ANALISIS KARBOHIDRAT SECARA KUALITATIF DAN KUANTITATIF Karbohidrat ('hidrat dari karbon', hidrat arang) atau sakarida (dari

bahasa Yunani, skcharon, berarti "gula") adalah segolongan besar senyawa organik yang paling melimpah di bumi. Karbohidrat memiliki berbagai fungsi dalam tubuh makhluk hidup, terutama sebagai bahan bakar (misalnya glukosa), cadangan makanan (misalnya pati pada tumbuhan dan glikogen pada hewan), dan materi pembangun (misalnya selulosa pada tumbuhan, kitin pada hewan dan jamur). Secara biokimia, karbohidrat adalah polihidroksil-aldehida atau polihidroksilketon, atau senyawa yang menghasilkan senyawa-senyawa ini bila dihidrolisis. Karbohidrat mengandung gugus fungsi karbonil (sebagai aldehida atau keton) dan banyak gugus hidroksil. Pada awalnya, istilah karbohidrat digunakan untuk golongan senyawa yang mempunyai rumus (CH2O)n, yaitu senyawa-senyawa yang n atom karbonnya tampak terhidrasi oleh n molekul air. Namun demikian, terdapat pula karbohidrat yang tidak memiliki rumus demikian dan ada pula yang mengandung nitrogen. Karbohidrat merupakan senyawa senyawa aldehida atau keton yang mempunyai gugus hidroksil. Senyawa seyawa ini menyusun sebagian besar bahan organic di dunia karena peran multipelnya pada semua bentuk kehidupan. Karbohidrat bertindak sebagai sumber energi, bahan bakar, dan zat antara metabolisme. Contoh : pati pada tumbuhan dan glikogen pada hewan adalah polisakarida yang dapat dimobilisasi untuk menghasilkan glukosa (bahan bakar utama untuk pembentukan energi). Gula ribosa dan deoksi ribosa pembentuk sebagian kerangka struktur RNA dan DNA. Fleksibilitas cincin kedua gula ini penting pada penyimpanan dan ekspresi informasi genetika. Karbohidrat atau sakarida terdapat gugus hidroksil (-OH), gugus aldehid atau gugus keton. Maka dapat didefinisikan bahwa karbohidrat sebagai senyawa polihidroksialdehida atau polihidroksiketon, atau senyawa yang dihidrolisis dari keduanya. Karbohidrat dapat digolongkan berdasarkan jumlah monomer penyusunnya. Ada 3 jenis karbohidrat berdasarkan penggolongan ini, yaitu,

Monosakarida, Disakarida (Oligosakarida) dan Polisakarida. Adanya karbohidrat dalam makanan dapat diketahui dengan berbagai uji baik uji kualitatif maupun uji kuantitatif. UJI KUALITATIF KARBOHIDRAT 1. Uji Benedict a. Prinsip : Gula yang mempunyai gugus aldehid atau keton bebas akan mereduksi ion Cu
2+

dalam suasana alkalis menjadi Cu+ yang mengendap sebagai Cu2O berwarna

merah bata. b. Jenis Karbohidrat yang Dianalisa Uji Benedict adalah uji kimia untuk mengetahui kandungan gula (karbohidrat) pereduksi (yang memiliki gugus aldehid atau keton bebas) . Gula pereduksi meliputi semua jenis monosakarida dan beberapa disakarida seperti laktosa, glukosa dan maltosa. c. Cara kerja 1. Alat dan bahan disiapkan 2. 3 tetes sampel(dalam bentuk larutan) dimasukkan kedalam tabung reaksi yang masih kering dan bersih 3. 2 mL pereaksi Benedict ditambahkan, kemudian dikocok. 4. Dimasukkan kedalam penangas air selama 5 menit. Amati perubahan warna endapannya. 5. Pembentukan warna endapan hijau, kuning, atau merah menunjukan reaksi positif karbohidrat.

