehman y Boys detallan que la instilacin de heparina en la cavidad peritoneal en perros y conejos era efectiva en la prevencin de formacin y reformacin de adherencias. Sin embargo, Bloor y col (1947) establecen en su estudio que al ser administrada en dosis elevadas no previene la formacin o reformacin de adherencias intraperitoneales o la deposicin de fibrina en la superficie de apndices en conejos. En modelos de peritonitis en diversos roedores, pequeas dosis de heparina han demostrado disminuir la incidencia en la formacin de adherencias, aumentar la supervivencia y la tasa de eliminacin de fibringeno intraabdominal (OLeary y col 1988). Bahadir y col (2007) concluyen de su estudio en ratones que el uso de heparina en dosis bajas contribuye a reducir la incidencia de adherencias; sin embargo, sealan que es necesario realizar ms estudios para conocer la dosis ptima y evitar as disminuir la severidad de las adherencias, adems de hemorragias abdominales. En equinos, ante el riesgo de formacin de adherencias, Mueller (2002) seala que la administracin de 30.000 UI de heparina diluida en 4 litros de suero Ringer lactato en el abdomen antes del cierre y manteniendo al caballo con 40 UI/kg de heparina sulfato, endovenosa, cada 6 horas por 48 a 72 horas postoperatorio sera de utilidad. La administracin sistmica de heparina en caballos produce adems una disminucin transitoria del VGA, alcanzando hasta 50% despus de 3 a 4 das de terapia. Se cree que esta disminucin ocurre por aglutinacin eritrocitaria y no por hemorragia o hemlisis (Mahaffey y Moore 1986). El VGA vuelve a valores normales dentro de 4 das de finalizada la terapia con heparina (Mueller 2002). Posterior a una laparotoma, alrededor del 95% de los pacientes humanos desarrollan adherencias. Para prevenir esta formacin se han investigado los lavados peritoneales y muchas diferentes soluciones han sido propuestas (Sortini y col 2006). Los lavados intraabdominales intraoperatorios se abocan a prevenir la desecacin de las superficies serosas, minimizar el trauma seroso durante la manipulacin intestinal y remover la sangre, fibrina peritoneal y mediadores inflamatorios (Hague y col 1998). Aparentemente el lavado postquirrgico crea un efecto de hidroflotacin, el cual separa la superficie de la serosa intestinal y adems remueve fibrina peritoneal y mediadores inflamatorios (Mueller 2002). Hague y col (1998) concluyen que el lavado peritoneal reduce la frecuencia de adherencias intraabdominales. Sin embargo, Johns (2001) seala que en humanos, a pesar del volumen aplicado, la capacidad de absorcin del peritoneo asegura que este fluido es

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reabsorbido al sistema vascular dentro de 24-48 horas, tiempo muy corto como para influir en la formacin de adherencias. No existen ensayos clnicos controlados que demuestren que la hidroflotacin tenga algn efecto en la formacin de adherencias postoperatorias en equinos. Igualmente, otras combinaciones han sido utilizadas en forma de lavado peritoneal. Un estudio realizado por Wang y col (2003) en perros concluye que el uso de una solucin combinada de alantona, metronidazol y dexametasona (AMD) sera de utilidad por su efecto antiinflamatorio, antibacteriano y antiexudativo, impidiendo que el exudado rico en fibrina quede en la cavidad abdominal, y adems aumentara la actividad del PA de tejido endogentico, lo que prevendra las adherencias intraabdominales postoperatorias. De acuerdo al estudio piloto, la proporcin ms adecuada de estos frmacos fue 50:32:1, la cual adems demostr ser la combinacin ms efectiva, mientras que la toxicidad no aument. Hague y col (1998) concluyen en su estudio que los lavados para remover sangre peritoneal y fibrina en el perodo inmediato postciruga son beneficiosos en la prevencin de adherencias, siendo mejores que los intraoperatorios ya que permiten la remocin de fibrina que se forma despus de la ciruga. Igualmente, se ha documentado que el uso de soluciones protectoras tisulares aplicadas al tejido antes de la manipulacin quirrgica y durante la ciruga protege las superficies mesoteliales directamente y previene o reduce el tejido daado durante el procedimiento quirrgico, el cual puede llevar a la formacin de adherencias (Murphy y col 2002). Las soluciones o sustancias que previenen las adherencias se caracterizan por inhibir la adhesiognesis sin restringir la reparacin de la herida, son eficaces an en presencia de sangre u otros fluidos corporales, tienen propiedades antiinflamatorias, ausencia de factores inmunolgicos, biodegradabilidad, seguridad de permanecer en el lugar despus de la aplicacin, facilidad de manejo y efecto inmediato (Risberg 1997). La administracin intraperitoneal de soluciones de carboximetilcelulosa sdica (CMC) al 1%, un polisacrido sustituido, ha sido usada con xito en modelos experimentales para prevenir las adherencias en animales de laboratorio, ovejas y ponies (Hay y col 2001), siendo los volmenes recomendados entre 1 y 7 mL/kg introducidos dentro del abdomen antes de la manipulacin intestinal; sin embargo, algunos cirujanos prefieren depositar una solucin de 4-5 mL/kg de CMC al 1% dentro del abdomen justo antes de terminar la sutura de la lnea alba (Smith y col 2005). Sullins y col (2004) describen que el uso de una solucin de CMC al 3% en potrillos aument la fibrosis y disminuy la regeneracin mesotelial, fenmeno relacionado a la irritacin de las superficies. La carboximetilcelulosa (CMC) se encuentra actualmente disponible en tres diferentes gamas de pesos moleculares: baja (90 kd), media (250 a 350 kd) y alta (700 a 1000 kd). En estudios en equinos han sido utilizadas soluciones de CMC con molculas de peso medio como barreras postoperatorias para prevenir adherencias

intraabdominales. Aunque la CMC es biocompatible, cambios leves y transitorios se han observado en variables hematolgicas y bioqumicas al usarla intraabdominalmente en caballos (Murphy y col 2002). Los efectos benficos de CMC derivan de un efecto de hidroflotacin, el cual mecnicamente previene la aposicin de las superficies serosas o peritoneales, previniendo as la formacin de adherencias (Mueller y col 1998). Lopes y col (1999) observaron que posterior a infusiones con CMC al 1% existe un aumento en la densidad y protenas totales; adicionalmente encontraron un incremento en el conteo de leucocitos, as como tambin un aumento relativo de neutrfilos, por lo cual concluyen que la CMC caus una respuesta inflamatoria ms intensa y con un curso mayor en la cavidad peritoneal y que su excrecin ocurre por fagocitosis. Hay y col (2001) reportan que la CMC disminuy la incidencia de adherencias en respuesta a la abrasin de serosas y reseccin yeyunal y anastomosis. Un litro de CMC al 1% es suficiente para cubrir todo el yeyuno e leon, lo que lleva a la lubricacin del intestino y guantes de los cirujanos, lo que subjetivamente reduce la friccin durante la manipulacin intestinal. Un segundo litro de CMC al 1% es aplicado despus de la manipulacin, llevando a la acumulacin de CMC en el lugar de la ciruga. Sin embargo, grandes volmenes de CMC (2-4 litros) deben ser usados para alcanzar el efecto de hidroflotacin en el abdomen de los equinos. Igualmente, se ha establecido que la absorcin sistmica despus de la administracin intraperitoneal de grandes volmenes de CMC en caballos resulta en pirexia, depresin y anorexia postoperatoria (Mueller y col 2000a). En este sentido, Hay y col (2001) determinaron en ponies y caballos que el uso de 7 mL/kg de SCMC al 1% no genera complicaciones como las descritas anteriormente. De la misma forma, en su estudio el uso de 4-6 mL/kg de CMC al 1% fue efectivo para prevenir las adherencias y no se observ este tipo de efectos secundarios. Igualmente, el hialuronato de sodio, un polmero hidroflico natural y excelente lubricante de tejidos, ha demostrado ser efectivo en reducir las adherencias postquirrgicas despus de cirugas abdominales, pericrdicas y ortopdicas, previniendo la formacin de adherencias primariamente a travs de la formacin de una barrera lubricante protectora en la superficie serosa intestinal, parecida a CMC, previniendo el trauma abrasivo por manipulacin y desecacin y preservando la integridad del mesotelio. Igualmente, concentraciones de 0,4% de hialuronato de sodio han demostrado inhibir la formacin de adherencias en ratas (Burns y col 1995, Peck y col 1995), siendo esta solucin reabsorbida de la cavidad peritoneal y excretada dentro de los cinco das de administrada en cerdos (Kramer y col 2002). Barreras fsicas. Un acercamiento a la prevencin de las adherencias intraabdominales en equinos es colocar un material absorbible biocompatible en el abdomen, el cual sirve como barrera fsica durante el perodo postoperatorio 9

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cuando se forman las adherencias (Avital y col 2005). Recientemente, una membrana bioabsorbible compuesta de la combinacin de hialuronato (HA) y CMC se ha desarrollado para reducir la formacin de adherencias despus de cirugas en humanos. Esta membrana translcida y flexible ha sido evaluada clnicamente en humanos y equinos y es utilizada en la superficie serosa del intestino o peritoneo, formando una barrera protectiva temporal contra la formacin de adherencias serosa-serosa o serosa-peritoneo durante el perodo postoperatorio temprano (Mueller y col 2000b, Cohen y col 2005). La combinacin de HA y CMC produce un compuesto con una permanencia in vivo mayor comparado con HA o CMC solos. La membrana se hidrata a un gel aproximadamente 24 a 48 horas despus de su aplicacin, pero permanece en el sitio de la aplicacin por ms de siete das, lo que realza su habilidad de reducir la formacin de adherencias (Mueller y col 2000a) en incidencia, extensin y severidad (Vrijland y col 2002). Mueller y col (1998) establecieron que el uso de la membrana bioabsorbible HA previene la formacin de adherencias intraabdominales inducidas experimentalmente en todos los caballos tratados, por lo cual se concluye que la membrana HA previene la formacin de adherencias por un mecanismo similar al de CMC, que es separar las superficies serosas durante el perodo postoperatorio temprano de la reparacin. Adicionalmente Mueller y col (2000b) describen que mediante evaluacin microscpica de los sitios de anastomosis de todos los grupos se pudo observar la evidencia de tejido de granulacin con invasin de macrfagos y proliferacin fibroblstica, tpico de la reparacin normal de una herida. Sin embargo, la acumulacin de fibrina en la superficie serosa del sitio de la anastomosis, en los grupos tratados con membrana de CMC y HA, fue significativamente menor que los caballos controles. Bajo condiciones normales, la fibrina es disuelta por el sistema fibrinoltico y las adherencias son resueltas antes de que haya una maduracin fibrosa. Estos mismos autores sealan que esta disminucin en la deposicin de fibrina en el sitio de la anastomosis en los grupos de caballos tratados con membranas de CMC y HA no comprometi la fuerza o reparacin del intestino delgado en el modelo experimental utilizado. Estos resultados concuerdan adems con Tarhan y col (2005) quienes al ocupar una membrana de HA y CMC redujeron la incidencia y severidad de las adherencias abdominales en ratas. Aunque t-PA es el activador de plasmingeno que es responsable del 95% de la actividad, los resultados indican que el efecto de prevenir adherencias de la membrana de HA y CMC no se encuentra relacionado con t-PA. Debido a esto, las propiedades fsicas (efecto barrera, hidroflotacin y siliconizacin) de la membrana pueden ser responsables primariamente de la prevencin de adherencias. Tsai y col (2005) concluyen de su estudio de membranas de colgeno-hialuronato que stas son resistentes a la digestin de hialuronidasa y no demostraron ser citotxicas a fibroblastos L929. Al ser 10

implantadas en ratas por ms de cuatro semanas, previnieron la formacin de adherencias, asocindose slo a una suave reaccin tisular. Por lo cual los resultados de ese estudio sugieren que estas membranas pueden ser una buena barrera mecnica para prevenir las adherencias intraperitoneales postoperatorias. Aunque no utilizado en equinos, el quitosn es otro tipo de membrana utilizado para la prevencin de adherencias. ste es un derivado de la quitina obtenida despus de deacetilacin, siendo la quitina el principal ingrediente del caparazn de los artrpodos (tales como camarones, cangrejos, insectos, etc.), el cual es una fuente renovable natural y de gran cantidad. Al ser el quitosn inocuo, biodegradable y con una biocompatibilidad ideal, ha sido ocupado para desarrollar biomateriales. La actividad biolgica del quitosn incluye: inhibicin del crecimiento de bacterias, actividad antineoplsica, aumento inmunolgico, actividad anticoagulante, promocin de la reparacin tisular y hemostasis (Zhang y col 2006). Sin embargo, Zhang y col (2006) concluyen en su estudio que las membranas de quitosn pueden no prevenir las adherencias por su baja velocidad de degradacin in vivo; adems las membranas mezcladas con gelatina pueden incluso exacerbar las adherencias peritoneales. Igualmente, sealan que el gel de quitosn tiene un buen efecto en la prevencin de adherencias peritoneales causadas por isquemia, pero no un efecto evidente en adherencias causadas por polvo de talco. Otros autores (Kennedy y col 1996, Costain y col 1997) han probado el uso de N,O-carboximetilquitosn (NOCC); esta molcula es parecida al cido hialurnico y la CMC, los cuales han demostrado ser beneficiosos en la reduccin de adherencias. Una serie de estudios se han realizado en distintos tipos de ciruga. Sin embargo, Diamond y col (2003) determinaron la eficacia promisoria en modelos animales de NOCC al reducir adherencias postoperatorias, demostrando su habilidad de disminuir la ocurrencia, extensin y severidad en humanos, por lo cual ofrecera grandes beneficios en la reduccin de la formacin de adherencias. Otro material utilizado como membrana es el cido polilctico, el cual est compuesto de un copolmero de dos formas de cido lctico (L-lactida y D,L-lactida). Este polmero es degradado en el cuerpo por hidrlisis seguido de metabolismo heptico. Es un material flexible que no se dobla o arruga fcilmente y puede ser manejado fcilmente con guantes. Al respecto, estos autores sealan que el uso experimental de esta membrana en ratas estuvo asociado a una reduccin del 42,1% de las adherencias intraabdominales postoperatorias as como tambin su severidad, haciendo notar que estos resultados se alcanzaron en un modelo que desarrolla un ciento por ciento de adherencias en las ratas no tratadas (Avital y col 2005). Schneider y col (2006) establecen el uso de una esponja de colgeno derivada de tendones equinos (TachoComb H), un agente hemosttico, el cual est cubierto de una capa de factores de coagulacin tales como fibringeno

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(humano) y trombina (humana) y un inhibidor de fibrinlisis aprotinina (bovino). Estos autores describen una disminucin significativa en la formacin de adherencias en el grupo tratado comparado con el grupo control. Sin embargo, sealan que es necesario realizar ms investigaciones comparando este producto con otras barreras mecnicas. Drenajes. Los drenajes abdominales han sido usados para muchas patologas, incluyendo peritonitis, abscesos intraabdominales, hemorragias y filtraciones de anastomosis. Igualmente son usados postoperatoriamente para prevenir la formacin de adherencias o la acumulacin de sustancias irritantes como sangre, bilis o enzimas pancreticas (Nieto y col 2003). Los drenajes son implantes quirrgicos, los cuales proveen y mantienen un canal de salida con el propsito de remover fluidos o gases desde una herida o cavidad corporal (Williams y col 1992). Celsius fue la primera persona en utilizar drenajes en el abdomen para remover fluido asctico. Galen en el siglo II y Avicena en el XI aplicaron este tratamiento para ascitis; despus de este tiempo no existen registros de su uso, hasta que Chauliac aparentemente lo redescubri en el siglo XIV. Par y Ryff, en el XVI, Scultetus en el XVII y Heister en el siglo XVIII usaron tubos metlicos ensanchados como drenajes de fluido intraabdominal (Jennings 1937). Los drenajes pueden ser pasivos o activos. Los pasivos funcionan por desbordamiento, gravedad o accin capilar y los activos por aplicacin de una fuente externa de vaco al drenaje (Arighi 1992). El uso de una fuente de succin externa para crear presin negativa tiene ventajas sobre los drenajes pasivos (Stone 1992). Los drenajes pasivos ms comnmente usados son los drenajes de Penrose, gomas de ltex dental y drenajes corrugados (Williams y col 1992). Los activos promueven el drenaje peritoneal, estn asociados a una reduccin en la incidencia de infecciones y complicaciones relacionadas a los drenajes y el volumen de egreso puede ser medido. Cuando se usan los drenajes pasivos en la cavidad abdominal, se recomienda proteger el extremo del drenaje para prevenir infecciones ascendentes (Stone 1992). De acuerdo a Eggleston y Mueller (2003) y Nieto y col (2003) las complicaciones asociadas a drenajes abdominales y lavados en otras especies incluyen hipoproteinemia, prdida de fluidos y electrolitos, perforacin de vsceras, infecciones ascendentes, herniacin del omento o intestino a travs de la salida del drenaje y obstruccin del drenaje, adems de edema ventral localizado en el sitio donde se encuentra el catter. En caballos, drenajes pasivos y lavados han sido usados en el tratamiento de peritonitis spticas y experimentalmente para minimizar la formacin de adherencias. Nieto y col (2003) consideran que debido a la ausencia de complicaciones severas y a la aparente mejora clnica, la utilizacin de sistemas de drenajes activos puede ser una terapia alternativa adecuada para el tratamiento y prevencin de peritonitis como tambin

para la disminucin en la presentacin de adherencias postquirrgicas en equinos. Manejo quirrgico. Otro tipo de tratamiento recomendado para las adherencias abdominales involucra repetir la celiotoma con objeto de eliminar las adherencias formadas. Desafortunadamente, este es un procedimiento invasivo, el cual ha resultado en la formacin de futuras adherencias en humanos y animales de laboratorio (Lansdowne y col 2004). La relaparotoma en equinos (previo al alta desde el hospital veterinario) es altamente aceptada como una opcin de tratamiento en el manejo de clico postquirrgico (Ducharme 2002), aunque de acuerdo a Hay y Mueller (1998) en equinos la ruptura de las adherencias durante una ciruga generalmente lleva a que se formen nuevamente debido a la naturaleza altamente irrigada de la zona afectada y a la severidad asociada del dao de la adherencia original. Adems, la repeticin de una celiotoma para corregir problemas asociados a las adherencias abdominales o el manejo de episodios recurrentes de clico atribuibles a las adherencias son por lo general no factibles econmicamente (Fubini 1990, Sullins 1990, Baxter 1992), por lo cual los propietarios frecuentemente eligen eutanasiar al caballo (Bour y col 2002). La laparoscopia diagnstica es usualmente usada para identificar patologas intraabdominales especficas como el caso de dolor abdominal y plvico crnico (Shayani y col 2002). Exitosas adhesilisis laparoscpicas han sido descritas en equinos; las ventajas reportadas de esta tcnica incluyen excelente observacin de las adherencias abdominales y mnimo trauma del peritoneo parietal y visceral comparado con laparotomas (Bleyaert y Brown 1997, Bour y col 1998). Lansdowne y col (2004) reportan en su estudio en potrillos que la instilacin de hialuronato frrico 0,5% en gel posterior a la diseccin laparoscpica de adherencias es ms efectiva que la diseccin laparoscpica sola, adems de ser una tcnica segura y efectiva de realizar en potrillos. Lansdowne y col (2004) reportan en su estudio laparoscpico en ponies realizado siete das despus de la celiotoma inicial que, independiente del uso de la misma tcnica quirrgica para inducir las adherencias y el mismo equipo quirrgico, ocurri una reformacin de adherencias. Extensivos estudios se han desarrollado para determinar el mejor tratamiento de adherencias abdominales postquirrgicas en humanos (Caspi y Halperin 1981, Franois y col 1994). Sobre el 80% de pacientes humanos con dolor abdominal crnico son aliviados o presentan mejoras clnicas despus de adhesilisis laparoscpica (Borellino y col 1998). En medicina humana, el tiempo ideal para realizar adhesilisis laparoscpica no ha sido an determinado, pero en general es aceptado que este procedimiento debe ser realizado despus de la reparacin de la serosa y antes de que se desarrollen las adherencias fibrosas (Jansen 1988). En equinos, la realizacin de omentectoma es an controversial (Hay y Mueller 1998). Kuebelbeck y col (1998) 11

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encontraron en su estudio que el omento frecuentemente se encuentra relacionado a las adherencias causando dolor abdominal por la formacin de stas en el intestino o pared abdominal que llevan a obstruccin o estrangulacin, adems de que la omentectoma reduce el grado de formacin de adherencias postoperatorias, siendo un procedimiento seguro, el cual debe ser considerado profilcticamente para atenuar la formacin de adherencias despus de cirugas abdominales en caballos. En contraste, Mueller (2002) indica que a pesar de que las adherencias omentales pueden causar signos de dolor abdominal a travs de la creacin de una tensin anormal en el mesenterio, o como foco de obstruccin o estrangulacin intestinal, se ha descrito que proveen un aporte vascular al tejido potencialmente isqumico, de tal modo, facilita la reparacin y prevendra la formacin de adherencias. RESUMEN
A pesar del gran nmero de investigaciones realizadas tanto en medicina humana como en medicina veterinaria, las adherencias intraabdominales continan siendo una complicacin para los cirujanos en la actualidad. El desarrollo de adherencias intraabdominales es un proceso dinmico y complejo que involucra una serie de eventos que comienzan con un proceso inflamatorio y dao tisular, seguido de desbalances en los procesos de fibrinognesis y fibrinlisis, terminando con la conversin de fibrina a tejido fibroso. En cirugas de intestino delgado en equinos, la incidencia de adherencias va de 14 a 22%, siendo la causa ms comn de dolor abdominal recurrente y la segunda causa de celiotomas repetidas. Sin embargo, al incluir todas las causas de cirugas abdominales, en esta especie la incidencia de adherencias es de aproximadamente un 5%. El mayor conocimiento del mecanismo celular de la formacin y reformacin de adherencias debe llevar a reducir su incidencia. Actualmente, existen una serie de mtodos de prevencin y tratamientos destinados a disminuir o evitar la aparicin de adherencias intraabdominales. El objetivo de esta revisin bibliogrfica fue el de recopilar la mayor informacin disponible e investigaciones que expliquen de mejor manera la fisiopatologa, prevencin y tratamiento de la formacin de adherencias intraabdominales.

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Arch Med Vet 41, 17-26 (2009) ARTCULO ORIGINAL

Prevalencia y distribucin espacial de brucelosis, leucosis bovina, diarrea viral bovina y rinotraquetis infecciosa bovina a partir del anlisis ELISA de estanques prediales en lecheras de la IXRegin, Chile#
Prevalence and space distribution of brucellosis, bovine leukaemia, bovine viral diarrhea and infectious bovine rhinotracheitis by using bulk milk ELISA test in dairy herds of the IX Region, Chile
R Felmera*, J Zigaa, A Lpez b, H Mirandab
aLaboratorio bFacultad

de Biotecnologa Animal, Instituto de Investigaciones Agropecuarias, INIA-Carillanca, Casilla 58-D, Temuco, Chile. de Ciencias Agropecuarias y Forestales, Universidad de La Frontera, Casilla 54-D, Temuco, Chile.

Summary Chile is internationally recognized for its good zoo-sanitarian situation as the country has been able to reach and maintain a status of officially free from the main diseases of the OIE List, including foot and mouth disease and classical swine fever. However, several infectious diseases are known to remain among herds, which produce a major effect in production due to losses by abortion, decrease of fertility and what it is more important, some of them represent barriers for export and constitute a risk of zoonosis for the population. In this work, a monitoring system based on the analysis of bulk milk antibodies by means of ELISA test, was implemented to study the epidemiology and distribution of 4 of the main bovine diseases that currently affect the IX Region of Chile (brucellosis, bovine leukaemia, IBR and BVD). The system allowed the surveillance of 279 dairies, which represented 43% of the dairies registered in IX the Region, and included 19,635 milking cows (14%). With this system, a high prevalence for leukaemia (59%), IBR (76%) and BVD (96%) could be established, whereas it was confirmed that brucellosis is restricted to a few dairies (5%). The surveillance system coupled to the satellite geographic information analysis, allowed to establish the space distribution of these diseases in the different communes of the Region, demonstrating to be an excellent and low cost support tool for the monitoring of the diseases in the herd, which guarantees the possibility of establishing this platform in the Region and its feasibility to project it at national level. Palabras clave: ELISA, estanque predial, enfermedades, SIG. Key words: ELISA, bulk milk, diseases, GIS.

Introduccin Chile es reconocido internacionalmente por poseer una buena situacin sanitaria, pues el pas ha podido alcanzar y mantener el estado de oficialmente libre de las principales enfermedades de la lista de la OIE (Organizacin Internacional de Epizootias), incluyendo la fiebre aftosa y la peste porcina clsica1. Sin embargo, an coexisten en nuestros rebaos bovinos una serie de enfermedades, las cuales tienen un directo impacto en la produccin, por cuanto disminuyen la fertilidad, producen prdidas por aborto, alargan el lapso interparto y fundamentalmente constituyen barreras sanitarias para la exportacin. Si bien la prevalencia e impacto econmico de algunas de estas enfermedades no estn claras, existen estudios e informes que evidencian prevalencias altas en diversas

Aceptado: 30.07.2008. # Proyecto FIA BID-PI-C-2001-1-P-035. * Casilla 58-D, Temuco, Chile; rfelmer@inia.cl 1 http://www.sag.gob.cl

regiones y sectores del pas, como en el caso de la diarrea viral bovina (DVB), rinotraquetis infecciosa bovina (IBR) y leucosis (Hochstein-Mintzel y col1986, Reinhardt y col1990, Celedn y col1996, Ziga y col2004). La falta de datos claros sobre la prevalencia de una enfermedad repercute negativamente, ya que no se puede cuantificar apropiadamente el impacto que sta tiene en los sistemas productivos y menos tomar decisiones para su control y eventual erradicacin. Las caractersticas de los anlisis de diagnstico actualmente empleados requieren de muestras individuales de suero de cada animal, lo cual impide una vigilancia adecuada de toda la masa bovina susceptible de contagios. Del mismo modo, una vez que se produce la erradicacin de una enfermedad en los predios se debe monitorear la salud del rebao constantemente, a fin de detectar nuevos brotes para poder controlarlos a tiempo (Lindberg y Alenius 1999). Diversos estudios en Europa han demostrado la factibilidad de diagnosticar algunas de las principales enfermedades del ganado bovino a partir de las inmunoglobulinas presentes en la leche, permitiendo de esta forma controlar el rebao lechero mediante el mtodo de ELISA aplicado a la deteccin de anticuerpos presentes 17

R Felmer y col

en la leche del estanque predial (Kerkhofs y col1990, Paton y col 1998, Wellenberg y col 1998, Lindberg y Alenius 1999, Nylin y col2000, Pritchard y col2002). Este sistema ELISA ha mostrado poseer una mayor sensibilidad y especificidad que los mtodos tradicionales de diagnstico, permitiendo adems su automatizacin para realizar la vigilancia de los rebaos a un costo mucho menor (Nielsen y col 1996, Vanzini y col 2001). Ms an, algunos de los mtodos desarrollados ya han sido reconocidos como mtodos oficiales en EE.UU., Canad y otros pases de Europa y son recomendados actualmente por la OIE 2 para su incorporacin en programas de control y prevencin de enfermedades (Simard y col2000). De esta forma, en este trabajo se implement un sistema de vigilancia predial basado en el anlisis ELISA para estudiar la epidemiologa de cuatro de las principales enfermedades bovinas de la IXRegin (brucelosis, leucosis DVB e IBR). Esta plataforma de vigilancia, acoplada a un sistema de informacin geogrfica satelital (SIG), permiti adems realizar un anlisis espacial de la prevalencia de estas enfermedades en los predios y establecer su distribucin en las diferentes comunas de laRegin. Material y Mtodos
REGISTRO DE LECHERAS Y FRECUENCIA DE MUESTREOS

tres ocasiones, correspondiendo estas muestras al grupo de lecheras de seguimiento para efectos de este estudio.
UBICACIN GEOGRFICA Y DISTRIBUCIN DE LOS PREDIOS

Se registraron y muestrearon 279 lecheras de la IX Regin que contaban con estanque de enfriamiento de leche. De los predios registrados se pudieron obtener datos poblacionales de 245 lecheras mediante una encuesta realizada en terreno con el dueo o encargado de los predios. Estos datos representaron el 37,4% de las lecheras de laRegin y el 46,8% de aquellas presentes en las 17 comunas del estudio, incluyendo un universo de 19.635 vacas equivalente al 14% de las vacas lecheras de la IX Regin (INE 2003). De acuerdo al segmento poblacional de animales, el 60% de las lecheras tenan menos de 50 animales, mientras que el 40% restante estaba constituido por lecheras en el rango de 51-100 animales (13,5%), 101-150 animales (11,4%) y ms de 151 animales (15,1%) (cuadro1). En conjunto, las lecheras en el rango sobre 150 animales representaron ms de la mitad (52%) del total de animales de la muestra (cuadro1). La comuna de Freire concentr la mayora de los predios con ms de 100 animales y comunas como Pitrufqun y Vilcn concentraron preferentemente a pequeos productores. El nmero de lecheras muestreadas en cada una de las tres oportunidades correspondi a 187 para el primer muestreo, 216 para el segundo y 246 para el tercero, representando el 67, 77 y 88% del total, respectivamente. Asimismo, 6, 11 y 41 muestras se recibieron exclusivamente en el primero, segundo o tercer muestreo y slo 158 se recibieron en las

La ubicacin geogrfica de cada uno de los predios que particip en este estudio se obtuvo aprovechando los recorridos habituales de los camiones recolectores de las empresas lecheras de SOPROLE (Freire), SURLAT (Pitrufqun) y PARMALAT (Victoria), las que participaron desinteresadamente de este estudio. Una vez en el predio, se ubic el lugar donde se almacenaba el estanque predial, punto en el cual se tom la lectura de su ubicacin geogrfica mediante un receptor GPS (Garmin Etrex). Esta lectura fue utilizada posteriormente para la generacin de representaciones geogrficas, empleando para este fin el programa Arcview GIS Versin 3.3, 2003 (Esri Inc.) y bases de datos de la regin. En total se determin la localizacin geogrfica de 235 lecheras (84%) de las 279 efectivamente muestreadas. A partir de este conjunto de datos se pudo determinar que la mayora de las lecheras muestreadas se localizaron en el valle central y preferentemente en las comunas de la provincia de Cautn. Esta distribucin estuvo naturalmente condicionada por el rea de cobertura de las plantas lecheras que colaboraron con este estudio, lo que excluy del muestreo reas lecheras importantes como Renaico, Villarrica y Loncoche, que entregan mayoritariamente su leche a la planta lechera de Loncoche (que declin participar de este estudio) o de reas que entregan la produccin a plantas queseras como ciertas comunas de la costa. Los predios muestreados estuvieron distribuidos en 17 de las 26 comunas, incluyendo a Cunco, Curacautn, Ercilla, Freire, Galvarino, Gorbea, Lautaro, Loncoche, Padre Las Casas, Perquenco, Pitrufqun, Temuco, Traigun, Victoria, Imperial y Vilcn (cuadro2). De esta forma, las 279 lecheras representaron el 43% de las lecheras de laRegin y el 53% del universo de lecheras existentes a nivel de las 17 comunas muestreadas (cuadro2). El nmero de lecheras muestreadas en cada comuna vari entre 1 (Ercilla e Imperial) y 57 (Vilcn), estando la mayora concentradas en las comunas de Vilcn,
Cuadro 1. Distribucin de vacas lecheras por segmento poblacional en una muestra de lecheras de la IXRegin (n = 245).
Distribution of milking cows in a sample of dairies of the IX Region (n = 245).

Segmento N de poblacional lecheras < 50 51 a 100 101 a150 > 151 Total 147 33 28 37 245

% 60,0 13,5 11,4 15,1 100

N de vacas por segmento poblacional 3.537 2.401 3.488 10.209 19.635

% 18,0 12,2 17,8 52,0 100

http://www.oie.int/eng/en_index.htm

18

ELISA, estanque predial, ENFERMEDADES, SIG

Cuadro 2. Distribucin de las lecheras muestreadas en las diferentes comunas de la IXRegin.


Distribution of dairies sampled in different communes of the IX Region.

Comuna Angol Collipulli Cunco Curacautn Ercilla Freire Galvarino Gorbea Imperial Lautaro Loncoche Los Sauces Padre Las Casas Perquenco Pitrufqun Pucn Puerto Saavedra Purn Renaico Temuco Teodoro Schmidt Toltn Traigun Victoria Vilcn Villarrica Total

Universo lecheras IXRegin 9 2 18 10 7 84 2 40 1 21 91 1 11 3 137 1 3 9 80 7 15 7 10 11 61 14 655

Total de lecheras muestreadas 8 0 18 6 1 56 2 35 1 10 17 0 8 3 40 0 0 0 0 4 0 0 2 11 57 0 279

Participacin por comuna (%) 89 0 100 60 14 67 100 88 100 48 19 0 73 100 29 0 0 0 0 57 0 0 20 100 93 0

Lecheras grupo seguimiento 0 0 10 6 1 29 2 6 0 6 6 0 7 3 24 0 0 0 0 2 0 0 2 7 47 0 158

Participacin por comuna (%) 0 0 56 60 14 35 100 15 100 29 7 0 64 100 18 0 0 0 0 29 0 0 20 64 77 0

Freire, Gorbea y Pitrufqun y la proporcin del universo comunal vari entre 14% (Ercilla) y 100% (Cunco, Galvarino, Imperial, Perquenco y Victoria) (cuadro2).
TOMA DE MUESTRAS DE LECHE Y PROCESAMIENTO

Las muestras de leche de los estanques prediales fueron recolectadas en frascos plsticos conteniendo dicromato de potasio (0,1% p/v) como preservante y remitidas directamente al laboratorio de Biotecnologa Animal de INIA-Carillanca, distante 20 km de la ciudad de Temuco. A su llegada al laboratorio, se procedi inmediatamente al descremado de las muestras mediante su centrifugacin por 10 minutos a 3.500 r.p.m., dejando la fraccin clarificada almacenada a -20 C para su posterior anlisis mediante ELISA.
DIAGNSTICO SErOLGICO

mediante la tcnica de enzimoinmunoensayo indirecto (ELISA-i) empleando un kit comercial (Svanovir SVANOVA, Suecia) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Las lecturas espectrofotomtricas se realizaron en un lector ELISA (Labsystems, Multiskan EX) a 450 nm para VLEB, VDVB y VHB-1 y a 650 nm para Brucella abortus. Para cada prueba, los valores de absorbancia de las muestras fueron estandarizados contra un control positivo y su clasificacin como positivas o negativas se estim de acuerdo al valor de cut-off sugerido por el fabricante.
ANLISIS KRUSKALL-WALLIS

La deteccin de anticuerpos a Brucella abortus, VLEB, VDVB y VHB-1, en las muestras de leche, se realiz

La relacin entre la presencia de las enfermedades y el nmero de vacas en ordea por predio se estableci empleando la prueba no paramtrica de Kruskall-Wallis, con el programa SPSS versin 11.5 para Windows (SPSS Inc., Chicago Il, USA), considerando como significativo el resultado si P < 0,05. 19

R Felmer y col

ANLISIS DE DENSIDAD DE NCLEO (KERNEL)

El anlisis de ncleo se realiz empleando las coordenadas obtenidas mediante la lectura GPS y el programa JMP (SAS Institute, 2003), considerndose para cada anlisis la reactividad de las enfermedades y su relacin espacial en los predios. Resultados
ANLISIS DE ANTICUERPOS A BRUCELLA ABORTUS, VLEB, VDVB Y VHB-1 EN MUESTRAS DE LECHE DEL ESTANQUE PREDIAL

Se detectaron anticuerpos a Brucella abortus en 6, 5 y 5%, respectivamente, de los estanques prediales muestreados en cada oportunidad (figura1), mientras que para leucosis, se detectaron anticuerpos en 63, 57 y 57%, respectivamente (figura1). Una mayor proporcin de anticuerpos se detect para VDVB, con 98, 96 y 93%, respectivamente (figura1). Esta situacin fue similar a la observada para VHB-1, con 78, 76 y 72%, respectivamente (figura1). Los valores obtenidos para estas cuatro enfermedades fueron similares en las 158 lecheras del grupo de seguimiento (cuadro 3). La distribucin geogrfica de las lecheras positivas a brucelosis permiti establecer su localizacin principalmente en las comunas de Freire y Vilcn (figura2)

y en su gran mayora correspondieron a predios de ms de 100 vacas por lechera (dato no mostrado). En el caso de leucosis, se observ una distribucin ms uniforme, estando presente la enfermedad en todas las comunas analizadas, con la excepcin de aquellas con una baja representacin de predios (Temuco, Ercilla y Perquenco). En el caso de DVB e IBR, debido a que el nmero de lecheras libres de anticuerpos fue muy baja (figura1), se realiz un anlisis en base al ttulo de anticuerpos, lo cual permite clasificar a aquellas lecheras donde existe mayor probabilidad de estar cursando infeccin activa (Niskanen y col1991, 1993). La figura3 muestra la variacin de las proporciones relativas de los estanques en cada clase obtenida durante el primer muestreo realizado a las 158 lecheras de seguimiento. La mayor proporcin de predios con una alta probabilidad de infeccin activa en ambas enfermedades se encontr en las comunas de Vilcn, Freire y Pitrufqun, consistente con la mayor representacin de predios en estas comunas. Aun cuando la mayora de las lecheras positivas se mantuvo relativamente constante durante los muestreos sucesivos, la fraccin de lecheras en clase3 tendi a disminuir durante el perodo de observacin (cuadro3). El anlisis de brucelosis, leucosis y diarrea viral bovina, mediante la prueba no paramtrica de Kruskall-Wallis, permiti establecer que no existe una relacin entre el nmero de vacas en ordea y la presencia de estas enfermedades en la muestra analizada. Sin embargo, en el caso

100 90 80 70 % Predios 60 50 40 30 20 10 0 M1 M2 M3 Brucelosis M1 M2 Leucosis M3 M1 M2 DVB M3 M1 M2 IBR M3

M: Muestreo

Figura 1. Prevalencia de las cuatro enfermedades evaluadas en una muestra de lecheras de la IXRegin en cada uno de los tres muestreos realizados. M: Muestreo, M1: 187 lecheras, M2: 216 lecheras, M3: 246 lecheras.
Prevalence of the 4 diseases evaluated in a sample of dairies of the IX Region in each one of three samplings carried out. M: Sampling, M1: 187 dairies, M2: 216 dairies, M3: 246 dairies.

20

ELISA, estanque predial, ENFERMEDADES, SIG

650000

700000

750000

800000

A) Cunco Vilcn Temuco Victoria Freire Galvarino COMUNAS


570000

565000

570000

575000

Perquenco Curacautn Pitrufqun Loncoche Gorbea Lautaro Ercilla

565000

575000

650000

700000

750000

800000

Brucelosis 3 Muestreo + Comunas en estudio Cunco Curacautn Ercilla Freire Galvarino Gorbea Lautaro Loncoche Padre Las Casas Perquenco Pitrufqun Temuco Toltn Traigun Victoria Vilcn

Traigun Padre Las Casas 0 D1 Alta (+) B) Media (+) Baja (+) Muy baja (-) 10 20 30 40 50

Rebaos

650000

700000

750000

800000

Cunco Vilcn Temuco Victoria

575000

COMUNAS

565000 570000

Freire Galvarino Perquenco Curacautn Pitrufqun Loncoche Gorbea Lautaro

565000

570000

575000

650000

700000

750000

800000

Ercilla Traigun

Leucosis 1 Muestreo + Comunas en estudio Cunco Curacautn Ercilla Freire Galvarino Gorbea Lautaro Loncoche Padre Las Casas Perquenco Pitrufqun Temuco Toltn Traigun Victoria Vilcn

Padre Las Casas 0 10 20 30 Rebaos 40 50

I1 Alta (+) Media (+) Baja (+) Muy baja (-)

Figura 2. Localizacin geogrfica de predios positivos a brucelosis y leucosis en una muestra de 158 lecheras de la IXRegin.
Geographic location of herds positive to brucellosis and leucosis in a sample of 158 dairies of the IX Region.

Figura 3. Clasificacin de las lecheras de acuerdo al nivel de anticuerpos en la leche del estanque predial y su asociacin con la probabilidad de ocurrencia de infeccin activa. Panel A: DVB, Panel B: IBR.
Classification of dairies according to the level of antibodies in bulk milk samples and its association with the probability of occurrence of active infection. Panel A: BVD, Panel B: IBR.

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R Felmer y col

Cuadro 3. Prevalencia de brucelosis, leucosis, DVB e IBR observada en una muestra de lecheras de la IXRegin, en base al anlisis ELISA aplicado a la leche del estanque predial.
Prevalence of brucellosis, leukaemia, BVD and IBR observed in a sample of dairies of the IX Region, on the basis of bulk milk ELISA test.

Total por muestreo Lecheras analizadas Fecha muestreo positivas a brucelosis positivas a leucosis positivas a DVB Clase 3 DVB positivas a IBR Clase 3 IBR 187 Jun-03 6% 63% 98% 39% 78% 62% 216 Dic-03 5% 57% 96% 44% 77% 55% 246 Sep-04 5% 57% 93% 25% 72% 41% Jun-03 6% 62% 98% 37% 77% 61%

Grupo de seguimiento 158 Dic-03 4% 61% 97% 44% 80% 56% Sep-04 4% 60% 95% 19% 77% 43%

Cuadro 4. Prueba de Kruskall-Wallis para establecer la relacin entre el nmero de vacas en ordea y la presencia de las cuatro enfermedades en la muestra de 158 lecheras.
Kruskall-Wallis test, to establish the relationship between the number of milking cows and the presence of the four diseases in a sample of 158 dairies.

