PROBLEMAS DE ENZIMAS

1. Se ha determinado la velocidad inicial de una reaccin catalizada por una enzima para diversas concentraciones de sustrato. Los datos obtenidos son los siguientes: [S] ( mol/L) 5 10 20 50 100 200 V( mol/L) min -1 22 39 65 102 120 135

a) Calcule Vmax y KM a partir de un grfico directo de V frente a [S]. tiene dificultades para obtener respuestas claras?. b) Utilice ahora la representacin de Lineweaver-Burk para analizar los mismos datos. funciona mejor? R = a) 150 ( mol/L) min -1 , KM = 20 mol/L b) 168 ( mol/L) min -1 , KM = 32 mol/L

2. Se estudia la cintica del estado estacionario de una enzima en presencia y ausencia de un inhibidor A. La velocidad inicial viene dada en funcin de la concentracin de sustrato en la tabla siguiente: [S] (mmol/L) 1.25 1.67 2.5 5.00 10.00 V[( mol/L) min-1] Sin inhibidor Con inhibidor A 1.72 0.98 2.04 1.17 2.63 1.47 3.33 1.96 4.17 2.38

a) Qu tipo de inhibicin se produce? b) Determine Vmax y KM en ausencia y presencia del inhibidor. R = a) No competitivo b) Sin inhibidor: KM = 2.5 mmol/L, Vmax = 5.0 (m mol/L) min -1 Con inhibidor: KM = 2.5 mmol/L, Vmax = 3.0 (m mol/L) min -1

3. Se estudia la cintica del estado estacionario de una enzima en presencia y ausencia de un inhibidor B, a dos concentraciones diferentes del inhibidor. Los datos son los siguientes: [S] (mmol/L) 1.25 1.67 2.5 5.00 10.00 Sin inhibidor 1.72 2.04 2.63 3.33 4.17 V[( mol/L) min-1] Con inhibidor B 3mM Con inhibidor B 5mM 1.25 1.01 1.54 1.26 2.00 1.72 2.86 2.56 3.70 3.49

a) Qu tipo de inhibicin produce el inhibidor B? b) Determine Vmax y KM en ausencia del inhibidor y para cada concentracin del inhibidor. R = a) Competitivo b) Vmax = 5.0 (m mol/L) min -1 a todas las concentraciones del inhibidor [I] (mmol/L) 0 3 5 KMapp (mmol/L) 2.5 3.8 4.0

4. El glucgeno es un carbohidrato polimrico compuesto de varios residuos de glucosa. La glucgeno sintetasa es la enzima responsable del alargamiento de la molcula de glucgeno, de acuerdo a la siguiente reaccin: UDP-glucosa + (glucosa)n (glucosa)n+1 + UDP
aceptor aceptor alargado

A continuacin se muestran los resultados de dos estudios separados de la accin cataltica de la glucgeno sintetasa variando la concentracin de UDP-glucosa y manteniendo constante la concentracin del aceptor poliglucosa. En un caso no se agreg nada y en otro caso de agreg ATP (2.5 mM). Determine el tipo de inhibicin a partir de los parmetros cinticos respectivos, determinados matemtica y grficamente.
UDP-glucosa milimolar 0.8 1.4 3.3 5.0 Velocidad inicial micromoles de (glucosa)n+1 formada /minuto Sin agregar nada Con ATP (2.5mM) 10.0 2.0 12.5 3.3 22.0 6.7 25.00 10.0

5. La enzima malato deshidrogenasa citoplsmica cataliza la siguiente reaccin: L-malato + NAD+ oxalacetato + NADH + H+

La enzima mencionada se aisl de corazn de cerdo y posteriormente fue purificada. Se estudio el efecto que ejercen sobre la velocidad de esta reaccin el AMP y la nicotinamida. Los ensayos fueron realizados a 25 o C; el medio de incubacin contena enzima, concentraciones variables de sustrato, buffer de borato de sodio 50 mM, pH 7.5 y cido oxalactico 5 mM. La velocidad de reaccin se midi siguiendo la variacin de la absorcin del NADH a 340 nm.
NADH (mM) 0.200 0.100 0.066 0.050 0.040 Control 1.250 1.080 0.909 0.800 0.800 Absorbancia a 340 nm min-1 Nicotinamida 200 mM 0.833 0.625 0.476 0.400 0.333

AMP 20 mM 0.769 0.526 0.400 0.322 0.270

a) Determine KM y Vmax para la cintica normal. b) Determine matemtica y grficamente el tipo de inhibicin que provoca sobre la reaccin uno de los inhibidores. (Justifique ampliamente el tipo de inhibicin que usted indique). 6. A partir de los siguientes datos de una reaccin enzimtica determine: a) La Km para el sustrato b) la Vmax para el sustrato c) El tipo de inhibicin Conc . de sustrato milimolar (mM) 2.0 3.0 4.0 10.0 15.0 Producto por hora en Micromol Sin inhibidor Con inhibidor 139 88 179 121 213 149 313 257 370 313

7. Se mide la cintica de una enzima como funcin de la concentracin de sustrato en presencia y ausencia de un inhibidor (I) de concentracin 2 x 10-3M. a) Determine la KM y VMax en ausencia del inhibidor. b) Determine la KM y VMax en presencia del inhibidir. c) Determine de que tipo de inhibicin de trata.