2. Uji Molisch a. Prinsip Prinsip reaksi ini adalah dehidrasi senyawa karbohidrat oleh asam sulfat pekat. Dehidrasi heksosa menghasilkan senyawa hidroksi metil furfural, sedangkan dehidrasi pentosa menghasilkan senyawa fulfural. Uji positif jika timbul cincin merah ungu yang merupakan kondensasi antara furfural atau hidroksimetil furfural dengan a-naftol dalam pereaksi molish. Uji molisch adalah uji kimia kualitatif untuk mengetahui adanya karbohidrat. Uji ini untuk semua jenis karbohidrat. Mono-, di-, dan polisakarida akan memberikan hasil positif. b. Jenis karbohidrat yang dianalisa Uji ini untuk semua jenis karbohidrat. Monosakarida, disakarida, dan polisakarida akan memberikan hasil positif. c. Cara Kerja 1. 15 tetes larutan uji dimasukkan ke dalam tabung reaksi. 2. 3 tetes pereaksi Molisch ditambahkan dan dicampur dengan baik. 3. Tabung reaksi dimiringkan lalu dialirkan dengan hati-hati 1 mL H2SO4 pekat melalui dinding tabung agar tidak tercampur. 4. Reaksi positif ditandai dengan terbentuknya cincin berwarna ungu pada batas antara kedua lapisan 3. Uji Seliwanoff a. Prinsip : Dehidrasi fruktosa oleh HCl pekat menghasilkan hodroksimetilfurfural dan dengan penambahan resorsinol akan mengalami kondensasi membentuk senyawa kompleks berwarna merah oranye.

b. Jenis karbohidrat yang dianalisa

Uji Seliwanoff bertujuan untuk mengeahui adanya ketosa (karbohidrat yang mengandung gugus keton) c. Cara kerja 1. 5 tetes larutan uji dan 15 tetes pereaksi Seliwanoff dimasukkan ke dalam tabung reaksi 2. Tabung dididihkan di atas api kecil selama 30 detik atau dalam penangas air mendidih selama 1 menit. 3. Hasil positif ditandai dengan terbentuknya larutan berwarna merah orange. 4. Uji Barfoed a. Prinsip Ion Cu2+ (dari pereaksi Barfoed) dalam suasana asam akan direduksi lebih cepat oleh gula reduksi monosakarida daripada disakarida dan menghasilkan endapan Cu2O berwarna merah bata. b. Jenis karbohidrat yang dianalisa Uji ini untuk membedakan monosakarida dan disakarida dengan jalan mengontrol kondisi-kondisi percobaan, seperti pH dan waktu pemanasan. Pada analisa ini, karbohidrat direduksi pada suasana asam. Disakarida juga akan memberikan hasil positif bila didihkan cukup lama hingga terjadi hidrolisis. c. Cara kerja 1. 1 mL larutan uji karbohidrat dimasukkan kedalam tabung reaksi yang masih kering dan bersih. 2. 1 mL pereaksi Barfoed ditambahkan, kemudian dikocok. 3. Tabung dimasukkan kedalam penangas air selama 3 menit. 4. Dinginkan dalam air mengalir. 5. Bila tidak terjadi reduksi selama 5 menit, lakukan pemanasan selama 15 menit sampai terlihat adanya reduksi.

5. Uji Tollens a. Prinsip Aldehid dioksidasi menjadi anion karboksilat, ion Ag+ dalam reagensia Tollens direduksi menjadi logam Ag. Uji positf ditandai dengan terbentuknya cermin perak pada dinding dalam tabung reaksi. b. Jenis karbohidrat yang dianalisa Uji ini untuk positif terhadap karbohidrat pentosa yang membedakannya dengan heksosa. c. Cara kerja 1. Masukkan beberapa tetes larutan uji karbohidrat kedalam tabung rekasi yang telah diisi 2 mL pereaksi Tollens. 2. Masukan kedalam penangas air selama 1 menit. Perhatikan perubahan warna yang terjadi. 3. Hasil dicatat 6. Uji Iodium a. Prinsip Polisakarida dengan penambahan iodium akan membentuk kompleks adsorpsi berwarna yang spesifik. Amilum atau pati dengan iodium menghasilkan warna biru , dekstrin menghasilkan warna merah anggur, sedangkan glikogen dan sebagian pati yang terhidrolisis bereaksi dengan iodium membentuk warna cokelat. b. Jenis karbohidrat yang dianalisa Uji iod bertujuan untuk mengidentifikasi polisakarida. Uji iod juga dapat membedakan amilum dengan nitrogen.