B1 2 Gl P 0,468 2 0,791

B2 5,842 2 0,054

B3 2,138 2 0,343

LEB1 0,816 2 0,665

LEB2 0,623 2 0,732

LEB3 0,328 2 0,849

DVB1 3,980 2 0,137

DVB2 4,818 2 0,090

DVB3 2,379 2 0,304

IBR1 11,921 2 0,003

IBR2 14,008 2 0,001

IBR3 7,566 2 0,023

Variable de agrupacin analizada: vacas en ordea por predio (0-100) (101-200) (201300).

de rinotraquetis infecciosa bovina, en los tres muestreos realizados, se obtuvo una relacin altamente significativa (P 0,05), confirmando en este caso que hay una relacin entre el nmero de animales en ordea y la presencia de esta enfermedad en los predios (cuadro4). El anlisis de la distribucin espacial y su relacin con las enfermedades, mediante la prueba no paramtrica de Kernel, permiti establecer los puntos de mayor concentracin o densidad que determinan por tanto los lugares de mayor riesgo entre las comunas. De esta forma, para el caso de brucelosis (figura4) las curvas de densidad confirman que las comunas de Vilcn y Freire concentran la mayor cantidad de predios positivos. De acuerdo a este anlisis, la comuna que presenta el mayor riesgo de contagio corresponde a la comuna de Vilcn (coordenadas 720.000, 5.710.000), la cual presenta una mayor densidad y cercana de predios negativos a los focos de infeccin. En el caso de leucosis, en los puntos de mayor densidad se encuentra el mayor porcentaje de predios positivos (coordenadas 720.000, 5.710.000 y 740.000, 5.710.000). Esta rea de mayor densidad confirma el hecho de que la muestra tiene un gran componente debido al efecto de la comuna, que en el caso de Vilcn corresponde a la comuna con mayor participacin de predios. Este anlisis permiti adems identificar zonas de una alta densidad de rebaos negativos para leucosis, tales como los que se encuentran en la comuna de Pitrufqun. Por otra parte, 22

hay sectores en que a pesar de que las densidades son bajas todos los rebaos se presentan positivos frente al anlisis de ELISA, como es el caso de la comuna de Cunco (figura4). Discusin En este estudio se registraron y muestrearon 279 lecheras distribuidas en 17 comunas de la IX Regin, lo que equivale al 43% de las lecheras oficialmente reconocidas en la Regin (cuadro 2). El anlisis de anticuerpos realizado en los tres muestreos efectuados entre junio de 2004 y septiembre de 2005 indica que la situacin para las cuatro enfermedades estudiadas es muy diversa. Mientras brucelosis se encuentra bajo control y restringida a unas pocas comunas, con una prevalencia predial de la muestra que no supera el 5%, leucosis, DVB e IBR se encuentran presentes en la mayora de las comunas estudiadas con una prevalencia promedio de la muestra de 59, 96 y 76%, respectivamente (figura1). La baja prevalencia de brucelosis se explica por el programa de control y erradicacin implementado por el SAG que permiti disminuir la prevalencia descrita en el ao 1982 de un 20,4% a nivel de rebaos y un 7% en los animales a alrededor de un 3% del censo de bovinos (Amthauer 1993, SAG 2005). Actualmente, la vigilancia de esta enfermedad se basa, entre otras acciones, en el anlisis trimestral de

ELISA, estanque predial, ENFERMEDADES, SIG

Figura 4. Anlisis de densidad no paramtrica Kernel ajustada a ordenada por abscisa para brucelosis (Panel A) y leucosis (Panel B) indicando la presencia de anticuerpos a la enfermedad en los predios (puntos negros).
Nonparametric density estimation (Kernel), fit to ordered by abscissa for brucellosis (Panel A) and leukaemia (Panel B) indicating the presence of antibodies to the disease in the herds (black points).

muestras de leche del estanque predial mediante la Prueba del Anillo en leche (Ring test)(SAG 2004). Si bien esta prueba permite un monitoreo a bajo costo del estatus de anticuerpos en una lechera determinada, la clasificacin de esta prueba es subjetiva y el nivel de anticuerpos no se puede cuantificar, impidiendo de esta forma un adecuado seguimiento entre los distintos muestreos, situacin que es crtica para detectar a tiempo a aquellas lecheras que estn en las primeras etapas del proceso de infeccin (Vanzini y col2001). En este estudio, el anlisis mediante ELISA permiti detectar anticuerpos en 12, 10 y 12 lecheras en cada muestreo, representando una prevalencia de 6, 5 y 5%, respectivamente, del total de muestras recibidas en cada oportunidad, lo que confirma la baja presencia de esta enfermedad en la Regin y su tendencia gradual a la erradicacin. Esta favorable situacin se confirma al examinar la evolucin de la inmunidad de esta enfermedad en un grupo de 158 lecheras de seguimiento, cuyas muestras pudieron ser recibidas y analizadas en las tres oportunidades. En este grupo, el porcentaje de lecheras positivas en cada uno de los muestreos realizados correspondi a 6, 4 y 4%, respectivamente (cuadro3), observndose una disminucin sostenida de la deteccin de anticuerpos en aquellos predios donde efectivamente se implementaron medidas de control en los rebaos. Esta situacin qued mejor evidenciada en un estudio de caso realizado a una lechera que pas de una reaccin altamente positiva en el estanque predial a negativa. En esta oportunidad, el cambio de reaccin en el estanque predial se pudo asociar a la remocin de tres animales positivos detectados luego de analizar serolgicamente a todos los animales del rebao,

empleando esta misma prueba ELISA (Ziga y col2004). Geogrficamente, las lecheras positivas a brucelosis se localizaron principalmente en las comunas de Freire y Vilcn (figura2) que en su mayora correspondieron a predios de ms de 100 vacas por lechera. Estas lecheras representaron los puntos de mayor riesgo, al encontrarse en zonas de alta densidad y colindantes a predios negativos (figura4). En efecto, en algunos predios fue posible asociar la infeccin con la compra de animales infectados desde predios vecinos previamente infectados (datos recabados directamente con el encargado de la lechera), lo que resalta la importancia de la implementacin en los predios de medidas de bioseguridad para evitar el contagio. La situacin de leucosis en Chile es muy diversa, dependiendo de la zona del pas evaluada. Los primeros estudios disponibles se enfocaron a determinar la prevalencia intrapredial de la enfermedad, permitiendo confirmar distintas prevalencias desde la III a la XRegin y con zonas endmicas como la VIII (Reinhardt y col 1988, Naranjo 1989, Islas y col 1990). Estudios posteriores realizados por el SAG, en el marco del Proyecto de Vigilancia Pecuaria, permitieron establecer prevalencias prediales de 87% para laRegin Metropolitana, 38% para la IXRegin y 21% para la XRegin (Gonzlez 1996). En nuestro caso y a diferencia de los registros anteriores, se estableci una prevalencia predial ms elevada para la IX Regin, detectndose anticuerpos en 117, 124 y 139 lecheras, lo que correspondi a una prevalencia de la muestra equivalente a 63, 57 y 57%, respectivamente (cuadro 3). La disminucin de la prevalencia entre el primer y segundo muestreo (6%) obedeci ms bien a 23

R Felmer y col

la inclusin de un mayor nmero de lecheras negativas en el segundo muestreo que a una tendencia neta a la disminucin de la prevalencia, como ocurri en el caso de brucelosis, situacin que se confirma con el grupo de lecheras de seguimiento, donde se registr una cada de la prevalencia de slo un 1% (cuadro3). En este mismo grupo, la incidencia de la enfermedad entre el primer y segundo muestreo correspondi a un 3,8%, proceso que pudo estar relacionado a la infeccin reciente de estos predios, mediante la introduccin de animales infectados que aumentaron levemente la reaccin del estanque. Tambin se pudo constatar que algunas lecheras positivas durante el primer muestreo (3) aparecieron negativas durante el segundo y tercer muestreo, coincidiendo en estos casos que estos predios se encontraban en saneamiento. La distribucin espacial de leucosis fue relativamente uniforme en las comunas analizadas (figura2) y no se encontr una relacin de esta enfermedad con el nmero de animales en los rebaos (cuadro4). La mayor prevalencia de leucosis descrita en este estudio (61%) respecto a los antecedentes disponibles para la IXRegin (38%) se puede explicar por el tamao y distribucin de la muestra analizada ya que en este estudio quedaron excluidas importantes comunas lecheras de la IXRegin tales como Renaico, Loncoche y la mayora de los predios de Pitrufqun, los cuales representan cerca del 45% de las lecheras de laRegin (cuadro2). Sin embargo, los recientes antecedentes sobre la mayor sensibilidad de la prueba de ELISA, respecto al mtodo oficial empleado para el diagnstico de leucosis (AGID), podran tambin explicar la mayor prevalencia observada para esta enfermedad (Trono y col2001, Felmer y col2006). La DVB se encuentra ampliamente distribuida en Chile, con estudios de seroprevalencia de 69,2 y 77,8% para la IX y X Regin, respectivamente (Reinhardt y col1990), y 59,7 y 86% en laRegin Metropolitana para el ganado de leche y carne, respectivamente (Celedn y col1996, Palacios 1996). En este estudio se determin una alta prevalencia de esta enfermedad en laRegin (96%), coincidiendo con los estudios anteriores. Aun cuando en la muestra hubo escasas lecheras libres de anticuerpos a VDVB, lo importante en esta enfermedad es conocer la fraccin de predios en los que est ocurriendo infeccin activa. De acuerdo a esto, los pases nrdicos dividen los predios en cuatro categoras o clases segn la magnitud del valor ELISA registrado para los anticuerpos a VDVB y VHB-1 (clase0, OD 0,05, Clase 1 OD 0,051 - 0,250, Clase 2 OD 0,251-0,550, clase3 OD 0,551). En base a las caractersticas de la transmisin de estas enfermedades, se ha determinado que mientras ms alto sea el valor ELISA (predios clase3), mayor es la probabilidad que est ocurriendo una infeccin activa o un cuadroagudo de la enfermedad, como asimismo mayor es la probabilidad de encontrar animales persistentemente infectados (PI) para el caso de DVB (Niskanen y col1991, 1993). A pesar de que en promedio el 96% de las lecheras present anticuerpos 24

contra el virus DVB en los tres muestreos efectuados, slo 73, 95 y 61 lecheras se clasificaron en clase3 (39, 44 y 25% del total de cada muestreo) y son sospechosas por tanto de presentar infeccin activa. Las proporciones de lecheras en clase3 en el grupo de seguimiento correspondieron a 37, 44 y 19%, respectivamente (cuadro3). Estas observaciones sugieren un mayor dinamismo de este virus comparado con brucelosis y leucosis, consistente con la biologa de este patgeno. Aun cuando no hay datos nacionales comparables, se estima que la proporcin de lecheras en clase3 es alta. Esta situacin reflejara la existencia de una presin de infeccin alta para esta enfermedad, favorecida por la inexistencia de medidas de control y deficiencias en la aplicacin de medidas de bioseguridad por parte de los productores (Lindberg y Alenius 1999). No obstante, datos equivalentes obtenidos en un estudio realizado recientemente en Per permitieron establecer que la proporcin de lecheras en clase3 era superior al reportado en nuestro caso (Stahl y col2002). Las comunas con la mayor proporcin de lecheras en clase3 correspondieron a Curacautn (80%) y Ercilla (100%), mientras que la mayor cantidad de lecheras en clase3 de esta muestra estuvieron concentradas en Vilcn, Freire y Pitrufqun, que corresponden a las comunas con mayor representacin (figura3). Sin embargo, no se pudo establecer una relacin entre el nmero de animales en las lecheras y el riesgo de infeccin en los rebaos analizados (cuadro4). Los estudios disponibles acerca de la prevalencia de IBR en el pas indican una alta prevalencia en el sur con valores prediales de 95% (Hochstein-Mintzel y col1986) y de 86% en la zona central (Celedn y col1996). En este estudio se pudo establecer un 76% de prevalencia de la infeccin por VHB-1 en las lecheras muestreadas de la IXRegin, confirmando, al igual que DVB, que ambas enfermedades se encuentran altamente distribuidas. Sin embargo, en este caso una fraccin mayor de lecheras fue clasificada en clase3, las que tendieron a disminuir en los sucesivos muestreos de 62 a 41%, respectivamente (cuadro3). Las comunas que concentraron la mayor cantidad de lecheras en esta clasefueron Vilcn, Freire y Pitrufqun, al igual que la situacin observada para DVB (figura3), siendo Freire la comuna que present la proporcin ms alta de lecheras en esta clase, lo que es consistente con el hecho de que en esta comuna predominan los rebaos grandes. Esta situacin fue confirmada mediante el anlisis de Kruskall-Wallis que arroj una relacin altamente significativa entre el nmero de animales en ordea y la presencia de esta enfermedad en la muestra. Esta prueba permiti confirmar que IBR se presenta con mayor probabilidad en los rebaos con un nmero ms alto de animales por predio, donde existira una mayor tendencia al stress debido a las condiciones de manejo y confinamiento, una de las principales causas que gatillan la aparicin a esta enfermedad (Tikoo y col1995). La tcnica de ELISA aplicada en este estudio permiti detectar de manera semicuantitativa la presencia de inmu-

ELISA, estanque predial, ENFERMEDADES, SIG

noglobulinas especficas presentes en la leche del estanque predial, producidas en respuesta a los patgenos causantes de las principales enfermedades analizadas en laRegin. La aplicacin de este sistema permiti la vigilancia y monitoreo predial de estas enfermedades a un costo relativamente bajo, contando con la ventaja de un diagnstico precoz y de alerta temprana ante la introduccin de algn patgeno en los predios. A diferencia de lo que ocurre con los mtodos de diagnstico actualmente en uso, esta plataforma ofrece la posibilidad de sistematizar y escalar el sistema de monitoreo de acuerdo a las necesidades, permitiendo adems realizar el anlisis de muestras individuales de animales para detectar y eventualmente eliminar a aquellos que efectivamente se encuentren positivos para una determinada enfermedad. Adems, junto a la integracin a sistemas de informacin geogrfica satelital, este sistema demostr la factibilidad de estudiar la epidemiologa y distribucin de una enfermedad en las distintas comunas de laRegin, informacin que es de gran relevancia en el proceso de control y erradicacin de una enfermedad en un rea particular. El sistema de monitoreo y vigilancia predial basado en el anlisis de ELISA de muestras de leche del estanque predial permiti establecer por primera vez en laRegin, que leucosis, IBR y DVB se encuentran ampliamente distribuidas en las lecheras, mientras que brucelosis se encuentra restringida a unas pocas lecheras. El acoplamiento de esta plataforma a un sistema de informacin geogrfica satelital (SIG) permiti realizar un anlisis espacial de la prevalencia de estas enfermedades en las diferentes comunas de laRegin, constituyndose en una herramienta de apoyo para la vigilancia de estas enfermedades en las lecheras y para estudios epidemiolgicos. Resumen
Chile es reconocido internacionalmente por poseer una buena situacin sanitaria pues el pas ha podido alcanzar y mantener el estado de oficialmente libre de las principales enfermedades de la lista de la OIE. Sin embargo, an coexisten en nuestros rebaos bovinos una serie de enfermedades, las cuales tienen un directo impacto en la produccin, por cuanto disminuyen la fertilidad, producen prdidas por aborto, alargan el lapso interparto y fundamentalmente constituyen barreras sanitarias para la exportacin, ya que constituyen un riesgo de zoonosis para la poblacin. En este trabajo se implement un sistema de vigilancia predial basado en el anlisis ELISA de muestras de leche del estanque, para estudiar la epidemiologa y distribucin espacial de cuatro de las principales enfermedades bovinas que afectan a la IXRegin de Chile (brucelosis, leucosis bovina, DVB e IBR). Este sistema permiti monitorear el estado de estas enfermedades en 279 lecheras, cobertura que represent al 43% de las lecheras registradas en la IXRegin, abarcando 19.635 vacas lecheras (14%). Con este sistema se pudo establecer por primera vez en laRegin una alta prevalencia en la muestra para leucosis (59%), IBR (76%) y DVB (96%), mientras que se confirm que brucelosis se encuentra restringida a unas pocas lecheras (5%). Este sistema de monitoreo predial acoplado al anlisis espacial (SIG) permiti establecer la distribucin de estas enfermedades en las distintas comunas de laRegin, demostrando ser una valiosa herramienta de apoyo y de bajo costo para la vigilancia epidemiolgica de enfermedades en el rebao lechero, lo que avala la posibilidad de establecer dicha plataforma como sistema de vigilancia predial en laRegin y su factibilidad de proyectarla a nivel nacional.

Agradecimientos
Los autores agradecen la asesora brindada por el profesor Stefan Alenius de la Universidad de Ciencias Agrcolas (SLU) de Suecia y el apoyo tcnico brindado en los muestreos por Horacio Floody de INIACarillanca. Adems, agradecen la colaboracin annima y desinteresada de los productores de la IXRegin que facilitaron el muestreo de sus rebaos.

Referencias
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R Felmer y col

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Arch Med Vet 41, 27-34 (2009) ORIGINAL ARTICLE

The effect of degree of competition for feeding space on the silage dry matter intake and feeding behaviour of dairy cows
Efecto del grado de competencia por espacio de comedero en el consumo de materia seca y comportamiento del consumo de vacas lecheras
HF Elizaldea*, CS Mayneb
aCentro bAgri-Food

Regional de Investigacin Tamel Aike, Instituto de Investigaciones Agropecuarias, Chile. and Bioscience Institute, Northern Ireland, Hillsborough, Co. Down BT26 6DR, UK.

RESUMEN Veinticinco vacas lecheras fueron asignadas a cinco tratamientos con 1, 3, 5, 7 9 vacas por espacio de comedero. Cada comedero consisti en un alimentador electrnico que permita el acceso del animal a ensilaje dispuesto sobre una balanza. El comportamiento de consumo fue monitoreado con collares electrnicos que permitan la identificacin individual de cada animal mientras consuma ensilaje. Los animales tuvieron acceso al ensilaje durante todo el da, el que fue ofrecido diariamente a las 9:30 h. No se utiliz concentrado. Las vacas fueron asignadas a un diseo de Cuadrado GrecoLatino con cinco perodos. Cada perodo consisti en 14 das, y para cada perodo se registr el comportamiento de consumo de una vaca por tratamiento con el resto de las vacas utilizadas para lograr el nivel de competencia asignado. Se observ un incremento lineal (P < 0,001) en el nmero de comidas por da y la tasa de ingestin, a medida que se incrementaba la competencia. Un aumento en la competencia result en una reduccin lineal (P < 0,01) en el tiempo total de consumo, tiempo de consumo por cada comida y tamao de cada comida. El consumo total disminuy, tanto bajo la ausencia de competencia, como a altos niveles de competencia, observndose una tendencia cuadrtica (P < 0,05) al incrementar los niveles de competencia. Se concluye que a niveles bajos de competencia las vacas consumen pocas comidas de mayor tamao, pero en la medida que aumenta la competencia, stas consumen el ensilaje en un gran nmero de pequeas comidas. A niveles intermedios de competencia, las vacas mantienen su nivel de consumo como resultado de marcados cambios en su comportamiento ingestivo. Key words: dairy cows, competition, intake, behaviour. Palabras clave: vacas lecheras, competencia, consumo, comportamiento.

INTRODUCTION In group housing situations, the role of spacing during feeding is important since it has implications both for production, as related to food intake, and for housing design (Ferris etal 2006). Dairy system designers need to pay close attention to the needs of cows and all aspects of the animal area when developing designs and recommendations (Mc Farland 2003). For example, Friend etal (1977) examined the effect of feed manger space per cow (0.1, 0.2, 0.3. 0.4 or 0.5 m/cow) on time spent eating and voluntary food intake. They found that when the length of manger was reduced below 0.2 m per cow, eating time and voluntary food intake were reduced. It has been suggested that with trough feeding, competition for food will occur if all cows cannot eat at the same time (Albright 1993, Tolkamp etal 1998). However, there is little experimental data on the critical length of manger/cow for easy-feed systems, below which eating behaviour, intake and performance may be adversely affected. Work reported by DeVries etal (2004), indicated that when access to food for 24 Holstein
Accepted: 03.07.2008. * PO BOX 296, Coyhaique, Chile; helizald@inia.cl

cows was increased from 0.5 to 1.0 m of feeding space per animal, daily feeding activity increased by 14% and aggressive behaviour between animals decreased. The aim of the present study was to evaluate the effect of competition between animals on dry matter intake and eating behaviour of late lactation dairy cows offered grass silage, using equipment which facilitates the automatic monitoring of food intake and feeding behaviour of individual animals kept in a group housed situation. MATERIAL AND METHODS
TREATMENTS AND ANIMALS

Twenty five Friesian dairy cows in late lactation (average milk yield 7.4 kg/day) were allocated to 5 treatments with 1, 3, 5, 7 or 9 cows per feeding space. Each feeding space consisted of a Calan gate with access to grass silage blocks placed on a load platform, as described by Forbes etal (1986). All animals were accustomed to the building and the feeding during the preceding winter feeding period. Animals were offered medium-quality grass silage ad libitum for a seven day standardisation period prior to the start of the experiment. 27

HF Elizalde, CS Mayne

Cows were then allocated to a five period GraecoLatin square design, in which the 5 treatments were grouped into replicates in three different ways with the consequence that the effects of three different sources of variation (i.e. gates, periods and competing animals) were equalized for all treatments (Cochran and Cox 1957). Each period consisted of 14 days, with the last five days of each period being the main recording period during which one cow per treatment was recorded for each period, with additional cows used to obtain the required level of competition. Recorded and non-recorded cows were rotated across treatments and gates over periods, as shown in table1. The silage offered in this experiment was harvested from a primary growth of a perennial ryegrass sward, using a double-chop harvester. An inoculant (Ecosyl ), was applied at the rate of 2.50 litres per tonne of fresh grass. The grass was ensiled in walled silos, thoroughly compacted and covered with polythene sheeting weighted with rubber tyres. During feeding, the silage was removed from the silo using a block cutter, in blocks as required. Silage was offered to each treatment in sufficient quantities to allow a refusal of 50 g/kg intake. Water was freely available at all times, from drinking troughs. No concentrates were offered. All animals were housed as a single group in cubicle accommodation with access to the silage controlled by 5 Calan gates. Treatment changeovers were made abruptly on the first day of each period. Cows were milked daily at 06:00 and 16:00 h with milk yields recorded at each milking.
Table1.

DRY MATTER INTAKE AND FEEDING BEHAVIOUR

Each feeding space consisted of a Calan gate with access to grass silage blocks placed on a load platform. These load platforms consisted of four compressions type load cells, the output of which was input via a signal conditioner to a microcomputer. Cows had continuous access to the silage on the load platforms via a feed barrier with one access point (Calan gate) per platform. Each access point was fitted with an aerial loop which energized an active transponder and transmitted the identity of the cow to the microcomputer. Signals were stored on a microcomputer programmed to continuously record the weight on each weight platform to the nearest 100 g and the time. Information on timing and size of meals for individual cows for each day was then transferred to the mainframe computer for sorting and statistical analysis. Each days data file was sorted according to cow using the mainframe computer. In order to determine which consecutive meals should be merged according to a minimum intermeal interval criteria, an appropriate intermeal interval was then determined, using the method proposed by Forbes etal (1986). This involved plotting the frequency distribution of intervals between visits with the change in slope indicating the boundary between within-meal pauses and true between meal intervals. The sorted data was then scanned by means of a program in which the intermeal interval criteria were specified when activating the program. The data for dry matter content of the silage was also input onto the program at this stage.

Allocation of cows to treatments.


Asignacin de las vacas a los tratamientos.

Gate N 1 Period I Cows/gate Period II Cows/gate Period III Cows/gate Period IV Cows/gate Period V Cows/gate A1 1 A3 B C 3 A5 D E F G 5 A4 N O P QRSTU 9 A2 H I J K LM 7 2 A2 B C 3 A4 D E F G 5 A1 H I J K LM 7 A5 1 A3 N O P QRSTU 9 3 A3 D E F G 5 A5 H I J K LM 7 A2 N O P QRSTU 5 A1 B C 3 A4 1 4 A4 H I J K LM 7 A1 N O P ARSTU 9 A3 1 A2 D E F G 5 A5 B C 3 5 A5 N O P QRSTU 9 A2 1 A4 B C 3 A3 H I J K LM 7 A1 D E F G 5

Treatment cows: A1 A2 A3 A4 A5. Additional cows: B D E F G H I J K L M N O P Q R S T U.

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dairy cows, competition, intake, behaviour

This program then calculated information regarding: number of meals per day; amount eaten per meal (kg DM); mean daily eating rate (g DM/min); eating rate for the first meal during the day (g DM/min ) and daily total silage intake (kg DM/day). The pattern of feed consumption throughout the day was also recorded using the mainframe computer, programmed to give the weight of feed consumed per cow continuously from 0 to 24 hours after feeding. Fresh silage was offered daily at 09:30 h. Daily samples of the silage were taken from each block of silage as loaded on the weigh platforms to give a bulked sample which was retained for determination of oven dry matter content. Once per week a sample of fresh silage (bulked across blocks) was analysed for toluene DM, ammonia - N, pH, volatile fatty acids, lactic acid, and ethanol, as described by MAFF (1981). Total N was determined by the macro Kjeldahl method, using fresh samples of forage. Oven-dried samples were also analysed for MAD fibre (Clancy and Wilson 1966). Ash and GE concentrations were analyzed as described by British Standard Institutions (1967). Daily silage dry matter intake and feeding behaviour were calculated on an oven dry matter basis. This was converted to a toluene dry matter basis, ethanol corrected.
LIVE WEIGHT AND MILK YIELDS

Live weights were recorded once per week during the experimental period. All animals were weighed to the nearest 0.5 kg on a 1500 kg capacity weighbridge, with weighing being carried out after pm milking. Individual milk yields were recorded at each milking to the nearest 0.1 kg.
STATISTICAL ANALYSIS

reduce the data to a more manageable form, a minimum intervisit - interval of 6 minutes was used. Data on feeding behaviour and silage dry matter intake are presented in Table3. There was a linear trend (P < 0.001) towards a higher number of meals per 24 h as the number of animals allocated per feed box increased. However, the amount eaten per meal decreased linearly (P < 0.01) with increasing number of animals per feeding space. Total feeding time per 24 h and feeding time per meal showed a similar trend, with linear reductions (P<0.001) with increasing competition per feeding space. Mean daily eating rates increased markedly with increasing competition per feeding space (P < 0.001). A similar trend was found with eating rate during the first meal of the day, increasing linearly (P < 0.001) with increasing number of animals per feeding space. Overall, total silage dry matter intake tended to be lower with the lowest and the highest levels of competition resulting in a quadratic trend (P < 0.05) with increasing competition per feeding space. Data on the percentage occupancy of individual feeding spaces is also presented in table3. There was a tendency towards increasing occupancy rate with increasing competition per feeding space, up to 7 cows per feeding space. Above 7 cows per gate, occupancy rate appeared to decrease.
PATTERN OF INTAKE DURING THE DAY

Treatment effects on silage dry matter intake at two hour intervals after offering fresh silage are presented in table4 with the cumulative dry matter consumption over a 24 h period presented in figure 1. During the first two hours

All data recorded during the last five days of each period i.e. milk yields, live weights, forage intake and feeding behaviour parameters were analyzed as 5 cows x 5 gates x 5 periods, Graeco-Latin square design with 5 treatments. Each of the 5 observations per treatment was used in deriving equations of response lines for increasing levels of competition, using the regression procedure of Genstat 5 Committee (1988). RESULTS
SILAGE COMPOSITION

Table2. Chemical composition of silage as removed from the silo (g/kg toluene DM, ethanol corrected, unless otherwise stated).
Composicin qumica del ensilaje, tal como removido del silo (g/kg MS al tolueno, corregida por etanol, a menos que se seale de otra manera).

s.d. Dry matter pH Composition of DM Crude protein Ammonia N (g/kg TN) Acetic acid Propionic acid Butyric acid Lactic acid Ash MAD-fibre Ethanol 222 3.68 137 72 22.8 0.72 1.02 136 74 353 6.83 19.1 0.12 10.5 10.8 4.2 0.45 0.55 16.0 9.9 8.7 2.5

The chemical composition of the silage offered is given in table2. Each value is the mean of ten observations. The silage was well preserved, as indicated by its low pH value and low concentration of ammonia-N and butyric acid.
FEEDING BEHAVIOUR AND SILAGE DRY MATTER INTAKE

Sequences of visits alternating with short intervals were assumed to be part of the same meal. In order to

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HF Elizalde, CS Mayne

Table3. Effect of level of competition on feeding behaviour, dry matter intake, percentage occupancy of individual feed spaces and animal performance.
Efecto del grado de competencia en el comportamiento del consumo, consumo de materia seca, porcentaje de utilizacin de los espacios individuales de comedero y la respuesta productiva animal.

Treatment 1 Number of meals per day Amount eaten per meal (min) Feeding time per meal (min) Total feeding time (min/day) Mean daily eating rate (g DM/min) Eating rate during the first main meal (g DM/min) Silage dry matter intake (kgDM/day) Percentage occupancy of individual feed spaces (%) Animal data Mean live weight (kg) Milk yield (kg/ day)
NA: Not applicable. NS: Not significant.

Linear Quadratic trend trend

2 13.2 0.80 19.1 253 42.1 51.4 10.6 53

5 15.0 0.69 11.3 170 60.8 97.6 10.4 59

7 15.4 0.74 11.3 174 65.3 96.3 9.6 85

9 16.9 0.57 5.9 100 96.3 153.9 9.6 63

s.e. 0.80 0.06 2.60 12.5 6.31 8.92 0.37 NA ** * *** *** *** NS NS NA *** ** *** *** *** *** NS NA NS NS * * NS NS * NA

11.0 0.90 30.9 339 29.0 30.6 9.8 24

561 8.0

567 7.5

554 6.9

549 7.4

541 7.3

3.5 0.33

*** NS

*** NS

NS NS

12

10

Accumulated daily DMI (kg)

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Hours after feeding 1 cow per gate 7 cows per gate 3 cows per gate 9 cows per gate 5 cows per gate

Figure 1. Effect of number of cows allocated per feeding space on the cumulative silage dry matter consumption over a 24 h period.
24horas. Efecto del nmero de vacas asignadas por espacio de comedero en el consumo acumulado de materia seca de ensilaje en un perodo de

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dairy cows, competition, intake, behaviour

Table4.

Effect of level of competition for feeding space on silage dry matter intake (kg) at two hour intervals after feeding initiation.
Efecto del nivel de competencia por espacio de comedero en el consumo de materia seca de ensilaje (kg), cada dos horas luego de ofrecido.

Time intervals (hours after feeding) 1 0-2 2-4 4-6 6-8 8-10 10-12 12-14 14-16 16-18 18-20 20-22 22-24 2.43b 0.99 0.93 1.09a 1.45 0.39a 0.55 0.54 0.25a 0.36 0.61 0.16 3 1.71ab 1.17 0.86 1.30ab 1.47 0.86ab 0.58 0.86 0.39ab 0.45 0.74 0.19

Level of competition (cows per gate) 5 1.44b 1.27 0.68 1.42ab 1.26 1.13b 0.65 0.54 0.83b 0.27 0.68 0.13 7 1.94b 1.25 0.73 1.77b 1.50 0.96b 0.56 0.79 0.60ab 0.33 0.74 0.23 9 1.38a 1.16 0.60 1.45ab 1.18 0.76ab 0.87 0.82 0.43ab 0.48 0.35 0.22 Significance # *** NS NS ** NS ** NS NS * NS NS NS

Means with the same superscripts, within rows, are not significantly different (P > 0.05). # SED in all comparisons was 0.179.

after feeding, silage dry matter intake was significantly higher (P < 0.001) with 1 and 7 cows per feeding space than when 5 or 9 cows were allocated per feeding space. Between 6-8 h after feeding, silage dry matter intake was significantly lower (P < 0.01) with 1 cow compared to 7 cows per feeding space, with the rest of the treatments being intermediate. By 10-12 h after feeding, animals on treatments with 5 or 7 cows per feeding space consumed significantly (P < 0.01) more silage dry matter, than when 1 cow was allocated per feeding space, with the remaining treatments being in an intermediate position. Between 16-18 h after feeding, silage dry matter intake was significantly higher (P < 0.05) with 5 cows than with 1 cow allocated per feeding space, with the rest of the treatments being intermediate and not differing significantly (P > 0.05) from each other. Increasing the number of cows allocated per feeding space had no significant effect (P > 0.05) on silage dry matter intake in the remaining time intervals.
LIVE WEIGHT AND MILK YIELD

Data on animal live weight and milk yield are presented in table 3. Animal live weight declined linearly (P < 0.001) with increasing number of animals per feeding space. At the same time, milk yields were not significantly (P > 0.05) affected by increasing level of competition. DISCUSSION Increasing the level of competition for silage between animals by increasing the number of cows allocated per

feeding space had a marked effect on feeding behaviour. In general, as the degree of competition increased, an increase in both number of meals per day and eating rate was observed, accompanied by reductions in total feeding time, feeding time per meal and average meal size. Hence, at low levels of competition, cows ate relatively few large meals, but as competition increased cows consumed silage in a larger number of small meals. In the present study, overall silage dry matter intake was lower with no competition or with the highest level of competition, with a significant quadratic trend (P<0.05). At intermediate levels of competition, cows tended to maintain their dry matter intake as a result of marked changes in eating behaviour. In the absence of competition, animals consumed large meals over a longer feeding time resulting in a lower total dry matter intake. As intake per meal declined, there was a concomitant increase in eating rate. For example, the data presented in table 3 indicate a marked linear increase in rate of eating with increasing competition, reflecting the remarkable flexibility of the dairy cow to maintain dry matter intake (Grant 2006). However, the beneficial effect of a higher eating rate with increasing competition was insufficient to compensate for the large reduction in meal size at the highest level of competition, and a reduction in dry matter intake occurred. These results are in general agreement with most of the available data reported in the literature. For example, early studies reported by Harb et al (1985) suggested that eating rates were increased when cows were group fed compared to when they were individually fed (57 vs. 31

HF Elizalde, CS Mayne

43g/min, respectively) and that feeding rate was further increased (71 g/min) if the number of trough spaces available to the group was reduced from 10 to 5. Later, Longenbach etal (1999), when restricting the manger space of dairy heifers from 47 to 31 and 15 cm, found that animals with restricted bunk space, ate faster in smaller meals to prevent a reduction in feed intake. Work reported by Olofsson (1999) and Olofsson and Wiktorsson (2001), indicated that the average feed consumption tended to increase when the number of cows per feeding station was changed from 1 to 4. The most common explanation for this phenomenon is an increased maintenance activity factor in the group-fed animals, due to additional energy expenditure such as stress during competition for manger space (Coppock etal 1972). In the current trial, cows without competition (1 cow per feeding space) ate on average 6.6% less dry matter than those with increased levels of competition. A number of studies reported in the literature suggest that group-fed animals eat more than isolated animals (Albright 1993, Nielsen 1999). Further, it has been noted that social stress increases food intake and body mass in hamsters (Foster etal 2006). However, there is little information regarding the effect of social factors on the dry matter intake of individual cows when offered feed in a group. It has been suggested that social facilitation (Ingrand etal 2000, Grant and Albright 2001), can result in enhanced intake in cows. In the present study, all cows were fed as a group and higher feeding times were observed with one cow per feeding space. However, the low eating rates accompanied with fewer meals per day, i.e. larger intermeal intervals, suggest that a lack of competition may result in a reduction in dry matter intake due to a decrease in the rate of eating. On the other hand, it is likely that the depression in intake observed at the higher level of competition (9 cows per Calan gate) might be due to stress of competition, i.e. more interaction between cows behind the feed barrier. As a result of this extremely high level of competition, the proportion of time during which feeding spaces were occupied was reduced at the highest level of competition (table 3). It has been stated that restricting feed access may cause subclinical acidosis and an overall reduction in mean intake (Schwartzkopf-Genswein 2003). This may account for the reduction in dry matter intake observed at the highest level of competition. Furthermore, the mean daily eating rate at 9 cows per gate is high (96 g DM/min). It has been reported that a high eating rate may lead to a reduction in plasma volume and a rise in systolic blood pressure (Blair-West and Brook 1969). This may result in a temporary dehydration and consequently feeding inhibition (Cole 2000). The tendency for lower silage dry matter intakes with individually fed animals has major implications for animal production research studies. For example the results of the present work, taken in conjunction with those previously published in the literature (Phipps etal 1983, Phipps 1986) suggest 32

that intake of individually fed animals is between 6-9% lower than that of group fed animals subject to a degree of competition during feeding. Consequently, the use of feed intake recording equipment such as that described by Forbes etal (1986), which enables automatic monitoring of food intake with groupfed animals under varying degrees of competition, may simulate more closely the on-farm situation, where there is normally a degree of competition during feeding.
PATTERNS OF CONSUMPTION

In general within a 24 h period, the majority of the dry matter intake and also most of the significant differences in intake tended to occur during daylight hours. For example, Tolkamp etal (2002) reported that loose-housed, lactating dairy cows offered grass silage ad libitum and concentrates, consumed most of the feed during daylight hours, with peaks and troughs in intake per hour of the feeding cycle just after noon and just after midnight, respectively. In the current trial, cows consumed on average 62% of their total daily silage dry matter intake between 9:30 am and 7:30 pm. For all treatments, a high proportion of the daily intake was consumed during the first 2 h after feeding. Studies have shown that the delivery of feed has great effect in terms of stimulating feeding activity in group-housed dairy cattle and is the primary influence in determining their daily feeding patterns (DeVries etal 2005, Mntysaari et al 2006). This effect tended to be more pronounced at low levels of competition. Therefore, a more uniform pattern of consumption was observed with increasing competition, reflecting higher activity throughout the day. The relatively low levels of initial intake observed at high levels of competition, tended to be compensated later during the day between 6-8, 10-12 and 16-18 h after feeding, with cows consuming relatively more dry matter at this time. It has been accepted that dairy cattle exhibit a diurnal feeding pattern where most of the feeding activity occurs during daylight hours. For example, Shabi etal (2005) observed that under dry lot, loose-housing, lactating dairy cows exhibit a distinct diurnal pattern in feeding activity; they were most active near sunrise and again near sunset. It is worth noting that in the present study, even at one cow per feeding space, some dry matter consumption was recorded 16-20 h after feeding, suggesting some circadian pattern of consumption (Takahashi and Zatz 1982).
LIVE WEIGHT AND MILK YIELD

Animal live weight tended to decrease linearly (P < 0.001) with increasing level of competition (table 3), probably as a result of an increase in the maintenance energy requirements with increased competition per feeding space, as suggested by Ellis etal (2006). It may be of interest to note, however, that animal live weight tended

dairy cows, competition, intake, behaviour

to be lower with one cow per feeding space compared to three cows per feeding space, although this may reflect gut fill effects resulting from reduced dry matter intake. When Olofsson (1999) compared 1 or 4 mid lactation dairy cows per feeding station with a total mixed diet fed for ad libitum intake, he found no differences in milk production. In the current study, mean milk yields were not markedly affected (P > 0.05) by increasing competition. However, the lack of effect of increasing competition on milk yield in the present study may reflect the fact that animals in this study were in late lactation, with the result that treatment effects on dry matter intake tended to be reflected in live weight change. It can be concluded that increasing the degree of competition per feed space had a marked effect on feeding behaviour. At low levels of competition, cows consumed relatively few, large meals but as the degree of competition increased, cows consumed silage in a large number of small meals. Total silage dry matter intake was reduced by 6.6% in the absence of competition, with a further reduction in intake at high levels of competition. Overall there was a significant quadratic relationship between degree of competition and total silage dry matter intake. The practical implication of these results is that provision of sufficient feeding space to enable all animals to consume forage simultaneously may reduce total forage intake in comparison to the situation where a moderate degree of competition is imposed at the feed barriers. SUMMARY
Twenty five late lactation dairy cows were allocated to 5 treatments with either 1, 3, 5, 7 or 9 cows per feeding space. Each feeding space consisted of a Calan gate with access to silage blocks placed on a load platform. Eating behaviour was monitored by identifying cows using collar borne transponders. Animals had access to silage throughout the day, with fresh silage being offered daily at 09:30 h. No concentrates were offered during the experiment. Cows were allocated to a Graeco-Latin square design with 5 periods. Each period consisted of 14 days, and one cow per treatment was recorded for each period, with additional cows used to reach the required level of competition. All cows were rotated across treatments and gates over periods. As the degree of competition increased, animals modified their feeding behaviour, with a linear increase (P < 0.001) in both number of meals per day and eating rate. Increasing level of competition resulted in linear reductions (P < 0.01) in total feeding time, feeding time per meal and average meal size. Total dry matter intake was reduced both by the absence of competition and at high levels of competition, showing a quadratic trend (P < 0.05) with increasing competition. It is concluded that at low levels of competition, cows ate relatively few, large meals, but as competition increased cows consumed silage in a large number of small meals. At moderate levels of competition (3-7 cows/feeding space) cows maintained their intake as a result of marked changes in feeding behaviour.

REFERENCES
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ACKNOWLEDGEMENTS
The authors thank the staff of the dairy unit of Agri-Food and Bioscience Institute for co-operation and Dr. D. Kilpatrick of Queens University of Belfast, Biometrics Division, for advice and statistical analysis of the data.