Conc . de sustrato M 0.3 x 10-5 0.5 x 10-5 1.0 x 10-5 3.0 x 10-5 9.0 x 10-5

Velocidad en micromoles por minuto Sin inhibidor Con inhibidor 10.4 4.1 14.5 6.4 22.5 11.3 33.8 22.6 40.5 33.8

8. Se realiz la separacin y purificacin de una enzima hasta actividad especfica constante. Se prob que estaba pura mediante varias otras pruebas. Cuando se le realiz una electroforesis en poliacrilamida a una muestra de la ltima etapa del procedimiento de aislamiento, mostr un gel teido con una sola zona principal y dos zonas secundarias menores. Adems, la protena asociada con cada una de las tres zonas cataliz la misma reaccin. Con base en los conocimientos que usted tiene acerca de las enzimas Qu puede concluir?. Explique amplia y claramente el porque. 9. En Mycobacterium phlei se ha encontrado un factor de acoplamiento unido a membranas, que interviene en los fenmenos de fosforilacin existentes en la cadena respiratoria. Dicho factor ha sido purificado por cromatografia de afinidad, observandose que exhibe actividad de ATPasa. Se determinarn sus propiedades cinticas utilizando como sustrato ATP y estimando el fosfato inorgnico liberado como una medida de la velocidad de reaccin. El medio de reaccin contena 160 microgramos de protena purificada, sustrato, MgCl2 4mM; los ensayos se realizarn a 30o C y pH 7.4. Adems se ensayo el efecto del ADP sobre la actividad enzimtica y se comprob que acta como inhibidor de la reaccin. a) Determine KM y Vmax. b) Determine matematica y graficamente el tipo de inhibicin provoca sobre la reaccin el inhibidor. c) Justifique ampliamente el tipo de inhibicin que usted indique. ATP MM 5.0 2.5 1.0 0.7 0.5 DATOS EXPERIMENTALES Micromoles Pi lib. min-1 mg -1 protena sin ADP con ADP 25mM 50.0 11.1 33.3 7.7 20.0 4.2 16.6 3.1 12.5 2.4

10. Se mide la cintica de una enzima como funcin de la concentracin de sustrato en presencia y ausencia de un inhibidor (I) de concentracin 2 x 10-4M. a) Determine la KM y VMax en ausencia del inhibidor. b) Determine la KM y VMax en presencia del inhibidor. c) Determine de que tipo de inhibicin de trata. Conc . de sustrato M 0.3 x 10-5 0.5 x 10-5 1.0 x 10-5 3.0 x 10-5 9.0 x 10-5 Velocidad en micromoles por minuto Sin inhibidor Con inhibidor 10.4 2.1 14.5 2.9 22.5 4.5 33.8 6.8 40.5 8.1

11. Determine la fraccin de la velocidad max que se tiene cuando la concentracin de sustrato es igual a 2k m, 10 km, y 50 km,.. Que puede deducir? 12. La enzima deshidrogenasa glutmica cataliza la siguiente reaccin: L- glutamato + NAD+ alfa-cetoglutarato + NH3 + NADH + H+ A continuacin se muestran los datos experimentales al medir la velocidad de formacin del producto:

Concentracin de Lglutamato milimolar

Velocidad inicial (cambio en absorbancia a 360 nm/min)

1.68 0.172 3.33 0.250 5.00 0.286 6.67 0.303 10.00 0.334 20.00 0.384 Calcule a partir de la grafica V.R vs Conc de S. Los parmetros KM y VMax. b) Haga la representacin de 1/V frente a 1/S a partir de los datos y calcule K M y VMax. Compare los valores obtenidos por ambos mtodos. 13. La actividad cataltica de muchas enzimas es funcin de cambios en el pH del medio. A partir del siguiente grupo de datos construya un grfico en el que muestre la variacin de la actividad enzimtica en funcin del pH. Cul es El pH ptimo par la enzima?. Justifique ampliamente. Unidades de actividad enzimtica PH 24.8 7.2 33.0 7.6 66.7 8.0 56.2 8.6 41.3 8.8 27.5 9.0

14. Se mide la cintica de una enzima como funcin de la concentracin de sustrato en presencia y ausencia de un inhibidor (I) de concentracin 2 x 10-3M. a) Determine la KM y VMax en ausencia del inhibidir. b) Determine la KM y VMax en presencia del inhibidir. c) Determine de que tipo de inhibicin de trata. Conc . de sustrato M 0.3 x 10-5 0.5 x 10-5 1.0 x 10-5 3.0 x 10-5 9.0 x 10-5 Velocidad en micromoles por minuto Sin inhibidor Con inhibidor 10.4 4.1 14.5 6.4 22.5 11.3 33.8 22.6 40.5 33.8