c. Cara kerja 1. 3 tetes larutan uji dimasukkan ke dalam tabung reaksi 2. Ditambahkan 2 tetes larutan iodium 3. Diamati perubahan warna yang terjadi 7. Uji Osazon a. Prinsip Suatu aldosa atau ketosa dengan fenil hidrazin akan membentuk Kristal osazon. Kristal osazon yang terbentuk khas sesuai dengan jenisnya. b. Jenis karbohidrat yang dianalisa Untuk membedakan bermacam-macam karbohidrat dari gambar kristalnya. c. Cara kerja 1. 2 mL larutan uji dimasukkan ke dalam tabung reaksi 2. Seujung spatel fenilhidrazin-hidroklorida dan kristal natrium asetat ditambahkan ke dalam tabung. 3. Tabung dipanaskan dalam penangas air mendidih selama beberapa menit. 4. Didinginkan perlahan dibawah air keran. 5. Perhatikan kristal yang terbentuk dan diidentifikasi dibawah mikroskop. 8. Hidrolisa Sukrosa a. Prinsip Sukrosa dalam HCl dalam keadaan panas akan terhidrolisis, lalu menghasilkan fruktosa dan glukosa. Hal ini menyebabkan uji Benedict dan Seliwanoff yang sebelumnya hidrolisis menghasilkan hasil negative menjadi positif. Uji Barfoed menjadi positif pula dan menunjukkan bahwa hidrolisis sukrosa menghasilkan monosakarida. b. Jenis karbohidrat yang dianalisa

Mengidentifikasi hasil hidrolisis sukrosa c. Cara kerja 1. Isi tabung reaksi dengan 5 mL larutan uji sukrosa. 2. Tambahkan 1 mL HCl 10%. 3. Masukan kedalam penangas air selama 15 menit. 4. Dinginkan perlahan-lahan, kemudian netralkan. 5. Tes hidrolisa dengan pereaksi Benedict, Seliwanoff dan Barfoed. 6. Catat hasil dan buatlah kesimpulannya 9. Uji Bial Uji bial untuk menguji adanya gula pentose. Pemanasan pentose dengan HCl pekat akan menghasilkan furfural yang berkondensasi dengan orcinol dan ion feri. Hasil pemanasan akan menghasilkan warna biru hijau yang menunjukkan adanya gula pentosa. a. Prinsip Dehidrasi pentosa oleh HCl pekat menghasilkan furfural dengan penambahan orsinol (3.5-dihidroksi toluena) akan berkondesasi membentuk senyawa kompleks berwarna biru. b. Jenis karbohidrat yang dianalisa Membuktikan adanya pentose c. Cara kerja 1. 5 tetes larutan uji dimasukkan ke dalam tabung reaksi. 2. 10 tetes peraksi Bial dan 2 tetes HCl pekat ditambahkan 3. Campurlah dengan baik, lalu dipanaskan di atas api kecil sampai timbul gelembung-gelembung gas dipermukaan larutan.

4. Perhatikan warna atau endapan yang terbentuk. Terbentuknya warna biru menunjukan adanya pentose. 10. Hidrolisa Pati a. Prinsip Pati dalam suasana asam bila dipanaskan akan terhidrolisis menjadi senyawasenyawa yang lebih sederhana. Hasil hidrolisis dapat diuji dengan iodium dan menghasilkan warna biru sampai tidak berwarna. Hasil akhir hidrolisis ditegaskan dengan uji Benedict. b. Jenis karbohidrat yang dianalisa Mengidentifikasi hasil hidrolisis amilum (pati) c. Cara kerja 1. 5 mL amilum 1% dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan 2,5 mL HCl 2 N 2. Campurlah dengan baik, lalu dimasukkan ke dalam penangas air mendidih. 3. Setelah 3 menit, ujilah dengan iodium dengan mengambil 2 tetes larutan ditambah 2 tetes iodium dalam porselin tetes. Catatlah perubahan warna yang terjadi. 4. Lakukan uji iodium setiap 3 menit sampai hasil berwarna kuning pucat. 5. Lanjutkan hidrolisis selama 5 menit lagi. 6. Setelah didinginkan, diambil 2 mL larutan hasil hidrolisis, lalu netralkan dengan NaOH 2%. Uji dengan kertas lakmus. 7. Kemudian ujilah dengan Benedict. 8. Simpulkan apa yang dihasilkan hidrolisis pati.