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HF Elizalde, CS Mayne

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Arch Med Vet 41, 35-41 (2009) ARTCULO ORIGINAL

Uso de suplementacin mineral con monensina sdica en corderas Pelibuey durante el crecimiento postdestete#
Use of mineral supplementation with monensin sodium in Pelibuey female lambs during the postweaning growth
AT Pieiro-Vzqueza, J Oliva-Hernndezb, c*, JA Hinojosa-Cullarb
Tecnolgico de Conkal, Yucatn, Mxico. Popular de la Chontalpa, Tabasco, Mxico. cCampo Experimental Huimanguillo, Centro de Investigacin Regional Golfo-Centro, INIFAP, Tabasco, Mxico.
bUniversidad aInstituto

SUMMARY Pelibuey lambs have a postweaning weight gain of less than 80 g/d when they are feeding on grazing pastures. Taking this into consideration, it is important to study several additives that could optimize the lambs growth. The aim of this study was to evaluate the influence of the mineral supplementation with monensin on postweaning performance of the Pelibuey ewe lambs. Twelve Pelibuey ewe lambs (76 days old and 11.7 kg body weight) were assigned to one of two treatments (six female lambs per treatment). The treatments consisted of mineral salt with or without monensin sodium, offered ad libitum during 66 days (ten days for adaptation to growth trial and 56 days for growth trial). Each lamb was assigned to one individual pen; the experimental unit was the lamb. The average daily intake for mineral salts was 12.2 0.9 g/lamb in the treatment without monensin and 2.3 0.6 g/lamb in the treatment with monensin. Mineral supplementation with monensin sodium did not affect (P > 0.05) the body weight, total body weight gain, average daily body weight gain and the growth of the lambs over 15 body measures. During 56 days of this study, the lambs gained weight, 1.5 0.3 kg of total body weight/lamb and 27 5 g daily body weight gain/lamb. The monensin treatment did not affect (P > 0.05) the daily intake of dry matter and crude protein. In Pelibuey ewe lambs fed with African Star hay, the mineral supplement with monensin sodium did not affect the average daily body weight gain nor the daily intake of dry matter and crude protein with respect to mineral supplement without monensin sodium. Palabras clave: ionforo, suplementacin mineral, ganancia de peso, trpico hmedo. Key words: ionophore, mineral supplement, body weight gain, humid tropic.

INTRODUCCIN La ganadera ovina localizada en la regin tropical de Mxico utiliza como base de la alimentacin el pastoreo sobre gramneas naturales y/o introducidas (Gonzlez y col2002a, Gonzlez y col2002b). Sin embargo, el tipo de gramneas utilizadas muestra ciertas limitaciones en la cantidad y calidad de los nutrientes, por ejemplo, los valores de energa y protena cruda son menores a los de pastos localizados en zonas templadas (suna y col1996). Especficamente en las corderas Pelibuey se ha reportado (Gonzlez y col2002a) una ganancia diaria de peso que no supera los 82 g/cordera cuando stas son alimentadas con base exclusiva en el pastoreo durante la etapa postdestete. Una forma de mejorar la eficiencia productiva de las corderas es a travs del uso de aditivos, por ejemplo, los ionforos. Los ionforos permiten un mejor uso de la energa generada por la dieta que consumen los corderos (Joyner
Aceptado: 18.07.2008. # FOMIX 2005-1, 16449. * Km 1 carretera Huimanguillo-Crdenas, Campo Experimental Huimanguillo, INIFAP, Huimanguillo, Tabasco, Mxico; olivajh20@ yahoo.com.mx

y col1979); por ejemplo, en ovinos alimentados con heno el consumo de monensina sdica (20 mg/kg de materia seca) reduce la cantidad de acetato e incrementa el propionato, lo que permite incrementar la cantidad de energa disponible para su utilizacin (Garca y col2000, Baran y itan 2002). Adicionalmente, se ha reportado (Joyner y col1979) que los corderos que reciben monensina en el alimento (10 a 20 mg/kg de materia seca) muestran un incremento en la energa metabolizable de la dieta. No obstante, existe controversia (Joyner y col1979, Baran y col1986, Huston y col1990, Plata y col2004) sobre el efecto final de la monensina en la ganancia diaria de peso de los corderos. En algunos estudios (Joyner y col1979, McCann y col1990, Martini y col1996) se indica que en los corderos que consumen dietas con monensina se reduce el consumo de alimento y se incrementa la eficiencia alimenticia. Sin embargo, no se informa de un incremento en la ganancia de peso. El uso de la monensina se ha estudiado fundamentalmente en ovinos de razas de lana (Joyner y col1979, Ricke y col1984, Baran y col1986, Huston y col, 1990, McCann y col1990, Martini y col1996, Baran y itan 2002, Mouro y col2006), existiendo pocos trabajos en ovinos de razas de pelo (Mazza y col2001, Plata y col2004, Arajo y col2006). 35

AT Pieiro-Vzquez y col

Adicionalmente, este ionforo se ha estudiado a travs de su incorporacin en un complemento alimenticio (en donde se controla la cantidad que consume un animal) y no se encontraron evidencias que sustenten su uso como parte del suplemento mineral, por lo que se requiere generar conocimiento que contribuya a aclarar si el consumo de la monensina (va un suplemento mineral) tiene un efecto positivo en la ganancia de peso de los corderos durante su crecimiento postdestete. Por otra parte, el crecimiento de las corderas ha sido evaluado a travs de la ganancia diaria de peso (Plata y col2004), en donde el uso de parmetros de tipo zoomtrico ha sido poco estudiado como un indicador de crecimiento (Martnez y col1987, Pulgarn y col2000). Con base en lo planteado anteriormente, el objetivo del estudio consisti en determinar la influencia de la suplementacin mineral con monensina sdica sobre la eficiencia de crecimiento postdestete de las corderas Pelibuey alimentadas con heno de Estrella de frica. MATERIAL Y MTODOS
LOCALIZACIN DEL ENSAYO

metionina de zinc 2.000 ppm; zinc 3.000 ppm; cobre 900 ppm; manganeso 900 ppm; hierro 200 ppm; yodo 40 ppm; cobalto 30 ppm y selenio 20 ppm. La composicin de la sal mineral con monensina sdica (Foscamag Plus con monensina sdica) fue similar al tratamiento control, pero sta contena 1.000 ppm de monensina sdica. Las corderas tuvieron acceso libre a la sal mineral durante el alojamiento nocturno. En forma diaria se supervis el nivel de sales minerales procurando que siempre existieran en el saladero. El nivel de consumo de las sales minerales cordera/da se determin a travs de cuantificar durante tres das consecutivos lo ofrecido y lo rechazado a intervalos de 14 das durante todo el perodo de estudio.
SISTEMA DE ALIMENTACIN

Las corderas se alimentaron en base a heno de Estrella de frica. El heno se ofreci diariamente (08:00 a 18:00 horas), procurando que siempre existiera un nivel de rechazo de al menos un 15% de lo ofrecido. El heno se obtuvo por corte (a intervalos de 25 das) y secado a campo.
CONSUMO DE HENO PROMEDIO POR CORDERA

El ensayo se realiz en la estacin experimental Huimanguillo del Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrcolas y Pecuarias localizada en Huimanguillo, Tabasco, Mxico (1750 LN, 9323 LO), a una altitud de 20 metros sobre el nivel del mar. El clima de la regin es clido con lluvias todo el ao (Af) y la temperatura media anual de 27,8 C (Annimo 2007).
PERODO EXPERIMENTAL

Se estim el consumo voluntario de heno de Estrella de frica cordera/da durante tres das consecutivos a intervalos de 14 das. Para ello, se cuantific el heno ofrecido, rechazado y consumido. Para estimar el consumo de materia seca y protena cruda cordera/da se tomaron muestras de heno ofrecido y rechazado y se les determin el valor de materia seca y protena cruda.
ALOJAMIENTO

El ensayo tuvo una duracin de 66 das, y fue dividido en una fase inicial o preexperimental de 10 das y una fase experimental de 56 das.
ANIMALES

Se utilizaron 12 corderas Pelibuey con una edad de 76 3 das y 11,7 0,5 kg de peso corporal.
TRATAMIENTOS

Durante la evaluacin del consumo de heno las corderas se alojaron en corrales individuales (2,4 m2) provistos de piso de concreto, comedero de canoa y bebedero. Una vez finalizado el perodo de alimentacin, las corderas se alojaron en grupo durante la noche (18:00 a 08:00 horas). Se utilizaron dos corrales, uno para cada tratamiento. Cada corral (25 m2) dispuso de un bebedero y saladero.
MEDICINA PREVENTIVA

Las corderas se distribuyeron al azar a uno de dos tratamientos (seis corderas por tratamiento). Se consider el tipo de nacimiento (origen nico y gemelar) en la asignacin de las unidades experimentales a los tratamientos. Se utiliz un diseo completamente al azar de un solo factor (sales minerales con o sin monensina sdica) (Cody y Smith 1991). La unidad experimental fue la cordera. Se ofrecieron diariamente sales minerales con o sin monensina sdica. La composicin de la sal mineral (Foscamag Plus) sin monensina sdica (en base a 100g) fue la siguiente: fsforo elemental 18,0 g; calcio 18,0g; sodio 5,0 g; magnesio 4,5 g; azufre 0,3 g; levadura 1,0 g; 36

El control de parsitos gastrointestinales se efectu con febendazole (un ml por cada 10 kg de peso, va oral; Panacur) al inicio del estudio y a los 35 das del primer tratamiento.
VARIABLES A EVALUAR

Peso corporal de las corderas. Se evalu al iniciar el estudio y posteriormente a intervalos de 14 das hasta la finalizacin del estudio. En cada sesin de pesaje las corderas fueron sometidas a un ayuno previo de 14 horas. Se utiliz una bscula electrnica (Gallagher) con una precisin de 0,100 kg.

Ionforo, suplementacin mineral, ganancia de Peso, Trpico Hmedo

Cambio de peso total. Se calcul a travs de la diferencia entre el peso corporal final y el inicial. Ganancia diaria de peso. Correspondi a la diferencia entre dos pesajes sucesivos dividida por el intervalo en das entre pesajes. Promedio en el consumo voluntario de heno. Se determin en base hmeda y seca. En cada perodo de 14 das se realizaron tres mediciones del consumo individual de materia hmeda y seca/da aportado por el pasto. El promedio de tres mediciones de consumo voluntario dentro de un perodo de 14 das se consider como el promedio en el consumo voluntario de heno. Promedio en el consumo de protena cruda. Se determin en cada perodo de 14 das. Para ello se estim primeramente el valor de protena cruda/da aportado por el pasto. Promedio en el consumo de minerales. Se efectu en cada perodo de 14 das. Se calcul el promedio en el consumo individual de minerales/da para cada tratamiento y durante todo el estudio. Medidas corporales. Se establecieron 15 mediciones en el cuerpo de la cordera de acuerdo a la metodologa propuesta por Martnez y col (1987). Las medidas corporales seleccionadas fueron: longitud del cuerpo, altura a la cruz y a la grupa, permetro torxico y abdominal, permetro, longitud, anchura y grosor de la caa, permetro y anchura del maslo de la cola, anchura del lomo y anchura de la cadera medida a la altura del acetbulo y de la tuberosidad isquitica. Todas las mediciones se expresaron en cm y se efectuaron con apoyo de una cinta mtrica y escuadra (alturas), vernier (anchura y grosor) y cinta mtrica de sastre (mediciones de permetro y longitud).
ANLiSIS ESTADSTICO

Los datos correspondientes al consumo de minerales se analizaron mediante estadstica descriptiva (media EE). Las variables paramtricas se compararon mediante un anlisis de varianza de manera transversal (Cody y Smith 1991) con apoyo del programa computacional SAS versin 8,0 para Windows (SAS Institute, Cary, NC, USA). Las variables que no mostraron una distribucin normal se analizaron con la prueba de la suma de rangos de Wilcoxon para datos no pareados (Milton y Tsokos, 1987). Se consider un P< 0,05 como estadsticamente significativo. Los datos se presentan como promedioerror estndar. RESULTADOS El promedio diario en el consumo de las sales minerales fue de 12,2 0,9 g/cordera en el grupo control y de 2,3 0,6 g/cordera en el tratamiento con monensina sdica.

En ambos tratamientos se detect una tendencia a reducir el consumo de sales minerales conforme increment el perodo de estudio postdestete (figura1). Sin embargo, en el grupo de corderas que recibieron sales minerales con monensina sdica, el promedio del consumo de la sal mineral fue menor al del grupo control (desde el inicio del estudio) e incluso la sal mineral no fue consumida en el perodo final del estudio. Durante los 56 das de evaluacin, el promedio general en el cambio de peso fue de 1,5 0,29 kg/cordera, la ganancia diaria de peso de 27 5 g/cordera, el promedio en el consumo diario de protena cruda estuvo entre 43 y 69 g/cordera y el de materia seca entre 248 y 396 g/cordera. Los promedios de protena cruda y materia seca en el heno ofrecido fueron de 13,0 1,7 y 91,3 1,0%, respectivamente, y para el heno rechazado de 9,4 1,0 y 91,6 0,8% respectivamente. En el cuadro 1 se muestran los valores de materia seca y protena cruda del heno de Estrella de frica ofrecido y rechazado durante el perodo de estudio. Las corderas mostraron consumos de materia seca y protena cruda similares (P > 0,05) entre tratamientos (cuadro 2 y figura 2). El peso corporal de las corderas (figura 3) y el cambio de peso total en los 56 das de evaluacin result similar (P> 0,05) entre tratamientos. El cambio de peso observado en ambos tratamientos fue positivo, 1,6 0,5 kg en el tratamiento sin monensina y 1,4 0,3 kg en el tratamiento con monensina. Durante el perodo dos a tres del estudio (figura 4), las corderas del tratamiento de sales minerales con monensina sdica mostraron una tendencia (P = 0,07) a obtener una mayor ganancia diaria de peso con respecto a lo detectado en las corderas del grupo control. Sin embargo, en el perodo cuatro a cinco las corderas del tratamiento de sales minerales sin monensina lograron una mayor ganancia diaria de peso (P < 0,05) con respecto a las corderas del grupo con monensina. En los otros perodos y en el promedio de la ganancia diaria de peso total, los tratamientos estudiados resultaron similares (P > 0,05). El crecimiento de las corderas medido a travs de 14 medidas corporales result similar (P > 0,05) entre tratamientos (cuadro 3). Los promedios en las medidas corporales a los 90 das de edad fueron: longitud del cuerpo, 35,6 0,6 cm, altura a la cruz 49,7 0,9 cm, altura a la grupa 49,7 0,9 cm, permetro torxico 59,5 1 cm, permetro abdominal 61,71 cm, permetro de la caa 5,5 0,1 cm, anchura de la caa 1,8 0,02 cm, grosor de la caa 1,3 0,02 cm, longitud de la caa 11,1 0,15 cm, permetro del maslo de la cola 7,4 0,3 cm, anchura del maslo 2,04 0,10 cm, anchura del lomo 12,4 0,24 cm, anchura de la cadera medido a la altura del acetbulo 15,1 0,3 cm, anchura de la cadera medido a la altura de la tuberosidad isquitica 10,6 0,3 cm y anchura del hombro 14,6 0,4 cm. 37

AT Pieiro-Vzquez y col

18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 1a2 2a3 3a4 Nmero de perodo de estudio (cada perodo: 14 das de duracin) Con monensina 4a5

80 Consumo diario de protena cruda por cordera 70 60 50 40 30 20 10 0 1a2 2a3 3a4 4a5

Consumo de sales minerales/cordera/da (g)

Nmero de perodo de estudio (cada perodo: 14 das de duracin) Sin monensina Con monensina

Sin monensina

Figura 1. Consumo de sales minerales (X EE) con y sin monensina sdica en corderas Pelibuey alimentadas con heno de Estrella de frica durante la fase postdestete.
Intake of mineral salts (X SE) with and without monensin in Pelibuey ewe lambs fed with African Star hay during the postweaning growth.

Figura 2. Consumo de protena cruda (X EE) en corderas Pelibuey alimentadas con heno de Estrella de frica durante la fase postdestete. Valores indicados en el mismo perodo resultaron similares (P > 0,05).
Crude protein intake (X SE) in Pelibuey ewe lambs fed with African Star hay during the postweaning growth.

14 Peso corporal (kg) 12 10 8 6 4 2 0 1 2 3 4 5

Ganancia diaria de peso (g/cordera)

16

100 80 60 40 20 0 20 1a 2 2a 3 3a 4 4a5

Nmero de perodo de estudio (cada perodo: 14 das de duracin) Sin monensina Con monensina

Nmero de perodo de estudio (cada perodo: 14 das de duracin) Sin monensina Con monensina

Figura 3. Efecto de la suplementacin mineral con y sin monensina sdica sobre el peso corporal postdestete (X EE) de corderas Pelibuey alimentadas con heno de Estrella de frica. Valores indicados en el mismo perodo (de manera transversal) resultaron similares (P > 0,05).
Effect of the mineral supplementation with and without monensin sodium on the postweaning body weight (X SE) of the Pelibuey ewe lambs fed with African Star hay.

Figura 4. Efecto de la suplementacin mineral con monensina sdica sobre la ganancia diaria de peso postdestete (X EE) de corderas Pelibuey alimentadas con heno de Estrella de frica. Valores indicados entre los perodos de estudio cuatro a cinco resultan diferentes (P < 0,05); en el resto de los perodos (comparadas transversalmente) los valores resultaron similares (P>0,05).
Effect of the mineral supplementation with and without monensin sodium on the postweaning weight gain (X SE) of Pelibuey ewe lambs fed with African Star hay.

Mientras que a los 120 das fueron de: longitud del cuerpo 36,0 0,5 cm, altura a la cruz 50,5 0,8 cm, altura a la grupa 50,7 0,8 cm, permetro torxico 61,7 1,2 cm, permetro abdominal 64,7 1,4 cm, permetro de la caa 5,6 0,09 cm, anchura de la caa 1,8 0,03 cm, grosor de la caa 1,4 0,02 cm, longitud de la caa 38

11,4 0,13cm, permetro del maslo de la cola 7,0 0,17 cm, anchura del maslo 2,1 0,07 cm, anchura del lomo 12,3 0,2 cm, anchura de la cadera medido a la altura del acetbulo 15,4 0,3 cm, anchura de la cadera medido a la altura de la tuberosidad isquitica 10,7 0,2 cm y anchura del hombro 14,5 0,3 cm.

Ionforo, suplementacin mineral, ganancia de Peso, Trpico Hmedo

Cuadro 1. Protena cruda del heno Estrella de frica ofrecido (HO) y rechazado (HR) durante la prueba de crecimiento de corderas Pelibuey.
Crude protein in the African Star hay offered (HO) and rejected (HR) during the growth trial in Pelibuey ewe lambs.

Nmero de perodo de estudioz 1 Componente del heno Materia seca (%) Protena cruda (%) da 1 a 14 HO 92,8 15,3 HR 92,9 11,3 HO 93,2 12,4 2 da 15 a 28 HR 92,6 10,2 HO 90,1 8,3 3 da 29 a 42 HR 91,3 6,6 HO 89,2 16,0 4 da 43 a 56 HR 89,5 9,6

z: Cada perodo de estudio tuvo una duracin de 14 das.

Cuadro 2. Influencia de la suplementacin mineral con monensina sdica sobre el consumo de materia seca en corderas Pelibuey.
Influence of mineral supplementation with or without monensin sodium on dry matter intake in Pelibuey ewe lambs.

Variable Perodo de estudio 1 a 2: da 1 a 14 2 a 3: da 13 a 28 3 a 4: da 29 a 42 4 a 5: da 43 a 56 Nmero de observaciones


1: Media EE. Valores indicados en la misma fila resultaron similares (P > 0,05).

Tipo de suplemento mineral Sin monensina sdica Promedio en el consumo Heno en base hmeda (g) Heno en base seca (g) Heno en base hmeda (g) Heno en base seca (g) Heno en base hmeda (g) Heno en base seca (g) Heno en base hmeda (g) Heno en base seca (g) 265 81 246 8 348 17 325 15 296 18 264 16 437 22 390 20 6 269 18 250 17 362 19 338 18 318 22 284 20 451 16 402 14 6 Con monensina sdica

DISCUSIN Existe limitada informacin que cuantifique el consumo de sales minerales en ovinos de razas de pelo (Oliva y Vidal 2001, Cadenas-Ramrez y col2007). En corderas Pelibuey X Blackbelly en crecimiento (primeros 60 das postdestete) se ha informado (Cadenas-Ramrez y col2007) un consumo diario de sales minerales (Magnophoscal) de 7,1 0,7 g/cordera cuando stas son alimentadas en base a pastoreo y un complemento alimenticio. En corderos machos Pelibuey en finalizacin, el consumo de sales minerales corresponde a 10,9 g/cordero/da (Oliva y Vidal 2001). En el presente estudio, las corderas mostraron un consumo de sales minerales variable, el cual no result superior a los 15 g/cordera y tendi a reducirse conforme se increment la edad de la cordera (figura1). En la figura1 se describe el consumo de sales minerales mostrado por las corderas de ambos tratamientos, en donde se aprecia que existen perodos en donde el consumo de

sales minerales mostrado por las corderas indica amplia variacin. Por ejemplo, del perodo cuatro a cinco de estudio las corderas del tratamiento de sales minerales con monensina muestran un nivel de consumo de sales minerales que represent el 0% del consumo mostrado por las corderas del tratamiento de sales minerales sin monensina. Para contrastar los resultados de este estudio con otros trabajos, no se dispuso de informacin que documente el consumo de sales minerales adicionadas con algn ionforo en corderas. Aunque las corderas del tratamiento de sales minerales con monensina mostraron menos variacin en el consumo de sales minerales con respecto al tratamiento sin monensina sdica (figura1), el bajo consumo de sales minerales detectado en las corderas del tratamiento sales minerales con monensina no permiti que stas lograran un consumo de monensina sdica en un nivel (20 mg/kg de materia seca) en el cual se tiene evidencia que sta ejerce efectos en los patrones de fermentacin ruminal 39

AT Pieiro-Vzquez y col

(Baran y itan 2002) y digestibilidad de la protena cruda (Mazza y col2001). Las corderas del tratamiento de sales minerales con monensina mostraron una tendencia a disminuir el consumo de monensina sdica conforme avanz el estudio; esta situacin impide atribuir de manera contundente los efectos encontrados en este estudio a la monensina. No obstante, en los casos en donde los tratamientos resultaron similares, se describirn y discutirn los cambios detectados en las variables estudiadas. En ambos tratamientos se detectaron cambios de la tendencia en el nivel de consumo de materia seca y protena cruda. Particularmente, entre los das 28 y 42 de estudio (perodos de estudio tres a cuatro) las corderas disminuyeron en un 17% el consumo de materia seca y en un 41% el de protena cruda con respecto al nivel registrado en los das 14 a 28. Es posible que este cambio se asocie al menor valor protenico del heno de Estrella ofrecido durante los das 28 a 42. Sin embargo, al incrementarse la calidad protenica del heno ofrecido en el perodo subsiguiente (das 42 a 56) los consumos diarios de materia seca/cordera y protena cruda/cordera se incrementaron nuevamente a un nivel superior al registrado en los dos perodos previos. En apoyo a estos resultados, se ha indicado (Rojas y col1984) que el valor de la protena cruda en el heno de Estrella de frica muestra una relacin directa con el nivel de consumo de materia seca de los ovinos. En este estudio, el nivel de consumo de sales minerales con monensina sdica (2,3 g/cordera/da) no permiti incrementar el peso corporal o la ganancia diaria de peso de las corderas Pelibuey alimentadas con el heno de Estrella de frica con respecto a lo detectado en las corderas del tratamiento de sales minerales sin monensina. Es probable que el bajo nivel de consumo de monensina sdica registrado en este estudio (2,3 mg/cordera/da) explique la ausencia de un efecto positivo del ionforo utilizado sobre los cambios de peso de las corderas. Adicionalmente, se tienen evidencias (Plata y col2004, Manrquez y col2005) que indican que en corderos machos Pelibuey finalizados con dietas integrales la monensina sdica no ejerce influencia sobre la ganancia diaria de peso a una dosis de 100 mg/kg de materia seca (Plata y col2004) o a 25 mg/kg de materia seca (Manrquez y col2005). Aunque se detectaron diferencias en la ganancia diaria de peso de las corderas entre tratamientos en el ltimo perodo de estudio (perodo cuatro), previamente se ha indicado que el bajo consumo de monensina no permite atribuir este efecto al ionforo. La reduccin en la ganancia de peso en ambos tratamientos puede ser explicada en parte por la amplia variacin en el consumo de materia seca y protena cruda y por la tendencia a una disminucin en el consumo de minerales que experimentaron estas corderas conforme avanz el estudio. Al respecto, se ha encontrado (Morales y col2007) que en los forrajes existen desequilibrios en 40

el contenido mineral que pueden afectar la concentracin srica de minerales e influir en la salud y nivel de produccin del rumiante. Las medidas corporales evaluadas (a los 90 y 120 das de edad) en las corderas no resultaron afectadas (P > 0,05) por alguno de los tratamientos utilizados. Al parecer, el bajo consumo de materia seca y protena cruda registrado por las corderas explica la baja eficiencia de crecimiento medido a travs del peso corporal y de medidas corporales. Se concluye que en corderas Pelibuey alimentadas con base en heno de Estrella de frica en la fase postdestete, la incorporacin de monensina sdica en el suplemento mineral durante 56 das no permiti que stas lograran un consumo de monensina sdica en un nivel en el cual se tiene evidencia que sta ejerce efectos sobre la eficiencia de crecimiento. El nivel de consumo de monensina que registraron las corderas no ejerci efectos sobre los niveles de consumo de materia seca y protena cruda, ganancia diaria de peso durante los primeros 42 das y no influy sobre las medidas corporales de las corderas. RESUMEN
Las corderas Pelibuey tienen una ganancia de peso menor a 80 g/da cuando son alimentadas en base a pastoreo. Tomando esto en consideracin, resulta importante estudiar diversos aditivos que muestren posibilidades de optimizar el crecimiento de los corderos. El objetivo de este estudio consisti en evaluar la influencia de la monensina sdica sobre el crecimiento postdestete de las corderas Pelibuey. Doce corderas Pelibuey (76 das de edad y 11,7 kg de peso corporal) fueron asignadas a 1 de 2 tratamientos (seis corderas por tratamiento). Los tratamientos consistieron de sales minerales con o sin monensina sdica, ofrecidas a libertad durante 66 das (10 das para adaptacin al estudio de crecimiento y 56 das para el estudio de crecimiento). Cada cordera fue asignada a un corral individual; la unidad experimental fue la cordera. El promedio en el consumo diario de sales minerales fue de 12,2 0,9 g/cordera en el tratamiento sin monensina y 2,3 0,6 g/cordera en el tratamiento con monensina. La suplementacin mineral con monensina sdica no afect (P > 0,05) el peso corporal, ganancia de peso total, promedio de ganancia de peso diaria y el crecimiento de las corderas establecido en 15 medidas corporales. Durante los 56 das del estudio, las corderas ganaron peso, 1,5 0,3 kg/cordera y 27 5 g/cordera/da. El tratamiento con monensina no influy (P > 0,05) en el consumo promedio de materia seca y protena cruda. En corderas Pelibuey alimentadas con heno de Estrella de frica la suplementacin mineral con monensina sdica no afect el promedio en la ganancia de peso diario, ni el consumo diario de materia seca y protena cruda con respecto a la suplementacin mineral sin monensina sdica.

AGRADECIMIENTOS
El presente material forma parte del proyecto Productividad de primalas de razas de pelo en pastoreo y con complementacin energtica y protenica y ha sido financiado parcialmente por el Gobierno del estado de Tabasco y el CONACYT 16449 FOMIX Tabasco 2005-1. Parte de este material conforma la tesis de licenciatura del primer autor.

REFERENCIAS
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Ionforo, suplementacin mineral, ganancia de Peso, Trpico Hmedo

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41

Arch Med Vet 41, 43-51 (2009) ARTCULO ORIGINAL

Impacto de la exposicin prenatal a testosterona sobre parmetros biomtricos y endocrinos en ovinos recin nacidos#
Impact of prenatal exposure to testosterone in biometrics and endocrine parameters of newborn lambs
SE Recabarrena*, PP Rojas-Garcaa, MP Recabarrena, K Norambuenaa, T Sir-Petermannb
aLaboratorio bLaboratorio

de Fisiologa y Endocrinologa Animal, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad de Concepcin, Chilln, Chile. de Endocrinologa y Metabolismo, Facultad de Medicina Occidente, Universidad de Chile, Santiago, Chile.

SUMMARY Biometric and endocrine parameters were studied in male and female Suffolk Down newborn lambs born to mothers exposed to an excess of testosterone (EPT) during 60 days (EPT-P1) and during 90 days (EPT-P2), beginning at day 30 of pregnancy. Control mothers received vegetable oil. At delivery time the following data were registered: time of delivery, number of newborns per mother and sex of the newborn. At 8 hours postpartum, the characteristics of the genitalia, the anus-urinary meatus distance and body weight were recorded. Blood samples were taken to measure cortisol, T3 and T4 on plasma. Data regarding time of birth, number of offspring and sex did not show any differences between the three groups of newborn lambs. Females born to EPT-P1 and EPT-P2 mothers exhibited masculinized genitalia, showing a penis and an empty scrotum. Females born to EPT-P1 mothers showed lower body weight and lower plasma T4 concentrations than females and males born to the other 2 groups of mothers (P < 0.05). Plasma cortisol concentrations were not different between offspring from the 3 groups of mothers, however, females born to EPT-P1 mothers showed an inverse correlation between cortisol concentration and body weight. Data showed that exposure to testosterone during a critical time during pregnancy had a profound impact on genitalia of females, and depending on the dose it produces lower body weight and lower plasma T4 concentrations in newborn females. The EPT had no effect on biometric and endocrine parameters in newborn male lambs. Palabras clave: testosterona, masculinizacin, hormonas tiroideas, programacin fetal. Key words: testosterone, masculinization of external genitalia, thyroid hormones, fetal programming.

INTRODUCCIN La oveja constituye un valioso modelo experimental para el estudio de la fisiologa reproductiva ovina y la de otros rumiantes menores o mayores. Adems, por varios aos se la ha utilizado como modelo experimental para el estudio de la fisiologa reproductiva humana ya que la hembra ovina comparte algunos aspectos endocrinoreproductivos con la mujer (Foster 1988). La exposicin prenatal a hormonas esteroidales como testosterona y cortisol ha permitido dilucidar aspectos claves de la fisiologa ovina y su impacto en la hembra y macho adulto. Entre ellos, se han podido reconocer las consecuencias del estrs prenatal sobre la reproduccin y el metabolismo del ovino adulto (De Blasio y col 2007) y ltimamente se han podido establecer no slo los aspectos organizacionales de los esteroides sobre la fisiologa reproductiva de la hembra adulta sino que tambin sobre el macho (Recabarren y col 2006).

Aceptado: 19.11.2008. # Financiado por Proyecto Fondecyt 1050915. * Casilla 537, Chilln, Chile; srecabar@udec.cl

Estudios pioneros en hembras ovinas prepberes con exposicin prenatal a testosterona (EPT) han podido establecer que la EPT durante el perodo crtico del desarrollo cerebral modifica el patrn de secrecin de LH, conduciendo a un adelanto de la pubertad, lo cual a su vez depende del momento, duracin y grado de la EPT (Kosut y col 1997). Este fenmeno, adems, se hace independiente del fotoperodo, lo cual es una caracterstica de la activacin del eje reproductivo del macho. Otros estudios han mostrado que la EPT ocasiona alteraciones en la morfologa ovrica (Clarke y col 1977, Rojas-Garca y col 2006), en la conducta sexual y en la sensibilidad al retrocontrol de progesterona (Robinson y col 1999, Recabarren y col 2005a). Un aspecto que no se ha definido an es si alguna de las consecuencias de la exposicin prenatal a testosterona se puede reconocer al nacimiento, o bien slo en etapas posteriores como la puberal o la adultez. Los estudios del grupo de Foster y de Padmanabhan (Wood y Foster 1998, Savabieasfahani y col 2005) han podido establecer que la EPT en altas dosis, sobre los 100 mg de testosterona propionato, adelanta el inicio de la pubertad neuroendocrina y modifica el patrn de secrecin de gonadotropinas del ciclo estral en hembras adultas. Adems, estudios de nuestro laboratorio han demostrado que la EPT modifica la 43

SE RECABARREN y col

sensibilidad tisular a la insulina (Recabarren y col 2005a), la respuesta ovrica a la LH endgena en hembras ovinas inmaduras (Recabarren y col 2005b) y la secrecin de LH y testosterona en respuesta al test de GnRH en machos maduros e inmaduros (Recabarren y col 2007). No obstante, an no se han descrito parmetros biomtricos y hormonales de machos y hembras recin nacidos con EPT. Es posible que la EPT modifique algunos parmetros biomtricos y endocrinos que se pueden reconocer al nacimiento. En el presente trabajo se describen algunos de esos parmetros, entre los cuales se incluyen: hora del parto, nmero de cras, sexo de las cras, caractersticas morfolgicas de los genitales, presencia de partos mltiples, peso al nacimiento, concentraciones plasmticas de cortisol, como una medida del estrs del nacimiento y de las hormonas tiroideas como un indicador del estado metablico. MATERIAL Y MTODOS
ANIMALES

Para este estudio se utilizaron 60 hembras ovinas adultas de la raza Suffolk Down y sus respectivas cras (90 en total), nacidas durante tres perodos reproductivos. Las hembras se obtuvieron de un predio particular (Fundo Los Gultros, comuna de San Fabin de Alico, VIII Regin). A fines de marzo-principios de abril de cada ao, las madres se sincronizaron y se aparearon con carneros de fertilidad probada. La sincronizacin de los estros, para monta dirigida, se logr con la aplicacin de un implante vaginal de progesterona por 7 das (Eazy Breed, CIDR-G). Al momento de la remocin del implante, se inyect prostaglandina F2- (Genestren, Drug Pharma) intramuscular. Con este esquema de tratamiento se asegur una fecha de cruzamiento y partos relativamente uniformes para la totalidad de las hembras. Las hembras preadas se distribuyeron al azar en tres grupos, un grupo control y dos de exposicin prenatal a testosterona. Los protocolos de EPT de las madres se basaron segn lo descrito por Kosut y col (1997) y Recabarren y col (2005a). El primer protocolo utilizado consisti en la administracin intramuscular de testosterona propionato (Steraloids Inc., USA) disuelta en aceite vegetal a un grupo de 16 hembras preadas (EPT-P1) en concentraciones de 60 mg dos veces por semana, a partir de los 30 das y hasta los 90 das de gestacin. En el segundo protocolo (EPTP2), a un grupo de 12 hembras preadas se le administr 30 mg de testosterona propionato intramuscular disuelta en aceite vegetal dos veces por semana, a partir de los 30 das y hasta los 90 das de gestacin, dosis que posteriormente se elev a 40 mg de testosterona propionato desde los 90 hasta los 120 das de gestacin. El grupo control, constituido por 32 hembras preadas, se subdividi en dos grupos de 16 hembras cada uno, a las cuales slo se les administr el vehculo consistente en aceite vegetal (30-90 das y 30-120 das). 44

Las ovejas preadas se alimentaron con dieta estndar para hembras en gestacin, en base a alimento pelletizado cuya composicin consista en materia seca (avena, maz, trigo, harina de gluten, harina de soya, harina de pescado, harina de girasol y sales minerales) con 18% de protena, 11% de fibra cruda, 2% de grasa y 2.450 Kcal/kg (Compaa Molinera El Globo, Chile), pradera natural y agua ad libitum. Adems se mantuvieron bajo estricto control veterinario durante toda la gestacin, con seguimiento ecogrfico realizado por el Laboratorio de Reproduccin Animal en la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad de Concepcin en Chilln. Las hembras parieron en los establos de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad de Concepcin, en un ambiente estabulado y constantemente controlado. Al momento del parto, los machos y hembras recin nacidos se dejaron sin intervencin alguna durante ocho horas para permitir la vinculacin madre-cra y asegurar la posterior ingesta de calostro durante las primeras horas de vida. Se registraron in situ la fecha y hora del parto, el tratamiento de la madre, el nmero de cras por madre, la condicin general de la madre y su cra. Posteriormente, a las ocho horas postparto, se observ y registr el sexo de la cra y las caractersticas de los genitales externos y se midi la distancia ano-meato urinario o vagina con una huincha de medir. Adems, se les registr el peso corporal mediante pesa digital y se les tom la primera muestra de sangre por venopuncin de la vena yugular. Adems, como medida profilctica, se limpi y desinfect el cordn umbilical con una solucin de polividona yodada al 10%. Las muestras de sangre se recibieron en tubos heparinizados (10 UI de heparina/1 mL de sangre). Los tubos se centrifugaron a 1.000 x g por 10 minutos a 4 C (IEC Centra 7-R). Posteriormente el plasma se rescat usando pipetas Pasteur y se deposit en microtubos Eppendorf de 1,5 mL, los que se conservaron a 20 C hasta el momento de la determinacin hormonal por radioinmunoanlisis (RIA).
MEDICIN DE HORMONAS

La medicin de la concentracin plasmtica de cortisol, triyodotironina (T3) y de tiroxina (T4) plasmtica se realiz en el Laboratorio de Fisiologa y Endocrinologa Animal de la Facultad de Ciencias Veterinarias (Universidad de Concepcin) mediante RIA, utilizando kits comerciales (Coat-A-Count, DPC, USA). El RIA de cortisol present un coeficiente de variacin intraensayo de 3% e interensayo de 7%, y un nivel de detectabilidad de 5 g/dL definido como el 90% del buffer control (Recabarren y col 2000, Recabarren y col 2004). Para el RIA de T3, el coeficiente de variacin intraensayo fue 2% e interensayo 5%, y un nivel de detectabilidad de 13 ng/dL definido como el 90% del buffer control. Para el RIA de T4 los coeficientes intraensayo e intersayo fueron 2% y 5%, respectivamente, y un nivel de detectabilidad de 0,97 g/dL definido como el 90% del buffer control.

TESTOSTERONA, MASCULINIZACIN, HORMONAS TIROIDEAS, PROGRAMACIN FETAL

Todos los procedimientos experimentales realizados fueron aprobados previamente por el comit tico local para la investigacin animal de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad de Concepcin.
ANLISIS ESTADSTICO

Se utiliz anlisis de varianza (ANDEVA) de dos vas (dos sexos y tres tratamientos) con comparacin de los promedios con el test de Newman Keuls para las variables hormonales y parmetros biomtricos (distancia ano-meato urinario, pesos al nacimiento de las cras), utilizando el programa computacional GB-Stat v.5. Para cuantificar la relacin entre las variables peso y concentracin plasmtica hormonal se utiliz la Correlacin de Pearson a travs del programa Prisma GraphPad 4,0. La hora del parto se distribuy en cuatro perodos de seis horas cada uno, correspondiente a las 24 horas del da (24:00 a 05:59 h; 06:00 a 11:59 h; 12:00 a 17:59 h y 18:00 a 23:59 h). El tipo de parto y sexo de las cras se expresaron en forma porcentual. Se consider para todos los anlisis un P<0,05 como estadsticamente significativo. Los datos se expresan como promedio error estndar. RESULTADOS
PARMETROS BIOMTRICOS

descritos. Se registr un total de 86 cras (cuatro cras no fueron incluidas en este anlisis porcentual por no tener el registro horario de su nacimiento). En las madres control la mayor cantidad de nacimientos se concentr durante la noche en el perodo comprendido entre las 24:00 h y las 05:59 h (36%), mientras que en las madres EPT-P1 la mayor cantidad de nacimientos se concentr en el perodo comprendido entre las 06:00h hasta las 11:59 h (43,8%). Finalmente, en las madres EPT-P2 la mayor cantidad de nacimientos se produjo durante el da y en dos perodos consecutivos, desde las 24:00 h hasta las 05:59 h (40%) y desde las 06:00 h hasta las 11:59 hs (40%). Nmero de cras. El cuadro 2 muestra el porcentaje de partos que tuvieron como resultado una cra (parto nico) o dos cras (partos melliceros). Considerando todos los partos, un 48,3% fueron partos nicos y un 51,7% fueron melliceros. Si se separa por grupo, las madres controles tuvieron mayormente partos nicos (parto nico: 59,4%; parto mellicero: 40,6%), mientras que las madres EPT-P1 y EPT-P2 mayormente tuvieron parto mellicero (EPT-P1: parto nico: 31,3%; parto mellicero: 68,7% y EPT-P2 parto nico: 41,7%; parto mellicero: 58,3%). El cuadro 2 muestra adems para cada grupo de hembras el porcentaje de mellizos del mismo sexo y de sexos diferentes. En los partos en donde ambas cras fueron machos, el grupo EPT-P1 present la mayor cantidad con un 44,4%; seguido por el grupo EPT-P2 con un 33,3% y el grupo control con un 22,2%. El grupo de hembras control

Horario de los partos. El cuadro 1 muestra la distribucin porcentual de los partos en los cuatro perodos horarios

Cuadro 1. Porcentaje de ovejas madres que paren en cuatro intervalos horarios durante las 24 horas del da. Las madres EPT recibieron testosterona propionato por 60 (P1) o 90 das (P2) a partir del da 30 de preez mientras que las madres control recibieron aceite vegetal.
Percentage of ewes delivering during four intervals of time during a 24-hours day. EPT mothers received testosterone propionate for 60 or 90 days beginning at day 30 of pregnancy while control mothers received vegetable oil.

Hora del da 24:00-05:59 Madres control Madres EPT-P1 Madres EPT-P2 36% 25% 40% 06:00-11:59 32% 43,8% 40% 12:00-17:59 19% 2,5% 10% 18:00-23:59 13% 18,8% 10%

Cuadro 2. Tipo de parto y sexo de cras melliceras nacidas de ovejas tratadas con testosterona durante la preez y ovejas control. Las madres EPT recibieron testosterona propionato por 60 (P1) o 90 (P2) das a partir del da 30 de preez mientras que las madres control recibieron aceite vegetal.
Delivery type and sex of the offspring born to ewes exposed to testosterone during pregnancy and to control sheep. EPT mothers received testosterone propionate for 60 or 90 days beginning at day 30 of pregnancy while control mothers received vegetable oil.