15. Se realiz la separacin y purificacin de una enzima hasta actividad especfica constante. Se prob que estaba pura mediante varias otras pruebas. Cuando se le realiz una electroforesis en poliacrilamida a una muestra de la ltima etapa del procedimiento de aislamiento, mostr un gel teido con una sola zona principal y dos zonas secundarias menores. Adems, la protena asociada con cada una de las tres zonas cataliz la misma reaccin. Con base en los conocimientos que usted tiene acerca de las enzimas Qu puede concluir?. Explique amplia y claramente el porque. 16. A partir de la ecuacin de Michaelis- Menten, explique como se obtiene la ecuacin de Lineweaver-Burk. Explique su grfico y su utilidad. Tratamiento matemtico completo. 17. Se mide la cintica de una enzima como funcin de la concentracin de sustrato en presencia y ausencia de un inhibidor (I) de concentracin 2 x 10-4M. a) Determine la KM y VMax en ausencia del inhibidor. b) Determine la KM y VMax en presencia del inhibidor. c) Determine de que tipo de inhibicin de trata.

Conc . de sustrato M 0.3 x 10-5 0.5 x 10-5 1.0 x 10-5 3.0 x 10-5 9.0 x 10-5

Velocidad en micromoles por minuto Sin inhibidor Con inhibidor 10.4 2.1 14.5 2.9 22.5 4.5 33.8 6.8 40.5 8.1

18. Determine la fraccin de la velocidad max que se tiene cuando la concentracin de sustrato es igual a 2k m, 10 km, y 50 km,.. Que puede deducir? 19. Una enzima se inhibe competitivamente en grados diferentes en la misma concentracin de tres inhibidores separados I1, I2 e I3. Las constantes de disociacin de los inhibidores son K I1= 0.1 mM, KI2= 0.01 mM, KI3= 1.0 mM. Cul inhibidor producir probablemente la mayor inhibicin y cul la menor inhibicin?. Justifique ampliamente. 20. La penicilina es hidrolizada y con ello inactivada por la penicilinasa (beta-lactamasa), una enzima presente en algunas bacterias resistentes. La masa de este enzima en Staphylococcus aurus es de 29.6 kd. La cantidad de penicilina hidrolizada en un minuto es una disolucin de 10 ml que contiene 10 -9g de penicilinasa purificada se midi como funcin de la concentracin de penicilina. Suponga que la concentracin de penicilina no cambia apreciablemente durante el ensayo. [penicilina] 0.1 x 10-5 0.3 x 10-5 0.5 x 10-5 1.0 x 10-5 3.0 x 10-5 5.0 x 10-5 Cantidad hidrolizada en moles 0.11 x 10-9 0.25 x 10-9 0.34 x 10-9 0.45 x 10-9 0.58 x 10-9 0.61 x 10-9

a) Obedece la penicilinasa la cintica de Michaelis-Menten. Calcule a partir de la grafica V.R vs Conc de S. Los parmetros KM y VMax. b) Haga la representacin de 1/V frente a 1/S a partir de los datos y calcule K M y VMax. Compare los valores obtenidos por ambos mtodos. 21. La enzima deshidrogenasa glutmica cataliza la siguiente reaccin: L- glutamato + NAD+ Concentracin de Lglutamato milimolar 1.68 3.33 5.00 6.67 10.00 20.00 alfa-cetoglutarato + NH3 + NADH + H+ Velocidad inicial (cambio en absorbancia a 360 nm/min) 0.22 0.100 0.136 0.153 0.184 0.234

A continuacin se muestran los datos experimentales al medir la velocidad de formacin del producto:

Calcule a partir de la grafica V.R vs Conc de S. Los parmetros KM y VMax. b) Haga la representacin de 1/V frente a 1/S a partir de los datos y calcule K M y VMax. Compare los valores obtenidos por ambos mtodos.

22. La enzima deshidrogenasa 6-fosfoglucnica cataliza la descarboxilacin oxidativa del cido 6-fosfoglucnico, de acuerdo con la siguiente reaccin: Acido 6 - fosfoglucnico + NADP+ ribulosa-5-fosfato + CO2 + NADPH + H+ De los datos cinticos de abajo, determine que efecto tiene El rosa de bengala sobre la actividad de la deshidrogenasa. a) Determine la KM y VMax en ausencia del inhibidor. b) Determine la KM y VMax en presencia del inhibidor. c) Determine de que tipo de inhibicin de trata. Concentracin de NADP+ (10-5 M) 2 3 4 6 10 Velocidad inicial unidades de actividad enzimtica Sin agregar nada Con rosa de bengala (10 -5M) 2.12 1.11 2.70 1.47 2.94 1.73 3.33 2.32 3.85 2.78