UJI KUANTITATIF KARBOHIDRAT

1. Analisis total gula (Metode Fenol) a. Prinsip Gula sederhana, oligosakarida, polisakarida, dan turunannya dapat bereaksi dengan fenol dalam asam sulfat pekat menghasilkan warna oranye kekuningan yang stabil. b. Jenis karbohidrat yang dianalisa. Metode ini digunakan untuk menetapkan total gula semua bahan pangan. c. Cara kerja Pembuatan kurva standar : 1. Ambil sebanyak 2 mL larutan pada beberapa konsentrasi 2. Tambahkan 1 mL larutan fenol (5%), lakukan vortex 3. Tambahakan 5 mL larutan asam sulfat pekat dengan cepat secara tegak lurus kepermukaan cairan 4. Diamkan selama 10 menit, vorteks, dan tempatkan dalam penangas air selama 15 menit. Ukur absorbansnya pada 490 nm untuk hekstosa sedangkan untuk pentosa dan asam uronat 480 nm. 5. Buat plot kurva standar. Lalu tentukan persamaan regresi linier. Analisis contoh 1. Lakukan pengenceran contoh 2. Masukkan 2 mL contoh ke dalam tabung reaksi dan lakukan tahap seperti pada pembuatan kurva standar. Perhitungan menggunakan metode fenol adalah konsentrasi gula dalam contoh ditentukan dengan menggunakan kurva standar (hubungan antara konsentrasi gula standar dengan absorbans) dan memperhitungkan pengenceran yang dilakukan. Rumus perhitungannya dapat ditulis sebagai berikut. Total gula (%) = ((GxFP)/W)x100

Dimana: G FP W = konsentrasi gula dari kurva standar (gram) = faktor pengenceran = berat contoh (gram)

2. Analisis total gula (Metode Anthrone) Gula dapat bereaksi dengan sejumlah pereaksi menghasilkan warna spesifik. Intensitas warna dipengaruhi oleh konsentrasi gula. Intensitas warna yang terbentuk diukur dengan spektofotometer. Pereaksi Anthrone (9,10-dihidro-9-oksoantrasena) 0,1% dalam asam sulfat pekat. Pereaksi Anthrone bereaksii dengan karbohidrat dalam asam sulfat pekat menghasilkan warna biru kehijauan. Intensitas absorbansnya diukur pada =630nm. Metode ini digunakan untuk analisis total gula bahan padat atau cair. a. Prinsip Prinsip dasar dari metode anthrone adalah senyawa anthrone akan bereaksi secara spesifik dengan karbohidrat dalam asam sulfat pekat menghasilkan warna biru kehijauan yang khas. Senyawa anthrone (9,10-dihydro-9- oxanthracene) merupakan hasil reduksi anthraquinone. b. Jenis karbohidrat yang dianalisa Metode ini digunakan untuk menetapkan total gula semua bahan pangan. c. Cara kerja Pembuatan kurva standar : 1. Kedalam tabung reaksi bertutup, pipet larutan glukosa standar sebanyak 0,2;0,4;0,6;0,8; dan 1,0 ml (glukosa standar 0,2 mg/ml), lalu encerkan sehingga total volume masing-masing tabung 1,0 ml. 2. Buat larutan blanko dengan cara memipet 1 ml air destilata ke dalam tabung reaksi lain. 3. Tambahkan pereaksi 5 ml Anthrone dengan cepat ke dalam larutan glukosa standard an blanko kemudian tutup. Voertex dan kocok hingga merata. 4. Panaskan tabung reaksi di atas penangas air 100oC selama 12 menit. Dinginkan