Tipo de parto Unico Madres control Madres EPT-P1 Madres EPT-P2 59,4% 31,3% 41,7% Mltiple 40,62% 68,7% 58,3% Macho-macho 22,2% 44,4% 33,3%

Sexo de los mellizos Macho-hembra 42,8% 28,6% 28,6% Hembra-hembra 62,5% 37,5% 0%

45

SE RECABARREN y col

Peso corporal (kg)

present la mayor cantidad de partos con ambas cras hembras con un 62,5%, el grupo EPT-P1 con un 37,5% y el grupo EPT-P2 no tuvo este tipo de parto. Por ltimo, en los partos en los que se obtuvo una cra de cada sexo el grupo de hembras control registr un 42,8% y los grupos de hembras EPT-P1 y-P2 obtuvieron, ambos, un 28,6%. Sexo de las cras. En el cuadro 3 se entregan los porcentajes de machos y hembras nacidos en cada grupo de madres. Las hembras masculinizadas que posean escroto vaco y pene fueron incluidas en el grupo de las hembras. En el grupo de las madres control, el mayor porcentaje de cras nacidas fue de sexo femenino con un 57%; en el grupo de madres EPT-P1 el mayor porcentaje de cras nacidas fue de sexo masculino con un 59%; y en el grupo de madres EPT-P2 el mayor porcentaje de cras nacidas fue de sexo masculino con un 63%. Peso de las cras. La figura 1 muestra la comparacin entre los pesos al nacimiento de las cras nacidas de madres control, madres EPT-P1 y madres EPT-P2 en ambos sexos. Las hembras recin nacidas de madres EPT-P1 presentaron estadsticamente un menor peso al nacimiento en comparacin a las hembras nacidas de madres control y nacidas de madres EPT-P2. Adems pesaron menos que los machos de su mismo grupo y de los otros grupos (P < 0,05). Caractersticas de los genitales externos y distancia ano-meato urinario. Las hembras nacidas de madres EPT exhibieron una marcada masculinizacin de los genitales externos (figura 2), con la presencia de pene y un escroto vaco. Como complemento de la observacin cualitativa se midi la distancia ano-meato urinario, la cual es un bioindicador de masculinizacin de la genitalia externa. En el cuadro 4 se muestra el promedio de las distancias ano-meato urinario separado por sexo y tratamiento. Las hembras EPT-P1 y EPT-P2 mostraron mayor distancia ano-meato urinario que las hembras control (P < 0,01) y similar a la que presentaron los machos. La distancia ano-meato urinario de las hembras EPT-P2 fue menor a la de hembras EPT-P1, pero mayor que el de las hembras control (P < 0,01).
Cuadro 3. Porcentaje de machos y hembras nacidos de ovejas expuestas a testosterona durante la preez y de madres control. Las madres EPT recibieron testosterona propionato por 60 (P1) 90 (P2) das a partir del da 30 de preez mientras que las madres control recibieron aceite vegetal.
Percentage of male and female lambs born to ewes exposed to testosterone during pregnancy and to control mothers. EPT mothers received testosterone propionate for 60 or 90 days beginning at day 30 of pregnancy while control mothers received vegetable oil.

6 5 4 3 2 1 0
n = 23

Hembras

Machos

n = 11

n=7

n = 19

n = 16

n = 12

Figura 1. Peso corporal (promedio EE) en ovinos recin nacidos de madres control y de madres con exposicin prenatal a testosterona. El color de la columna es indicativo del tratamiento (blanca = control, negro = EPT-P1, gris = EPT-P2). Se muestran en forma separada hembras y machos. Dentro de cada columna se seala el nmero de recin nacidos de cada grupo. * indica diferencia significativa respecto a los otros grupo (P 0,05, ANDEVA).
Body weight (mean SEM) in newborn lambs born to control mothers and to mothers with EPT. Colour of column indicates the treatment (white = control, black = EPT-P1, gray = EPT-P2). Males and females are presented separately. Within each column, the number of newborn is given for each group. * indicates significant differences with respect to the other groups (P 0,05, ANOVA).

a
Cortisol (g/dL)

14 12 10 8 6 4 2 0 350 300 250 200 150 100 50 0 12,5

Hembras

Machos

n = 23

n = 11

n=7

n = 19

n = 16

n = 12

b
T3 (ng/dL)

n = 23

n = 11

n=7

n = 19

n = 16

n = 12

c
T4 (ug/dL)

10,0 7,5 5,0 2,5 0,0


n = 23 n = 11 n=7 n = 19 n = 16 n = 12

Grupos Madres control Madres EPT-P1 Madres EPT-P2

Machos 43% 59% 63%

Hembras 57% 41% 37%

Figura 2. Concentraciones plasmticas (promedio EE) de a) cortisol, b) triyodotironina (T3) y c) tiroxina (T4) en ovinos recin nacidos de madres control y madres con EPT. El color de la columna es indicativo del tratamiento (blanca = control, negro = EPT-P1, gris = EPT-P2). Se muestran en forma separada hembras y machos. Dentro de cada columna se seala el nmero de recin nacidos de cada grupo.
Plasma concentrations of a) cortisol, b) triiodothyronine (T3) and c) thyroxine (T4) in newborn lambs born to control mothers and to mothers with EPT. Colour of column indicates the treatment (white= control, black = EPT-P1, gray = EPT-P2). Males and females are presented separately. In each column, the number of newborns is given for each group.

46

TESTOSTERONA, MASCULINIZACIN, HORMONAS TIROIDEAS, PROGRAMACIN FETAL

Distance from anus to urinary meatus in newborn male and female lambs born to ewes exposed to testosterone during pregnancy and to control mothers. EPT mothers received testosterone propionate for 60 or 90 days beginning at day 30 of pregnancy while control mothers received vegetable oil.

Cortisol (g/dL)

Cuadro 4. Distancia (cm) ano-meato urinario en machos y hembras recin nacidos de ovejas expuestas a testosterona durante la preez y de ovejas control. Las madres EPT recibieron testosterona propionato por 60 (P1) o 90 (P2) das a partir del da 30 de preez mientras que las madres control recibieron aceite vegetal.

30

20

10

Distancia (cm) Machos control Hembras control Machos EPT-P1 Hembras EPT-P1 Machos EPT-P2 Hembras EPT-P2
A es distinto de b (P 0,05, paired t test).

0 3 4 5 Peso corporal (kg) 6 7

16,1 1,63 15,4 14,5 15,3 11,5

0,4a 0,1b 0,45 0,3 0,58 2,0

Figura 3. Correlacin entre el peso corporal y el cortisol plasmtico en corderos recin nacidos de madres EPT-P1. Cada punto en el grfico indica un recin nacido. La correlacin utilizada fue de Pearson, con un valor de R2 de 0,374 y un valor de P 0,05. La lnea recta da cuenta del ajuste de los valores a la correlacin. La pendiente de la lnea recta es significativamente distinta de0.
Correlation between body weight and plasma cortisol concentrations in newborn lambs of mothers with EPT-P1. Each point in the figure indicates one newborn. Pearson correlation was used with a R2 of 0,374 and P 0,05. The slope of the straight line is significantly different from0. 450 350 T3 ng/dL 250 150 5 50 0 2 3 4 5 6 7 Peso corporal (kg) 20 15 T4 ug/dL 10

PARMETROS ENDOCRINOS

Concentraciones plasmticas de cortisol, T3 y T4. La figura 2 muestra las concentraciones plasmticas de cortisol, T3 y T4, en las cras macho y hembra nacidas de madres control y de madres EPT a las 8 horas postparto. No hubo diferencias estadsticas al comparar los tres grupos de cras. Las hembras nacidas EPT-P1 presentaron un promedio de cortisol plasmtico de 8,99 g/dL, un valor levemente superior al de los otros grupos de hembras y machos (figura 2 a). Adems, este grupo present un peso promedio significativamente ms bajo. Es por ello que se evalu la correlacin entre ambos parmetros. Se encontr que en todas aquellas hembras nacidas EPT-P1 cuya concentracin plasmtica de cortisol fue mayor a 8,99 g/dL, el peso se correlacionaba inversamente con esta concentracin de cortisol, es decir, aquellas hembras que tuvieron cortisol alto, su peso fue ms bajo (figura3). Esta correlacin no se observ en los otros grupos de animales control o EPT-P2. En relacin a la T3, no hubo diferencias estadsticas al comparar los tres grupos de cras, mientras que en la T4 las hembras del grupo EPT-P1 mostraron una menor concentracin de T4 que las hembras del grupo control. La correlacin peso corporal-niveles de tiroxina es un importante bioindicador de estado metablico en recin nacidos animales y humanos (De Blasio y col 2006, Fisher 2007). Al evaluar esa correlacin en nuestros animales encontramos que en las hembras del grupo control existe una correlacin directa entre peso corporal y T4 plasmtica (figura 4). Esta correlacin no est presente en machos y se pierde en las hembras nacidas EPT-P1 y EPT-P2.

Figura 4. Correlacin entre peso corporal y hormonas tiroideas en corderos hembras recin nacidos de madres control. Cada punto en el grfico indica un recin nacido. La T3 est representada por los crculos negros y la T4 por los crculos blancos. La correlacin utilizada fue de Pearson, con un valor de R2 de 0,302 y un valor de P 0,05. La lnea recta da cuenta del ajuste de los valores a la correlacin (lnea punteada = T3, lnea continua = T4). La pendiente de la lnea recta es significativamente distinta de 0 slo para T4.
Correlation between body weight and T4 in newborn female lambs of control mothers. Each point in the figure represents one newborn lamb. Pearson correlation was used with a R2 of 0,302 and P 0,05. The slope is significantly different from 0 only for T4.

DISCUSIN El presente estudio describe una serie de variables relacionadas con el parto de hembras ovinas Suffolk-Down y sus cras bajo condiciones de estabulacin y medioambientales controladas y cmo puede una exposicin 47

SE RECABARREN y col

prenatal a testosterona alterar estas variables. Las hembras con exposicin prenatal fueron tratadas con testosterona propionato durante una etapa crtica del desarrollo del feto, lo que equivale a un cambio en el ambiente intrauterino que deja importantes efectos en el recin nacido. El mayor impacto en los parmetros analizados se observ en las hembras nacidas de madres EPT-P1 (60 mg de testosterona, dos veces por semana, del da 30 al 90 de gestacin), las cuales, adems de la masculinizacin de los genitales externos, exhibieron menor peso al nacimiento y menor concentracin de tiroxina a las ocho horas postparto que las hembras control y machos. Las hembras nacidas de madres EPT-P2 tambin presentaron masculinizacin de los genitales externos, pero sin exhibir menor peso al nacimiento ni menor concentracin de tiroxina que las control. Los machos nacidos de madres control y madres EPT no se diferenciaron entre s en ninguno de los parmetros estudiados. Indudablemente, la aparicin de aspectos fenotpicos masculinos en una hembra denota un fuerte efecto del tratamiento con testosterona sobre el desarrollo genital. Los resultados en relacin al parto muestran que los nacimientos en las hembras control se concentraron en dos intervalos horarios que abarcaron entre la medianoche y las seis de la maana y entre las seis de la maana y el medioda. Cerca del 70% de los partos ocurrieron entre esos horarios. El horario de inicio del parto podra estar en relacin al ritmo circadiano de cortisol. El cortisol plasmtico empieza a aumentar en las primeras horas de la madrugada en varias especies para alcanzar un mximo alrededor de las 07:00-08:00 h (Cagnacci y col 1998, Hernandes y col 2000). El ritmo circadiano de cortisol en los fetos previo al parto es desconocido, pero se ha evidenciado que los fetos de ovejas exhiben un ritmo de cortisol (Parraguez y col 1989). Lo observado en cuanto al horario de los partos es similar a lo encontrado en humanos. Estudios realizados en mujeres a punto de parir indican que existe una mayor incidencia de partos en la madrugada y al anochecer (Cagnacci y col 1998, Anderka y col 2000). Sin embargo, la distribucin horaria de los partos en las madres EPT-P2 fue ms tarda en comparacin con las hembras control. La razn de ese retraso y desplazamiento desde las primeras horas de la maana hasta el horario de la tarde es desconocida, pero podra estar relacionada con el ritmo circadiano de cortisol del feto. Cabe hacer notar que no se encontr una relacin entre el sexo de la cra y la hora del parto. En las hembras control, el 59,4% de los partos fue parto nico, mientras las hembras EPT fue mayormente de mellizos. La frecuencia de la obtencin de mellizos es un carcter racial y, por tanto, de base genotpica, si bien se ha establecido que influyen en diversos grados factores ambientales, sobre todo la alimentacin. No obstante, en los ovinos la heredabilidad (h2) de nacimientos gemelares es, en general, baja (10-15%). Las madres de nuestro estudio eran todas multparas. Si se toman en cuenta todas 48

las madres, el porcentaje de madres melliceras sobrepasa levemente el 50%. El tratamiento con testosterona a las madres no debera influir en el nmero de cras gestadas ya que la exposicin a un exceso de testosterona se inicia a los 30 das postencaste, aunque Wolf y col (2002) observaron que en ratas la EPT puede llevar a efectos txicos con reduccin en el tamao de la camada y la viabilidad de los embriones. Adems, el sexo de las cras nacidas de las hembras control es 57% hembras y 43% machos. Si se toma en consideracin el total de cras, independiente del tipo de madre, el porcentaje de machos fue mayor que el de hembras (55% versus 45%), producto de que las madres con los protocolos de exposicin a testosterona parieron ms machos que hembras. En este caso, se debe considerar que el tratamiento tampoco influira en el sexo de la cra ya que ste se establece en el momento de la fecundacin, a menos que la exposicin prenatal a testosterona determinara una mayor mortalidad embrionaria de hembras a partir de los 30 das postgestacin. Sin embargo, el seguimiento ecogrfico no mostr signos de muerte embrionaria, por lo que los resultados en relacin al sexo seran determinados por el azar. Las hembras nacidas de madres EPT-P1 y -P2 presentaron masculinizacin de los genitales externos con la presencia de pene y un escroto vaco de menor tamao que el de los machos y con una distancia ano-meato urinario semejante a los machos. Estos resultados, con dos protocolos diferentes de exposicin prenatal a testosterona, confirman lo observado por otros autores. Se ha descrito que hembras nacidas de ovejas tratadas con 200 mg de testosterona entre los 30 y 90 das de gestacin nacen con genitales completamente virilizados, con un pseudopene y una bolsa escrotal vaca en lugar de una apertura vaginal (Herbosa y col 1995, Robinson y col 1999). Las hembras masculinizadas presentan ovarios y un tero con terminacin ciega pero sin vagina (Unsworth y col 2005). Se ha establecido adems, que el efecto virilizante observado en los genitales externos se acompaa de conductas masculinas en la hembra adulta (Orgeur 1995), de mltiples alteraciones neuroendocrinas y ovricas como el hipergonadotropismo (aumento en la secrecin de hormona luteinizante, LH), la sensibilidad reducida al retrocontrol positivo y negativo de estradiol (Sharma y col 2002, Savabieasfahani y col 2005, Vergara 2007), el desarrollo de ovarios multifoliculares (Padmanabhan y col 2006, Rojas-Garca y col 2006), as como alteraciones en el perfil de LH y estradiol en la fase folicular del ciclo estral (Vergara 2007). En contraste, otros estudios han mostrado que las hembras nacidas de madres tratadas con testosterona entre los 60-90 das de gestacin (segunda mitad del perodo crtico) nacen con genitales externos normales, pero tienen la postura urinaria masculinizada (Clarke y col 1976, Herbosa y col 1995), lo que permite concluir que el perodo crtico para la masculinizacin de los genitales externos ocurre entre los 30 y 60 das de gestacin al igual que la masculinizacin del sistema nervioso central (SNC).

TESTOSTERONA, MASCULINIZACIN, HORMONAS TIROIDEAS, PROGRAMACIN FETAL

Los efectos de la EPT en los genitales externos femeninos se han descrito en otras especies. En ratas, Wolf y col (2002) encontraron que la administracin prenatal de propionato de testosterona condujo a la formacin de genitales externos masculinos, con la distancia ano-genital aumentada. En humanos, las nias expuestas prenatalmente a altos niveles de andrgenos, como en el caso de la hiperplasia suprarrenal congnita, presentan virilizacin de los genitales externos al nacimiento, incluyendo clitoromegalia y fusin de los labios (Nimkarn y New 2007, New 2004). El efecto de los andrgenos prenatales sobre el tracto reproductivo en la hembra se debera a que la testosterona y dihidrotestosterona mantienen el sistema de conductos de Wolff y promueven el crecimiento y desarrollo de glndulas accesorias y genitales externos de sexo masculino, mientras que la regresin del tracto reproductor femenino es principalmente dependiente de la hormona antimlleriana (AMH) que se secreta desde la clula de Sertoli fetal (Josso y col 2006, Wolf y col 2002). La exposicin prenatal a testosterona influy en el peso de nacimiento de las cras hembras de las madres EPT-P1. Las hembras recin nacidas EPT-P1 pesaron menos que las hembras control, que las hembras EPT-P2 y que los machos. Este fenmeno estara asociado a la dosis y duracin de la exposicin a testosterona, dado que slo se observa con el tratamiento EPT-P1. Estos resultados concuerdan con el estudio de Manikkam y col (2004) quienes observaron que el tratamiento con dosis de 100 mg de testosterona propionato dos veces por semana entre los 30 y 90 das de gestacin redujo el peso corporal y talla de los recin nacidos de ambos sexos y la circunferencia torcica de las hembras. En humanos, se ha propuesto que el peso al nacimiento es un indicador de la aparicin de diferentes patologas en la edad adulta por los efectos programadores de esta condicin (Eriksson y col 2001, Barker 2005, Barker y col 2006, Carlsen y col 2006). Resultados en recin nacidos humanos sugieren que la exposicin prenatal a testosterona como aquella que se observa en madres con el sndrome de ovario poliqustico tiene como resultado recin nacidos con menor peso, lo que se conoce como nios pequeos para la edad gestacional (PEG) (Sir-Petermann y col 2002). Se ha atribuido tambin que el menor peso sera consecuencia de una alteracin en la concentracin de IGF-1 en el feto como resultado de la exposicin a la testosterona (Padmanabhan y col 2006). Por otro lado, en el estudio de Dwyer y col (2006) se observ que el peso al nacimiento de los corderos estaba relacionado con el tamao de la camada. Las gestaciones triples eran ms cortas que las gestaciones nicas o gemelares. El peso al nacimiento de los corderos disminua con cada aumento en el nmero de corderos en la camada. Sin embargo, en el presente estudio slo las hembras EPT-P1 tuvieron un peso corporal menor al de los machos y hembras de otros grupos, pero este fenmeno no estara relacionado con el tamao de la camada. Los efectos de un bajo peso al nacimiento en ovinos se pueden evidenciar en sus desempeos

productivos en la vida adulta, como, por ejemplo, reduccin en el nmero de fibras musculares, lo que podra afectar el contenido y calidad de la carne (Fahey y col 2005). Sin embargo, otros estudios le atribuyen un efecto reductor en el contenido de grasa subcutnea o perirrenal o plvica al tratamiento con testosterona prenatal, lo que podra contribuir a una mejor calidad de la carcasa en el animal al momento de su faena (DeHaan y col 1987). En relacin al cortisol plasmtico, los resultados muestran que no hubo diferencia en los niveles plasmticos al nacimiento entre los tres grupos. Estos resultados concuerdan con los de Manikkam y col (2004) quienes no encontraron diferencias significativas en los niveles del cortisol circulantes entre las borregas controles y las tratadas prenatalmente con testosterona. En el presente estudio no se observ una correlacin entre peso al nacimiento y las concentraciones de cortisol, tomando en cuenta el total de recin nacidos o separados segn el tratamiento de la madre. No obstante lo anterior, si se usa el valor de cortisol promedio de cada grupo como un lmite de corte, se encontr una relacin inversa entre peso al nacimiento y peso corporal en los recin nacidos EPT-P1. Esto ocurre slo si se separa por cortisol y esta correlacin no se repite en los recin nacidos de hembras control o nacidos de madres EPT-P2. En recin nacidos humanos se ha determinado que aquellos nios pequeos para la edad gestacional tienen mayor concentracin de cortisol en la sangre del cordn umbilical que los nios adecuados para la edad gestacional (Economides y col 1988), lo cual sugiere que habra una relacin entre el peso al nacimiento y las concentraciones de cortisol. Si se considera que el menor peso al nacimiento es el resultado final del crecimiento fetal en el tero, el cual depende principalmente de la disponibilidad de nutrientes, es posible suponer que hembras nacidas de madres EPT-P1 tuvieron menor disponibilidad de nutrientes que las hembras nacidas de hembras EPT-P2. Las razones de este fenmeno se desconocen, pero se ha demostrado en la oveja preada que un aumento del cortisol induce una reduccin en el nmero de clulas binucleadas de la placenta productoras del lactgeno placentario (Ward y col 2002), lo cual puede comprometer la disponibilidad del lactgeno placentario necesario para el crecimiento fetal por sus efectos en la particin de nutrientes y en las concentraciones de IGF-1 fetal (Braun y col 2007). El cortisol es un factor relevante para la maduracin fetal (Fowden y col 1998, Dwyer y col 2006) y para el aumento de la produccin de triyodotironina (T3) en el feto. Esto ltimo prepara al feto para el aumento en la demanda metablica y la termognesis que ocurren al nacimiento (Dwyer y col 2006). A su vez, las hormonas tiroideas promueven el desarrollo fetal y actan como signos de disponibilidad de energa (Fowden y Forhead 2004). En la oveja, las hormonas tiroideas presentes en el plasma fetal derivan principalmente de fuentes fetales (Fowden y Forhead 2004). La triyodotironina se produce 49

SE RECABARREN y col

a partir de la tiroxina (T4) en el tejido adiposo pardo por la enzima 5-monodeyodinasa, cuya actividad aumenta durante los ltimos meses de preez. Las concentraciones de T3 no se diferenciaron entre los grupos, mientras que la concentracin plasmtica de T4 fue menor en las hembras nacidas de madres EPT-P1. Mellor y Pearson (1977) describieron una menor concentracin de T4 en recin nacidos durante las primeras 24 horas postparto con restriccin del crecimiento fetal por disminucin del tamao de la placenta de las ovejas madres. En un estudio de Dwyer y col (2006), la T3 plasmtica se relacion significativamente con el peso al nacimiento durante las primeras 24 horas de vida, pero no despus de esto. Los corderos de mayor peso tenan concentraciones plasmticas mayores de T3 y T4 (Dwyer y col 2006). Esta asociacin entre peso al nacimiento y T4 concuerda con nuestros datos. En primer lugar porque, a lo menos en las hembras, un alto valor de T4 coincidi con un peso mayor. Y en segundo lugar porque las hembras recin nacidas EPT-P1 presentaron una concentracin promedio de T4 ms baja que el resto de los grupos, y esas hembras tuvieron el menor peso promedio al nacimiento, aun cuando no encontramos una correlacin directa entre ambas variables como en las hembras control. Las concentraciones de T3 y T4 fueron iguales entre los otros grupos ya que no diferan en el peso al nacer, lo que significara que metablicamente no habra diferencia entre los grupos. Este estudio confirma la hiptesis planteada en relacin a que las cras hembras expuestas prenatalmente a un exceso de testosterona durante su gestacin exhiben diferencias en parmetros biomtricos y endocrinos, tales como: distancia entre ano-meato urinario, peso al nacimiento y concentraciones de tiroxina (T4) en relacin a las hembras nacidas de madres controles. En consecuencia, se puede inferir que el mayor impacto de la exposicin prenatal a testosterona se produce en la hembra recin nacida. Las hembras presentan virilizacin de los genitales externos y dependiendo de la dosis y la duracin de la EPT presentan menor peso al nacimiento y una menor concentracin plasmtica de T4. Sin embargo, en los otros parmetros biomtricos y hormonales estudiados no se encontraron diferencias estadsticas entre cras de madres control y cras nacidas de madres expuestas a un exceso de testosterona, lo cual descarta efectos de la testosterona en la madre. Esto sugiere que el mayor impacto del exceso de testosterona en el feto y recin nacido se relaciona con la masculinizacin de las hembras. Aparentemente, la EPT no influira en los parmetros estudiados en machos EPT, sin embargo, efectos de largo plazo no se pueden descartar. RESUMEN
Se estudiaron parmetros biomtricos y endocrinos de cras recin nacidas de ovejas Suffolk Down expuestas prenatalmente a un exceso de testosterona (EPT) durante 60 das (EPT-P1, n = 16) y 90 das (EPTP2, n=12), a partir del da 30 de preez. Las madres control (n =32) recibieron aceite vegetal. Al momento del parto se registraron: hora del

parto, nmero de cras por madre y sexo de las cras. Ocho horas postparto se registraron: las caractersticas de los genitales externos, distancia ano-meato urinario (DAM) y peso corporal. Se determin concentracin plasmtica de cortisol, T3 y T4, por radioinmunoensayo. Hora del parto, nmero y sexo de las cras fue similar entre los grupos. Las hembras nacidas de madres con EPT-P1 y EPT-P2 exhibieron genitales masculinizados con presencia de un pene y un escroto vaco. Las hembras nacidas de madres EPT-P1 presentaron menor peso al nacimiento que las hembras y machos control y hembras nacidas de madres EPT-P2 (P < 0,05), DAM semejante a los machos (P<0,01) y menor concentracin de T4 que los otros grupos (P<0,05). Adems presentaron una relacin inversa entre cortisol plasmtico y peso corporal. Las hembras nacidas de madres EPT-P2, con excepcin de la masculinizacin de los genitales, no se diferenciaron de las hembras nacidas de madres control. Los parmetros biomtricos y endocrinos de los machos no mostraron diferencias entre los tres grupos. Concluimos que la EPT produce masculinizacin de los genitales de hembras y, dependiendo de la concentracin de testosterona, la EPT puede disminuir las concentraciones plasmticas de T4 en las hembras. La EPT no influye en parmetros biomtricos y endocrinos de machos recin nacidos.

AGRADECIMIENTOS
Los autores expresan sus agradecimientos a los alumnos de pregrado de la carrera de Medicina Veterinaria de la Universidad de Concepcin, Chilln, quienes colaboraron en la coleccin de los datos de los partos. Al Dr. Jos F. Cox y colaboradores del Laboratorio de Biotecnologa de la Reproduccin por el seguimiento ecogrfico. Este trabajo fue financiado por Proyecto Fondecyt 1050915.

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TESTOSTERONA, MASCULINIZACIN, HORMONAS TIROIDEAS, PROGRAMACIN FETAL

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Arch Med Vet 41, 53-59 (2009) ORIGINAL ARTICLE

Evaluation of clinical and pathological characteristics of 155 canines with mammary tumours: a retrospective study
Evaluacin de caractersticas clnicas y patolgicas de 155 caninos con tumores mamarios: un estudio retrospectivo
BH Sontasa*, H Ozyogurtcub, A Gurelb, H Ekicia
aDepartment bDepartment

of Obstetrics and Gynaecology, Faculty of Veterinary Medicine, Istanbul University, Avcilar, Istanbul, Turkey. of Pathology, Faculty of Veterinary Medicine, Istanbul University, Avcilar, Istanbul, Turkey.

Resumen En este estudio se evaluaron en forma retrospectiva las caractersticas clnicas y patolgicas de 155 perras con tumores mamarios. 55% de los animales con tumores mamarios eran Poodle (83 pacientes). La edad promedio al momento de la excisin del tumor fue de 10,30,2 aos, mientras que el tiempo transcurrido entre la deteccin del tumor y tratamiento del paciente fue de 308 38,5 das. 46 de las 119 perras haban parido al menos una vez y 22 de 59 haban presentado un historial con falsa preez. Adems, 2% de los animales haban presentado tumores de origen vulvar o vaginal. 212 tumores fueron removidos quirrgicamente y de ellos, 78,3% eran malignos, 12,3% resultaron benignos, 8% eran cambios hiperplsicos y 1,4% eran tumores no clasificados. No hubo asociacin significativa entre el tipo histopatolgico de los tumores mamarios y edad, raza, ubicacin y duracin del tumor, estado reproductivo, historial de preez o pseudopreez. Key words: canine, mammary neoplasia, age, breed, histopathology. Palabras clave: caninos, neoplasia mamaria, edad, raza, histopatologa.

Introduction Mammary gland is a modified sweat gland which is the second most common site for tumour development after the skin in dogs (Dorn et al 1968, Schneider et al 1969, Schummer et al 1981, Moulton 1990). At 9 to 11 years of age, dogs have maximum risk of developing mammary tumours (MTs) although the risk rises at the age of 6 to 7 years which is defined as the cancer age (Schneider 1970, Moulton 1990). Hormonal influences, obesity at a young age and intake of red-meat or home-made diet were determined to increase the risk of tumour development (Schneider et al 1969, Briggs 1980, Sonnenschein et al 1991, Bruun 1997, Alenza et al 1998, Alenza et al 2000). Factors like number of pregnancies, history of false pregnancies, regularity of oestrous cycles, number of litters or puppies and their size were found to be unrelated to the development of MTs (Brodey et al 1966, Schneider et al 1969, Schneider 1970). Retrospective studies investigating epidemiologic, clinical and pathologic features of MTs in dogs have been previously published (Brodey et al 1966, Dorn et al 1968, Schneider 1970, Mulligan 1975, Priester 1979, Boldizsar et al 1992, Hellmen et al 1993, Itoh et al 2005, Zatloukal et al 2005). However, according to the place

where the study was conducted or due to the different classification systems used, features like breeds of dogs at high or low risk and the ratio of benign or malignant tumours varies among the reports. Therefore, the objective of the retrospective study presented here was to identify clinical and pathological characteristics of 155 reviewed canine mammary tumour cases. Material and Methods A total of 328 bitches with MTs were clinically examined and surgically treated at the Department of Obstetrics and Gynaecology, between January 1, 2000 and January 1, 2005. Only the animals with histopathologic diagnosis were included in this study (n=155). Breed, age, location of affected mammary glands, tumour size (maximal diameter of the tumour), number of days between the time the tumour was first determined and the time the patient was presented, reproductive history (spaying status, age at spaying, whelping and history of false pregnancy), application of any kind of exogenous hormones and type of surgery (simple mastectomy or radical mastectomy) were obtained from review of medical records or phone calls to the owners. Histopathological examination of the tumours was performed at the Department of Pathology. Histological classification of the samples were performed according to World Health Organization (WHO) classification for mammary tumours of the dog (Misdorp et al 1999). However, in addition to WHO classification, malignant mix 53

Accepted: 27.08.2008. * bhsontas@istanbul.edu.tr, bhsontas@gmail.com

BH SONTAS ET AL

tumour was used for the tumours containing both epithelial elements and cartilagenous or osseous components. (Moulton 1990, Helmen et al 1993, Funakoshi et al 2000, Restucci et al 2000). In 2006, the owners were contacted for additional follow-up information.
Statistical methods

Statistical analysis were performed using statistical packages for social sciences for Windows 11.5 package program (SPSS 2004). The effects of breed, age, location of the tumour and reproductive status on tumour type were analyzed using Kruskal-Wallis test. The effect of type of surgery on survival time was analyzed with x test. The correlation between the size of the tumour and survival time was analyzed using the Mann-Whitney U test. Survival time was defined as the time from surgery to death, was analyzed using Kaplan-Meier method and were compared using the log-rank test between dogs grouped according to factors as follows; age (< 10 vs 10 years), breed (Poodle vs other breeds), reproductive status (spayed vs intact), number of tumours (single vs multiple), maximal diameter of tumours (< 5 vs 5 cm), type of surgery (simple mastectomy vs radical mastectomy), histological diagnosis (benign vs malignant), (< 6 vs 6 months), the use of exogenous hormones (yes vs no), whelping (yes vs no) and history of pseudopregnancy (yes vs no). Results In the present study, it was determined that some of the information was not recorded or could not be followed-up by telephone. As seen in table 1, 22 different breeds (excluding mixed breed dogs) were represented in 155 dogs and Poodle was the most commonly affected breed with 83 cases determined in this study. The mean age of 150 dogs at the time of examination was 10.3 0.2 years, with a range of 4 to 17 years (figure1). However, age at detection of the tumour was 9.37 0.27 years with a range of 3 to 15 years in 93 dogs. Duration of tumour growth was recorded in 91 dogs which was between 2 and 1,460 days with an average of 308 38.5 days. The mean age of dogs with benign tumours at the time of examination was 9.38 0.48 years while for those with malignant tumours it was 10.15 0.23 years. Dysplasia or hyperplasia was diagnosed at the mean age of 9.6 0.81 years. However, no significant difference (P < 0.05) was found between the ages of animals diagnosed with dysplasia/hyperplasia or benign or malignant tumours. Location of the tumour was recorded in 88 cases. The mammary glands involved by 133 tumours were as follows: thoracical (22.5%), abdominal (30.1%) and inguinal (47.4%). The ratio of malignant tumours in thoracal, abdominal and inguinal mammary glands were 89%, 70% and 79%, respectively. The size of 82 tumours varied from 0.5 cm 54

to 18.0 cm with an average of 3.58 0.34 cm. Malignant tumours (n = 74, size = 5.5 0.47 cm) were larger than benign tumours (n = 8, size = 3.07 1.03 cm) without statistical significance (P < 0.05). All the dogs with MTs were female and 92 of 121 dogs (76%) were sexually intact at the time of examination. Regarding the spayed bitches (24%), spaying was performed in 1 animal at 9 months old; in 3 at 2 years; in 1 each at 4, 5, 7, 12 and 13 years; in 4 at 6; in 2 at 8; 3 each at 9 and 10 years and in 8 animals at unknown time. The owners of two animals, indicated that one of the ovaries was not removed at the time of spaying. Fourty-six out of the 119 (38%) dogs had whelped at least once in their life-time. Out of the 82 dogs, six had a history of hormonal treatment in which steroid hormones were used in two dogs for the treatment of skin diseases and oestrogen was used in one bitch to terminate pregnancy. In three dogs the reason of the use was not identified. Pseudopregnancy was recorded in 22 of 59 bitches. Three out of 155 animals (1.9%) with mammary tumours also had vulvar (1 dog) and vaginal (2 dogs) tumours of myoma, fibropapilloma and leiomyoma. Two hundred and twelve tumours were surgically removed since 57 out of the 155 dogs were presented with more than one tumour. Of the 212 tumours, 78.3% were malignant tumours, 12.3% were benign, 8.0% were hyperplastic changes and 1.4% were unclassified tumours. Follow-up information was obtained from the owners of 65 dogs in which 32 died because of related, unrelated or unknown causes. Of the 32 dogs, death was unrelated with mammary tumours (pyometra, hypothyroidism, ingestion of foreign body, paresis, nasal tumour, fall and lethargy) in seven animals, recurrence in two and respiratory disease in seven. Euthanasia was reported in four animals due to recurrence and in two dogs due to undetermined reasons. The cause of death of the remaining 10 animals was not reported. No necropsy was performed or reported in any animal. The average postmastectomy survival time was 331 64 days for 32 dogs. Median survivals for 32 dogs with malignant and benign tumours were 304 and 575 days, respectively. The survival rates of animals that had radical mastectomy (n = 20) were higher than those in dogs that had simple mastectomy (n = 38) although there were no significant differences (P < 0.05). No significant relationship (P < 0.05) was found between the histologic diagnosis of the mammary tumours and breed, age, duration, location or size of the tumour, reproductive history including spaying status, pregnancy or pseudopregnancy and application of exogenous hormones. Discussion In the present study, a total of 155 bitches with MTs that were surgically treated at the Department of Obstetrics and Gynaecology were evaluated retrospectively to explore

CANINE, MAMMARY NEOPLASIA, HISTOPATHOLOGY

Table 1.

Breed distribution of 155 dogs with mammary tumours.


Distribucin de razas de 155 perras con tumores mamarios.

Breed

Number of dogs 83 11 10 6 5 5 5 4 4 1 1 1 1 1 1 1 3 2 1 1 1 1 1 5 155

Number of tumours 112 17 12 8 9 7 5 6 9 1 1 1 2 1 1 1 3 2 1 1 4 1 1 6 212

Number of dogs Number of dogs with benign with malignant tumours tumours 11 1 2 1 1 0 0 1 2 0 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 2 0 0 2 26 93 14 8 7 8 7 4 4 4 1 0 0 2 1 1 1 2 2 1 1 1 1 1 2 166

Number of dogs with hyperplasias/ dysplasias 8 2 1 0 0 0 0 1 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 17

Number of dogs with unclassified tumours 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 3

Poodle Cocker Spaniel Mixed breed Boxer Miniature Pinscher German Shepherd Rough Collie Anatolian Shepherd dog Pekingese Great Dane Miniature Spitz Golden Retriever Beagle Samoyed Caucasian Sheep dog Dachshund Irish Setter Pointer Doberman Pinscher English Setter Dalmatian Chihuahua Tibetian Terrier Unknown Total

clinicopathologic characteristics of MTs in female dogs. Despite the fact that 328 female dogs with MTs were treated between 2000 and 2005, histopathologic identification could not be made in all cases due to the owners financial constraints. Mammary tumours were determined in 22 different purebred dogs. Poodle was the most commonly affected breed although sporting dogs including Pointers, Retrievers, English Setters and Spaniels were reported to have a higher frequency (Priester 1979, Moulton 1990). This may be related to the fact that small or miniature dogs, especially poodles, are the dominant house-hold pets in this region compared to medium or large sized dogs. Therefore, we agree with the belief that breed predisposition varies due to the pet population (Alenza et al 2000). Mean age at detection of the tumour was 9.37 years with a range of 3-to-15 years. However, duration of the tumour before presentation was between 2 and 1460 days with an average of 308 days which means that the dogs were brought approximately a year after the detection of

the mass by the owner. Because of this reason the mean age at the time of examination was 10.3 years (range 4-to-17) which is in accordance with the ages reported in several studies (Schneider 1969, Boldizsar et al 1992, Zatloukal et al 2005). Both in our study and in the study by Chang et al (2005), dogs were examined and treated more or less a year after the detection of the mass. It is our opinion that some private practitioners prefer to wait until the tumour becomes big in size before referring the patient or establishing a treatment plan. In addition, we also believe that the owners disregard the disease or postpone the examination if no signs of pain or suffering are observed in their animal. This hypothesis was supported by a study (Alenza et al 2001) in which dogs with inflammatory carcinoma suffering from generalized weakness, signs of pain and inflammatory changes, were examined and treated approximately 55 days after the perception of the clinical signs by the owner. Benign tumours occured one to two years earlier than malignant tumours which coincides with the findings of 55

BH SONTAS ET AL

Number of dogs

30 20 10 0

Table 2. Histologic types and number of tumours presented between 2000 and 2005.
Tipos histolgicos y nmero de tumores presentados entre los aos 2000 y 2005.

10

11

12

13 14

15 16

17

Number of tumours 166 60 32 25 23 12 5 4 3 1 1 26 10 7 6 3 3 1 1 1 17 9 6 1 1

Histologic diagnosis Malignant Tumours Simple carcinoma Complex carcinoma Malignant mixed tumour Carcinosarcoma Osteosarcoma Noninfiltrating (in situ) carcinoma Other sarcomas Fibrosarcoma Spindle cell carcinoma Squamous cell carcinoma Benign Tumours Benign mixed tumour Adenoma Fibroadenoma Duct papilloma Unclassified Tumours Mast cell tumour Lipoma Osteochondrom Hyperplasias/Dysplasias Duct ectasia Adenosis Endrinopathy Osteoma

% 78.30 28.30 15.09 15.06 13.85 5.66 2.36 1.89 1.42 0.47 0.47 12.27 4.72 3.30 2.83 1.42 1.41 0.47 0.47 0.47 8.02 4.25 2.83 0.47 0.47

Age at examination (Years) Number of dogs


30 20 10 0 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Age at rst occurence (Years) Total number of dogs Unclassi ed Malignant Benign Hyperplasia/dysplasia

Figure 1. Age distribution of dogs with mammary tumours at surgery and at first occurence.
Distribucin de la edad de perras con tumores mamarios, en ciruga y en primera ocurrencia.

previous studies (Moulton 1990, Zatloukal et al 2005). In two reports (Miller et al 2001, Zatloukal et al 2005) the mean age of dogs with dysplastic or hyperplastic changes were determined to be 6.1 and 8.3 years, respectively, which contrasts with the mean age found in the present study (9.6 years). In our opinion, this could be related to the delayed presentation of the patients because of the previously mentioned reasons. The mean age of the dogs with malignant tumours was 10 years which is in correspondance with the mean age of dogs with malignant mammary tumours in the other studies (Moulton 1990, Zatloukal et al 2005). Growing age is highly related with malignancy due to accumulation of tumourogenous factors leading to malignant tumours by advancing age (Zatloukal et al 2005). Tumour development was most commonly determined in inguinal mammary glands which is in accordance with previous studies (Mulligan 1975, Moulton et al 1986, Moulton 1990, Miller et al 2001, Vural and Aydn 2001). The reason of the increased frequency in the last two glands is unknown, however, several explanations such as presence of larger mass of tissue, or greater proliferative change in response to oestrogen in the most caudal glands have been suggested (Moulton et al 1986, Moulton 1990). Furthermore, hyperplastic nodules which occur most commonly in the last two glands, are considered the beginning stages of tumourogenesis (Moulton et al 1986, Hellmen 1996). Reproductive history of the bitches reported here was similar to those documented elsewhere (Brodey et al 1966, Schneider et al 1969, Priester 1979). Most bitches were sexually intact which may suggest that the risk of tumour 56

development may be higher in intact bitches than in spayed bitches (Frye et al 1967). One of the most interesting findings in the present study was, two animals with ovarian remnant syndrome that had mammary tumours, which is not indicated previously. No significant correlation was found between the development of MTs and pregnancy or pseudopregnancy that corresponds well with the studies by Brodey et al (1966) and Schneider et al (1969). Although, the incidence of mammary gland tumours may increase when progestagens and oestrogens are used at high dosages or at the wrong time or at prolonged administration, in this study, the use of progestagens was not recorded in any animals (Briggs 1980, Van Os et al 1981, Bruun 1997). This is probably related with less attraction of the private practitioners to the use of hormonal contraception in small animal practice in this region.

CANINE, MAMMARY NEOPLASIA, HISTOPATHOLOGY

Figure 2. A 7 year-old, sexually intact, Chihuahua bitch presented with a small mass in the inguinal mammary gland. The mass was histopathologically diagnosed as simple carcinoma.
Perra Chihuahua de 7 aos de edad, sexualmente intacta, presentando una pequea masa en la glndula mamaria inguinal. La masa fue histopatolgicamente diagnosticada como carcinoma simple.

