Copyright by $ta

1. DIAGNOSTYKA GRULICY a. Pobieranie materiau b. Diagnostyka mikrobiologiczna z zastosowaniem testw morfologiczno-biochemicznych c. Metody chromatograficzne d. Metody genetyczne 2. DIAGNOSTYKA BAKTERII BEZTLENOWYCH 3. TECHNIKA BARWIENIA METOD GRAMA: a. Sposb barwienia b. Mechanizm barwienia c. Efekt barwienia Grama

D i a g n o s t y k a

g r u l i c y

Wyduone, paeczkowate, proste lub lekko wygite bakterie Prtki to drobnoustroje wolno rosnce, tlenowe, o niezwykej budowie ciany komrkowej o Lipidy stanowi 40% masy ciany komrkowej, poza tym znajduj si w niej wielocukry, nukleoproteidy i frakcje biakowej Znaczna oporno na dziaanie kwasw (unikalna budowa ciany prtka, a dokadniej obecno w ich cianie kwasu mykolowego) Z trudnoci barwi si metod Grama Wi kszo prtkw to saprofity wystpujce w glebie i wodzie oraz jako staa flora ludzi i zwierzt Choroby wywoane przez prtki nazywa si mykobakteriozami o Grulica wywoana przez Mycobacterium tuberculosis o Trd wywoany przez Mycobacterium laprae o M. bovis, M. avium-intracellulare, M. kansasi, M. gordonae prtki atypowe Zakaenie prtkiem grulicy moe by zlokalizowane w kadym narzdzie, ale najczciej narzdem tym jest: ukad oddechowy, przewd pokarmowy, skra, bony luzowej Najczstsz postaci grulicy jest posta pucna Prtki mog rwnie wywoywa grulic jelit, skry, w zw chonnych, koci czy opon mzgowordzeniowych rdem zakaenia jest osoba prtkujca lub chore zwierz

Pobieranie materiau Do diagnostyki mikrobiologicznej w kierunku mykobakteriozy materiaem moe by: plwocina, materiay z p ukania oskrzelowego, popuczyny odkowe, pyny wysikowe, przesiki, pyn mzgowo-rdzeniowy, mocz, materia sekrecyjny Pobranie duej objtoci pynu zwiksza prawdopodobiestwo wykrycia czynnika chorobotwrczego (w 1 ml pynu moe by jedynie kilka prtkw)

Diagnostyka mikrobiologiczna z zastosowaniem testw morfologiczno-biochemicznych Plwocina o objtoci 10-20 ml ma by pobrana do jaowego naczynia, powinna by odksztuszona rano i pochodzi gboko z puc pobrany materia przenosi si do pytki Petriego wyszukanie ropnych lub podbarwionych krwi grudek przeniesienie ich ez na szkieko podstawowe przykrycie drugim szkiekiem i rozcieranie uzyskuje si 2 preparaty wyschnicie i utrwalenie w pomieniu palnika o o Obecnie rutynowo stosowan metod w laboratoriach jest metoda fluorescencyjna (auramina, rodamina, oran akrydyny) prtki wiec Dawniej jedyn metod barwienia prtkw bya metoda Ziehl-Neelsena prtki na kolor czerwony, to na niebieski Wynik ujemny brak prtkw Wynik w tpliwy 1-2 prtki w preparacie Wynik dodatni + - pojedyncze prtki w caym preparacie Wynik dodatni ++ - pojedyncze prtki w poszczeglnych polach widzenia, obfite prtkowanie -1-

 Copyright by $ta

Wynik dodatni +++ - liczne prtki w poszczeglnych polach widzenia, bardzo obfite prtkowanie