5. Pindahkan larutan ke dalam kuvet dan baca absorbans dengan UV-Vis spektrofotometer pada 630 nm. 6. Buat plot kurva yaitu konsentrasi (g) glukosa standar pada sumbu x dan nilai absorbans pada sumbu y. Analisis contoh : 1. 2. 3. Lakukan pengenceran contoh Masukkan sebanyak 1ml contoh kedalam tabung reaksi tertutup Lakukan tahap seperti pada pembuatan kurva standar Perhitungan metode ini adalah dengan menentukan konsentrasi gula dalam contoh mengguanakan kurva standar (hubungan antara konsentrasi gula standar dengan absorbans) dan memperhitunkan pengenceran yang dilakukan. Rumusnya dapat ditulis sebagai berikut. Total gula (%) = ((GxFP)/W)x100 Dimana: G FP W = konsentrasi gula dari kurva standar (gram) = faktor pengenceran = berat contoh (gram)

3. Analisis gula reduksi (Metode Lane-Eynon) Gula pereduksi dalam bahan pangan dapat ditentukan konsentrasinya berdasarkan pada kemampuannya untuk mereduksi pereaksi lain. Analisis gula pereduksi dengan metode Lane-Eynon dilakukan secara volumetri dengan titrasi/titrimetri. Metode ini digunakan untuk penentuan gula pereduksi dalam bahan padat atau cair seperti laktosa, glukosa, fruktosa, maltosa. a. Prinsip

Metode Lane-Eynon didasarkan pada reaksi reduksi pereaksi Fehling oleh gula-gula pereduksi. Penetapan gula pereduksi dengan melakukan pengukuran volume larutan gula pereduksi standar yang dibutuhkan untuk mereduksi pereaksi tembaga (II) basa menjadi tembaga (II) oksida (Cu 2O). Udara yang mempengaruhi reaksi dikeluarkan dari campuran reaktan dengan cara mendidihkan laruta selama titrasi. Titik akhir titrasi ditunjukkan dengan metilen blue yang warnanya akan hilang karena kelebihan gula pereduksi di atas jumlah yang dibutuhkan untuk mereduksi semua tembaga b. Jenis karbohidrat yang dianalisa Metode ini digunakan untuk penentuan gula pereduksi dalam bahan padat atau cair seperti laktosa, glukosa, fruktosa, maltose c. Cara kerja Standarisasi larutan fehling : 1. Masukkan 10 ml laruta campuran Fehling A dan B kedalam erlenmeyer dan tambah 2-4 tetes metilen blue 0,2%. 2. Kemudian lakukan tahapan seperti pada analisis contoh. Analisis contoh : 1. Campurkan larutan fehling A dan B dengan volume yang sama 2. Pipet 10 ml larutan dari hasil persiapan contoh kedalam erlemeyer 3. Tambahkan kedalam erlenmeyer 10 ml larutan campuran fehling A dan B serta 2-4 tetes metilen blu 0,2 %. 4. Panaskan campura larutan di atas hot plate magnetic stirrer 5. Setelah mendidih, lakukan titrasi sengan larutan gula standart sampai warna biru hilang 7. Titrasi dilakukan dengan cepat, maka perlu ditambahkan larutan glukosa standar dengan volume tertentu.

Perhitungan dalam metode ini adalah sebagai berikut. Gula pereduksi (%) = [(V0-Vs)xGxTsxFx100]/(TxW) Dimana: Vo Vs G Ts T W F = volume larutan glukosa standar untuk titrasi larutan Fehling (ml) = volume larutan glukosa standar untuk titrasi contoh (ml) = konsentrasi larutan glukosa standar (g/ml) = volume contoh total dari persiapan contoh (ml) = volume contoh yang diperlukan untuk titrasi (ml) = berat contoh (g) = faktor pengenceran

3. Analisis Gula Reduksi (Nelson-Somogyi) a. Prinsip Metode Nelson-Somogyi didasarkan pada reaksi reduksi pereaksi tembaga sulfat oleh gula-gula pereduksi. Gula pereduksi mereduksi pereaksi tembaga (II) basa menjadi tembaga (I) oksida (Cu2O). Cu2O ini bersama dengan arsenomolibdat membentuk senyawa komplek berwarna. Intensitas warna menunjukkan banyaknya gula pereduksi dengan pengujian menggunakan =520 nm. b. Jenis karbohidrat yang dianalisa. Metode ini dapat digunakan untuk mengukur kadar gula reduksi. c. Cara kerja Pembuatan kurva standar 1. Siapkan 6 tabung reaksi masing masing diisi dengan 0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 dan 1 ml larutan glukosa standar.