Figure 3. An 8 year-old, sexually intact, Terrier bitch was presented with a 4 months history of a large mass as big as a baby head in the inguinal mammary gland. The dog was euthanized due to the inoperable size of the mass. Histopathological diagnosis of the mass was not determined because neither a necropsy nor a biopsy has been permitted.
Perra Terrier de 8 aos de edad, sexualmente intacta, presentando un historial de 4 meses con una masa tan grande como la cabeza de un beb en la glndula mamaria inguinal. Se le aplic eutanasia debido al tamao inoperable de esta masa. El diagnstico histopatolgico de la masa no fue determinado, ya que ni la necropsia ni la biopsia fueron permitidas.

Figure 4. Malignant mix tumour in the left inguinal mammary gland of a 4.5 year-old, sexually intact, German shepherd bitch. Atypical gland epithelial cells located adjacent to cartilagenous component is shown. (Haematoxylin and eosin X 400).
Tumor mixto maligno en la glndula mamaria izquierda de una perra pastor alemn de 4,5 aos de edad, sexualmente intacta. Se observan clulas epiteliales glandulares atpicas ubicadas en forma adyacente al componente cartilaginoso.

Figure 5. Simple carcinoma (tubulopapillary carcinoma) in a 9 year-old, sexually intact, mixed-breed dog. Various sized tubular structures and branching tubules are demonstrated. (Haematoxylin and eosin X 400).
Carcinoma simple (carcinoma tubulopapilar) en una perra de raza mixta de 9 aos de edad, sexualmente intacta. Se observan estructuras tubulares de varios tamaos y tbulos ramificados (Hematoxilina y eosina X 400).

The aims of determining the survival time following the surgery and the effects of investigated variables such as tumour size or type of surgery on survival failed because of several reasons. First of all, follow-up information was obtained from 65 of 155 owners which was evaluated as a small sample number to make a clear statement. In addition to this, in 7 of 31 dogs, the cause of death was unrelated to MTs like pyometra, hypothyroidism or ingestion of foreign body. Moreover, it was clearly observed that after the surgical removal of the tumours, the animals were

examined in private clinics for subsequent diseases which prevented us to follow-up the patients and to perform necropsies on them. The data of survival time found in the present study should be considered only descriptive because of the low sample number and of the low power of the statistical analyses. 57

BH SONTAS ET AL

Histopathological diagnosis of MTs is crucial in prediction of tumour behaviour after surgical excision. Moreover, histopathologic typing of the tumour is also important in establishing a post-operative chemotherapy plan to increase the survival time following the surgery since several protocols have been used with success in dogs (Karayannopoulou et al 2001). Various classification systems (Hampe and Misdorp 1974, Gilbertson et al 1983, Misdorp et al 1999) have been developed to estimate the prognosis of the disease. However, because of the lack of a standart criteria to differentiate benign from malignant tumours, the incidence of malignant tumours varies widely from 39 to 91 per cent according to different reports (Priester 1979, Nerurkar et al 1989, Hellmen et al 1993, Vural and Aydn 2001, Martins et al 2002, Itoh et al 2005, Zatloukal et al 2005). In the current study, the histologic ratio of malignant to benign tumours was approximately 7:3 which is in accordance with those determined in most studies (Priester 1979, Nerurkar et al 1989, Hellmen et al 1993, Vural and Aydn 2001, Martins et al 2002, Itoh et al 2005) whereas, in contrast to Misdorp et al (1999). This interesting regional difference may be due to a) the duration of the growth before the diagnosis; b) the age of the dogs; and c) high prevelance of unspayed animals. In five dogs presented with more than one tumour, the histological diagnosis of each mammary mass was determined to be different. This means that a dog presented with multiple mammary tumours may have benign and malignant tumours at the same time, which also confirms the importance of histological examination. The average time from the detection of the tumour to presentation was approximately 308 days which is a sufficient time for transitions between dysplasias, benign tumours and carcinomas. According to Hellmen (1996), hyperplastic and preneoplastic nodules exist in the mammary gland which may become tumourous lesions by time. And also, dysplastic or hyperplastic changes in the mammary glands are considered preneoplastic that are the initial stages in the multi-step process of tumourogenesis (Schneider et al 1969, Hellmen 1996). The low incidence of dysplastic or hyperplastic changes compared to benign and malignant tumours is in accordance with previous studies which may also be associated with the time of consultation that seems to occur late in progress of the disease (Vural and Aydn 2001, Martins et al 2002, Zatloukal et al 2005). Finally, this study demonstrated that in the bitch, mammary tumours occur most commonly in the last two glands of small breed dogs at the age of 10 to 11 years and the nature of the tumours is histologically malignant. Summary
In the present study, clinical and pathologic features of 155 bitches with mammary tumours were evaluated retrospectively. Fifty-five per cent of the animals with mammary tumours were Poodles (83 patients).

Mean age at the time of tumour excision was 10.3 0.2 years and days between the time the tumour was first determined and the time the dog was presented were 308 38.5 days. Fourty-six of the 119 dogs whelped at least once and 22 of 59 dogs had a history of false pregnancy. Two per cent of the animals also had tumours of vulvar and vaginal origine. Two-hundred and twelve tumours were surgically removed and out of the 212 tumours, 78.3% were malignant, 12.3% were benign, 8.0% were hyperplastic changes and 1.4% were unclassified tumours. No significant association was found between the histopathological type of mammary tumours and age, breed, location and duration of the tumour, reproductive status, history of pregnancy or pseudopregnancy.

Acknowledgement
The authors are grateful to Assoc. Prof. Dr. Blent Ekiz (Department of Animal Breeding and Husbandry, Faculty of Veterinary Medicine, Istanbul University) for the statistical analysis.

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CANINE, MAMMARY NEOPLASIA, HISTOPATHOLOGY

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Arch Med Vet 41, 61-66 (2009) ARTCULO ORIGINAL

Estudio comparativo de la prstata en perros mediante ecografa transrectal y transabdominal


Comparative study of the canine prostate using transrectal and transabdominal ultrasonographic techniques
J Thibaut*, J Santander, M Mieres
Instituto de Ciencias Clnicas Veterinarias, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile.

Summary The purpose of this study was to compare the use of transrectal and transabdominal ultrasonographic techniques for the examination of the canine prostate gland. Twenty healthy male dogs, from 1.5 to 10 years old, weighing between 15 and 35 kg were used. They were anesthetised intravenously with Xylazine and Ketamine. The transrectal ultrasound was performed using a 7.5 MHz linear transducer and the transabdominal ultrasound with a 7.5 MHz sector transducer. The parameters compared with both techniques were: detection of the prostate gland, its length, width echogenicity and echotexture. The transrectal technique allowed the detection of the prostate gland in all cases. The transabdominal technique achieved 4 complete images, 11 incomplete images and in 5 cases the prostatic gland was not detected at all. Significant differences in prostatic length and width were found comparing both techniques. The gland was longer with the transrectal technique and wider with the transabdominal method. There were no differences between both techniques when comparing the echogenicity and echotexture. However the obtained image detail was better with the transrectal technique. It can be concluded that the transrectal technique gives better information regarding prostatic size than the transabdominal technique. The transrectal technique is rarely used, because a rectal probe and general anesthesia are required. In dogs, both techniques are important and complementary in order to determine prostatic image. Palabras clave: ecografa, transrectal, transabdominal, prstata, caninos. Key words: ultrasonography, transrectal, transabdominal, prostate, canines.

Introduccin La prstata es la glndula accesoria ms importante del perro macho (Kirk 1995, Johnston y col 2001). Es una glndula bilobulada que envuelve a la uretra caudal al cuello de la vejiga urinaria (Swinney 1998). Su ubicacin es retroperitoneal. Est dorsalmente rodeada por el recto y ventralmente se encuentra en contacto con la snfisis pbica (Root-Kustitz y Klausner 2000). El tamao y peso de la prstata varan dependiendo de la edad, raza y peso corporal del perro (Selcer 1995). Su posicin se relaciona con el grado de distensin de la vejiga, la presencia de alguna patologa y la edad del animal (Snchez y Cortese 1994). En el animal joven se ubica en la pelvis mientras en el perro adulto su posicin es ms craneal (Loriot y col 1997). Durante la vida del perro el desarrollo de la prstata se puede dividir en tres etapas. La primera corresponde al perodo de embriognesis y del desarrollo postnatal inmediato y finaliza cuando el animal tiene 2-3 aos. La segunda consiste en una fase de desarrollo hipertrfico exponencial que es dependiente de los andrgenos y termina

Aceptado: 17.09.2008. * Casilla 567, Vadivia, Chile; jthibaut@uach.cl

cuando el animal tiene 12 a 15 aos. En la ltima etapa se observa una involucin senil, que comienza cuando la produccin de andrgenos disminuye (Berry e Isaacs 1984, Verstegen 1999). El crecimiento de la prstata es andrgeno dependiente (Purswell y col 2000), la castracin lleva a disminuir el volumen prosttico, con atrofia de la glndula y elementos estromticos, y disminuye la habilidad para aceptar y metabolizar andrgenos (RootKustitz y Klausner 2000). La principal regulacin andrgena del crecimiento prosttico est dada por la 5 alpha-dihidrotestosterona (5 alpha-DHT), que es formada desde la testosterona por la enzima 5 alpha reductasa. Tanto 5 alpha-DHT como la testosterona comparten el mismo receptor intracelular. La 5 alpha-DHT produce un efecto mayor porque sta se une al receptor con una afinidad dos veces mayor que la testosterona y posee una tasa de disociacin cinco veces menor que testosterona (Cohen y col 1995, Susuki y col 1998a, Root-Kustitz y Klausner 2000). Las patologas de la prstata son comunes y suelen tratarse de procesos de origen infeccioso, hormonal, anatmico o embriolgico. Se ha observado un incremento de incidencia conforme aumenta la edad del animal y podra estar relacionado con el hiperdesarrollo fisiolgico del rgano, bajo la influencia de los andrgenos (Verstegen 1999). 61

J THIBAUT Y COL

Tanto andrgenos como estrgenos deben estar presentes para producir una hiperplasia/hipertrofia significativa. Perros viejos con hiperplasia prosttica benigna (HPB) han demostrado que secretan 40% menos testosterona, 15% menos de 5 alpha-DHT y 60% ms estradiol que los perros normales. Esta alterada relacin estrgeno:andrgeno sensibiliza la prstata de manera que los estrgenos priman. Los estrgenos pueden aumentar el nmero de los receptores de andrgenos en el tejido prosttico y pueden formar metabolitos con actividad de radicales libres que daan el tejido prosttico alterando su respuesta a la 5 alpha-DHT (Root-Kustitz y Klausner 2000). El examen de la prstata debera ser de rutina en perros mayores de cinco aos. La observacin clnica, palpacin rectal y abdominal ayudan a diagnosticar posibles patologas prostticas, adems de un examen radiogrfico y ecogrfico que pueden mostrar aumento de tamao con o sin alteracin de la estructura (Antelo 2002). El estudio ultrasonogrfico del tracto reproductivo del perro es un procedimiento til, seguro y no invasivo que permite acceder a la prstata canina (Johnston y col 1991, Nyland y Matoon 1995). El examen ecogrfico de la prstata se facilita por la presencia de lquido en la vejiga urinaria. Esto puede conseguirse evitando la miccin o rellenndola de solucin salina isotnica mediante una sonda uretral (England 1995). El rol del ultrasonido en enfermedades reproductivas radica en su capacidad para detectar anormalidades anatmicas y la capacidad de realizar procedimientos para tomar muestras de tejido que nos entreguen un diagnstico definitivo (Nyland y Matoon 1995). Para la ecografa de la prstata va transabdominal son indispensables sondas sectoriales, ya que su posicin intraplvica reduce la va de abordaje. La prstata es bastante superficial y es preferible una frecuencia de 7,5 MHz, para obtener una buena imagen. Sin embargo, una sonda de 5 MHz permite tambin obtener imgenes de calidad, pero no posee suficiente resolucin para la ecografa de la prstata en perros pequeos (Loriot y col 1997). La mejor resolucin de imgenes de la glndula prosttica es obtenida va transrectal (Miles 1989). La prostatomegalia canina usualmente resulta en un desplazamiento de sta hacia el abdomen caudal, lo que provee un fcil acceso por la va transabdominal (Selcer 1995). Puede ser difcil tomar imgenes cuando la glndula se encuentra alojada dentro de la pelvis; en ese caso, el transductor puede ser colocado en el recto del animal y dirigido ventralmente para obtener imgenes de la prstata caudal. Esta tcnica, aun requiriendo de sedacin o anestesia, es til, pues permite el examen de la porcin diseminada de la glndula prosttica, que no puede ecografiarse transabdominalmente, y que clnicamente es descuidada con frecuencia (England 1995). La ecografa transrectal no requiere de una vejiga llena (Miles 1989). La imagen de la prstata presenta un aspecto ecogrfico homogneo, con una ecogenicidad superior a la de los riones, 62

pero inferior a la del bazo. Numerosas manchas pequeas anecognicas aparecen homogneamente diseminadas en el parnquima, las que representan las zonas colectoras de las secreciones prostticas. La parte prosttica de la uretra no es visible en el perro; sin embargo, est a veces algo dilatada en perros viejos (Loriot y col 1997). La forma bilobulada de la glndula prosttica puede ser reconocida generalmente en el plano de imagen transversal (Nyland y Matoon 1995). En un corte longitudinal, la prstata tiene forma alargada (Loriot y col 1997). La forma cambia con la edad, en los cachorros es alargada, con el paso de los meses adquiere una forma redondeada, a los 1,5 a 2 aos de edad la glndula es ovalada y claramente bilobulada. Con los aos los surcos dorsal y ventral se hacen ms evidentes, con lo que en la vista transversal la prstata adquiere forma de mariposa (Fritsch y Gerwing 1996). Dado que generalmente se utiliza la tcnica transabdominal, en el presente estudio se desea comparar con la tcnica transrectal para determinar las ventajas y desventajas de cada una y as poder evaluar la conveniencia del uso de una o ambas tcnicas. Material y mtodos El estudio se realiz en el Hospital Clnico Veterinario de la Universidad Austral de Chile. Se utiliz un total de 20 perros machos mestizos clnicamente sanos, de 1,5 a 10 aos de edad y de 15 a 35 kg, los que fueron anestesiados previo ayuno de 12 horas con Xilacina1 (1mg/kg) y Ketamina2 (3 mg/kg) va endovenosa. Luego se depil la cubierta de pelo abdominal rasurando a ambos lados del prepucio hasta el escroto; seguidamente el paciente fue ubicado en decbito lateral. Para la ecografa transrectal se utiliz un Ecgrafo Pie Medical 480 provisto de un transductor lineal electrnico bifrecuencia de 5,0 / 7,5 MHz. Se coloc el transductor lineal dentro de un protector de ltex que contena gel ecogrfico en su interior, luego se lubric e introdujo por el recto del paciente hasta lograr visualizar la glndula prosttica obteniendo un corte longitudinal nico. Posteriormente se realiz la ecografa transabdominal con un Ecgrafo Pie Medical 300 S PANDION Vet, provisto de un transductor mecnico sectorial Sonda APAS de 5,0 / 7,5 MHz. Se aplic gel ecogrfico, luego se ubic el transductor perpendicularmente en la regin paraprepucial, se identific la vejiga, el cuello vesical y, siguiendo caudalmente el corte longitudinal, se localiz la prstata, que fue observada longitudinalmente. Luego de realizar ambas tcnicas ecogrficas en todos los perros con una frecuencia de 7,5 MHz se procedi a su evaluacin registrndose la visualizacin total, parcial o nula de la prstata mediante ambas tcnicas. Luego se registr el largo y alto mximo de la prstata en centmetros realizando tres
1 2

Xilacina 2% Laboratorio Agroland, Chile. Ketamina 10% Laboratorio Drag Pharma, Chile.

ECOGRAFA, TRANSRECTAL, TRANSABDOMINAL, PRSTATA, CANINOS

ecografas individuales por cada tcnica, obteniendo un promedio de las mediciones. La ecogenicidad obtenida fue evaluada y registrada, clasificndose en hipoecoica, isoecoica o hiperecoica en relacin al parnquima esplnico y la ecotextura se evalu como homognea o heterognea. Las mediciones obtenidas para el largo y alto prosttico fueron ingresadas a una planilla MS Excel y se analizaron mediante el uso de estadstica descriptiva en base a media aritmtica y desviacin estndar (DE). Se realiz una prueba de normalidad utilizando la prueba de Shapiro-Wilk y para determinar si existieron diferencias significativas entre las mediciones de largo y ancho prosttico se utiliz una prueba de t de student pareada con un nivel de significancia de P < 0,05. El programa computacional utilizado fue el Statistix versin 8.0 para Windows (Statistix 8, Copyright 1985-2003, Analytical Software, USA). Resultados
Visualizacin de la prstata va transrectal

a la sombra ecogrfica originada por la pelvis. En los perros en que la glndula fue visible se observ alargada en su corte longitudinal, de una ecogenicidad y ecotextura dependientes del caso observado. En cinco de los 20 perros ecografiados va transabdominal no fue posible observar la glndula prosttica.

De las 20 prstatas ecografiadas va transrectal se logr una buena visualizacin de la glndula en la totalidad de los casos estudiados, observndose completa, como una estructura alargada en su corte longitudinal, con una buena definicin de todos sus bordes, con una ecogenicidad y ecotextura variables, dependiendo del caso observado.

Figura 2. Imagen de un corte longitudinal de prstata en perro. Ecografia va transabdominal.


Prostatic image in a dog using transabdominal ultrasound. P, Prstata; V, vejiga; CV, cuello vesical.

En la figura 3 se observa con la tcnica transrectal la glndula prosttica completa en la totalidad de los animales, y slo en cuatro perros al utilizar la tcnica transabdominal.
Tamao prosttico

El nmero de casos utilizados para la comparacin ecogrfica fue de 15, debido a que la glndula prosttica no fue observada en cinco perros con la tcnica transabdominal.
Cuadro 1. Media aritmtica (X) DE (cm) y valor de P para las mediciones del largo y altura de la prstata en perros utilizando las tcnicas transrectal y transabdominal (n = 15).
Prostatic length and width measures in dogs using transrectal and transabdominal ultrasound.

Medicin ecogrfica (cm) Largo prosttico Altura prosttica


Ecogenicidad

Transrectal X DE 4,17 1,50 2,13 0,52

Transabdominal X DE 3,67 1,14 2,32 0,69

Figura 1. Imagen de un corte longitudinal de prstata en perro. Ecografia va transrectal.


Prostatic image in a dog using transrectal ultrasound. V, Vejiga; P, Prstata. Visualizacin de la prstata va transabdominal

0,014 0,029

De las 20 prstatas ecografiadas va transabdominal, cuatro pudieron ser visualizadas en su totalidad, esto por dificultad para definir el borde caudal de la prstata debido

La ecogenicidad de la prstata con la ecografa va transrectal se observ isoecoica en 19 casos e hiperecoica en uno. Con la ecografa transabdominal, en 15 casos se observ isoecoica y en cinco no pudo ser evaluada por no observarse la prstata. 63

J THIBAUT Y COL

25 20

20 11 4 5

15 10 5 0

Transrectal Completa

Transabdominal Tcnica ecogrfica Incompleta Nula

Figura 3. Observacin de la glndula prosttica en perros mediante las tcnicas ecogrficas transrectal y transabdominal (n = 20).
Prostatic gland observation in dogs using transrectal and transabdominal ultrasound. Ecotextura

La ecotextura de la prstata con la ecografa va transrectal fue homognea en 13 casos y heterognea en siete. La tcnica transabdominal demostr una ecotextura homognea en 10 casos y heterognea en cinco. En cinco perros la prstata no pudo ser evaluada al no observarse por esta va. Discusin
Visualizacin de la prstata va transrectal

La observacin de la glndula prosttica con este mtodo permite apreciar lesiones tanto en el borde caudal como en el craneal, as como realizar mediciones de la glndula y estimar si existe o no algn grado de hiperplasia. Como han descrito Paclikova y col (2006), las alteraciones prostticas son ms frecuentes en perros mayores de seis aos; sin embargo, han sido observadas en perros de diferentes edades y su deteccin oportuna puede lograr mantener la fertilidad del paciente y en casos extremos realizar algn tratamiento para salvarle la vida. Mosca Zohil y Castellano (1995) establecen que al encontrarse slo la pared del recto entre el transductor y la prstata la imagen obtenida permite observar alteraciones a nivel de la cpsula, que slo son visibles con este mtodo, adems de visualizar el cuello de la vejiga cuando ste no es visible con la tcnica transabdominal, permitiendo determinar neoplasias a ese nivel. Kamolpatana y col (2000) indican que las dificultades de utilizar esta tcnica estn dadas principalmente por la incomodidad que produce en los pacientes, por lo que es necesario utilizar sedacin o anestesia para su ejecucin, as como la necesidad de contar con un transductor lineal, que no es de uso habitual en la clnica de pequeos animales.
Visualizacin de la prstata va transabdominal

N casos

En los 20 perros estudiados la prstata pudo ser apreciada completa, debido a que la ubicacin preferencial de la glndula es plvica como ha sido descrito por Selcer (1995) y Gobello y Corrada (2001), similar a lo descrito en humanos por Peeling y Griffiths (1984). Esta visualizacin de la glndula concuerda con lo descrito por Mosca Zohil y Castellano (1995), Kamolpatana y col (2000) y Sasaki y col (2006) quienes mencionan que la ecografa transrectal sigue siendo el mtodo ms preciso y exacto para visualizar la prstata. Segn Gallardo de Medrano (2006), la posicin plvica de la glndula puede variar con la edad del animal, as como con el grado de distensin de la vejiga urinaria. Sin embargo, una posicin ms abdominal no dificult la observacin de la prstata en este estudio. Adems, la ecografa transrectal no necesit de una vejiga urinaria llena para visualizar con mayor facilidad la prstata, tal como lo describe Selcer (1995), a diferencia de la ecografa transabdominal. Susuki y col (1998b) sealan que la observacin completa de la prstata utilizando este mtodo se debe principalmente a que slo la pared del recto se encuentra entre el transductor y la glndula, la que no presenta inconveniente para permitir el paso de las ondas de ultrasonido, a diferencia de la tcnica ecogrfica transabdominal donde se interponen grupos musculares y la estructura sea plvica, que dificulta la visualizacin del margen caudal o incluso de la glndula completa. 64

El no visualizar la prstata en cinco casos ecografiados y obtener una observacin incompleta en 11 de ellos puede deberse a la edad de los perros. Como describe Gallardo de Medrano (2006), la prstata se encuentra en la cavidad plvica hasta aproximadamente los cinco aos, y luego por efecto hormonal pasa a ubicarse en gran parte en la cavidad abdominal. Esto se correlaciona con lo reportado por Atalan y col (1999) quienes reportan no haber observado la prstata en dos casos por esta va. Lo observado en este estudio se contradice con Mosca Zohil y Castellano (1995) quienes observaron la prstata en todos los casos mediante ecografa transabdominal, lo que puede deberse a que los perros eran mayores de seis aos y presentaban patologas prostticas. Selcer (1995) y Ruel y col (1998) coinciden en que, a diferencia de la ecografa transrectal, la visualizacin de la prstata va transabdominal tiene ciertos requerimientos, entre los cuales destacan una vejiga llena y que la glndula se encuentre en posicin abdominal. Sin embargo, resulta ser un mtodo, aunque menos preciso, seguro y conveniente ya que se puede utilizar el transductor sectorial habitualmente utilizado en la clnica de pequeos animales no siendo necesaria la sedacin del paciente.
Tamao prosttico

Si bien no se encontraron estudios que comparen la medicin de la prstata utilizando las tcnicas ecogrficas

ECOGRAFA, TRANSRECTAL, TRANSABDOMINAL, PRSTATA, CANINOS

transrectal y transabdominal en caninos, Huang Foen Chung y col (2004) realizaron esta medicin en humanos comparando el volumen prosttico, estudio que no arroj diferencias significativas; sin embargo, no se observ la glndula va transabdominal en dos pacientes, y hubo diferencias de volumen hasta de un 30% en mediciones seriadas va transabdominal. El largo prosttico significativamente mayor obtenido con la ecografa transrectal (4,171,5 cm), en comparacin con la va transabdominal (43,671,14 cm), se debe a la ubicacin de la glndula, ya que la sombra ecogrfica originada por la cavidad plvica puede dificultar o impedir la correcta visualizacin de la prstata al realizar una ecografa va transabdominal como fue descrito por Loriot y col (1997). La menor altura de esta imagen transrectal (2,130,52 cm), en comparacin con la va transabdominal (2,320,69 cm), se podra explicar por la compresin realizada en la prstata al introducir el ecgrafo en el recto. Juniewicz y col (1989) determinaron que la ecografa transrectal puede ser usada para estimar correctamente el peso prosttico, basndose en las mediciones obtenidas. En un trabajo realizado por Susuki y col (1998b) se utiliz un normograma para determinar el volumen prosttico utilizando ecografa transrectal, ya que es el mtodo ms exacto para tomar mediciones prostticas in vivo.
Ecogenicidad

Ecotextura

Aunque la calidad de la imagen obtenida fue mejor al realizar la ecografa va transrectal, la ecogenicidad observada con ambos mtodos no mostr grandes variaciones. Se observ un caso en que la ecogenicidad va transrectal fue diferente a la transabdominal, a diferencia de lo descrito por Mosca Zohil y Castellano (1995), quienes al comparar lo observado con ambas tcnicas encontraron mltiples variaciones de ecogenicidad en el parnquima prosttico, debido principalmente a que todos los animales utilizados presentaban patologas prostticas y que utilizaron un transductor de 3,5 / 5 MHz para realizar la ecografa transabdominal y uno de 7,5 MHz para realizar la ecografa transrectal. Ruel y col (1998) establecen que las variaciones ecognicas de la prstata estn dadas principalmente por patologas, si bien la ecogenicidad de la glndula tiende a variar con la edad del paciente, siendo menor en perros jvenes y mayor en perros de mayor edad. De acuerdo a Selcer (1995), entre las patologas que cambian la ecogenicidad, la ms frecuente es la HPB, en que se puede observar una glndula hipoecoica o hiperecoica; para el resto de patologas como las neoplasias, quistes prostticos o prostatitis, lo ms caracterstico es la presentacin de patrones ecognicos mixtos, observando zonas anecoicas, hipoecoicas e hiperecoicas combinadas.

Slo dos variaciones de ecotextura fueron encontradas al comparar los mismos casos con las tcnicas transrectal y transabdominal. Sin embargo, cinco casos que presentaron una ecotextura heterognea mostraron distintas caractersticas ecogrficas con una y otra tcnica, pudiendo observarse un mayor detalle y precisin con la tcnica transrectal al igual que lo descrito por Mosca Zohil y Castellano (1995), los cuales establecen que el mayor detalle observado se debe a la distancia entre el transductor y la prstata ya que solo la delgada pared del recto se interpone entre la sonda transrectal y la glndula. Las modificaciones de ecotextura de acuerdo a Ruel y col (1998) se deben en su mayora a patologas prostticas; las lesiones cavitarias no son patognomnicas y pueden verse tanto en quistes, abscesos, quistes paraprostticos, prostatitis, neoplasia o lesiones combinadas, por lo tanto el diagnstico definitivo se realiza con punciones guiadas ecogrficamente. Narayan y col (2005) describen que la ecografa transrectal junto con la resonancia magntica son tcnicas usadas para el estudio mdico de la patofisiologa prosttica. Sin embargo, la resonancia magntica es de alto costo y de escasa utilizacin en medicina veterinaria, siendo la ecografa transrectal el mtodo ms exacto. La tcnica ecogrfica transrectal permiti visualizar completamente la prstata a diferencia de la tcnica transabdominal. El largo prosttico es mayor al ser medido con la tcnica transrectal, mientras que la altura es mayor al ser medida con la tcnica transabdominal. La ecotextura y ecogenicidad son similares al comparar ambas tcnicas. Resumen
Con el objetivo de evaluar las tcnicas ecogrficas transrectal y transabdominal para el examen de la glndula prosttica en perros, se realiz un estudio en 20 perros machos enteros, clnicamente sanos, de 1,5 a 10 aos de edad y un peso de 15 a 35 kg, los que fueron anestesiados con xilacina y ketamina EV. Se realiz la ecografa transrectal en un corte longitudinal con un transductor lineal de 7,5 MHz y la ecografa transabdominal con un transductor sectorial de 7,5 MHz. Los parmetros para comparar ambas tcnicas fueron: a) posibilidad de observacin de la glndula prosttica, b) largo y alto mximo de la prstata, ecogenicidad y ecotextura prosttica. La prstata se observ en todos los casos ecografiados con la tcnica transrectal, a diferencia de la tcnica transabdominal, en que se logr obtener cuatro imgenes completas, 11 incompletas, no observndose la glndula en cinco perros. Se encontraron diferencias significativas (P<0,05) en las mediciones de largo y alto prosttico al comparar ambas tcnicas, siendo mayor el largo de la glndula prosttica con la tcnica transrectal y la altura con la tcnica transabdominal. No se encontraron diferencias al comparar la ecogenicidad y ecotextura, sin embargo, el detalle de la imagen obtenida fue mejor con la tcnica transrectal. Se concluye que la tcnica ecogrfica transrectal permiti visualizar completamente la prstata en todos los perros, a diferencia de la tcnica transabdominal, en que no siempre se observ la glndula por encontrarse total o parcialmente dentro del canal plvico. Se estima que ambos mtodos de examen son complementarios e importantes de realizar en determinados casos.

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J THIBAUT Y COL

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Arch Med Vet 41, 67-71 (2009) ARTCULO ORIGINAL

Salmo salar: morfologa ultraestructural de la pared del corion en ovas normales y con problemas de eclosin#
Salmo salar: ultrastructural morphology of chorion, from normal and with hatching problems ova
R Jaramillo*, O Goicoechea, O Garrido, E Molinari
Instituto de Embriologa, Facultad de Ciencias, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile.

Summary Either eyed alevins unable to digest the chorion or those digesting it partially, are both suffering the hard chorion phenomenon; in both cases alevins can not survive producing high mortality rates. During recent years, the salmon farming industry in Southern Chile has been facing massive mortality events caused by hard chorion. Since hard chorion is a recently observed phenomenon there are no literature reporting its origin. The aim of this study was to find differences in the ultrastructure of chorion fibers from Salmo salar ova at different stages of development by using Scanning Electron Microscopy and image analysis technique. Early results here reported indicated no differences in thickness of chorion fibers for Salmo salar ova at different stages of development, however differences in spatial arrangement of fibers forming the inner layer of chorion seem to explain the hard chorion occurrence. No pores were observed in the inner layer of chorion of ova exhibiting hard chorion as opposed to normally developed ova which have pores and allow hatching of alevins. Since choriogenin is a protein formed by a number of sub-units, it is possible that failure in synthesis of one of these sub-units might be responsable for an anomalous arrangement of fibers of chorion causing the hard chorion phenomenon. Palabras clave: Salmo salar, reproduccin, ultraestructura, corion. Key words: Salmo salar, reproduction, ultrastructure, chorion.

Introduccin El desarrollo ontogentico en peces ocurre a travs de una sucesin de estados que conducen al nacimiento del alevn durante el proceso denominado eclosin. El perodo de eclosin es la etapa en la cual el embrin emerge desde la envoltura que rodea al huevo (corion) durante el desarrollo, para constituirse en alevn con saco, el cual iniciar su fase de vida libre, primero utilizando el vitelo remanente en el saco vitelino como nutriente, para ms tarde iniciar su alimentacin externa. Durante la ovognesis, el hgado de la hembra de peces telesteos sintetiza, entre otras, una protena compleja llamada coriogenina (Darie y col 2005). Esta protena est formada por tres subunidades, las cuales son transportadas a travs del torrente sanguneo hasta llegar al ovario en donde se ensamblan para constituir una cubierta protectora denominada envoltura vitelina o corion (Celius y Walther 1998). Una vez ocurrida la fecundacin, con la finalidad de evitar la poliespermia y de proteger al embrin durante su desarrollo, se produce el endurecimiento del corion,

Aceptado: 10.09.2008. # Proyecto DID UACH 200717. * Casilla 567, Valdivia, Chile; jjaramil@uach.cl

el cual permanecer envolviendo al huevo fecundado hasta el momento en que ocurra la eclosin del alevn. Este endurecimiento parece producirse por la participacin de Ca2+ en medio cido, junto a mucopolisacridos sometidos a reacciones de oxidorreduccin, sumados a la formacin de puentes disulfuros entre las protenas del corion (Masuda y col 1992). Bajo condiciones normales, el desarrollo de los embriones ocurre al amparo de la accin protectora del corion, pero alcanzado el estado de ova con ojo comienza la produccin de enzimas de eclosin, las cuales inician el proceso de digestin de las paredes internas del corion. El adelgazamiento progresivo y considerable de esta envoltura permite que ocurra la ruptura del corion y la subsecuente salida de los alevines con saco desde su interior. Los estudios relacionados con el corion, hasta ahora conocidos, hacen referencia al proceso de endurecimiento del corion postfecundacin, a la caracterizacin de las enzimas participantes y los mecanismos involucrados en dicho proceso (Iuchi y col 1991, Masuda y col 1992, Iconomidou y col 2000, Darie y col 2005). Sin embargo, y a pesar de las evidencias qumicas y espectroscpicas que muestran cambios estructurales en la conformacin de las protenas del corion luego del proceso de fecundacin, no existen estudios que muestren las caractersticas ultraestructurales del corion previo a la fecundacin y luego de ocurrido el endurecimiento. 67

R JARAMILLO Y COL

Por otra parte, y directamente relacionado con el proceso de eclosin, se ha podido observar que en algunas pisciculturas dedicadas a la produccin de alevines de salmnidos en el sur de Chile han ocurrido fracasos reproductivos importantes debido a que un gran porcentaje de ovas con ojo de algunas cohortes no logran romper el corion. Un porcentaje menor de ovas logra romper el corion de manera parcial, por lo que una parte del cuerpo del embrin o parte de su saco vitelino eclosiona, quedando el resto del embrin o del saco atrapado al interior de la cavidad corinica, lo que lleva a la muerte del alevn. Debido a que en apariencia el corion se transforma en una barrera difcil de romper o degradar este fenmeno ha sido denominado comnmente como corion duro. Este problema ha sido reportado principalmente en ovas de Salmo salar y Oncorhynchus kisutch, pero parece ser un fenmeno generalizado entre los salmondeos, ya que tambin se ha observado en otras especies cultivadas en el sur de Chile, tales como Salmo trutta y Oncorhynchus mykiss, desconocindose hasta ahora la razn por la cual el corion es digerido de manera parcial por las enzimas de eclosin. Como este fenmeno parece ser de reciente ocurrencia, hasta el momento no existen antecedentes que expliquen el origen del corion duro. Sin embargo, y como resultado de la observacin macroscpica de los cambios que ocurren con las ovas entre el momento de su obtencin y la posterior fecundacin, es posible pensar que la organizacin estructural de las fibras proteicas que componen el corion o su distribucin se encuentren alteradas en aquellas ovas que no eclosionan o que eclosionan parcialmente. Un primer paso para entender este fenmeno sera el conocer las caractersticas de la organizacin estructural del corion normal en ovas sin fecundar y del corion de ovas postfecundacin, y luego conocer las caractersticas del corion en ovas parcialmente eclosionadas o definitivamente sin eclosionar. Material y mtodos
Recoleccin de ovas

fato, para luego ser dispuestas en una caja refrigerada y ms tarde trasladadas al laboratorio de microscopa del Instituto de Embriologa de la Universidad Austral de Chile en Valdivia. A partir del grupo de ovas que continu el desarrollo, durante la eclosin de los alevines, se procedi a recolectar el corion de aquellas ovas eclosionadas, las cuales fueron fijadas en las mismas condiciones que las anteriores. En el caso de ovas que evidenciaron la ocurrencia del fenmeno corion duro, se procedi primero a disecar el corion de los alevines no eclosionados o parcialmente eclosionados para luego proceder a su fijacin utilizando el mismo fijador. El transporte de ambos tipos de corion hasta el laboratorio de Embriologa en Valdivia se realiz segn el procedimiento ms arriba descrito.
Microscopa electrnica de barrido

Las muestras de corion fueron preparadas para su observacin a la Microscopa Electrnica de Barrido (MEB) segn el siguiente protocolo. Primero fueron lavadas en buffer fosfato, postfijadas en tetrxido de osmio al 1% en el mismo buffer, deshidratadas en una batera de alcohol y acetona, seguida de un proceso de secado al punto crtico del CO2 y montadas sobre un portaespecmenes. Finalmente fueron metalizadas por ionizacin con una capa de oro de 20 nm de espesor. La observacin de las muestras se realiz en un microscopio electrnico de barrido modelo LEO 420.
Anlisis de imgenes

Las fotografas de los diferentes tipos de corion obtenidas a la MEB fueron utilizadas para realizar un anlisis de imgenes que permiti evaluar cuantitativamente las caractersticas del corion de los diferentes tipos de ovas en estudio. En este caso se procedi a realizar mediciones del grosor del corion as como tambin de las fibras que forman la cara interna del corion. El programa utilizado para este estudio fue SigmaScan pro5 (SPSS Inc.). Resultados

Para el estudio de la ultraestructura normal del corion de ovas sin fecundar y ovas recin fecundadas se obtuvieron ovas de Salmo salar desde una piscicultura de la Dcima Regin. El corion de ovas eclosionadas y sin eclosionar se obtuvo a partir de cohortes de Salmo salar provenientes de la misma empresa y colectadas en el momento en que se present el fenmeno de corion duro.
Fijacin del corion para microscopa electrnica de barrido

El corion de ovas sin fecundar as como de ovas postfecundadas fueron fijados en terreno mediante la utilizacin de una solucin de glutaraldehdo al 2,5% en buffer fos68

El estudio de ovas sin fecundar, de ovas fecundadas, de ovas parcialmente eclosionadas y ovas sin eclosionar de S. salar a la MEB revel que el corion de todas ellas posee similares caractersticas estructurales; es decir, que en todos los casos el corion aparece como una envoltura compuesta por dos capas o estratos ntimamente asociados, seguidos de un tercer estrato que presenta una serie de porosidades formando una especie de red y que se dispone prximo a la membrana citoplasmtica del ovocito (figura 1). El estrato externo, que corresponde a la fraccin de corion que est en contacto con el medio ambiente, es de apariencia granular y corresponde a una capa fina de aproximadamente 0,2 m de espesor, que se contina con un segundo estrato (estrato esponjoso), situado inmedia-

SALMO SALAR, REPRODUCCIN, ULTRAESTRUCTURA, CORION

tamente por debajo y que est compuesto por numerosos haces de fibras proteicas ordenadamente entrelazadas. Esta disposicin permite la formacin de numerosos espacios o poros (aproximadamente 1,15 m de dimetro) que le otorgan a este segundo estrato la apariencia de una esponja derivando de all su nombre.

Figura 2. MEB de la cara interna del corion de ovas eclosionadas de Salmo salar (FP=fibras proteicas; PO=poros que se continan hacia el estrato esponjoso).
SEM view of chorions outer stratum from hatched ova of Salmo salar (FP=protein fibers; PO=pores connected to the spongy stratum).

Figura 1. MEB del corion de ovas de Salmo salar recin fertilizadas. (EE = estrato externo; EEs = estrato esponjoso; EI=estrato interno; PO=poros que se continan hacia el estrato esponjoso).
SEM chorions view of fertilized Salmo salar ova. (EE=external stratum; EEs=spongy stratum; EI=inner stratum; PO=pores connected to the spongy stratum).

El tercer estrato o estrato interno corresponde a la cara del corion que est en contacto directo con la membrana plasmtica del ovocito. Este estrato est formado por un entramado muy similar a la estructura de una red que permite la aparicin de poros. Los poros tienen su origen en el estrato esponjoso y su prolongacin hacia el estrato interno permite el establecimiento de una relacin de continuidad entre ambos estratos (figura 2), la que es caracterstica para cada especie de salmnido. A pesar de estas similitudes en la estructura del corion, se observaron algunas variaciones entre los diferentes tipos de ovas estudiadas. Estas diferencias se producen fundamentalmente al realizar mediciones del grosor del corion y del grosor de las fibras proteicas que constituyen el corion. En el caso del espesor del corion de las ovas no fecundadas este promedio lleg a los 30,5 m, mientras que en el caso de las ovas fecundadas el grosor del corion alcanz un promedio de 25,5 m (cuadro 1). En el caso del grosor de las fibras, las ovas no fecundadas mostraron un grosor 0,16 m, mientras que en las ovas fecundadas el grosor fue de 0,29 m (cuadro 1), no observndose diferencias en la disposicin espacial (entramado) de las fibras (figuras 2 y 3).

Figura 3. MEB de la cara interna del corion de ovas no eclosionadas de Salmo salar (FP=fibras proteicas). Ntese la ausencia de poros.
SEM inner stratum chorions view from not hatched ova of Salmo salar (FP=protein fibers). See homogeneous distribution of fibers and absence of pores.

El estudio del corion de ovas eclosionadas, tambin llamado corion normal, mostr un grosor del corion promedio de 25,6 m (cuadro 1), mientras que el grosor del corion de ovas que no permitieron la eclosin de alevines llamadas corion duro fue de 25,4 m. Si bien es cierto que la diferencia en el grosor del corion entre ambos tipos de ovas es mnima, la principal diferencia 69

R JARAMILLO Y COL

Cuadro 1. Valores promedios en m obtenidos para parmetros como grosor del corion y fibras del corion para los diferentes tipos de ovas de Salmo salar estudiadas mediante el anlisis de imgenes.
Thickness average values (m) obtained for both chorion and chorion fibers from different types of studied ova in Salmo salar.