Hodowla prtkw o Homogenizacja prtkw eby usun pozosta flor i zagci o Rutynowo stosowane podoe to podoe Lowensteina-Jensena (masa jajowa + r-r zieleni malachitowej) innym stosowanym podoem staym jest podoe agarowe Middlebrooka M. tuberculosis suche, szorstkie, uniesione, tobeowe kolonie o nierwnej powierzchni M. bovis mae, bezbarwne, piramidoksztatne kolonie Identyfikacja o Tempo wzrostu o Zdolno do wytwarzania barwnika o Cechami pozwalajcymi na odrnienie M. tuberculosis od pozostaych prtkw s: wytwarzanie czynnika sznurowego i produkcja niacyny Inne, nowe, przyspieszone systemy hodowli prtkw kwasoodpornych: o Izotopowy pautomatyczny system do hodowania, rnicowania i oznaczania wraliwoci na leki Do podoa dodawany kwas palmitynowy znakowany w glem C14 prtki, rosn zuywaj kwas palmitynowy i wydzielaj CO2 znakowany C14 odczyt na podstawie przyrostu radioaktywnoci CO2 Wzrost na poywkach Middelbroka odczyt wizualny P ynny system hodowli z odczynnikami fluorescencyjnymi Nieizotopowy, w peni skomputeryzowany system hodowli prtkw na podoach pynnych odczyt na podstawie przyrostu CO2 System hodowli prtkw na poywce pynnej Kirchnera z dodatkiem surowicy oraz soli tetrazolowych

o o o o

Metody chromatograficzne Sk ad ilociowy i jakociowy kwasw mykolowych jest charakterystyczny dla poszczeglnych gatunkw prtkw analiza chromatograficzna kwasw tuszczowych wyizolowanych ze ciany komrkowej

Metody genetyczne Hybrydyzacja kwasw nukleinowych PCR amplifikacja in vitro wybranych odcinkw genomu

D i a g n o s t y k a

b a k t e r i i

b e z t l e n o w y c h

Tlenowce Wzgldne beztlenowce to najliczniejsza grupa bakterii chorobotwrczych dla czowieka, np. E. coli, S. aureus Beztlenowce o cile bezwzgldne beztlenowce nie s zdolne do wzrostu gdy zawarto tlenu w atmosferze przekracza 0,5% (np. Clostridium haemolyticum) o Umiarkowane bezwzgldne beztlenowce troszk wiksza tolerancja na tlen Mikroaerofile wymagaj tlenu jako kocowego akceptora elektronw, jednak jego st enie powinno by obni one (5%) (np. Campylobacter jejuni)

chorobotwrczo beztlenowych laseczek sporujcych nalecych do rodzaju Clostridium o tec, zgorzel gazowa, botulizm izolacja i identyfikacja bakterii niesporujcych jest trudniejsza, gdy s one bardziej wymagaj ce, jeli chodzi o warunki hodowli, ni bakterie Clostridium -2-

 Copyright by $ta

Aby umoliwi izolacj beztlenowcw z materiaw klinicznych musz by spenione nastpujce warunki: o Pobieranie i przesyanie materiau musi odbywa si w warunkach beztlenowych lub przy ograniczonym dostpie tlenu o Posiew powinien odbywa si pod oson gazu obojtnego, bd przy krtkotrwaym wystawieniu na dziaanie powietrza o Podoa uywane do hodowli powinny by wieo przygotowywane lub przechowywane w warunkach beztlenowych o Naley zastosowa odpowiedni metod hodowli, ktra powinna by prowadzona w mieszaninie gazw obojtnych przy rwnoczesnej kontroli warunkw beztlenowych o Izolacja kolonii musi by wykonana przy jak najkrtszym wystawieniu na dziaanie powietrza Pobieranie i transport materiaw o Materia do bada moe pochodzi z zakae toczcych si w zamknitych jamach ciaa, z ropni, materiaem do bada mog by te skaone pokarmy o Prbki z tych miejsc pobiera si przez aspiracj, a nie przez wymazy, aby unikn skaenia ich przez bakterie tlenowe. o Transport Technika otwarta transportu polega na umieszczeniu materiau w szerokiej probwce z CO2, zamknitej szczelnie gumowym korkiem Czciej stosowan i prostsz metod jest tzw. technika zamknita wprowadzenie materiau ze strzykawki przez gumowy korek do fiolek wype nionych wolnym od tlenu gazem (CO2, N2) i specjalnie przygotowanym podoem do wzrostu beztlenowcw Preparat bezporedni o Po dostarczeniu materiau do laboratorium wykonuje si preparat bezporedni barwiony metod Grama. W preparatach naley zwraca uwag na: Nieregularnie barwice si, pleomorficzne, Gram-ujemne paeczki: Bacteroides Cienkie, ostro zakoczone Gram-ujemne paeczki zawieraj ce czsto ziarnistoci: Fusobacterium Due grube i drobne Gram-dodatnie laseczki ze sporami w rodku: Clostridium Cienki i nitkowate, bd grube maczugowate Gram-dodatnie laseczki: Bifidobacterium, Corynebacterium, Propionibacterium, Ramibacterium, Catenaebacterium Gram-dodatnie ziarenkowce, tworzce dwoinki lub acuszki: Peptococcus, Peptostreptococcus Drobne Gram-ujemne ziarenkowce: Veillonella Posiew materiau o eby usun tlen z podoa w ktrym maj rosn naley najprociej zagotowa poywk, a nastpnie j szybko ochodzi o Wprowadzenie materiau do poywki i przykrycie warstw jaowej parafiny o Preferowan metod jest hodowla w anaerostatach. o Obecnie najczciej stosowane s naczynia, w ktrych atmosfer beztlenow uzyskuje si na drodze chemicznej o Podoa z wysianymi materiaami inkubuje si przez 48 godzin. o Obecnie polecanym podstawowym podoem do hodowli bakterii beztlenowych jest ppynne podoe tioglikolanowe wzbogacone witamin K i hemin Identyfikacja beztlenowcw o W przyblionej diagnostyce bakterii beztlenowych posugujemy si skrconymi schematami identyfikacyjnymi. o W zasadzie u wszystkich beztlenowcw naley dokadnie opisa: wygld kolonii zachowanie ich w promieniach UV zmiany w podou wok koloni (depresja podoa, pkni cia agaru, hemoliza) okreli morfologi komrek okreli barwliwo wg Grama, zbada wytwarzanie katalazy zbada fermentacj niektrych w glowodanw