2. Tambahkan aquadest dalam tiap tiap tabung tersebut sehingga volume untuk tiap-tiap tabung mencapai 1 ml 3. Tambahkan 1 ml reagensia Nelson pada tiap-tiap tabung dan panaskan dalam air mendidih selama 20 menit 4. Dinginkan semua tabung dengan cara direndam dalam air dingin hingga suhu mencapai 250C 5. Tambahkan 1 ml reagen Arsenomolibdat pada tiap-tiap tabung, kocok homogen sampai semua endapan kuprooksida larut semua. 6. Tambahkan 7 ml aquadest,kocok homogen 7. Tera absorbansinya pada 540 nm dengan spektrofotometer 8. Buat kurva standar hubungan antara absorbansi dan konsentrasi 9. Tentukan persamaan kurva standarnya Penentuan kadar gula reduksi sampel: 1. Ambil 1 ml larutan sampel jernih, lakukan prosedur yang sama dengan pembuatan kurva standar mulai dari no. 3 7. 2. Tentukan kadar gula reduksi sampel dengan menggunakan persamaan kurva standar. Perhitungan dalam metode ini adalah kandungan gula pereduksi dalam contoh ditentukan dengan menggunakan kurva standar (hubungan antara konsentrasi gula standar dengan absorbans) dan memperhitungkan pengenceran yang dilakukan. Apabila kandungan gula pereduksi diketahui, maka kandungan gula non-pereduksi dapat ditentukan sebagai selisih antara kadar total gula dengan kadar gula pereduksi. Total gula = gula pereduksi + gula non-reduksi 4. Analisis Total Pati, Amilosa, Amilopektin Kandungan pati dalam bahan pangan dapat ditentukan secara volumetrik/titrimetri atau kolorimetri. Penentuan total pati adalah dengan cara menghidrolisis pati secara sempurna menjadi glukosa. Hidrolisis pati menjadi gula

dapat terjadi saat ada perlakuan asam yaitu memecah ikatan glikosidik yang menghubungkan antar glukosa. Dapat juga terjadi secara enzimatis (enzim -amilase dan glukoamilase) yang memecah molekul-molekul amilosa dan amilopektinn menjadi gula sederhana. Kandungan glukosa dapat ditentukan menggunakan metode penetapan gula seperti metode Anthrone, metode fenol, metode Lane-Eynon, metode NelsonSomogyi. Kandungan pati ditentukan menggunakan fakor pengali (0,9). Sehingga kandungan pati adalah kandungan glukosa x 0,9. Dapat ditentukan untuk analisis kadar pati pada contoh padat atau cair. Prosedur Kerja Analisis Total Pati Persiapan Contoh : 1. Masukkan sebanyak 2 5 g contoh padat atau cair ke dalam gelas (untuk contoh padat perlu dihaluskan dahulu) 2. Tambahkan ke dalam gelas piala sebanyak 50 ml alkohol 80%. Aduk selama 1 jam 4. Saring suspensi yang terbentuk dengan kertas saring dan cuci dengan air sampai volume filtrat 250 ml (filtrat ini mengandung karbohidrat yang larut dan dibuang) 5. Untuk menghilangakn lemak, cuci pati yang terdapat sebagai residu dengan 10 ml eter (sebanyak 5 kali). Saring setiap pencucian dengan kertas saring. Biarkan menguap eter yang tersisa dalam residu. 6. Cuci lagi residu dengan 150 ml alkohol 10% untuk membebaskan lebih lanjut karbohidrat yang terlarut. 7. Pindahkan residu secara kuantitatif dari kertas saring ke dalam gelas piala dengan cara pencucian dengan 200 ml air. Tambahkan 20 ml HCl 25%. 8. Tutup suspensi residu di dalam gelas piala dengan pendinginan balik (kondensor). 9. Setelah didinginkan, netralkan larutan yang terbentuk dengan larutan NaOH 45% dan masukkan ke dalam labu takar 500 ml secara kuantitatif. 10. Tepatkan larutan sampai tanda tera dengan menggunakan air destilat. 11. Saring kembali larutan dengan menggunakan kertas saring.

Analisis contoh : Filtrate diperoleh dari persiapan contoh dianalisis kadar glukosa dengan menggunakan analisis gula pereduksi (metode Lane Eynon atau Nelson - Somogyi).