Tipo de ovas Corion ovas sin fecundar Corion ovas fecundadas Corion normal Corion duro

Grosor del corion Promedio m 30,5 25,5 25,6 25,4 Desv. Std. 7,37 1,45 1,08 2,95

Grosor de las fibras Promedio m 0,16 0,29 0,18 0,25 Desv. Std. 0,052 0,099 0,058 0,083

entre ambos tipos de corion viene dada por el grosor de las fibras y por la disposicin de stas en el estrato interno (figuras 2 y 3). En el caso del corion normal, el grosor promedio de las fibras es de 0,18 m, mientras que en el caso de corion duro las fibras alcanzan un promedio de 0,25 m (cuadro 1). En el caso de las ovas normales las fibras que conforman el corion siguen el patrn de ordenamiento observado en las ovas fecundadas y no fecundadas, es decir, mantienen la estructura de una red con poros dispuestos de manera equidistante y que permiten una comunicacin entre el estrato interno y el esponjoso. El estrato interno del corion de ovas que presentan el fenmeno corion duro exhibe una disposicin regular de las fibras proteicas; sin embargo, esta disposicin est completamente alterada ya que no hay formacin de la estructura en forma de red caracterstica del corion normal, por lo cual no se aprecia la formacin de poros. En este caso las fibras se disponen densamente no permitiendo formacin de poros, lo que no hace posible el paso de sustancias hacia el estrato esponjoso (figura 3). Discusin En general, las ovas de los peces telesteos presentan una envoltura primaria externa, que le confiere una identidad morfolgica y bioqumica a cada especie, y que recibe el nombre de corion (Brivio y col 1991). Este corion es una estructura formada por capas que pueden variar en nmero y grosor dependiendo de la especie (Cotelli 1998). Las ovas de Salmo salar siguen estos patrones ya descritos exhibiendo tres capas: un estrato externo, un estrato medio o esponjoso y un estrato interno. Del mismo modo, los resultados aqu presentados muestran que el corion de los diferentes estados de desarrollo de las ovas de S. salar exhibe de manera regular el mismo nmero de capas. Respecto del grosor del corion, los datos nos permiten establecer una variacin entre el corion de ovas no fecundadas y ovas fecundadas. La diferencia puede ser explicada debido a que el corion presenta un cierto grado de elasticidad. En el caso de ovas no fertilizadas y no hidratadas, se aprecia ms grueso debido a que las primeras no han sido

hidratadas y por lo tanto se mantienen como al momento de la ovulacin. En el caso de las ovas fecundadas, stas han permanecido por algunas horas en el agua, por lo que se ha producido ingreso de agua por osmosis al interior de la ova, lo que produce aumento de la presin de turgencia al interior de la ova, la que ejerce presin sobre el corion. Este aumento de la presin interna de la ova conlleva un estiramiento del corion por la resistencia que este ltimo realiza para evitar la ruptura de la ova. Los valores reportados para el grosor del corion de ovas fecundadas con desarrollo normal y de ovas con corion duro varan en 0,1 m. Esto podra estar relacionado con la disposicin y grosor de las fibras, lo que podra estar asociado a una menor elasticidad. Respecto del grosor de las fibras del corion normal, podemos decir que las fibras que forman tanto el corion de ovas no fecundadas y fecundadas no presentan cambios en su grosor, mientras que en el caso del corion duro stas son definitivamente ms gruesas ya que alcanzan los 0,25m. El origen de esta anomala es de etiologa desconocida. Aun cuando se ha encontrado en ovas de reproductores con dao heptico, en reproductores alimentados con dieta de alta energa y reemplazo proteico no existe certeza que pudiesen ser stas las causas de la anomala. La diferencia ms notoria entre las ovas con desarrollo normal y aquellas que muestran corion duro es que en este ltimo caso el estrato interno no exhibe la caracterstica disposicin de red que conecta al ovocito con los poros del estrato esponjoso, por lo tanto no hay continuidad entre el ovocito y el corion. Estudios publicados acerca del corion han reportado que las principales funciones de ste son permitir la difusin de gases y productos metablicos de desechos, proporcionar proteccin mecnica, adems de un aislamiento trmico a la ova (Iconomidou y col 2000), facilitando de este modo el desarrollo normal y la posterior eclosin de los alevines. Todas estas funciones se ven facilitadas por la presencia de los poros, situados en el estrato esponjoso, que se encuentran invadidos por microvellosidades que se proyectan desde la membrana plasmtica del ovocito y que atraviesan la red de espacios (poros) observados en el estrato interno del corion (Shabanipour y Heidari 2004).

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SALMO SALAR, REPRODUCCIN, ULTRAESTRUCTURA, CORION

La ausencia de poros en el estrato interno del corion, por tanto, debiera reducir las funciones normales de ste y con ello afectar la viabilidad del alevn en formacin. Por otra parte, las enzimas de eclosin que de manera normal disuelven el estrato interno del corion degradando especficamente ciertas glicoprotenas estructurales que forman parte de la red del estrato interno del corion (Yamagami 1981), facilitando con ello la ruptura del corion (corilisis), tambin parecen ser afectadas. La ausencia de poros en el estrato interno no permite o permite slo de manera parcial la actividad degradativa de las enzimas de eclosin, lo que redunda en la persistencia parcial o total del corion. Puesto que la sntesis de la coriogenina ocurre en el hgado, es posible pensar que peces con algn tipo de dao heptico podran producir una forma alterada de alguna de las tres subunidades que constituyen la coriogenina. Esta alteracin podra significar que alguna de las subunidades de la coriogenina no se dispone de manera entrelazada, generando con ello un estrato interno del corion carente de poros. De este modo, entonces, el fenmeno denominado corion duro podra ser explicado por la ausencia de poros en el estrato interno del corion, con lo que se producira una restriccin de los procesos fisiolgicos de las ovas en desarrollo. Resumen
El corion duro es un fenmeno de reciente ocurrencia y se caracteriza porque algunos alevines con ojo no son capaces de degradar el corion que les rodea o lo hacen slo de manera parcial, producindose en ambos casos la muerte del alevn. Este fenmeno ha causado fracasos reproductivos importantes en algunas pisciculturas del sur de Chile, desconocindose hasta ahora la razn de su ocurrencia. En este estudio se realizaron mediciones del grosor del corion de Salmo salar as como de las fibras que forman parte de ste en ovas fertilizadas, no fertilizadas, con desarrollo normal y ovas que no lograron eclosionar. Los resultados

obtenidos indican que las leves variaciones observadas en el grosor del corion entre los diferentes estados de desarrollo de las ovas estudiadas no explican la ocurrencia del corion duro. Sin embargo, la disposicin de las fibras proteicas que forman el estrato interno del corion parece ser la respuesta a este fenmeno. Las ovas que no eclosionan presentan corion duro y exhiben un estrato interno carente de poros a diferencia de lo que se observa en las ovas que desarrollan normalmente y que logran la eclosin. Se propone que problemas en la sntesis de alguna de las sub-unidades que forman la coriogenina seran los responsables de la formacin de un estrato interno carente de poros, siendo sta la razn del corion duro.

Referencias
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Arch Med Vet 41, 73-76 (2009) COMUNICACIN

Frecuencia de comportamientos anormales estereotipados en caballos Chilenos estabulados


Frequency of stereotyped abnormal behaviour in stabled Chilean horses
L Muoz*, J Torres, O Seplveda, C Rehhof, R Ortiz
Departamento de Ciencias Clnicas, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad de Concepcin, Concepcin, Chile.

SUMMARY The frequency of stereotyped abnormal behaviour i.e. windsucking/crib-biting, weaving and stall-walking were studied in 100 Chilean horses of both sex, stabled in individual boxes either all day long or during a certain period of time. All horses were tamed and older than 2 years old, and belonging to 16 studs of the Comuna de Chilln (Chile). The horses were observed between 7:00 and 19:00 hours during one day, and its owner or carer was asked whether the horse presented some stereotyped abnormal behaviour or not. Horses were separated according to age into 2 groups: 2 to 5 years old and older than 5 years, and also according to sex: stallions, geldings or mares. Data was analysed using the Microsoft Excel Worksheet to establish frequencies. Differences between groups were analysed by Exact Fishers Test. Significance level was P<0.05. The results showed that 50% of the studs had one or more horses with some stereotyped abnormal behaviour. Ten porcent of the horses presented stereotyped abnormal behaviour. Stall-walking was the most frequent stereotyped abnormal behaviour (8%), then windsucking/crib-biting (2%), and finally weaving (1%). According to sex, statistic differences were observed only for stall-walking between stallions and mares (P = 0.012). According to age no statistic differences were observed. Palabras claves: comportamiento anormal, estereotipias, equinos, caballo Chileno. Key words: abnormal behaviour, stereotypies, equine, Chilean horse.

INTRODUCCIN En la vida silvestre, los caballos son gregarios y si tienen opcin pasan ms de la mitad de su tiempo en contacto con otros caballos (Houpt y Ogilvie-Graham 2002), por lo que el aislamiento social es una experiencia perturbadora (Mal y col 1991). Esto junto a algunas prcticas de manejo asociadas a la estabulacin como la alimentacin fraccionada pueden favorecer el desarrollo de algunos comportamientos anormales, los cuales son comunes en caballos domsticos (Simpson 1998). Los comportamientos anormales no son deseados por los propietarios tanto desde el punto de vista esttico como de salud, debido a que algunos de ellos pueden causar o predisponer a algunas patologas (Houpt 1995, McBride y Long 2001). Sin embargo, estos comportamientos anormales reflejan condiciones de vida inapropiadas asociadas a la domesticacin (Mason 1991, Simpson 1998, Harewood y McGowan 2005), aun cuando se ha demostrado que para algunas de ellas existe una predisposicin gentica (Marsden 2002). Los comportamientos anormales se pueden dividir en dos grupos, los propiamente anormales y los anormales estereotipados; los primeros son un acto aberrante con un

fin determinado, en tanto que los estereotipados aparte de ser aberrantes son repetitivos, y se caracterizan por manifestarse con una secuencia de movimientos recurrentes e invariables, que se mantienen de un modo extraordinario y el animal parece tener dificultades para detenerlos, adems no poseen un propsito o funcin definida (Dodman y col 1994). El presente estudio tuvo como objetivos conocer la frecuencia de los comportamientos anormales estereotipados en el caballo Chileno estabulado y posteriormente comparar estos resultados con estudios realizados en otros pases en diferentes razas o tipos de caballos y condiciones de manejo. MATERIAL Y MTODOS En septiembre del 2007, de 16 criaderos de la comuna de Chilln, Regin del Biobo, Chile, se utilizaron 100 caballos Chilenos inscritos en los Registros Genealgicos de la Sociedad Nacional de Agricultura, de ambos sexos, y que cumplieran con los siguientes requisitos: permanecer estabulados en pesebreras individuales durante todo el da o parte de ste, amansados y de dos aos o ms. Los caballos fueron observados en sus pesebreras, por un solo observador, un da, desde las 7:00 horas a las 19:00 horas con la finalidad de detectar algn comportamiento anormal estereotipado, adems, complementariamente, se consult al propietario o cuidador si el caballo presentaba 73

Aceptado: 10.06.2008. * Casilla 160-C correo 3, Concepcin, Chile; lismunoz@udec.cl

L MUOZ Y COL

uno o ms de los siguientes comportamientos anormales estereotipados: aerofagia (tragador de aire) con o sin apoyo, bamboleo (mal del oso), o bien paseo circular en la pesebrera. Los equinos de acuerdo a su edad se dividieron en dos grupos: grupo A (de 2 a 5 aos; n=33) y grupo B (mayores a 5 aos; n=67). De acuerdo al sexo los equinos se dividieron en tres grupos: machos enteros (n=37), machos castrados (n=26) y hembras (n=37). ANLISIS ESTADSTICO Para el anlisis de los datos se us la planilla electrnica Microsoft Excel para el clculo de frecuencias, luego para comparar las diferencias existentes dentro de las variables sexo y edad se utiliz la Prueba Exacta de Fisher, con un nivel de significancia de P<0,05. RESULTADOS Y DISCUSIN El 50% de los criaderos tena uno o ms caballos con algn comportamiento anormal estereotipado. Este porcentaje est dentro del rango observado en otros estudios realizados en el Reino Unido, siendo muy similar al 46% reportado por Waters y col (2002) en criaderos de caballos en donde slo se consideraron caballos menores a cinco aos, mantenidos la mayor parte del da en pradera. Tambin es similar a lo sealado por McBride y Long (2001) quienes encontraron que el 55% de los centros de competencias ecuestres y el 58% de las escuelas de equitacin tenan caballos con este tipo de comportamientos. Sin embargo, los resultados son mucho menores al 80% reportado por estos mismos autores en corrales de caballos de carrera. Esto confirma que los comportamientos anormales estereotipados son muy comunes en los lugares donde se cran o mantienen caballos, principalmente si stos se mantienen estabulados, lo que coincide con lo sealado por otros autores (Houpt 1986, Simpson 1998). De los 100 equinos estudiados, el 10% manifest comportamientos anormales estereotipados, resultado que se encuentra dentro del rango observado en otros estudios similares, en que las prevalencias reportadas varan entre 3,9 y 34,7% (Luescher y col 1991, Houpt 1995, McGreevy y col 1995a, Redbo y col 1998, Pell y McGreevy 1999, McBride y Long 2001, Marsden 2002, Waters y col 2002, Christie y col 2006). El cuadro 1 muestra la frecuencia de comportamientos anormales estereotipados total y por edad en caballos Chilenos estabulados de la comuna de Chilln. De acuerdo a estos resultados se pudo establecer que slo el 1% de los caballos presentaba ms de un comportamiento anormal estereotipado, adems, no se observaron diferencias estadsticamente significativas asociadas a la edad. El cuadro 2 muestra la frecuencia de comportamientos anormales estereotipados segn el sexo, observndose slo diferencias estadsticamente significativas entre machos enteros y hembras para paseo circular en la pesebrera (P=0,012), siendo ms frecuente en machos 74

enteros. Tanto la aerofagia como el bamboleo tuvieron una frecuencia de presentacin muy baja, cercana al lmite inferior del rango reportado por otros autores, que para la aerofagia es de un 0,4 a 10,5% y para el bamboleo de 0,1 a 9,5% (McGreevy y col 1995a, McGreevy y col 1995b, Redbo y col 1998, Pell y McGreevy 1999, McBride y Long 2001, Waters y col 2002), lo cual era esperable ya que en el caballo Chileno muchos de los factores de riesgo estn atenuados como el ser un pony (Christie y col 2006), que su alimentacin se basa principalmente en forraje y no concentrado (McGreevy y col 1995a, Johnson y col 1998, Redbo y col 1998, Waters y col 2002, Bachmann y col 2003, Mills y col 2000), que el sistema de manejo permite el contacto visual entre caballos (McGreevy y col 1995a) y que se usa preferentemente cama de paja (McGreevy y col 1995a, Goodwin y col 2002, Christie y col 2006). Es importante sealar que diversos estudios han demostrado que en la aerofagia con y sin apoyo, a diferencia de lo que se crea hasta hace algunos aos, el aire deglutido llega slo hasta la parte craneal del esfago y luego vuelve a la faringe (McGreevy y col 1995c, Marsden 2002), que los clicos recurrentes observados con frecuencia en estos caballos son la causa y no consecuencia de este comportamiento y que son los factores genticos y de manejo los que hacen pensar errneamente que este comportamiento puede ser copiado por otros caballos (Houpt 1986, McGreevy y col 1995a, Marsden 2002, Nicol y col 2002). Eso s, est demostrado que en los caballos con aerofagia hay un aumento del tiempo de trnsito intestinal (McGreevy y col 2001). Respecto a nuestros resultados, llaman la atencin dos situaciones: el alto porcentaje de caballos que realizan paseo circular en la pesebrera, ya que estudios anteriores realizados en caballos de carrera, enduro, adiestramiento y salto sealaban un rango para este comportamiento de entre 0,2 y 5,5% (McGreevy y col 1995a, McGreevy y col 1995b, Redbo y col 1998, Pell y McGreevy 1999, Waters y col 2002) y que el paseo circular en la pesebrera sea ms frecuente que la aerofagia y bamboleo, situacin observada slo por McGreevy y col (1995b) en caballos de enduro en el Reino Unido y por Christie y col (2006) en caballos en Canad. Este comportamiento fue explicado por McGreevy y col (1995b) como una manifestacin de aversin a la pesebrera, ya que el sistema de manejo del caballo de enduro implica gran cantidad de horas fuera de la pesebrera, recibiendo incluso su forraje fuera de sta, por lo que la pesebrera no es el refugio que pudiera representar para caballos que tienen un manejo en que pasan pocas horas al da fuera de la pesebrera, situacin que podra coincidir con el manejo del caballo Chileno, el cual pasa la mayor parte del da amarrado al aire libre fuera de la pesebrera o, menos frecuentemente, en un corral o potrerillo, lugar donde recibe alimento; adems, el entrenamiento del caballo Chileno considera el trabajar en pareja junto a otro caballo. Sin considerar el sexo, podemos decir que el caballo Chileno tiene una mayor predisposicin a desarrollar este comportamiento. Sin embargo, a la

COMPORTAMIENTO ANORMAL, ESTEREOTIPIAS, EQUINOS, CABALLO CHILENO

Cuadro 1. Frecuencia total y por edad de comportamientos anormales estereotipados en caballos Chilenos estabulados de la comuna de Chilln.
Total and according to age frequency of the stereotypic abnormal behaviour in stabled Chilean horses of Chilln.

Frecuencia (%) Comportamiento anormal estereotipado Paseo circular en la pesebrera Aerofagia Bamboleo Total 8 2 1 Grupo A 2-5 aos n = 33 3 0 0 Grupo B 6-19 aos n = 67 5 2 1

Cuadro 2. Frecuencias de comportamientos anormales estereotipados en caballos Chilenos estabulados de la comuna de Chilln, segn sexo.
Frequency of stereotypic abnormal behaviour according to sex in stabled Chilean horses of Chilln.

Comportamiento anormal estereotipado Paseo circular en la pesebrera Aerofagia Bamboleo


a

Frecuencia (%) Machos enteros n = 37 6a 1 1 Machos castrados n = 26 2 0 0 Hembras n = 37 0a 1 0

= P<0,05 entre machos enteros y hembras.

luz de los resultados, el que este comportamiento se haya presentado slo en machos y principalmente en machos enteros indica que existe un factor de riesgo asociado al sexo y ms probablemente al manejo de los machos, por lo que adquiere validez lo sugerido por Houpt (1986) al sealar que el paseo circular en pesebrera es causado por el confinamiento y la frustracin. Esto es altamente probable si tomamos en cuenta que los criadores de caballos Chilenos habitualmente mantienen los machos enteros la mayor parte del da en pesebrera, sin contacto tctil con otros caballos y muchas veces an sin contacto visual. Con los resultados obtenidos, se puede concluir que el 50% de los criaderos de caballo Chileno tienen caballos con comportamientos anormales estereotipados, que la frecuencia de stos en la raza es muy baja, con excepcin del paseo circular en la pesebrera, probablemente debido a factores de riesgo asociados al manejo, los cuales sera interesante analizar en futuros estudios. RESUMEN
La frecuencia de comportamientos anormales estereotipados como aerofagia, bamboleo y paseo circular en la pesebrera, fue estudiada en 100 caballos Chilenos, de ambos sexos, estabulados en pesebreras individuales durante todo el da o parte de ste, amansados y de dos aos o ms pertenecientes a 16 criaderos de la comuna de Chilln. Los caballos fueron observados desde las 7:00 a las 19:00 horas durante un da y su propietario o cuidador consultado si presentaba algn comportamiento anormal estereotipado. Los equinos de acuerdo a su edad se dividieron en dos grupos: de 2 a 5 aos y mayores a 5 aos, y de acuerdo al sexo

en tres grupos: machos enteros, machos castrados y hembras. Los datos fueron analizados por medio de la planilla electrnica Microsoft Excel, para establecer las frecuencias, y para comparar diferencias existentes entre los comportamientos anormales y las variables sexo y edad se utiliz la Prueba Exacta de Fisher, con un nivel de significancia de P<0,05. El 50% de los criaderos tena uno o ms caballos con algn comportamiento anormal estereotipado. De los 100 equinos estudiados, el 10% manifestaba algn comportamiento anormal estereotipado, siendo el paseo circular en la pesebrera el ms frecuente (8%), luego aerofagia (2%) y bamboleo (1%). Respecto al sexo, slo se observaron diferencias estadsticamente significativas para paseo circular en la pesebrera entre machos enteros y hembras (P=0,012), siendo este comportamiento ms frecuente en machos enteros. Para la variable edad no se encontraron diferencias estadsticamente significativas.

AGRADECIMIENTOS
Al Dr. Mario Briones, del Departamento de Ciencias Pecuarias de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad de Concepcin, por su apoyo en el anlisis estadstico de los datos.

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L MUOZ Y COL

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Arch Med Vet 41, 77-82 (2009) COMUNICACIN

Concentrados autlogos de plaquetas como tratamiento de lesiones de tejidos blandos del aparato locomotor en caballos
Autologous platelet concentrates as a treatment for soft tissue musculoskeletal lesions in horses
JU Carmonaa*, M Pradesb, D Argellesc
Terapia Regenerativa, Departamento de Salud Animal, Universidad de Caldas, Calle 65 N 26-10, Manizales, Caldas, Colombia. bDepartamento de Medicina y Ciruga Animal, Universidad Autnoma de Barcelona, Edificio V. 08193. Bellaterra, Barcelona, Espaa. cCentro de Referencia Clnica Equina, La Equina. Manilva, Mlaga, Espaa.
aGrupo

SUMMARY The efficacy of an autologous platelet concentrate (APC) in 5 horses with soft tissue musculoskeletal injuries namely: superficial digital flexor tendon (SDFT) tendinopathy and suspensory ligament desmopathy (DSL), was evaluated. Initial degree of lameness, flexion test response, ultrasonographic images and long term (1 year) clinical follow-up were documented. Three injections of APC were performed at two week intervals. Horses were evaluated before each injection, two months after the last treatment and one year after. Platelet counts, white blood cell counts and determination of TGF-1 levels per ml of APC were performed. Two horses had acute SDFT tendinopathy, 1 had chronic forelimb proximal desmitis (PD) of the suspensory ligament (PDSL), 2 had chronic hindlimb PDSL, and 1 of them also had desmitis of the medial branch of the suspensory ligament of the right hindlimb. All the horses in this study presented a clinical decrease of degree of lameness and response to flexion test, two months after last APC treatment. Ultrasound appearance improved in the horses with SDFT lesions, but remained the same in the horses with DSL. All the horses returned successfully to competition without reinjury. Means of 250 71.8 x 106 platelets, 8.68 3.78 leucocytes x 106, and 12.5 2.4 ng of TGF-1 per 1 ml of the PC were obtained. Palabras clave: caballo, tendinopata, desmopata, concentrado autlogo de plaquetas, TGF-1. Key words: horse, tendinopathy, desmopathy, autologous platelet concentrate, TGF-1.

INTRODUCCIN Las lesiones de los tendones y ligamentos sanan lenta e ineficientemente. Una vez se produce la lesin, estas estructuras nunca vuelven a recuperar sus propiedades biomecnicas originales (Goodship y col 1994, Smith y Schramme 2003). Se ha descrito la presencia de citocinas catablicas como el factor de necrosis tumoral alfa (TNF) y la interleucina 1 (IL-1) en biopsias de tendones de caballos afectados por tendinopata crnica (Hosaka y col 2002, Hosaka y col 2004). Estas citocinas promueven la produccin exagerada de metaloproteinasas de matriz (MMPs) y ciclooxigenasa 2 (COX-2), entre otras molculas proinflamatorias, las cuales tienen efectos nocivos sobre la matriz extracelular (ECM) y las clulas residentes de tejidos tales como los tendones y ligamentos (Tsuzaki y col 2003, Hosaka y col 2004, Hosaka y col 2005). Los efectos negativos de las citocinas catablicas podran ser disminuidos por algunos factores de crecimiento (GFs) (van Miert 2002). Estudios in vitro han demostrado

Aceptado: 20.06.2008. * Departamento de Salud Animal, Universidad de Caldas, Calle 65 N26-10, Manizales, Caldas, Colombia; carmona@ucaldas.edu.co

las propiedades benficas del factor de crecimiento transformante beta (TGF-) (Murray y col 2003, Anitua y col 2004), factor de crecimiento similar a la insulina tipo I (IGF-I) (Dahlgren y col 2001), y otros GFs (Zhang y col 2003, Murray y col 2003, Wong y col 2003). Adems, Dahlgren y col (2002) documentaron la accin positiva del IGF-I en un modelo equino de tendinitis del flexor digital superficial (SDFT) inducida con colagenasa. Los resultados de esos estudios sugieren los posibles beneficios de usar GFs como un tratamiento complementario de las lesiones de tejidos blandos del aparato locomotor, ya sea mediante el uso de protenas puras recombinantes o mediante terapia gnica (Dahlgren y col 2001, Beredjiklian 2002, Dai y col 2003). Los concentrados de plaquetas son una fuente autloga de algunos GFs, especialmente TGF-1 y otras molculas que modulan la inflamacin y el proceso de reparacin tisular (Anitua y col 2004, 2005, Sutter y col 2004). Los concentrados autlogos de plaquetas (APCs) han sido usados exitosamente en medicina humana en situaciones como reconstruccin alveolomaxilar (Anitua y col 2004, Carlson y col 2002), ciruga plstica (Bhanot y Alex 2002) y ortopdica (Anitua y col 2004). Tambin existen reportes anecdticos sobre el uso de APCs como tratamiento de la tendinopata de Aquiles en dos atletas y para tratar una 77

JU CARMONA Y COL

avulsin traumtica de cartlago articular en un jugador de ftbol (Snchez y col 2003). Anitua y col (2005) documentaron los efectos positivos de los concentrados de plaquetas sobre tenocitos humanos. En ese estudio los concentrados plaquetarios indujeron proliferacin celular y aumento en la expresin de dos pptidos angiognicos como el factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF) y factor de crecimiento derivado del hepatocito (HGF). Adicionalmente, Schnabel y col (2007) y Smith y col (2006) describieron importantes efectos anablicos del plasma rico en plaquetas sobre explantes de tendones equinos. En esos trabajos se pudo observar que los concentrados de plaquetas promovan la sntesis de colgeno tipo I y de la protena olimrica de la matriz de cartlago (COMP). En este trabajo se presenta un estudio clnico descriptivo sobre el uso de APCs como tratamiento de lesiones de tendones y ligamentos en cinco caballos. Los objetivos de este trabajo fueron describir los posibles efectos benficos y la seguridad clnica de la inyeccin de APCs en caballos con lesiones de tejidos blandos del aparato locomotor. MATERIAL Y MTODOS Este estudio clnico fue aprobado por las directivas del Hospital Clnico Veterinario de la Universidad Autnoma de Barcelona, Espaa. Los propietarios fueron informados sobre la naturaleza experimental del tratamiento con APCs y sus posibles complicaciones. Todas las observaciones y determinaciones fueron realizadas por el mismo clnico.
CABALLOS

ESQUEMA DEL TRATAMIENTO

Cada paciente fue tratado con una inyeccin intra y perilesional de un APC cada 15 das, por tres veces consecutivas.
DISEO DEL ESTUDIO

Cinco caballos de diferente sexo, edad, raza y aptitud fueron incluidos en el estudio. La edad promedio de los pacientes fue de 8,6 aos (rango 5-14 aos). Un total de ocho extremidades fueron tratadas, ya que algunos pacientes presentaban lesin bilateral (cuadro 1). Dos pacientes tenan lesin aguda relacionada con tendinopata del SDFT, uno con desmitis proximal crnica bilateral del ligamento suspensorio de los miembros anteriores, dos caballos con desmitis crnica bilateral del origen del ligamento suspensorio de los miembros posteriores; uno de esos pacientes tambin presentaba desmitis de la rama medial del ligamento suspensorio del miembro posterior izquierdo.
CRITERIOS DE INCLUSIN

Se realiz un examen completo de cojera a cada paciente. En ste se incluyeron los bloqueos anestsicos necesarios para determinar el sitio exacto de la lesin en la extremidad. Cada examen fue complementado mediante evaluacin ecogrfica. Los exmenes de cojera y ecogrfico fueron realizados antes de cada tratamiento, dos meses despus de la ltima inyeccin del APC y un ao despus. El grado de cojera fue calificado subjetivamente de 0-5 de acuerdo con el criterio de la AAEP (1991). El examen de cojera siempre fue realizado sobre la misma superficie, los pacientes fueron manipulados por el mismo operario y recorrieron siempre la misma distancia. Para la evaluacin ecogrfica de las lesiones de tendones y ligamentos se emple la clasificacin ecogrfica modificada de Rantanen y col (2003), que incluye la combinacin de los signos clnicos (calor, inflamacin, cojera, sensibilidad al tacto y grosor de las estructuras anatmicas comprometidas) y las lesiones ecogrficas de cada paciente. Los parmetros ecogrficos usados en este estudio incluyeron: permetro de rea seccional (CSA), regin de mayor lesin (MIZ), porcentaje de la regin de mayor lesin en comparacin con la regin contralateral sana del ligamento o tendn, patrn ecognico de la lesin y orientacin transversa y longitudinal de las fibras. El examen clnico y el ecogrfico de cada caballo fueron combinados para crear una escala cualitativa de lesin en seis categoras de 0-V, donde 0 = tendn o ligamento de apariencia ecogrfica normal en un paciente clnicamente normal, V = presencia de lesiones anecoicas muy graves, con un gran incremento en los parmetros CSA-MIZ, desorganizacin horizontal y/o transversal de las fibras con evidentes signos clnicos acompaados de grados moderado o severo de cojera. El tratamiento con los APCs fue considerado como exitoso cuando el caballo regresaba al mismo nivel fsicoatltico de entrenamiento o competicin que tena antes de haber presentado la lesin y sin observarse recidiva a lo largo del perodo de evaluacin clnica (un ao).
PREPARACIN E INYECCIN DEL CONCENTRADO AUTLOGO DE PLAQUETAS

Los criterios de inclusin empleados en este trabajo fueron que los caballos presentaran lesiones de tendones o ligamentos, pero que no hubieran sido tratados al menos durante los ltimos seis meses. Los caballos enrolados no deban recibir ningn tratamiento adicional durante el tiempo del estudio (ms de un ao). 78

Previa preparacin asptica, se obtuvo sangre entera de la vena yugular de cada paciente mediante un catter mariposa 23G (Terumo, Blgica). La sangre fue depositada en tubos de citrato de sodio 3,2% v/v con capacidad para 5 ml. Los tubos con sangre fueron centrifugados a 120 g durante cinco minutos. La primera fraccin supernadante

CABALLO, TENDINOPATA, DESMOPATA, CONCENTRADO AUTLOGO DE PLAQUETAS, TGF-1

(50%) del plasma, adyacente a la capa leucoplaquetaria (buffy coat), fue obtenida bajo estricta asepsia en una cmara de flujo laminar horizontal. Esta fraccin fue depositada en tubos sin aditivo y centrifugada a 240 g durante cinco minutos. Luego se extrajo el 25% del plasma del fondo de cada tubo. Esta ltima fraccin fue depositada dentro de jeringas estriles y activada con cloruro de calcio (4,5 mEq/5 ml), a razn de 50 l por ml de APC (Argelles y col 2006). Dos ml de APC de cada paciente fueron empleados para realizar recuento de plaquetas y leucocitos (ADVIA 120, Bayer, USA) y determinar los niveles de TGF-1 mediante una prueba comercial humana de ELISA (R&D System, USA). El rea afectada de la extremidad de cada paciente fue preparada aspticamente para realizar la inyeccin del APC. Los pacientes fueron sedados con un bolo intravenoso de detomidina (40 g/kg) (Domosedan, Pfizer, Espaa) y tartrato de butorfanol (0,02 mg/kg) (Torbugesic, Fort Dodge Laboratories Inc, Espaa). Cada APC fue aplicado peri e intralesionalmente mediante inyeccin (aguja 21G) ecoguiada. La cantidad de APC usada en cada paciente fue determinada subjetivamente en funcin del tipo, tamao (cm2 de rea en corte transversal ecogrfico) y extensin de la lesin (cm de longitud) (cuadro 1). Durante el tratamiento los caballos fueron confinados y dos semanas despus de la ltima inyeccin se permiti un aumento gradual del ejercicio en funcin de la sintomatologa clnica de cada paciente. RESULTADOS Y DISCUSIN Este estudio clnico piloto fue realizado en equinos, en atencin a que existe suficiente informacin cientfica y anecdtica sobre los efectos positivos de los APCs en lesiones de tejidos blandos de seres humanos (Bhanot y col 2002, Carlson y col 2002, Anitua y col 2004), tales como tendinopatas y desmopatas (Snchez y col 2003, Anitua y col 2005).

Un promedio de 5 ml de APC fue obtenido a partir de cada 75 ml de sangre entera. El anlisis de APC revel un promedio de 250 71,8 x 106 plaquetas, 8,68 3,78 leucocitos x 106 y 12,5 2,4 ng de TGF-1 por mililitro. La tcnica empleada para preparar los APCs de este estudio produjo una baja concentracin de plaquetas (250 71,8 x 106 plaquetas/ml) en comparacin con los valores obtenidos mediante el mtodo de afresis descrito por Carter y col (2003) (490 x 106 plaquetas/ml) y por Sutter y col (2004) (855 x 106 plaquetas/ml) o mediante un mtodo semiautomatizado de buffy coat (1.472 x 106 plaquetas/ml). Sin embargo, con la tcnica empleada en este estudio se obtuvieron concentraciones elevadas de TGF-1 (12,52,4 ng/ml) en comparacin con las concentraciones obtenidas mediante el mtodo de afresis descrito por Carter y col (2003) (7,4 1,3 ng/ml), y concentraciones bajas de TGF-1 en comparacin con los resultados descritos por Sutter y col (2003) (23,6 ng/ml). Es importante aclarar que concentraciones tan bajas como 5 ng/ml de TGF-1 inducen sntesis de ECM y proliferacin celular in vitro (Fortier y col 1997). Los animales con lesiones del SDFT presentaban un registro ecogrfico inicial grado V (cuadro 2). Los caballos con desmitis del origen del ligamento suspensorio presentaron registros ecogrficos entre los grados I-IV (mediana II) (cuadros 2 y 3). Durante el inicio del estudio todos los pacientes presentaron un grado leve de cojera y una respuesta moderada a la prueba de flexin. El mejoramiento en ambos parmetros (clnico y ecogrfico) fue ms evidente al final del estudio. La apariencia cosmtica del rea lesionada (tendinopatas) fue excelente, incluso despus de la primera inyeccin. La evaluacin ecogrfica seriada mostr un mejoramiento en el registro de las lesiones, especialmente en los pacientes con tendinopata del SDFT (cuadro 2). Los pacientes con desmitis del origen del ligamento suspensorio no cambiaron la apariencia del registro de calificacin ecogrfica. Sin embargo, estos pacientes

Cuadro 1. Historia clnica, resea y aptitud de los pacientes del estudio.


Clinical history sex, breed, age and aptitude of the studied patients.

Caballo N 1 2 3 4 5

Raza Cruce Cruce Warmblood Anglorabe Trotn

Sexo Hembra Macho Macho Macho castrado Macho

Edad (aos) 10 11 11 6 5

Disciplina Salto Salto Doma clsica Salto Trote

Extremidad afectada AI AD D&IA D&IP D&IP

Diagnstico Tendinopata aguda del SDFT Tendinopata aguda del SDFT PDSL Crnica PDSL Crnica PDSL crnica. Desmitis de la rama medial del SL de la EPI

APC (ml/lesin) 5 5 8 8 8-4

AI: Anterior izquierda. AD: Anterior derecha. PD: posterior derecha. PI: Posterior izquierda. SDFT: tendn flexor digital superficial. PDSL: Desmitis proximal del origen del ligamento suspensorio. SL: Ligamento suspensorio.

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Cuadro 2. Evaluacin ecogrfica y clasificacin de los caballos con lesiones del tendn flexor digital superficial y del ligamento suspensorio.

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Evaluacin ecogrfica de la lesin C C III No existe una diferencia ecogrfica objetiva entre la lesin y el resto del tendn. III Patrn de ecogenesidad y orientacin de las fibras casi normal en el sitio de la lesin. EAI: Sin cambios. EAD: Sin cambios. II I II II Similar a la ltima eva luacin. II C IV La lesin es ms pequea y menos extendida (1cm). Las fibras estn ms organizadas. III Antes del 2 tratamiento Antes del 3er tratamiento C Similar a la ltima eva luacin. Un ao despus del ltimo tratamiento Dos meses despus C II IV No existe evidencia de lesin ecogrfica en el tendn. I II II I EAD: Sin cambios. I II Existe un incremento de la ecogenicidad de la lesin y disminucin de su tamao. El permetro de la lesion es de 14,8 mm2. EAI: Disminucin de la seccin longitudinal del origen del SL (10,5 mm). EAD: Sin cambios. Existe un incremento de la ecogenesidad de la lesin y buen alineamiento de las fibras en el sitio de la lesin. EAI: Sin cambios. EAI: Sin cambios. EAD: Sin cambios. II I I Evaluacin ecogrfica de la lesin C C II II Sin cambios en ninguna extremidad. Antes del 2 tratamiento Antes del 3er tratamiento Sin cambios en ninguna extremidad. C II Dos meses despus Sin cambios en ninguna extremidad. C II Un ao despus del ltimo tratamiento Sin cambios en ninguna extremidad. C II IV Sin cambios en el origen de ambos SLs. Ecogenicidad incrementada de la rama medial del SL de la EPI. III Sin cambios en el origen de ambos SLs. No existe evidencia de lesin en la rama del SL. II Sin cambios desde la ltima evaluacin. II Sin cambios desde la ltima evaluacin. II

Ultrasound evaluation and classification of the horses with superficial digital flexor tendon and suspensory ligament lesions.

JU CARMONA Y COL

Caballo N

Antes del 1er tratamiento

Lesin circular lateral de 2 cm de longitud, localizada en la regin 2A. Representa el 10% del CSA del tendn. Lesin hipoecoica ubicada medialmente en la regin 2A. Representa el 20% del CSA. El permetro de la lesin es de 17,3 mm2. EAI: Engrosamiento del origen del SL, regin 1A (10.8 mm -seccin longitudinal-). Periostitis 2-4 MT en la regin 2B. EAD: Sin cambios en el SL.

C: Categora de la lesin. CSA: Corte de rea seccional. E: Extremidad. MT: hueso metatarsiano. 1A, 2A, y 2B: representan las regiones de la extremidad evaluada mediante ecografa. Dems iniciales como en la tabla 1.

Cuadro 3. Evaluacin ecogrfica y clasificacin de los caballos con lesiones del ligamento suspensorio.

Ultrasound evaluation and classification of the horses with suspensory ligament lesions.

Caballo N

Antes del 1er tratamiento

Engrosamiento del origen de ambos ligamentos suspensorios de los miembros posteriores. Engrosamiento del origen de ambos ligamentos suspensorios de los miembros posteriores. Lesin hipoecoica en la rama medial del SL de la EPI.

Iniciales como en las tablas 1 y 2.