-3-

 Copyright by $ta

T e c h n i k a
Sposb barwienia

b a r w i e n i a

m e t o d

G r a m a :

na odtuszczone szkieko podstawowe nanie bakterie i po ewentualnym dodaniu pynu fizjologicznego wykona rozmaz 2. szkieko z rozmazem pozostawi do cakowitego wyschni cia, po czym preparat utrwali przez trzykrotne przesunicie nad pomieniem palnika 3. utrwalony preparat zalewa nad rynienk roztworem fioletu krystalicznego 4. odczeka 60 sekund 5. tryskawk delikatnie zmy barwnik 6. zala preparat jodyn lub pynem Lugola 7. odczeka 30 sekund 8. ostronie odbarwi cao w etanolu przez ok. 10-20 sekund 9. spuka preparat wod 10. dobarwi innym barwnikiem, np. safranin czy fuksyn zasadow przez ok. 30 sekund 11. dobrze spuka preparat wod i ogl da pod mikroskopem

1.

Mechanizm barwienia Komrki bakteryjne, zarwno gramdodatnie, jak i gramujemne, zabarwiaj si fioletem krystalicznym. Dodanie pynu Lugola powoduje, e fiolet reaguje z jodem, w wyniku czego tworz si stosunkowo due kompleksy zoone z barwnika i jodu. Na tym etapie obydwa typy komrek maj zabarwienie granatowe. P ukanie w alkoholu powoduje, e w komrkach Gram-dodatnich nastpuje zmniejszenie pustej przestrzeni w wielowarstwowych cianach komrkowych, majcych wygld wielu (ok. 50) naoonych na siebie siatek. W rezultacie kompleksy fioletu krystalicznego z jodem nie mog ulec wypukaniu, co w przypadku 1-2 warstw u bakterii Gram-ujemnych nie jest przeszkod i alkohol wietnie wypukuje barwnik. Po zakoczonym pukaniu komrki Gram-dodatnie s granatowe, za Gram-ujemne bezbarwne. Dodatkowy barwnik (np. safranina, fuksyna) dobarwia, niezbyt mocno, komrki Gram-ujemne, nie zmieniaj c barwy komrek Gram-dodatnich.

Efekt barwienia Grama W efekcie wyej przedstawionych dziaa i opisanego mechanizmu komrki efekty mog by trojakie: bakterie barwi si na kolor ciemno-fioletowy, prawie czarny, okrelamy jako Gram-dodatnie lub (Gram +) bakterie barwi si w kolorze czerwonym, okrelamy jako Gram-ujemne lub (Gram -) bakterie nie barwi si w ogle metod Grama

-4-