Perhitungan Berat pati dalam contoh diperoleh dengan mengalikan berat glukosa dengan 0,9. Angka 0,9 adalah factor konversi untuk pembentukan glukosa dari hidrolisis pati. Prosedur Kerja Analisis Amilosa Pembuatan kurva standar 1. Timbang sebanyak 40 mg amilosa murni dan masukkan ke dalam tabung reaksi. 2. Tambahkan ke dalam tabung reaksi 1 ml etanol 95% dan 9 ml NaOH 1N. 3. Panaskan tabung reaksi di dalam air mendidih sekitar 10 menit sampai semua amilosa membentuk gel. 4. Setelah didinginkan, pindahkan campuran secara kuantitatif ke dalam labu takar 100ml dan tepatkan dengan air sampai tanda tera 5. Pipet gel amilosa (beberapa seri konsentrasi) ke dalam labu takar 100ml 6. Tambahkan ke dalam masing masing labu takar asam asetat 1N, kemudian tambahkan masing masing 2 ml larutan iod. 7. Tepatkan larutan iod dengan air hingga tanda tera. 8. Setelah didiamkan selama 20 menit, ukur absorbans dari intensitas warna biru dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 625 nm. 9. Buat kurva standar sebagai hubungan antara kadar amilosa (sumbu x) dengan absorbans (sumbu y) Analisis contoh :

1. Gunakan contoh tepung yang mengandung pati (apabila contoh mengandung komponen lain maka pati perlu diekstrak dahulu) 2. Timbang sebanyak 100mg contoh dan masukkan ke dalam tabung reaksi 3. Tambahkan ke dalam tabung reaksi 1ml etanol 95% dan 9ml NaOH 1 N. 4. Panaskan tabung reaksi selama 10 menit untuk menggelatinisasi pati 5. Setelah didinginkan, masukkan pasta pati ke dalam labu takar 100ml dan tepatkan hingga tanda tera dengan menggunakan air 6. Pipet larutan pati tersebut dan dimasukkan ke dalam labu takar 100ml, lalu ditambahkan asam asetat 1N, 2 ml larutan iod, dan air hingga tanda tera 7. Setelah didiamkan selama 20 menit, ukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada 625 nm. Kandungan amilosa ditentukan berdasarkan kemampuan amilosa untuk bereaksi dengan senyawa iod yang menghasilkan kompleks berwarna biru. Intensitas warna biru tergantung pada kadar amilosa dan dapat ditentukan secara spektofotometri. Kandungan amilopektin ditentukan sebagai selisih antara kandungan pati dengan amilosa. Pati = amilosa + amilopektin Perhitungan dalam menentukan berat pati dalam contoh diperoleh dengan mengalikan berat glukosa dengan 0,9. Angka 0,9 adalah faktor konversi untuk pembentukan glukosa dari hidrolisa pati. Kadar amilosa (%) = (CxVxFPx100)/W Dimana, C= konsentrasi amilosa contoh dari kurva standar (mg/ml) V FP W = volume akhir contog (ml) = faktor pengenceran = berat contoh (mg) Perhitungan kadar amilosa ditentukan dengan menggunakan kurva standar, dengan menggunakan rumus:

Kadar amilopektin (%) = Kadar pati (%) Kadar amilosa (%)

Petunjuk Praktikum Biokimia. : FMIPA UNJANI 1. http://filzahazny.wordpress.com/2009/07/10/karbohidrat/ 2. http://wahyuriyadi.blogspot.com/2009/10/uji-kualitatif-karbohidrat.html 3. http://pengujiankadarpengendalian.blogspot.com/2010/11/pengujiankarbohidrat-dengan-metode.html http://id.scribd.com/doc/46498473/Analisa-Kualitatif-Dan-KuantitatifKarbohidrat#download Yazid, Estien dan Lisda, Nursanti. 2006. Penuntun Praktikum BIOKIMIA untuk Mahasiswa Analis. Andi Offset : Yogyakarta. Sudarmaji, B. dkk. 1982. Analisa Bahan Makanan dan Pertanian. Liberty : Yogyakarta Winarno, F.G. 1986. Kimia Pangan dan Gizi. Gramedia : Jakarta