CABALLO, TENDINOPATA, DESMOPATA, CONCENTRADO AUTLOGO DE PLAQUETAS, TGF-1

presentaron disminucin del grado de cojera y respuesta a la prueba de flexin. Los caballos con desmitis del origen del ligamento suspensorio finalizaron el estudio con una calificacin ecogrfica mediana similar a la inicial (II), pero con una disminucin en el rango de la clasificacin (I-II) (cuadros 2 y 3). Los caballos con tendinopata del SDFT regresaron a su nivel de ejercicio o competencia normal 4,5 meses despus del ltimo tratamiento, sin recidiva durante el perodo de seguimiento (1 ao). El caballo con desmitis crnica bilateral del origen del ligamento suspensorio de los miembros anteriores regres a su nivel de competencia previo a la lesin dos meses despus del ltimo tratamiento y no present recidiva durante el ao de seguimiento. Los pacientes con desmitis bilateral del origen del ligamento suspensorio de los miembros posteriores regresaron a su nivel de competicin a los seis meses despus de la ltima inyeccin del APC y no mostraron recadas durante el ao de seguimiento. Aunque los caballos 1 y 2 de este estudio presentaron lesiones agudas del SDFT, en realidad esas afecciones podran ser potencialmente consideradas como un cuadro de naturaleza degenerativa (Molloy y col 2003). Es necesario considerar que, aunque muchas lesiones tendinosas o ligamentosas pueden cursar como afecciones agudas (traumticas), muchas de stas, en realidad, son episodios relacionados con recidiva de lesiones crnicamente activas o con el fallo biomecnico de tejido cicatricial ubicado dentro de los tendones o ligamentos previamente lesionados (Goodship y col 1994, Dowing y col 2000, Smith y Schramme 2003). Se sabe que caballos con clasificacin de lesin tendinosa del SDFT (grados IV-V) similar a la de los dos caballos de este estudio estn muy predispuestos a sufrir recidiva de la lesin; esto a pesar de haber seguido un programa adecuado de ejercicio controlado y recibir tratamiento convencional. Normalmente se recomienda un perodo de reposo de 9-12 meses como parte del tratamiento de esa clase de pacientes (Jorgensen y Genovese 2003, Dyson 2004). Aunque no es una muestra representativa, en este estudio se pudo apreciar que los dos pacientes con tendinopata del SDFT, tratados con APCs, regresaron a su nivel de competicin normal en la mitad del tiempo esperado y no presentaron recidiva de la lesin en comparacin con casos reportados en la literatura, los cuales haban sido manejados con tratamientos convencionales como la inyeccin intra o perilesional de glicosaminoglicanos polsulfatados, cido hialurnico o beta-aminopropiontrilo (BAPN), entre otros (Jorgensen y Genovese 2003, Dyson 2004). Es necesario comentar que en un estudio reciente (Abellanet 2007) se evalu el efecto de los APCs en 39 caballos con tendinopata del SDFT con resultados esperanzadores. De manera general, se observ que los caballos tratados con APCs presentaron un mayor xito teraputico (medido como regreso a la competicin) 69-76% (Abellanet 2007) en comparacin con otros estudios en los que caballos con afecciones parecidas fueron tratados

de manera convencional (40-50%) (Dyson 2004). Por otra parte, tambin se observ que los caballos tratados con plaquetas presentaron un menor nivel de recadas despus de iniciar la competicin (20-22%) (Abellanet 2007) en comparacin con caballos tratados de manera clsica (5080%) (Smith 2003, Dyson 2004). Los casos de desmitis crnica proximal bilateral de los miembros posteriores no mostraron mejoramiento en su apariencia ecogrfica despus del tratamiento con APCs. Aunque estos pacientes no presentaban lesiones anecoicas y nicamente mostraban desorganizacin de las fibras y engrosamiento del origen del ligamento suspensorio, ellos mejoraron clnicamente y regresaron a su nivel de trabajo sin recidiva durante el ao de seguimiento. El pronstico de las lesiones del ligamento suspensorio depende de la extensin de la afeccin, del rea afectada y de la extremidad (Dyson y col 1995). La desmitis proximal del ligamento suspensorio tiene un buen pronstico cuando ocurre en los miembros anteriores en comparacin con los posteriores (Dyson y col 1995). El caballo nmero 3 con desmitis proximal de los miembros anteriores regres al nivel de entrenamiento previo a la lesin dos meses despus de la ltima inyeccin de APC. Se ha observado que equinos con esta misma clase de afeccin regresan al nivel de entrenamiento previo a la lesin despus de un programa de reposo seguido por ejercicio controlado durante tres meses (Dyson y Genovese 2003). La principal limitacin del estudio presentado aqu es el pequeo nmero de casos documentados y la variedad de las patologas. Sin embargo, a partir de los resultados obtenidos en este trabajo y a partir de los datos documentados por Abellanet (2007), se podra pensar que la inyeccin de APCs podra ser una nueva teraputica promisoria para el tratamiento de las desmopatas y tendinopatas en el caballo. Sin embargo, esta terapia no puede ser recomendada hasta que se haya evaluado un mayor nmero de casos clnicos e idealmente bajo un esquema de estudio doble ciego con un largo perodo de seguimiento. Esto servira para validar las impresiones clnicas observadas en este estudio y para reafirmar el uso emprico de esta sustancia por muchos veterinarios de equinos. Finalmente, la seguridad del tratamiento con APCs es un aspecto positivo que se puede asumir de esta investigacin. RESUMEN
Se evalu la eficacia de un concentrado autlogo de plaquetas (APC) en cinco caballos con lesiones de tejidos blandos del aparato locomotor, tales como tendinopata del tendn flexor digital superficial (SDFT) y desmopata del ligamento suspensorio (DSL). Se documentaron el grado inicial de cojera, la repuesta a la prueba de flexin, las imgenes ecogrficas y un seguimiento clnico a largo trmino. Se aplicaron tres inyecciones con un intervalo entre inyeccin de dos semanas. Los caballos fueron evaluados antes de cada inyeccin, dos meses despus del ltimo tratamiento y un ao despus. El nmero de plaquetas, leucocitos y los niveles de TGF-1 fueron determinados en cada APC. Dos pacientes presentaron tendinopata aguda del SDFT, un caballo tena desmitis crnica proximal del ligamento suspensorio (PDSL) de ambos miembros anteriores, dos caballos tenan PDSL de ambos miembros posteriores; de estos pacientes uno tena desmitis de la rama medial

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JU CARMONA Y COL

de ligamento suspensorio del miembro posterior izquierdo. Todos los caballos de este reporte presentaron una disminucin clnica del grado de cojera y respuesta a la prueba de flexin dos meses despus del ltimo tratamiento. La apariencia ecogrfica mejor en los caballos con tendinopata del SDFT, pero permaneci similar en los caballos con PDSL Los caballos con tendinopata aguda del SDFT regresaron exitosamente a su nivel de competicin sin recidiva. Los caballos con PDSL tanto de las extremidades anteriores como posteriores regresaron exitosamente a su nivel de competicin sin recidiva. Por cada ml de APC se obtuvo un promedio de 250 71,8 x 106 plaquetas, 8,68 3,78 leucocitos x 106 y 12,5 2,4 ng de TGF-1.

AGRADECIMIENTOS
Los autores desean agradecer al Instituto de Terapia Regenerativa Tisular, Barcelona, Espaa, y a Catalina Lpez, MVZ, por la preparacin de los APCs.

REFERENCIAS
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Arch Med Vet 41, 83-88 (2009) COMUNICACIN

Caractersticas citolgicas del lavado bronqueoalveolar y respuesta inmune humoral frente a Aspergillus fumigatus en caballos Chilotes con obstruccin recurrente de las vas areas#
Cytologic broncheoalveolar lavage findings and humoral immune response against Aspergillus fumigatus in Chilote horses with recurrent airway obstructions heaves
G Morna,b*, O Arayac, A Ortloffd, H Folcha
de Inmunologa, Facultad de Medicina, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile. CONICYT, Programa de Doctorado en Ciencias Veterinarias, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile. c Instituto de Ciencias Clnicas Veterinarias, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile. dEscuela de Medicina Veterinaria, Universidad Catlica de Temuco, Temuco, Chile; Programa de Doctorado en Ciencias Veterinarias, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile.
bBecario aInstituto

SUMMARY In this study, the presence and characteristics of the recurrent airway obstruction (RAO), in Chilote horses were investigated. The Chilote horse is a breed of small and very rustic horses, descendent from the horses that were brought by the spaniards during the colony and remained isolated in the Chiloe island, south of Chile, for a long time. Twenty two animals, all from the same farm and living under similar conditions, were physically examined. In all cases broncheoalveolar lavage (BALF) was performed and the recovered resident cells from the respiratory tract were studied in smears stained with May Grewald Giemsa; the level of antibodies against Aspergillus fumigatus was determined by ELISA. The results indicate that out of the total population of animals under investigation, 13 showed clinical signs compatible with RAO and 9 were normal. In all cases, the animals that were considered RAO positive showed a higher percentage of polymorphonuclear neutrophils in the BALF: furthermore, a clear positive correlation between the relative amount of neutrophilic cells present in the airways and the severity of the signs observed during the physical examination exists. All of the animals, healthy and RAO positive horses, showed high titres of antibodies against A. fumigatus, a well known allergen, commonly distributed in the region and present in the hay/straw. Our results show that Chilote horses, even though they are a rustic bread, are very susceptible to become RAO positive with similar characteristics to those described in other breeds, moreover, all animals were sensitized to A. fumigatus antigens showing the immunogenicity and the important distribution of this fungal allergen. Palabras clave: caballos Chilote, ORVA, LBA, alergia. Key words: Chilote horses, RAO, BALF, allergy.

INTRODUCCIN El caballo Chilote, mantenido en la Isla Grande de Chilo desde la llegada de los espaoles, es un recurso nico en el mundo; antecedentes histricos, caractersticas morfolgicas y su anlisis gentico confirman que tiene su origen en aquellos ejemplares equinos provenientes de la pennsula ibrica durante el periodo de la conquista. En 1999 se aprob formalmente la existencia de la raza del caballar Chilote y se abrieron los registros genealgicos, permitiendo la inscripcin de los ejemplares que cumplen con los estndares establecidos. Una de las caractersticas de esta raza es su rusticidad y su capacidad de adecuarse al medio, lo que hace de estos animales una excelente herramienta para labores de tipo agrcola (Escobar y Tadich 2006). Estos equinos, a pesar de su rusticidad, al
Aceptado: 09.07.2008. # Financiado por proyecto DID-UACH 2006-04. * Casilla 567, Valdivia, Chile; gmoran@uach.cl

igual que las otras razas de caballos conocidas, desarrollan obstruccin recurrente de las vas areas (ORVA) si son expuestos a determinados alrgenos. El ORVA, conocido en ingls como RAO (recurrent airways obstruction), es consecuencia de un proceso inflamatorio originado por una hipersensibilidad gatillada por la inhalacin de agentes alergnicos. Esta condicin, debido a los mecanismos inmunolgicos que intervienen en la patognesis, tiene alguna similitud con el asma humana (Herszberg y col 2006, Morn y col 2006). Esta patologa pulmonar equina se caracteriza por una inflamacin de las vas areas, acumulacin de mucus y obstruccin reversible, debido a la hipersensibilidad bronquial (Jackson y col 2000), lo que hace que el animal presente una gran disnea, caracterizada por doble espiracin abdominal y tos seca. Si la patologa lleva varios meses se puede apreciar la llamada lnea del esfuerzo, la cual se debe a la hipertrofia de los msculos rectoabdominales. En los casos menos severos, slo es posible observar una disminucin en el rendimiento deportivo del caballo. 83

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La hipersensibilidad broncopulmonar de tipo I y la hipersensibilidad tipo III son los factores etiopatognicos que se sealan como principales del ORVA (Robinson y col 2001, Horohov y col 2005); estos cuadros se desarrollan como consecuencia de una exagerada respuesta inmune humoral, que a su vez depende de la actividad de las clulas T CD4+ del tipo Th2 e IL-4 (Lavoie 2001). Adicionalmente, juegan un rol importante las citoquinas proinflamatorias que se producen como consecuencia de la entrada de los alrgenos en las vas respiratorias (Barnes y col 1998). Entre los alrgenos ms importantes como inductores de este cuadro alrgico estn las esporas de Aspergillus fumigatus, hongo oportunista causante de varias patologas respiratorias tanto en hombre como en animales (Rementeria y col 2005). Las esporas de este hongo se encuentran principalmente en heno y paja almacenados con 20-30% de humedad (Araya y Zaror 1995). Tambin se han encontrado bacterias inductoras de hipersensibilidad pulmonar como Faenia rectivirgula y Thermoactinomices vulgaris, las que crecen en las mismas condiciones que el Aspergillus fumigatus (MacGorum y col 1998). Por otra parte, los caros del polvo son potencialmente alergnicos para humanos y caballos (Hockenjos y col 1981), y constituyen un factor de complicacin, debido a que stos se alimentan de esporas de hongos, las que son eliminadas como pellets fecales, los cuales tambin seran un factor para iniciar este cuadro alrgico en los equinos (Clarke y Madelin 1987). El objetivo de este estudio es analizar las caractersticas citolgicas del lavado bronqueoalveolar (LBA) de caballos Chilote con ORVA y compararlos con los resultados obtenidos de los animales sanos, determinar el grado de respuesta inmune humoral de estos animales contra Aspergillus fumigatus y determinar la importancia de este microorganismo en la induccin de este cuadro alrgico pulmonar en esta raza de caballos mantenidos en la Regin de los Ros de Chile. MATERIAL Y MTODOS
Animales

caballos incluidos en el experimento se les extrajo sangre por venopuncin yugular para la realizacin de un hemograma y la obtencin de suero, el que posteriormente fue congelado a -20C hasta su anlisis.
Lavado Bronqueoalveolar

Para la realizacin del LBA se ocup una sonda Fogarty flexible de 180 cm, la cual se introdujo va nasotraqueal hasta un bronquio de tercera o cuarta generacin. Para efectuar el examen, los caballos fueron sedados con Romifidina en dosis de 60 g/kg va endovenosa (Laboratorio Boehringer Ingelheim). El fin de este procedimiento fue facilitar la maniobra y evitar la tos paroxstica al momento que la sonda traspasa la carina traqueal. Una solucin fisiolgica estril a 37 C fue instilada en el rbol respiratorio mediante jeringas de 60 ml en un volumen total de 180 ml. Posteriormente se recuper tanto lquido como fue posible. Luego las muestras fueron centrifugadas por 10 minutos a 2.500 g y seguidamente su componente celular fue sometido a conteo diferencial en frotis utilizando la tincin May-Grnwald Giemsa.
Prueba de ELISA para la deteccin de inmunoglobulinas especficas para los antgenos de Aspergillus fumigatus

En el presente estudio se utilizaron 22 caballos Chilote. Los animales correspondieron a individuos de ambos sexos mantenidos estabulados durante la noche y alimentados con heno que, segn pudo determinarse, contena esporas de Aspergillus fumigatus. La contaminacin por este hongo fue determinada usando el muestreador manual de Burkard como ha sido descrito anteriormente (Araya y Zaror 1995). El diagnstico de ORVA se realiz mediante el examen clnico, lo cual permiti clasificar los animales segn la intensidad de la signologa clnica como ha sido propuesto por Robinson (2000). Adems, los animales fueron sometidos a un lavado bronqueoalveolar (LBA) y a una inspeccin endoscpica del tracto respiratorio. Adicionalmente a los 84

Para detectar y cuantificar en los sueros problema la presencia de inmunoglobulinas especficas contra Aspergillus fumigatus se mont un ELISA indirecto. Para ello se utilizaron placas de microtitulacin de 96 pocillos. A cada pocillo se le agregaron 100 l de antgeno de Aspergillus fumigatus en buffer carbonato 0,1 M a pH 9,5, el cual se dej incubando por 12 horas a 4 C. Posteriormente los pocillos de las placas se lavaron tres veces con 300 l de buffer PBS a pH 7,0 con 0,05% de Tween 20. Luego los pocillos de la placa se bloquearon con 200 l de PBS con un 5% de leche descremada por una hora a T ambiente; la placa fue lavada tres veces con la solucin de lavado. Terminado este proceso, se agregaron a cada pocillo 100 l de suero de caballo diluido 1:100 en PBS, se incub por una hora a T ambiente, a continuacin la placa fue lavada tres veces con la solucin de lavado. Luego se agregaron a cada pocillo 100 l de suero antiinmunoglobulina de caballo preparado en conejo en una dilucin 1:1000 e incubados por 1 hora a 37 C; luego las placas fueron lavadas tres veces y cada pocillo fue cargado con 100 l de Ac antiIgG de conejo conjugado con peroxidasa diluido 1:1000. Posteriormente la placa fue lavada tres veces con solucin de lavado para agregarle 100 l de solucin de sustrato (buffer fosfato citrato a pH 5,0). La placa se incub por 10 minutos a T ambiente en oscuridad, luego la reaccin colorimtrica se detuvo agregando 50 l de solucin 2,5 M de cido sulfrico para colocarlo en el lector de ELISA con un filtro de 490 nm.

CABALLOS CHILOTE, ORVA, LBA, ALERGIA

Obtencin de antgenos de Aspergillus fumigatus

Para la obtencin de las protenas solubles de Aspergillus fumigatus usadas en el test de ELISA, el crecimiento del Aspergillus se dividi en dos partes: cultivo en agar peptona por 7 das a 23 C y luego cultivo en suspensin en caldo Malta por otros 7 das a 23 C. La extraccin de protena se bas en el mtodo descrito por Cspedes y col (1999). Para esto, los microorganismos se cosecharon por centrifugacin y se fijaron con etanol (Merck, USA) al 60% por 24 horas. Luego, los microorganismos se centrifugaron por 10 minutos a 12.500 g, se elimin el sobrenadante y se incub en una solucin salina hipertnica 1 M NaCl, 0,1 M de citrato de sodio y 0,5 mM de EDTA (Sigma Chemical Co. USA) por 24 horas a 4 C. Posteriormente, los microorganismos fueron sonicados (Ultrasonic Homogenizer, serie 4710 Cole Parme USA) durante 20 minutos a 90 Watts, las clulas desintegradas se centrifugaron a 25.000 g por 30 minutos y el sobrenadante, que contena las protenas solubles, se dializ contra buffer fosfato salino (PBS). Posteriormente, las protenas obtenidas se concentraron mediante el uso de Speed Vac SC 110 (Savant, USA) y fueron cuantificadas por el mtodo Bradford, conservndose a 20 C hasta su uso.
Anlisis estadstico

Cuadro 1. Clasificacin de los animales positivos y negativos a ORVA segn su signologa clnica (Robinson y col 2000), la edad de cada animal y el porcentaje relativo de neutrfilos presente en el LBA.
Clinical signology score according to Robinson et al (2000) in the horse population under study, showing the age of each animal and the relative percentage of neutrophils in the cells recovered from BALF (LBA).

Signos clnicos de ORVA Signos clnicos severos Signos clnicos moderados

Edad (aos) 12 2 15 5 13 2 4 5 11 3 2 3 3 10 5 11 4 4 12 7 3 6

Neutrfilos en LBA (%) 82 75 66 70 58 52 46 44 40 33 31 20 20 8 6 5 4 2 2 1 0 0

Signologa leve

Signologa clnica positiva slo despus de ejercicios

Ausencia de signos clnicos

Los valores obtenidos tanto en los conteos celulares del LBA como en las distintas pruebas a que fueron sometidos los animales fueron evaluados para determinar su normalidad mediante el test de Kolmogorov-Smirnov. Adems, fueron comparados por el mtodo Wilcoxon rank test, donde P < 0,05 fue considerado significativo. RESULTADOS Y DISCUSIN De los veintids caballos Chilote del predio en que se realiz el estudio, trece mostraron sntomas compatibles con ORVA y nueve resultaron normales al examen clnico. Los animales positivos fueron a su vez agrupados en cuatro grupos de acuerdo a la severidad de su signologa (cuadro 1); slo un animal fue clasificado con ORVA de 8 puntos (signologa clnica severa), que presentaba gran disnea, tos seca, secrecin nasal abundante, ollares dilatados y miembros extendidos, producto de la dificultad respiratoria. El anlisis de las clulas recobradas del LBA mostr en este ejemplar un 82% de neutrfilos. Los tres animales ORVA positivos que por sus signos clnicos fueron clasificados con 5-6 puntos (signologa clnica moderada) mostraban una disnea importante, tos y secrecin nasal evidente, y el examen citolgico del LBA demostr un porcentaje de neutrfilos que variaron entre un 66% a 75%. En el grupo con signologa clnica leve (3-4 puntos), fueron incluidos cinco caballos ORVA positivos que mostraron disnea moderada con espiracin abdominal y tos seca ocasional; el porcentaje de neutr-

filos en el LBA en este grupo vari en un rango de 40% a 58%. Por ltimo, en la clasificacin 1-2, se incluyeron los cuatro animales positivos restantes que mostraban escasa signologa clnica cuando estaban en reposo, en los cuales, hecho el examen citolgico del LBA, se pudo observar un porcentaje de neutrfilos que vari entre un 20% y un 31%. Los animales normales al examen clnico mostraron en las clulas recobradas del LBA un porcentaje igual o inferior al 8% de neutrfilos, lo que est en perfecta coincidencia con lo reportado anteriormente (Hare y col 1994, Robinson y col 2001). De estos resultados parece evidente, en equinos con ORVA, la perfecta correlacin que existe entre la presencia de neutrfilos en el rbol bronquial y los signos clnicos. En la figura 1A puede verse el aspecto de un frotis de LBA normal en que abundan macrfagos, linfocitos y algunas clulas epiteliales, no observndose la presencia de neutrfilos. En la figura 1B se muestra un frotis del LBA que corresponde a un caballo con ORVA con signologa clnica moderada en que se ve una gran cantidad de neutrfilos y una escasa presencia de macrfagos y linfocitos. 85

G MORN Y COL

Adicionalmente, como hallazgo curioso puede verse en la figura 1C el aspecto de un frotis de clulas obtenidas de un caballo positivo a esta enfermedad, mostrando un 57% de polimorfonucleares eosinfilos; observaciones como esta ltima han sido descritas anteriormente como consecuencia de parasitismo pulmonar, por lo general causado por Dictyocaulus arnfieldi o producto de la migracin de scaris, que preferentemente en el equino es Parascaris equorum (Morn y col 2006). Tambin hallazgos similares han sido atribuidos a un cuadro poco frecuente en equinos denominado eosinofilia pulmonar idioptica (McGorum y Dixon 1994) o al efecto aditivo de las numerosas citoquinas producidas en los primeros estadios de una reaccin de hipersensibilidad tipo I en el pulmn (Hare y col 1998). En este caso, esta ltima parece ser la causa del hallazgo descrito, ya que en lavados posteriores la eosinofilia fue reemplazada por una neutrofilia evidente; sin embargo, un efecto concomitante de una parasitosis para que se produzca esta eosinofilia exagerada no puede ser descartado ya que sabemos que los antgenos parasitarios son particularmente buenos inductores de clulas T helper de tipo 2 (TH-2) cuya activacin es necesaria para que se produzca la inflamacin alrgica en el pulmn (Robinson 2001). Otro hallazgo nico en el grupo de animales estudiados lo constituye un caballo que present en el LBA un 86% de clulas epiteliales (figura1D) cuando en general stas no deben sobrepasar el 5%, aumento que puede ser atribuido a causas iatrognicas durante el lavado o a procesos infecciosos generalmente de carcter viral, siendo esto ltimo la aparente causa de este hallazgo, ya que al examen endoscpico se pudo observar un gran dao de la va area superior, con una exfoliacin masiva del epitelio respiratorio. Adems, una infeccin respiratoria viral previa de los equinos actuara como un factor predisponente para desencadenar el cuadro de ORVA; lo ms probable es que un animal afectado por un cuadro viral presente una respuesta mucho ms severa a la inhalacin de esporas de hongo, debido principalmente a la grave alteracin producida por los virus sobre el sistema mucociliar, facilitando de esta manera la penetracin de las esporas en el sistema respiratorio (Morn y col 2006); sin embargo, en este caso el equino no hizo ORVA ya que al evaluar posteriormente los fluidos bronquiales volvi a la normalidad en sus valores. Al examinar el forraje de la poblacin animal en estudio pudo determinarse la presencia de esporas de Aspergillus fumigatus en gran cantidad, hecho que no debe llamar la atencin ya que Araya y Zaror (1995) demostraron la presencia de este hongo en un 80% de muestras de forrajes en 17 criaderos de caballos chilenos de las provincias de Valdivia y Osorno. Establecida la presencia de este hongo en el ambiente se quiso determinar el nivel de anticuerpos especficos presentes en el suero de estos animales contra antgenos de Aspergillus fumigatus. Los resultados demostraron, como puede verse en la figura2, que tanto los animales ORVA positivos como los animales sanos mostra86

Figura 1. Citologa de lavado bronquioalveolar de caballo Chilote: (A) citologa caballo sano; (B) cuyo conteo diferencial indic 80% de polimorfonucleares neutrfilos; (C) conteo diferencial de polimorfonucleares eosinfilos indic 57% y (D) conteo diferencial indic un 86% de clulas epiteliales. Tincin May Grnwald-Giemsa.
Smears of cells obtained from bronchioalveolar lavage cytology of Chilote horse stained with May Grnwald-Giemsa. (A) Cytology obtained from a normal horse showing epithelial and mononuclear cells. (B) Aspect of a smear of an RAO positive horse showing great percentage of polimorphonuclear neutrophils. (C) Smear obtained in a special case were 57% of cells present in BALF were polimorphonuclear esosinophils and (D) a unique sample of BALF that shows 86% of cylindrical and ciliated epithelial cells.

ban niveles similares de inmunoglobulinas antiprotenas de Aspergillus fumigatus. Estos resultados concuerdan con lo descrito por Schmallenbach y col (1998) quienes sugieren que las protenas de Aspergillus fumigatus son altamente inmunognicas y adems concuerdan con los reportes obtenidos por los mismos autores y Eder y col (2001), quienes encontraron que los niveles de IgG especfica en el suero no tenan diferencia entre los caballos con ORVA y los individuos sanos. Sin embargo, estos mismos autores demostraron que los niveles de IgG e IgE especficas en el LBA eran significativamente ms altos en individuos con ORVA que en caballos sanos. Estos resultados demuestran adems la amplia distribucin del antgeno, ya que todos los animales se encuentran inmunizados, dependiendo por tanto la presentacin de la enfermedad a causas adicionales, probablemente localizadas en el rbol bronquial. Una de estas causas probables podra pertenecer al mbito de la inmunidad innata, ya que est demostrado que los polisacridos, glucanos, galactomananos y componentes proteicos de Aspergillus fumigatus en su primer encuentro con los fagocitos y el epitelio del rbol bronquial estimulan de inmediato a los TLR-2 y TLR-4, induciendo a estas clulas a producir citoquinas proinflamatorias IL-1 y TNFalfa (Meier y col 2003), lo cual inducira la secrecin de IL-6 e IL-8, para seguir con la produccin de IL-17 por

CABALLOS CHILOTE, ORVA, LBA, ALERGIA

1,5

* *

1,0 ODa 490 nm

0,5

0,0 ORVA Control

examen fsico, se les evalu la citologa pulmonar mediante un lavado bronqueoalveolar (LBA) y se les extrajo suero sanguneo, con el propsito de determinar anticuerpos especficos contra Aspergillus fumigatus a travs de un ELISA indirecto. Los resultados obtenidos de los extendidos celulares hechos a partir del LBA muestran que el porcentaje relativo de neutrfilos encontrados en los caballos con ORVA era concordante con los hallazgos obtenidos en el examen clnico. Con respecto a la prueba de ELISA se determin que todos los animales, incluidos los controles, tenan niveles similares de anticuerpos especficos contra Aspergillus fumigatus no existiendo diferencias entre los individuos con ORVA y el grupo de animales sanos (P > 0,05). Se puede concluir que los caballos Chilote, al igual que las otras razas de caballo, tienen la predisposicin de hacer ORVA al estar sensibilizados con los alrgenos inductores de este cuadro alrgico pulmonar y que existe concordancia entre el porcentaje de neutrfilos encontrados en el LBA y la gravedad de los sntomas clnicos de estos animales. Adems, los antgenos de Aspergillus fumigatus tienen un rol importante en la induccin de ORVA en esta especfica raza de caballo.

Figura 2. Niveles de inmunoglobulinas especficas para Aspergillus fumigatus en suero de caballos Chilote con ORVA y grupo control sano (*P > 0,05).
Levels of specific antibodies against Aspergillus fumigatus in serum of RAO positive (ORVA) and control Chilote horses.

REFERENCIAS
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parte de clulas NKT residentes. IL-8 e IL-17 podran explicar por s solas la presencia de los neutrfilos en el rbol bronquial de los caballos positivos a ORVA, tal como parece estar demostrado en ratones y en asma humana (Afzali y col 2007); adicionalmente, este efecto podra verse reforzado con la formacin de complejos inmunes que tienden a prolongar la inflamacin pulmonar y a perpetuar la infiltracin neutroflica mediante la generacin de factores quimiotcticos derivados de la activacin del complemento. Esta mirada renovada de la patognesis del ORVA viene, en cierta forma, a complicar la visin anterior ms simplista que propona una explicacin basada en la superposicin de una hipersensibilidad tipo I, mediada por anticuerpos reargnicos, con una hipersensibilidad tipo III mediada por complejos antgeno-anticuerpo. Se puede concluir que los caballos Chilote, al igual que las otras razas equinas, tienen la predisposicin de presentar ORVA al estar sensibilizados con los alrgenos inductores de este cuadro pulmonar, sugiriendo que la presentacin de este cuadro alrgico pulmonar en equinos se debe a la interaccin de factores genticos y ambientales, al igual que los cuadros alrgicos humanos; adems, los antgenos de Aspergillus fumigatus tienen un rol importante en la induccin de ORVA en esta raza de caballos. RESUMEN
El objetivo de este estudio fue analizar las caractersticas citolgicas del lavado bronquealveolar (LBA) y la respuesta inmune humoral en caballos Chilote con obstruccin recurrente de las vas areas (ORVA) contra Aspergillus fumigatus y su rol en la induccin de este cuadro alrgico. Para esto, se utilizaron 22 caballos Chilote, de los cuales 13 presentaban ORVA y 9 estaban clnicamente sanos, los cuales fueron utilizados como controles. A todos los animales se les realiz un

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Arch Med Vet 41, 89-95 (2009) COMUNICACIN

Caracterizacin demogrfica de la poblacin de perros de Via del Mar, Chile


Demographic characterization of the dog population in Via del Mar, Chile
MA Morales*, C Varas, L Ibarra
Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias, Universidad de Chile, Santiago, Chile.

SUMMARY The high population of dogs living in the streets, specially in tourist destinations such as Via del Mar represents a problem that requires to study some of the characteristics of this population, starting with the dogs that have an owner. A random survey sample of 861 households proportionally stratified according to the number of households in twelve locations of the city was carried out. The information was gathered by handing a questionnaire survey to house owners. Total population was estimated in 100,717 dogs with 95% confidence limits of 92,961 and 108,463; there was an average of 0.95 dogs per household, sex ratio was 1.6 males per 1 female, mean age was 4 years and 7 months, and human-dog ratio was 4.1 people per dog. The crude rate of fertility was 39.1%, and general fertility rate was 115.1%; the total fertility rate shows that every female rears 10 puppies during her reproductive life. The mortality rate was 23%. The growth rate was 8.2% and the turnover rate was 25%. Palabras claves: demografa, perros, Chile. Key words: demography, dogs, Chile.

INTRODUCCIN El hombre ha permitido que el perro se reproduzca en forma desordenada, lo ha echado de la casa para que busque su alimento y lo ha abandonado una vez que se ha aburrido de l, propiciando que se convierta en un serio problema social en muchas ciudades y comunidades (lvarez y Domnguez 2001). A travs del tiempo, esta tenencia irresponsable ha creado problemas de exceso de animales, amenazas a la salud, contaminacin, molestias, crueldad y abandono (Collins 1976). Se han publicado datos aislados sobre el tamao de la poblacin canina en algunas poblaciones o pases, generalmente obtenidas de encuestas especficas realizadas en localidades que desean conocer la dinmica poblacional del perro con objeto de estar en mejores condiciones de implementar medidas de control (lvarez y Domnguez 2001). En Chile existen estudios de demografa canina desde el ao 1966 (Montes 1966), cambios que se han observado (Morales y col 1993), y otros estudios que a la fecha han abarcado ciudades del norte, centro y sur del pas. No cabe duda que la presencia de perros en ciudades con atractivos tursticos, mercados, playas, sitios arqueolgicos o cualquier otro lugar de inters para visitantes nacionales y extranjeros constituye un aspecto negativo para la promocin de la llamada industria sin chimeneas y los ingresos por este concepto (lvarez y Domnguez 2001).

En los ltimos aos, la sociedad de Via del Mar ha experimentado diversos cambios con relacin a la tenencia responsable de mascotas y control de la poblacin canina a travs de la aprobacin de una ordenanza municipal en el ao 2001, un programa de esterilizacin de hembras caninas, campaas de desparasitacin, estudios de captura y recaptura de perros callejeros en el centro de la ciudad y diversas campaas de educacin por parte de la Seccin de Medio Ambiente de la Ilustre Municipalidad de Via del Mar. Pero esta iniciativa no se ha visto sustentada en un conocimiento de la poblacin existente que abarque todos los sectores de la ciudad, para un futuro programa global y sectorial de control de poblacin canina. Por este motivo se realiz un estudio de caractersticas demogrficas de la poblacin canina con dueo de la ciudad de Via del Mar. MATERIAL Y MTODOS Se estudi la poblacin canina con dueo existente en la ciudad de Via del Mar. Se utilizaron los planos de los sectores y unidades vecinales de dicha ciudad (Servicio Comunal de Planificacin de la Ilustre Municipalidad de Via del Mar), los planos zonales censales de la misma y el Censo de Poblacin 2002 (Instituto Nacional de Estadsticas V Regin y Oficina Censal Comunal del Servicio Comunal de Planificacin de la Ilustre Municipalidad de Via del Mar). Se confeccionaron un formulario de encuesta, un manual de instrucciones para los encuestadores, cartas de presentacin y credenciales de identificacin y planos de recorrido. Se trabaj con personal y vehculos de la 89

Aceptado: 20.06.2008. * Casilla 2 correo 15, Santiago, Chile; mamorale@uchile.cl

MA MORALES Y COL

I.Municipalidad de Via del Mar y encuestadores capacitados previamente. La unidad de muestreo fue la vivienda. El tamao de la muestra se determin bajo el supuesto de un promedio de 0,733 perros por vivienda y una desviacin estndar de 0,977 (Acua 1998). Para estimar la poblacin con un error de 0,09 y un 99% de confianza, se obtuvo un tamao de muestra de 784 viviendas, usando la frmula para tamao de muestra de Cochran (1963). Teniendo en cuenta una probabilidad de no respuesta del 20%, el total de viviendas encuestadas sera de 940, distribuidas proporcionalmente segn nmero de viviendas por sector de la ciudad de Via del Mar. Se logr encuestar un total de 861 viviendas seleccionadas al azar, que respondieron satisfactoriamente (8,4% de no respuesta). El marco fue constituido por los planos que muestran los doce sectores de la ciudad de Via del Mar con sus respectivas Unidades Vecinales y los Planos Zonales Censales correspondientes al Precenso de Vivienda 2001, que posteriormente se utiliz para el Censo de Poblacin 2002. Los planos estn identificados segn el Distrito, Zona Censal y Unidad Vecinal que correspondan. Se hizo un listado de los doce sectores y sus unidades vecinales correspondientes y se obtuvo el nmero de manzanas de cada unidad vecinal y por ende de cada sector. Se enumer en forma ascendente cada manzana hasta llegar a completar el total de manzanas por sector. La forma de identificacin de las viviendas seleccionadas dentro de la manzana tuvo un orden, empezando a contar las viviendas a partir de la esquina noroeste, caminando alrededor de la manzana en el sentido contrario a las manecillas del reloj, y a medida que se avanzaba alrededor de la misma, se contaron solamente las unidades de vivienda que que-

daban a la izquierda hasta completar el total de viviendas por manzana (Kish 1972). Se visit previamente las reas seleccionadas, con el objeto de sensibilizar a los habitantes sobre el motivo de la encuesta y se realiz una encuesta piloto en una vivienda por sector. La encuesta se llev a cabo en noviembre de 2002, durante dos semanas, en un horario de 9:00 a 18:30 horas y de 19:00 a 22:00 horas. Las dos semanas siguientes se utilizaron para validar las respuestas de la encuesta e insistir con las viviendas que no haban contestado previamente. Los datos fueron procesados utilizando el programa Epi Info 2002 (Dean y col 2002). Para el anlisis se construyeron distribuciones de frecuencias con las variables, se calcularon tasas de fecundidad, mortalidad y migracin utilizando las frmulas de Haupt y Kane (1991). RESULTADOS Y DISCUSIN La poblacin canina de la ciudad de Via del Mar fue estimada en 100.717 individuos, con lmites de confianza (95%) de 92.961 y 108.463 perros, Chorrillos es el sector con menor poblacin canina con un nmero estimado de 3.264 perros y Achupallas el sector con mayor poblacin con 12.879 (cuadro 1). La estructura de la poblacin canina por sexo para la ciudad de Via del Mar es 62% para los machos y 38% para las hembras, lo que determina una razn de masculinidad de 1,63:1, semejante a muchas ciudades de Chile y de los pases en vas de desarrollo, en que se observa una mayor existencia de machos respecto de hembras (Margawani y Robertson 1995, Nunes y col 1997, Gttler 2005). En comparacin con otras ciudades del pas esta razn es

Cuadro 1. Poblacin estimada de perros, lmites de confianza, razn de masculinidad, edad media y porcentaje de mestizos, Via del Mar, Chile.
Estimated dog population, confidence limits, sex ratio, mean age and percentage of crossed breed per area, Via del Mar, Chile.

Sector Nueva Aurora Recreo Forestal Chorrillos Oriente Miraflores Santa Ins Plan Achupallas Gmez Carreo Reaca Alto Reaca Bajo Total Via del Mar

Poblacin estimada 7.121 10.424 12.215 3.264 10.777 10.040 3.950 8.712 12.879 5.483 9.951 5.901 100.717

Lmites de confianza 5.006 8.430 9.411 2.381 8.673 7.157 2.226 6.517 2.917 2.917 7.995 5.054 92.961 9.236 12.418 15.019 4.147 12.881 12.923 5.674 10.907 11.907 8.049 11.907 7.748 108.463

Razn de masculinidad 2,73:1 1,18:1 2,50:1 3,14:1 1,10:1 1,55:1 1,50:1 1,17:1 1,37:1 1,59:1 3,04:1 1,19:1 1,63:1

Edad media 4 aos 3 meses 4 aos 9 meses 4 aos 9 meses 4 aos 2 meses 5 aos 7 meses 4 aos 2 meses 5 aos 5 meses 5 aos 8 meses 3 aos 0 meses 6 aos 2 meses 3 aos 9 meses 4 aos 8 meses 4 aos 7 meses

% mestizos 82,1 42,4 76,9 72,4 70,5 79,8 84,0 31,6 75,5 50,0 80,6 19,6 64,7

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DEMOGRAFA, PERROS, CHILE

ms estrecha, lo que indica una menor discriminacin hacia las hembras como se observa en la mayora de las ciudades de Chile, a excepcin de Iquique, con un ndice de masculinidad de 1,6:1 (Luza 1996). El resto de las ciudades muestran a Chilln con un ndice de masculinidad de 2,1:1 (Vliz 1993), Santiago 1,9:1 (Acua 1998), Osorno 1,9:1 (Ruiz 1999) y Valdivia 2,4:1 (Gttler 2005). Si se compara con ciudades de Sudamrica, el ndice de masculinidad es mayor en Via del Mar, es as como en Araatuba, So Paulo (Nunes y col 1997), y en Bogot el valor es de 1,3:1 (Urrego y Lanzziano 1999). En Bali, el ndice de masculinidad es ms alto ya que el valor se eleva a 5,7:1 (Margawani y Robertson 1995). En algunas comunas de Zimbabwe tambin el valor es 1,3:1 (Butler y Bingham 2000). En Estados Unidos y Reino Unido los valores de ndice de masculinidad son menores que en Via del Mar, acercndose al valor de 1:1, lo que representa una menor discriminacin hacia la tenencia de hembras. En St Joseph, Indiana, es 0,9:1 (Patronek y col 1997). En el Reino Unido, el ndice de masculinidad es 1:1 (Thrusfield 1989, Michel 1999). La edad promedio de la poblacin canina de Via del Mar fue estimada en 4,58 aos (4 aos 7 meses), con una desviacin estndar de 3,9 aos (cuadro 1). El promedio es mayor que en otras ciudades y localidades de Chile, pero semejante a los promedios de ciudades de pases desarrollados. En Chilln, 4,2 aos (Vliz 1993), en Valdivia es de 3,5 aos (Garca 1995) al igual que en Iquique (Luza 1996), en Santiago, 3,8 aos (Acua 1998), en Osorno, 4,1 aos (Ruiz 1999). En comparacin con Bogot, el promedio de edad en esta ciudad es ms bajo que en Via del Mar con un valor de 3,5 aos (Urrego y Lanzziano 1999). En algunas comunas de Zimbabwe, la poblacin es ms joven, con un promedio de edad de 2 aos (Butler y Bingham 2000). En cambio, en Estados Unidos y el Reino Unido los promedios se asemejan a Via del Mar. Patronek y col (1997) en St Joseph, Indiana, encontraron una mediana de 5 aos. En el Reino Unido el promedio de edad de la poblacin canina es de 4,8 aos (Thrusfield 1989). En Bahamas el promedio de edad alcanz los 3 aos (Fielding y Mather 2001). Con respecto a la pirmide poblacional canina de Via del Mar, figura 1, su forma muestra una poblacin donde abundan los perros menores de un ao, especialmente los machos. Se observa el control ejercido sobre el tamao de la poblacin de este grupo de edad, probablemente por efecto de sacrificio, lo que afecta al grupo de 1 ao. Por otra parte, la menor amplitud de las barras a los 4 y 9 aos de edad refleja el hbito de las personas a redondear o recordar edades en cifras terminadas en 5 o 10. Observando otras pirmides poblacionales, su forma difiere de la pirmide poblacional de Reino Unido de 1986 (Thrusfield 1989), especialmente por la proporcin de perros menores de 1 ao de edad.

20 19 18 17 16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 <1 20 15 10 5 0 5 10 15 20

Edad (aos)

% Machos

% Hembras

Figura 1. Pirmide poblacional de perros, Via del Mar, Chile.


Dog population pyramid, Via del Mar, Chile.

La existencia estimada de perros mestizos en la ciudad de Via del Mar se eleva a un 64,7%, semejante al de Santiago, con un 67,1% (Acua 1998), pero menor al resto de las ciudades del pas, lo que indica una mayor tenencia de perros de raza en ambas ciudades. En Iquique los perros mestizos representan el 75% de la poblacin canina (Luza 1996) y en Osorno el 74,4% (Ruiz 1999). Si se compara con St Joseph, Indiana, Estados Unidos (Patronek y col 1997), el porcentaje de perros mestizos en Via del Mar es mayor. Con respecto a los perros no mestizos, se estima que la raza ms frecuente en Via del Mar es Cocker Spaniel con un 6,6% de la poblacin canina total. Esto difiere de la mayora de las ciudades de Chile donde el Ovejero Alemn ocupa el primer lugar; es el caso de Chilln (Vliz 1993), Valdivia (Garca 1995); la excepcin es Iquique, donde la raza Pekins fue proporcionalmente mayor (Luza 1996). Con relacin a trabajos de pases desarrollados, en Suecia, Sallander y col (2001) observaron que la raza ms frecuente era la Dachshund y en el Reino Unido, el Labrador Retriever (Thrusfield 1989). En el cuadro 2 se presentan resultados que relacionan la poblacin de perros con la vivienda y con sus habitantes. El Plan es el sector con menor nmero de perros por vivienda y Forestal el sector con el promedio ms alto de perros por vivienda. En la ciudad de Via del Mar se obtuvo un promedio de 0,95 perros por vivienda, es decir, casi un perro por vivienda, lo que es bastante alto comparado con estudios en otras ciudades de Chile como, por ejemplo, Chilln, con un promedio de 0,77 perros por vivienda (Vliz 1993), Valdivia, 0,54 (Garca 1995), Iquique, con un promedio de 0,45 perros por vivienda (Luza 1996), Santiago 0,76 (Acua 1998), Osorno 0,63 (Ruiz 1999). En Zimbabwe, el promedio de perros por vivienda es an ms alto, llegando a 1,5 en algunas de sus comunas (Butler y Bingham 2000). En cambio, en pases desarrollados, este promedio es ms bajo; 0,48 en St Joseph, Indiana (Patronek y col 1997), y 0,32 en el Reino Unido (Thrusfield 1989). 91

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Cuadro 2. Nmero promedio de perros por vivienda, razn persona: perro, principal razn de la tenencia y porcentaje de confinamiento permanente en la vivienda segn sector, Via del Mar, Chile.
Mean number of dogs per household, human: dog ratio, main reasons for keeping dogs and percentage of permanent confinement per area, Via del Mar, Chile.

Sector Nueva Aurora Recreo Forestal Chorrillos Oriente Miraflores Santa Ins Plan Achupallas Gmez Carreo Reaca Alto Reaca Bajo Via del Mar

Promedio perros por vivienda 1,27 1,05 1,28 1,21 1,14 1,04 1,04 0,43 1,17 0,85 1,22 0,71 0,95

Razn Persona: perro 3,4:1 3,8:1 3,2:1 3,2:1 3,4:1 3,2:1 4,4:1 8,0:1 3,6:1 4,7:1 3,6:1 5,6:1 4,1:1

Principal razn de la tenencia Afectivo-guardin Afectivo-guardin Afectivo-guardin Afectivo-guardin Afectivo-guardin Afectivo Afectivo-guardin Afectivo Afectivo Afectivo-guardin Afectivo-guardin Afectivo-guardin

Porcentaje de confinamiento permanente 67,9 84,7 65,9 79,3 76,1 60,7 96,0 79,4 79,4 81,8 76,3 95,7 77,5

En Via del Mar, el 57% de las viviendas posee al menos un perro, valor superior al de otras ciudades como Iquique donde el 35,5% de las viviendas posee al menos un perro (Luza 1996), Osorno, el 47% (Ruiz 1999), Valdivia con un 44,9% (Gttler 2005). Chilln (Vliz 1993) y Santiago (Acua 1998) son las ciudades que ms se asemejan a los valores de Via del Mar con 52,8% y 51,7% respectivamente. Comparado con otros pases del mundo, el resultado de porcentaje de viviendas con perro es ms alto en Via del Mar, con excepcin de algunas comunas de Zimbabwe donde alcanza a 62% (Butler y Bingham 2000). En St Joseph, Indiana (Patronek y col 1997), se encontr un 21,7%. En otras ciudades como Bali, Indonesia, es de 39% (Margawani y Robertson 1995) y en Araatuba, So Paulo, Brasil, es de 50,4% (Nunes y col 1997). La relacin persona: perro (cuadro 2) en Via del Mar arroj un valor de 4,1:1, razn que se encuentra dentro de los valores de distintas ciudades. En Santiago y Bogot, esta razn es ms amplia con valores de 6,4:1 (Acua 1998) y 10,86:1 (Urrego y Lanzziano 1999) respectivamente. El valor observado en Via se asemeja a los mostrados en Araatuba, So Paulo con una razn de 4,2:1 (Nunes y col 1997) y en algunas comunas de Zimbabwe, con una razn de 4,7:1 (Butler y Bingham 2000). La razn de tenencia estimada para la poblacin canina en la ciudad de Via del Mar se resume en un 42,4% por razn afectiva, 13,3% por razn de guardin, 41,4% por ambas razones y el 3,2% por otras razones. Comparando con Santiago, las razones de afectividad en Via del Mar son mayores, ya que el problema de seguridad es menos relevante que en la capital de Chile, y es as que en Santiago 92

la opcin afectiva es de 22,4% y la de guardin el 41,4% (Acua 1998). En el resto de las ciudades de Chile las opciones afectiva y guardin son mayoritarias, pero en todas las ciudades la opcin afectiva prevalece al igual que Via del Mar, mostrando un 62,8% en Chilln (Vliz 1993), un 73,17% en Valdivia (Garca 1995), un 81,5% en Iquique (Luza 1996), un 64,5% en Osorno (Ruiz 1999). En algunas comunas de Zimbabwe, las razones de tenencia afectivas en este pas no superan el 1,2%, mientras que la opcin de guardin alcanza a 60% (Butler y Bingham 2000); en Suecia (Sallander y col 2001) un 64 % se usa como animal de cra y 16% para caza. De los 12 sectores de la ciudad de Via del Mar en 10 de ellos predomina la razn afectiva-guardin (cuadro 2). En cuanto al confinamiento (cuadro 2) se estima que en la poblacin canina de la ciudad de Via del Mar el 77,5% es permanente, el 10,5% temporal y el 12% sin confinamiento. El sector donde se manifiesta principalmente el confinamiento permanente es Reaca Bajo. En comparacin con otras ciudades de Chile, la poblacin canina de Via del Mar, en el grado de confinamiento permanente, slo es superada por Santiago con un 85,4% (Acua 1998); en el resto de las ciudades el porcentaje es menor, lo que indica un menor control y mayor tenencia irresponsable de mascotas: Chilln con un 63,6% (Vliz 1993), Valdivia con un 61,93% (Garca 1995), Iquique con un 59,6% (Luza 1996), Osorno, con un 61% (Ruiz 1999). En St Joseph, Indiana, Estados Unidos, el grado de confinamiento permanente alcanza al 89,5% (Patronek y col 1997), lo que indica mayor control por parte de la poblacin y mayor conciencia de tenencia responsable de mascotas.

DEMOGRAFA, PERROS, CHILE

Segn cmo la poblacin canina sale a la calle, el 42% (37% para los machos y 49,8% para las hembras) lo hace acompaada con sus dueos y con correa, lo que obedece a la ordenanza municipal vigente. El 22% (23% para los machos y 19,6% para las hembras), aunque salen acompaados de sus dueos, no salen con correa a la calle. El 36% (40% para los machos y 30,6% para las hembras) de la poblacin canina sale a la calle sin ningn control. Esto seala que los dueos mantienen un mayor control sobre las hembras que sobre los machos, ya que se observa una mayor proporcin de machos que permanece libre en la calle. La tasa general de natalidad (TGN) estimada para la poblacin canina de la ciudad de Via del Mar es de un 39,1%, de modo que de 100 individuos de la poblacin 39 nacen durante el ao; esto es levemente mayor que la TGN registrada para la ciudad de Santiago, con un 36,2% (Betzhold 1998) y mayor que la registrada en Bogot que fue de un 21,1% (Urrego y Lanzziano 1999), lo que indica que en Via del Mar nacen ms cras vivas por ao con relacin a la poblacin de perros que en las ciudades mencionadas. La tasa de fecundidad general (TFG) es de 115,1%, resultado mayor que el registrado para la ciudad de Santiago con un 103% (Betzhold 1998), lo que significa que nacen ms cras vivas por ao por cada 100 hembras caninas en edad frtil en la ciudad de Via del Mar con respecto a Santiago. La tasa de fecundidad especfica por edad estimada muestra que la edad ms frtil de las hembras caninas de Via del Mar es la de 1 ao de edad, con un valor de 166,7%; a continuacin las hembras de 2 a 4 aos y tambin las de 6 y 7 aos. De los 11 aos en adelante la fecundidad es cero, aunque excepcionalmente hubo hembras que parieron despus de esa edad (cuadro 3). En Santiago, la mayor fecundidad se obtuvo en hembras entre 6 y 10 aos de edad, con un valor de 136,1% (Betzhold 1998). La Tasa Global de Fecundidad (TGF) es de 10 cras, resultado menor que el registrado para la ciudad de Santiago con un valor de 16,1 (Betzhold 1998), lo que implica que en Via del Mar una hembra tiene menos descendencia en toda su vida reproductiva que en la ciudad de Santiago.

El tamao de camada promedio al nacimiento es de 4,95 cras; las hembras jvenes tienen un promedio de 6 cras, de las cuales todas nacieron vivas, en cambio, en las hembras mayores de 10 aos de 4 cras totales 3,5 nacen muertas (cuadro 4). La cifra de 4,95 cras promedio de Via es similar a la de Iquique con 5,2 cras (Luza 1996), a la de Santiago con 4,58 cras (Betzhold 1998), a la de Osorno con 4,6 cras (Ruiz 1999) y slo es mayor en la ciudad de Valdivia con 7,3 cras (Garca 1995). En algunas comunas de Zimbabwe el valor es de 4,6 cras (Butler y Bingham 2000). La tasa general de mortalidad, que es de un 23%, indica que de 100 individuos totales de la poblacin 23 mueren durante el ao, y es mayor en hembras (25,1%) que en machos (21,7%). El promedio es ms alto que en Santiago con un 10,3% (Brizuela 1998) y Bogot con un 8,14% (Urrego y Lanzziano 1999). Esta tasa de 23% se explica por la alta mortalidad de la poblacin menor de un ao de

Cuadro 3. Tasas de fecundidad especfica por edad en hembras caninas, Via del Mar, Chile.
Chile. Specific fertility rates of bitches per age, Via del Mar,

Edad (aos) Menor de 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Mayor o igual a 15

Tasa de fecundidad especfica (por 100) 11,8 166,7 143,8 132,4 132,0 71,4 126,3 104,5 33,3 0,0 60,0 0,0 0,0 0,0 0,0 20,0

Cuadro 4. Razones de reproduccin en hembras caninas segn edad de la madre, Via del Mar, Chile.
Reproduction rates of female dogs according to the mothers age, Via del Mar, Chile.

Edad de la madre (aos) Razn Tamao camada al nacimiento Promedio de cras nacidas vivas Promedio de cras nacidas muertas Menor de 1 6,00 6,00 0,00 1 a 1,9 5,71 5,36 0,36 2 a 4,9 4,83 4,20 0,13 5 a 10 4,67 4,33 0,33 Mayor de 10 4,00 0,50 3,50 Total 4,95 4,38 0,56

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edad que constituye la poblacin con mayor nmero de perros de la ciudad de Via del Mar, mortalidad que se ve reflejada claramente en su efecto sobre el tamao del grupo de 1 ao en la pirmide poblacional. En Ontario, Canad, se observ una mortalidad mucho menor (260 muertes en 10.000 perros asegurados) (Bonnett y col 1997). La tasa de mortalidad especfica por edad, tal como se acaba de sealar, muestra un valor alto en los perros menores a 1 ao de edad y tambin en los perros sobre 15 aos, semejndose a la observada en Santiago (Brizuela 1998), pero con valores bastante superiores. La causa ms frecuente de mortalidad fue el aplastamiento de perros por la madre, con un 4,6%, lo que explica la alta mortalidad en perros menores de 1 ao de edad. Tambin se declararon como causas importantes las intoxicaciones y los atropellos; en cambio, en Santiago la causa ms frecuente fueron las enfermedades con un 2,9% (Brizuela 1998). El otro factor que influye en el tamao de la poblacin son los movimientos migratorios. La tasa de inmigracin estimada para la poblacin canina de la ciudad de Via del Mar fue de un 21,5%, valor similar al de la ciudad de Santiago con un 22,34% (Gigoux 2002). El valor para los machos fue de 22,8%, parecido al de Santiago, con 21,89%, y en las hembras, el valor fue de 19,3%, valor menor al observado en Santiago, con 23,22% (Gigoux 2002). La tasa de emigracin estimada fue de un 29,4%, valor notoriamente mayor al registrado para la ciudad de Santiago que fue de un 5,25% (Gigoux 2002). El valor para los machos fue de 25,6%, cifra mayor a la observada en Santiago, con 5,09%, y el de las hembras fue de 35,7%, cifra igualmente mayor a la observada en Santiago, con 5,58% (Gigoux 2002). Como consecuencia de las dos tasas anteriores, la tasa neta de migracin estimada alcanz un valor negativo, 7,94%, lo que indica que hay ms poblacin que emigra que la que inmigra. Por otra parte, en Santiago el valor es positivo, con un 17,09% (Gigoux 2002). Si se consideran en conjunto las tasas de fecundidad general, de mortalidad general y neta de migracin la tasa de crecimiento anual estimada para la poblacin canina de la ciudad de Via del Mar es de un 8,2%, valor menor que el registrado para la ciudad de Bogot con un 13,12% (Urrego y Lanzziano 1999) pero mayor a los registrados en California, con un 1,4% (Kass y Hansen 2000) y algunas comunas de Zimbabwe, con un 6,52% (Butler y Bingham 2000); esto significa que en un perodo cercano a los 12 aos la poblacin canina de Via del Mar podra crecer al doble si no se realiza un efectivo control. La tasa de renovacin anual estimada para la poblacin canina de la ciudad de Via del Mar es de un 25%, mayor a la registrada en St Joseph, Indiana, con un 14,1% (Patronek y col 1997), y Bogot, con un 16,3% (Urrego y Lanzziano 1999). 94

RESUMEN
El nmero excesivo de perros callejeros, especialmente en una ciudad con las caractersticas tursticas de Via del Mar, representa un problema que hace necesario conocer algunas de las caractersticas de esta poblacin, en primer lugar de aquellos perros con dueos. Se obtuvo una muestra al azar de 861 viviendas que fueron proporcionalmente distribuidas segn el nmero de viviendas de los 12 sectores de la ciudad. La informacin fue recolectada mediante un cuestionario que se aplic a los dueos de la vivienda. Se estim una poblacin total de 100.717 perros con lmites de confianza al 95% de 92.961 y 108.463; haba un promedio de 0,95 perros por vivienda, la razn de masculinidad fue de 1,6:1, la edad media de los perros fue de 4 aos y 7 meses, la razn nmero de personas por perro fue de 4,1. La tasa general de natalidad fue de 39,1%, la tasa de fecundidad general fue de 115,1% y la tasa de fecundidad total seala que cada hembra durante su vida reproductiva tiene 10 cras nacidas vivas. La tasa de mortalidad fue de 23%, la tasa de crecimiento alcanz la cifra de 8,2% y la tasa de renovacin de la poblacin fue de 25%.

AGRADECIMIENTOS
Se agradece a la Ilustre Municipalidad de Via del Mar por el apoyo prestado a la realizacin de este trabajo.

REFERENCIAS
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Instrucciones para los autores ARCHIVOS DE MEDICINA VETERINARIA

Fundada en 1969 ISSN 0301-732x Revista seleccionada por los siguientes repertorios cientficos internacionales: Current Contents Agriculture, Biology and Environmental Sciences (CC/AB and ES), Commonwealth Agricultural Bureaux, International (C.A.B.I.), Dairy Science Abstracts, Veterinary Bulletin, Animal Breeding Abstracts; Helminthological Abstracts S.A., Biological Abstracts; Agrindex, Periodica, Focus on: Veterinary Sciences and Medicine.

Archivos de Medicina Veterinaria publica, en espaol o ingls, contribuciones cientficas originales en la forma de artculos cientficos, revisiones bibliogrficas y comunicaciones cortas que pueden incluir observaciones clnicas, descripciones de tcnicas o mtodos, y avances en todos los aspectos de las ciencias veterinarias y bienestar animal. Envo de la publicacin Los artculos deben ser enviados al Editor e incluir: Tres ejemplares impresos en papel, incluyendo los cuadros y figuras. Una versin electrnica del texto, cuadros (preferentemente en formato MS Word) y figuras (en formato Excel, JPG o TIFF, 300 dpi), deben adjuntarse en un CD, debidamente rotulado con el apellido del primer autor y las primeras palabras del ttulo del artculo. Los trabajos deben ser originales y, por lo tanto, no deben estar en proceso de arbitraje en otra revista. Los artculos que se presenten sin considerar las normas de estilo sern devueltos sin ser sometidos a revisin. Para experimentos con animales o humanos, el Comit Editor podr solicitar que se adjunte la autorizacin de un Comit de Biotica o instancia similar. Incluir y completar una declaracin de la responsabilidad de autora, con la firma de todos los autores. Se deber incluir una carta dirigida al Editor solicitando la publicacin de su trabajo y sealando a uno de los autores como responsable de la revisin de las pruebas de imprenta y de la correspondencia. La propiedad intelectual de los trabajos publicados pertenece a los autores. Los revisores de Archivos de Medicina Veterinaria asesoran al Comit Editor para decidir si el trabajo puede ser publicado. Los autores podrn sugerir revisores. Todos los artculos enviados para publicacin sern enviados a dos revisores seleccionados por el Comit Editor y pueden incluir, o no, los sugeridos por los autores. En caso de existir controversia en los informes, se recurrir a un tercero en carcter de rbitroarbitrador, que asesorar al Comit Editor para decidir el destino del trabajo. Los revisores estn obligados a mantener el carcter confidencial de toda la informacin de los trabajos, aun cuando no sean publicados. Previo a la publicacin de un trabajo aceptado se debe pagar un valor cuyo monto se seala en la Web www.medicinaveterinaria.cl

Forma y preparacin del artculo Tipos de artculos Artculos de revisin: son realizados por expertos que resumen y proyectan el conocimiento actualizado en un campo particular en las Ciencias Veterinarias, y no necesariamente se ajustan a un formato definido de presentacin. Los autores deberan previamente consultar a los editores antes de iniciar el trabajo de revisin. El Comit Editor podr solicitar a expertos el envo de artculos de revisin, los que tambin sern sometidos al proceso de arbitraje y edicin. No deben exceder de 30 pginas, incluidos cuadros, figuras y referencias. Artculos cientficos: stos informan un nuevo avance en Ciencias Veterinarias basados en una investigacin original. El formato de ellos deber incluir summary, introduccin, material y mtodos, resultados, discusin, resumen, agradecimientos (cuando corresponda) y referencias. No deben exceder de 20 pginas, incluidos cuadros, figuras y referencias. Comunicaciones cortas: informan de manera breve un avance, resultado de un experimento, observaciones clnicas o nueva metodologa, ajustndose al siguiente formato: summary, introduccin, material y mtodos, resultados y discusin (seccin conjunta), resumen, agradecimientos (cuando corresponda) y referencias. No deben exceder de 12 pginas, incluidos cuadros, figuras y referencias. Estilo y formato de la revista Presentacin general: la revista publica artculos en espaol o ingls. Los artculos debern ser escritos con letras Times New Roman 12, por un solo lado de las hojas, a interlineado y medio, en tamao carta (21,5 x 27,9 cm), dejando un margen de 2 cm en los cuatro bordes. Todas las pginas deben ser numeradas de manera consecutiva en el ngulo superior derecho, y las lneas debern ser numeradas en cada pgina, inicindose con el nmero 1, junto al margen izquierdo, en todo el trabajo. Los ttulos de captulos deben ser escritos en mayscula, justificados al lado izquierdo, en lneas separadas y sin punto final. Ejemplo: MATERIAL Y MTODOS. En los subttulos slo la primera letra es mayscula. (Ejemplo: Diseo experimental) y deber ser justificado al lado izquierdo. Subttulo secundario debe ser justificado al lado izquierdo y en letra cursiva. No debern usarse subrayado ni numeracin de subttulos o lista de tems.

Las cifras deben ser escritas en nmeros. Cuando estn al inicio de una frase, o cuando la claridad del texto lo requiera, deben ser expresadas en palabras. Un decimal deber ser precedido de un numeral usando punto cuando el artculo es en ingls o coma cuando el artculo es en espaol (Ejemplo: 0,5 no ,5). Mltiplos de mil deben escribirse separados por punto (Ejemplo: 1.000). Las medidas de cantidad debern ajustarse al Sistema Internacional de Unidades, a menos que la prctica en una disciplina use derivados de ellos (Ejemplo: la unidad internacional de Curie). Las fechas deben ser expresadas como 07 de septiembre de 1954 en el texto, pero pueden presentarse abreviadas en los cuadros y figuras. El tiempo diario se debe expresar segn las 24 horas cronolgicas (Ejemplo: 13:00 h). Para la nomenclatura qumica se deben utilizar las normas de la Sociedad de Bioqumica (Biochem J 209, 1-27, 1983), los frmacos o drogas deben ser mencionados por sus nombres genricos (en minsculas), si es necesario colocar marcas y sus fuentes debern ir a pie de pgina. Las enzimas deben ser identificadas, cuando se mencionan por primera vez, segn la Enzyme Commission of the International Union of Biochemistry. Los trminos en latn y sus abreviaciones que son de uso comn en la literatura cientfica, tales como: in vitro, in vivo, ad libitum debern ir en cursiva. Los valores de probabilidad deben ser dados en la forma de P < 0,05 o P < 0,01. Desviacin estndar, error estndar de la media e intervalos de confianza, se abreviarn en la forma siguiente: DE, EE y IC, respectivamente. Ttulo El ttulo del trabajo debe ser conciso, especfico e informativo. Slo la primera letra ser mayscula, en negritas, centrado, inicindose en la lnea 10, sin usar marcas comerciales o abreviaciones. Se deber sealar, con superndice (#) la fuente de financiamiento, si lo hubiese, que se detallar a pie de pgina. Separado por el espacio de una lnea se deber escribir el ttulo en ingls. Autores y direcciones Los nombres de los autores se escribirn bajo el ttulo separados por un espacio. Use iniciales (sin puntos) y apellido separando por comas entre los autores, ajustndose al siguiente ejemplo: CT Westwood, E Bramley, IJ Lean. Al trmino de cada nombre de autor debe identificarse con una letra en superndice, el nombre de la seccin, departamento, servicio o institucin a la que pertenece o perteneci dicho autor, durante la ejecucin del trabajo. La letra con un asterisco indica el autor responsable de la correspondencia, debindose sealar a pie de pgina el nmero de fax, correo electrnico y casilla de correo. Pie de pgina Sern usados para elaborar abreviaciones citadas en el ttulo de cuadros, marcas comerciales, nombre y direccin de empresas. Deben ser indicados con nmeros.

Summary La segunda pgina debe contener un summary, de no ms de 250 palabras y que describa los propsitos del estudio o investigacin, el material y mtodos empleados, los resultados principales y las conclusiones ms importantes. No se deben emplear abreviaturas no estandarizadas. En lnea aparte, separado por un espacio y justificadas a la izquierda se deben incluir key words (palabras clave) en minsculas, las que no deben ser ms de 4. Introduccin En la tercera pgina en la lnea 1 se escribir el ttulo del captulo. En la lnea siguiente, con sangra, predeterminada de un tabulador en 5 espacios, se plantearn los antecedentes que sustentan el propsito del artculo, sin un despliegue extensivo del tema y utilizando slo las referencias ms pertinentes. Se deben indicar, cuando corresponda, la hiptesis que se postula y los objetivos de la investigacin. Entre prrafos debe conservar el interlineado y medio. Material y Mtodos Separado por un espacio de la seccin anterior, se deber describir el captulo con suficientes detalles para permitir a otros repetir el estudio. Despus de la primera referencia en el texto a drogas o reactivos, se deben sealar el nombre genrico, dosis y va de administracin. Para el caso de equipo especializado se indicarn la marca, el modelo y el nombre del fabricante. Los mtodos estadsticos utilizados deben ser sealados como subttulos: Anlisis estadstico y deben incluir un adecuado detalle, que permita a los lectores establecer con precisin cmo han sido analizados y presentados los datos y las unidades de medidas en que estn expresadas (medias aritmticas, desviaciones estndares, errores estndares de la media, medianas, rangos o lmites de confianza, etc.). Si las pruebas usadas fueron paramtricas (Chi cuadrado, prueba t de Student, Anova, etc.) o no paramtricas (Wilcoxon, Kruskal-Wallis, etc.). Se debern identificar el nombre, la versin y el proveedor del programa computacional utilizado, ejemplo: SPSS versin 9.0 para Windows (SPSS Inc, Chicago IL, USA). Resultados Separado por el espacio de una lnea de la seccin anterior, se deber describir el captulo de resultados, presentado en forma concisa y lgica, sin discusin o referencia a otro trabajo. Los cuadros y figuras deben ser los mnimos necesarios y los datos no deben ser repetidos en el texto y tampoco debern ser mostrados simultneamente o reiterados. Discusin Esta seccin, separada por una lnea de la anterior, debe evaluar e interpretar los resultados, relacionndolos a los de otros estudios relevantes. No debe repetir resultados o presentar nuevos. Debe ser diligentemente tratada en su desarrollo, hacindola de manera lgica y concisa, estableciendo conclusiones, relevancias y proyecciones del trabajo. Debe evitarse formular conclusiones

que no estn respaldadas con sus hallazgos ni sustentadas en trabajos an no publicados. Resumen El resumen en espaol deber ser escrito en hoja aparte, y deber ajustarse a las mismas normas sealadas para el summary. Separadas por el espacio de una lnea se debern escribir las palabras clave en letras minsculas, no debiendo ser ms de cuatro y justificadas en el lado izquierdo. Agradecimientos Deben ser breves y slo incluir personas o instituciones que han hecho una contribucin directa, han provisto material necesario o dado las facilidades para la realizacin del estudio. Referencias La precisin con la que son sealadas las referencias es de responsabilidad de los autores y deben corresponder al artculo original; asegrese que todos los artculos citados en el texto estn incluidos en el listado de referencias y viceversa. En el texto, las citas se deben indicar entre parntesis y en orden cronolgico, citando el apellido del autor y la expresin y col despus del apellido del primer autor, cuando son ms de dos, Ej.: (Prez 1994, Castro y Martnez 1996, Cifuentes y col 2002). El listado de referencias debe ir en orden alfabtico de acuerdo al apellido del primer autor y debe incluir el apellido e iniciales de todos los autores. Cuando no se dispone del nombre del autor, use el trmino annimo entre comillas, tanto en el texto como en el listado de referencias. Las referencias, cuando son del mismo autor, solo o con ms autores, deben ser escritas en orden cronol gico. Las letras a, b, c, etc., deberan ser agregadas como superndice cuando un autor escribe ms de un trabajo en el mismo ao. Los nombres de los autores deben escribirse en minsculas, sin punto entre las iniciales. Los nombres de las revistas y de los libros deben ser en letra cursiva, usando la abreviatura estandarizada. Use los siguientes ejemplos como gua. Para artculos en revista: Matamoros R, C Gmez, M Andaur. 2002. Hormonas de utilidad diagnstica en medicina veterinaria. Arch Med Vet 34, 167-182. Severino G, M del Zompo. 2004. Adverse drug reactions: role of pharmacogenomics. Pharmacol Res 49, 363-373. Para captulos en libros o publicaciones ocasionales: Horneck DA, RO Miller. 1998. Determination of total nitrogen in plant tissue. In: Kalra YP (ed). Handbook of Reference Methods foor Plant Analysis. 2nd ed. CRC Press, Washington DC, USA, Pp 75-83. Flrez J. 1992. Frmacos analgsicos opiceos. En: Flrez J (ed). Farmacologa Humana. 2 ed. Masson-Salvat, Barcelona, Espaa, Pp 25-28. WHO, World Health Organization. 1972. International Drug Monitoring: The role of national centres. Tech Rep Ser WHO N 48.

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de dgitos en cada columna. Informe el valor de cero como 0. El ancho mximo de los cuadros no debe exceder los 80 mm para una columna, o los 170 mm para dos columnas. Figuras Las figuras deben ser presentadas en hojas separadas con sus respectivos ttulos en espaol e ingls en la parte inferior y numeradas consecutivamente usando nmeros arbigos, segn el orden en que aparecen en el texto. Ej.: Figura 1, no Fig. 1. Denomine figura a cualquier ilustracin que no sea cuadro, Ej.: grficos, radiografas, ecografas, electrocardiogramas, fotografas, etc. Las figuras deben ser orientadas verticalmente y acompaadas de una corta descripcin que contenga la explicacin de todos los marcadores, lneas y smbolos usados. Si la figura tiene secciones, stas deben ser identificadas como a, b, c, etc., en la esquina superior derecha y debern ser descritas en la leyenda. Para el caso de fotografas, en el reverso y con lpiz a carbn, deben sealarse con flecha la orientacin espacial, el nmero de la figura y el nombre del autor principal. Los smbolos, flechas o letras, empleados en las fotografas, deben tener un tamao y contraste suficientes para distinguirlos de su entorno. Enve las

figuras protegidas en un sobre grueso y de tamao apropiado. Las figuras pueden disearse a una o dos columnas de ancho (80 y 170 mm, respectivamente). Las reproducciones en colores de las figuras deben ser financiadas por los autores. Cuando las figuras no son originales debe sealarse la autora, y cuando corresponda, se debe adjuntar la autorizacin del autor para ser reproducidas. Pruebas de imprenta Una prueba de imprenta ser enviada al autor encargado de la correspondencia, para su lectura y correccin puntual, y debe ser devuelta al editor dentro del plazo que se especifique. Por otra parte, el editor se reserva el derecho a corregir la prueba de imprenta cuidadosamente, pero sin asumir responsabilidad de tal, y de esta manera agilizar el proceso de publicacin. La decisin final para la publicacin del trabajo ser en el momento en que el Comit Editor acepte las correcciones, que a sugerencia de los rbitros han realizado los autores. Modificaciones a las pruebas de imprenta que no sean de errores menores no sern aceptadas. Ni los editores ni la imprenta aceptarn responsabilidad por la impresin de errores de los ar tculos que los autores no hayan corregido en la prueba de imprenta.

DIRECCIN Comit Editor Archivos de Medicina Veterinaria Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Austral de Chile e-mail: archmv@uach.cl - Fono-Fax: (56-63) 221459 www.medicinaveterinaria.cl www.scielo.cl Casilla 567, Valdivia, CHILE Representante Legal: Vctor Cubillos Godoy Rector de la Universidad Austral de Chile

INSTRUCTIONS FOR AUTHORS JOURNAL ARCHIVOS DE MEDICINA VETERINARIA

Founded in 1969 ISSN 0301-732x Journal indexed by the following international scientific repertoires: Current Contents Agriculture, Biology and Environmental Sciences (CC/AB and ES), Commonwealth Agricultural Bureaux, International (C.A.B.I.), Dairy Science Abstracts, Veterinary Bulletin, Animal Breeding Abstracts; Helminthological Abstracts S.A., Biological Abstracts; Agrindex, Periodica, Focus on: Veterinary Sciences and Medicine.

Archivos de Medicina Veterinaria publishes, in Spanish or English, original scientific contributions such as scientific articles, reviews and short communications which can include clinical observations, descriptions of methods or techniques and advances in all aspects of veterinary science and animal welfare. Submission of Manuscripts Manuscripts should be submitted to the Editor and must include: Three paper copies of the manuscript, including all tables and figures. An electronic version of the text, tables (preferably in MS Word format) and figures (in Excel format, JPG or TIFF, with 300 dpi), on a CD, labeled with the first authors surname and the beginning of the articles title. The manuscripts must be original, and may not be considered for publication in another journal. Manuscripts that do not conform to editorial requirements will be returned without review. The editor may require a copy of the appropriate Bioethical Committee Certification for manuscripts describing studies involving animals or humans. Authors must include a letter declaring authorship, signed by all authors. A covering letter to the Editor must be included requesting publication of the work, and naming the corresponding author who will also revise the proof of the article, should it be accepted for publication. The intellectual property of the work will be retained by the authors. Referees of Archivos de Medicina Veterinaria will aid the Editorial Committee to determine whether the manuscript fulfills publication requirements. The authors may suggest possible referees. All articles submitted for publication will be assessed by two referees. The referees will be selected by the Editorial Committee, and may or may not include those nominated by the authors. In the case of a disagreement between the referees reports, a third referee will aid the Editorial Committee to reach a decision. Referees are obliged to keep all information from the articles confidential, including unpublished information. Previous to the publication of accepted articles, the publication charge must be paid, the amount of which can be found at www.medicinaveterinaria.cl.

Preparation and Form of Manuscripts Types of articles Review articles: provide expert summaries of current knowledge in a particular field of veterinary science, and do not necessarily have a set format. Authors should consult with the Editor before initiating a review. The Editorial Committee may solicit an expert to prepare a review, which will also be refereed and edited. Reviews must not exceed 30 pages in length, including tables, figures and references. Scientific articles: report new advances in veterinary science based on original research. The format must include summary, introduction, material and methods, results, discussion, resumen, acknowledgements (when pertinent) and references. The maximum length of the manuscript is 20 pages, including tables, figures and references. Short communications: briefly inform of an advance, experimental result, clinical observations or new methodology, with the following format: summary, introduction, material and methods, results and discussion (combined), resumen, acknowledgements (when pertinent) and references. The maximum length of the manuscript is 12 pages, including tables, figures and references. JOURNAL STYLE AND LAYOUT General presentation: The journal publishes articles in English or Spanish. Manuscripts must be written using 12 point Times New Roman font with one and a half-line spacing, on one side only of letter paper (21.5 x 27.9 cm) using 2 cm margins on all sides. Pages must be numbered consecutively in the top right corner, and lines must be numbered on the left, starting with number one, on all pages. Headings must be in upper case, left-justified on a separate line with no full stop following, eg. MATERIAL AND METHODS. Only the first letter of sub-headings is capitalized. Primary sub-headings (eg. Experimental design) should be left-justified; secondary sub-headings are left-justified and italicized. Do not use underlining and do not number sub-headings or itemized lists. In the text, numbers must be written in numerals. When a sentence begins with a number or when necessary for clarity, this should be written in words. A decimal point must be preceded by a number (eg. 0.5 not .5) and a point is used to denote the decimal in English and a comma in Spanish. All measurements should be reported in IS units unless it is normal practice in a discipline to use derivatives (eg. the Curie international unit). Dates must be formatted as 07 September, 1954 in the text, but

they may be abbreviated in tables and figures. Use the 24-hour clock for times of day (e. g. 13:00 h). Chemical nomenclature must be expressed using the Biochemical Society Standards (Biochem J 209, 1-27, 1983), generic names (in lower caps) must be used for medications. If brands and sources of medications need to be included, this should be included as a foot-note. Enzymes must be identified at first mention, in accordance with the Enzyme Commission of the International Union of Biochemistry. Latin terminology and abbreviations commonly used in scientific literature, such as in vitro, in vivo, ad libitum must be italicized. Probability values must be presented as P<0.05 or P<0.01. Standard deviation, standard error of the mean and confidence intervals are abbreviated as follows: SD, SEM and CI, respectively. Title Titles should be short, specific and informative. The title is centred in bold, starting at line 10 without using trade names or abbreviations. Only the first letter is capitalised. The superscript symbol # should be used to indicate the source of funding, with details given as a footnote, if appropriate. Authors names and addresses Authors names are written underneath the title, separated by a space. Use initials (without stops) and surnames only, separated by comas, as in the example: CT Westwood, E Bramley, IJ Lean. Superscript letters should be used after each authors name to identify the section, department, service or institute of the author where the work was conducted. The corresponding author is indicated using the superscript letter followed by an asterisk, with the full contact details, including fax number and email address indicated in the footnote. Footnotes These are used to define abbreviations used in table titles, commercial brands, the name and address of companies. They must be indicated with numbers. Resumen The second page must contain a summary in Spanish (Resumen), of no more than 250 words, that describes the objectives of the study or research, the material and methods used, the principal results and the most important conclusions. Non-standard abbreviations must not be used. On a separate line, left-justified and separated by a space, up to four palabras clave (key words) should be identified. Introduction The subheading Introduction is written on the third page on line 1. In the following line, indented by 5 spaces, the context of the study is briefly presented without an extensive revision of the theme, and only citing the most relevant references. When appropriate, the hypothesis and objectives of the study must be clearly and concisely presented. The one and a half-line spacing between paragraphs must be kept. Material and methods Separated by one space from the previous section, this section should contain sufficient detail to allow others to repeat the study. When the first reference in the text is made to medications or chemicals, the generic name, dose and route of administration

should be indicated. For specialized equipment, the brand, model and manufacturers name must be indicated. Details of all statistical methods used must be given at the end of this section under the sub-heading Statistical analysis and should include adequate detail to allow readers to determine precisely how data have been analysed and the units that are used to express the results (mathematical mean, standard deviation, standard error of the mean, mediums, ranges or confidence limits, etc.). The use of parametric (Chi-square, students T-test, ANOVA, etc.) or non-parametric (Wilcoxon, Kruskal-Wallis etc.) analyses must be indicated. The name, version and sources of computational statistical analysis programs must be identified, eg. SPSS version 9.0 for Windows (SPSS Inc, Chicago IL, USA). Results Separated by one space from the previous section, this section should contain a concise and logical description of the results obtained without discussion or reference to other work. The minimum number of tables and figures should be included to present the pertinent data without repetition, and data presented in tables and figures should not be repeated in the text. Discussion This section, separated by one space from the previous section, should evaluate and interpret the results and relate these to other relevant results. The results should not be repeated and new results must not be presented in this section. Care should be taken to ensure that the discussion is developed in a logical and concise manner, and conclusions are reached, as well as a discussion of their relevance. Conclusions that are not directly supported by the data of the study or other unpublished studies should not be presented. Summary The summary is written in English, and must be presented on a separate page. The summary should contain the same elements as the Resumen. On a separate line, following the summary, left-justified in small caps and separated by a space, up to four key words should be identified. Acknowledgements This section should be brief, and should only include people or institutions that have made a direct contribution, provided necessary material or have provided the facilities for the studys development. References The accuracy of the reference section is the responsibility of the authors and references must be verified against the original article. Please ensure that all articles cited in the text are included in the reference list and vice versa. In the text, citations should be listed in parentheses in chronological order, citing authors names, and using et al after the first authors name where there are more than two (e.g. Prez 1994, Castro and Martnez 1996, Cifuentes et al 2002). The reference list must be ordered alphabetically according to the first authors name, and all authors names and initials must be included. When no author is given, use the term Anonymous in both text and reference list. References with the same author, single or with coauthors, should be listed in chronological order. The letters a, b, c, etc. should be appended as a superscript when more than one work is cited from the

same author within the same year. Authors names should appear with the initials and first letter of the surname in upper caps and the remainder of the surname in lower caps, with no dots between initials. Journal titles and names of books should be in italics using standard abbreviations. Use the following examples as a guide: For journal articles: Matamoros R, C Gmez, M Andaur. 2002. Hormonas de utilidad diagnstica en medicina veterinaria. Arch Med Vet 34, 167-182. Severino G, M del Zompo. 2004. Adverse drug reactions: role of pharmacogenomics. Pharmacol Res 49, 363-373. For chapters in books or occasional publications: Horneck DA, RO Miller. 1998. Determination of total nitrogen in plant tissue. In: Kalra YP (ed). Handbook of Reference Methods foor Plant Analysis. 2nd ed. CRC Press, Washington DC, USA, Pp 75-83. Flrez J. 1992. Frmacos analgsicos opiceos. En: Flrez J (ed). Farmacologa Humana. 2 ed. Masson-Salvat, Barcelona, Espaa, Pp 25-28. WHO, World Health Organization. 1972. International Drug Monitoring: The role of national centres. Tech Rep Ser WHO N 48. SAG, Servicio Agrcola y Ganadero, Chile. 1996. Resolucin Exenta N 3599 del 29 de noviembre de 2006.. Weinstein L, MN Swartz. 1974. Pathogenic properties of invading microorganisms. In: Sodeman WA Jr, Sodeman WA (eds). Pathogenic physiology: Mechanism of Disease. WB Saunders, Philadelphia, USA, Pp 457-472. For articles and proceedings published in regular series: Contreras PA, V Ruiz, F Wittwer, H Bhmwald. 1998. Valores sanguneos de triyodotironina (T3) y tiroxina (T4) en vacas lecheras del sur de Chile. Resmenes del X Congreso Chileno de Medicina Veterinaria, Valdivia, Chile, Pp 135-136. For dissertations: Matthei SM. 2002. Determinacin de la presencia del receptor del factor activante plaquetario en membranas de neutrfilos de bovino. Memoria de ttulo, Escuela de Medicina Veterinaria, Universidad Austral de Chile, Chile. For Theses: Vilanova LT. 2002. Presencia y funcionamiento del receptor GM-CSF en espermatozoides bovinos y su relacin con la motilidad espermtica. Tesis Doctoral, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Austral de Chile, Chile. Minimise the citation of abstracts as references. Authors are specifically discouraged from citing unpublished data or personal communication, unless this information exists in written form, in which case the text should be referred to, but this should not appear in the list of references. References to papers which have been accepted but not published should be cited as in press, whereas manuscripts which have been submitted for publication but not accepted should be referred to as unpublished data. Web pages should not be included as references. If so required, web page addresses should be written as footnotes, including date of consultation.

Complementary instructions Tables The titles to tables and figures must be presented in both Spanish and English. The number of tables should be kept to a minimum and presented on separate pages with their respective titles in English and Spanish at the top. Information in tables must not be repeated in the text. Tables must be numbered consecutively with Arabic numbers in the order in which they are referred to in the text. The brief title to the table should indicate the contents of the table and should be understandable without reference to the text. Each column of each table must have a short or abbreviated heading. Only column headings and general titles should be separated with horizontal lines. Data columns should be separated by spaces and not vertical lines. When additional explanatory information is required, this should appear at the foot of the table. Explanatory information for non-standard abbreviations and units should appear within parentheses. If superscripts are used to indicate significant differences between values, use a, b, c. Minimise the number of digits in each column. Indicate a zero value as 0. Table widths should not exceed 80 mm for one column or 170 mm for two columns. Figures Figures should be submitted on separate pages, with their respective titles in English and Spanish at the bottom and numbered consecutively using Arabic numerals in the order they are referred to in the text. Eg. Figure 1, not Fig. 1. Figures include all illustrations that are not Tables, eg. graphs, radiographies, ecographies, electrocardiograms, photographs, etc. Figures must be vertically oriented and be accompanied by a short descriptive caption that contains an explanation for all markers, lines and symbols used but no abbreviations. If the figure contains sections, these should be labelled as a, b, c, etc. in the top right corner and must be described in the caption. The reverse of photographs must be marked using graphite pencil with the number of the figure, the first author and an arrow showing the orientation of the photograph. Symbols, arrows or letters used should be of an adequate size and contrast to be easily visible. Photographs should be submitted in a protective, adequately sized envelope. Figures may be one or two columnwidths (80 or 170 mm, respectively). The cost of printing coloured figures must be met by the authors. The authorship of non-original figures must be acknowledged, and when appropriate, authorization to reproduce these figures must be provided. Proofs A proof will be sent to the corresponding author for proofreading, and must be returned within the specified time. Otherwise the Editor reserves the right to carefully proof-read the article but without assuming responsibility for errors, to continue with the publication process. The final decision regarding acceptance of the manuscript will be taken when the Editorial Committee accepts the manuscript following correction according to the referees comments. Alterations to the proof that do not correspond to minor errors will not be accepted. Neither the Editor nor the Publisher accept any responsibility for printed errors which were not noted by the authors at the time of proof-reading the proof.

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