Caracterizacin de la Accin de los componentes seleccionados Aceite Esencial en bacterias Gram-negativas Carvacrol, ( + )-carvona, timol, y trans-cinnamaldehyde fueron probados

por su actividad inhibidora contra Escherichia coli O157: H7 y Salmonella typhimurium. Adems, a su toxicidad Photobacterium leiognathi fue determinado, utilizando un ensayo de bioluminiscencia. Sus efectos sobre la la superficie celular fueron investigados por la medicin de la absorcin de 1 - N-phenylnaphthylamine (NPN), por la medicin de su sensibilizacin de las suspensiones bacterianas a los detergentes y la lisozima, y por analizar el material liberado de las clulas en el tratamiento de estos agentes. Carvacrol, timol, y transeuropeas cinnamaldehyde inhibido E. coli y S. typhimurium al 13 mM, mientras que (+ )-carvona se menos inhibitorio. transeuropeas Cinnamaldehyde fue el componente ms inhibitoria hacia p. leiognathi. El carvacrol y el timol se desintegr la membrana externa y libertad asociada a la membrana externa material de las clulas exteriores a la media; por dicha liberacin (+)-o trans-carvona cinnamaldehyde era insignificante. Componentes de la prueba, el carvacrol y el timol redujo el intracelulares de ATP piscina de E. coli y tambin inreased extracelular de ATP, lo que indica la accin perturbadora en el citoplasma membrana. INTRODUCCIN Plantas derivadas de los aceites esenciales han servido como agentes de sabor en los alimentos y bebidas, y debido a su verstil contenido de compuestos antimicrobianos, que poseen potencial como agentes naturales para alimentos (Conner, 1993). La actividad antimicrobiana de los principales aceites, es asignado a un nmero de pequeas y terpenoid compuestos fenlicos, que tambin en forma pura se han demostrado que la exposicin o actividad antifngica antibacteriana (Karapinar y Aktug, 1987; Didry et al., 1993; Conner, 1993; Juven et al., 1994; Oosterhaven et al., 1996; Smid et al., 1996). Mecanismos especficos de accin bactericida de aceite esencial de los mandantes, como el timol y carvacrol siguen siendo, sin embargo, mal caracterizado. La lucha contra la bacterianas propiedades de estos compuestos son, evidentemente, relacionados con su carcter lipoflico, lo que lleva a la acumulacin en las membranas y los miembros posteriores Brane-eventos asociados, tales como el agotamiento de la energa (conner, 1993; Sikkema et al., 1995). Aceites esenciales y sus componentes se sabe que activo contra una amplia variedad de microorganismos, incluyendo cin las bacterias Gram-negativas (Decanos y Ritchie, 1987; Conner, 1993; Sivropoulou et al., 1996). Todos los Gram- negativo bacterias poseen una membrana externa (OM), que proporciona la bacteria con un sur-hidroflico cara, debido a la presencia de lipopolisacrido (LPS) molculas (Nikaido, 1996). Pequeos solutos hidrfilos son capaces de pasar el OM a travs de abundantes Porin proporcionar las protenas transmembrana hidroflica-chan canales, mientras que la OM sirve como barrera de penetracin hacia macromolculas y compuestos hidrfobos, y es por esta razn que las bacterias Gram-negativas son relativamente resistentes a los antibiticos y hidrfobas drogas txicas (Nikaido y Vaara, 1985; Nikaido, 1996). La OM es, sin embargo, no es totalmente impermeable a los hidrofbico molculas, algunas de las cuales puede recorrer lentamente a travs de porins (Plsiat y Nikaido, 1992; Nikaido, 1996). En general, por encima de la OM es un requisito previo soluto para ejercer cualquier actividad bactericida hacia Las bacterias Gram-negativas. Por lo tanto, debe ser un valor de mientras que para evaluar compuestos antimicrobianos presentes en plantas para su actividad en las bacterias Gram-negativas en un nmero real de los sistemas alimentarios. Hay indicios de que tambin los microorganismos, por ejemplo, algunos de cido lctico bacterias, producen pequeas masa molecular antibacterianos y compuestos antifngicos (Helander et al., 1997b) que debe ser muy til en los alimentos. Se por lo tanto, de inters para investigar el modo de accin aceite esencial de determinados componentes en Gram-negativas bacterias, centrndose en los efectos sobre la OM. MATERIAL Y MTODOS Productos qumicos. Carvacrol, (+)-carvona trans, cinnamaldehyde, y timol (en adelante, aceite esencial de los componentes) se obtuvieron de Fluka. Las soluciones (1 mM) de estos se prepararon en el 85% de etanol acuoso. El mximo solubilidad de estos compuestos en el agua a 20 C, se determinadas en 10 mm para el carvacrol y el ( + )-carvona, 13 mM de transeuropeas cinnamaldehyde, y 7 mm de timol. Huevo de gallina blanco lisozima (CE 3.2.1.17), n-metil heptadecanoic cido ster, 1 - N-phenylnaphthylamine (NPN), SDS y se com - expulsados de Sigma-Aldrich, y el Triton X-100 es de BDH. + + Proteinasa K (CE 3.4.21.64) fue de Merck y de EDTA Riedel-de Haen-AG. Silicio y aceites AR200 eran de AR20 Wacker de Sustancias y Preparados Qumicos. Bacterias. ATCC 35150 Escherichia coli (O157: H7) y Salmonella typhimurium ATCC 13311 fueron cultivadas en caldo LB (por litro, 10 g de Difco tryptone, 5 g de extracto de levadura Difco, y 5 g de NaCl, pH 7,0) a 37 C con agitacin (200 revoluciones / min). El crecimiento fue supervisado spectrophotometr camente a 630 nm. Photobacterium leiognathi se ATCC 33469 cultivadas a 25 C con agitacin en un medio que contiene, por litro, 30

g de NaCl, 3.9 g de K 2 HPO 4 , 2,1 g de KH 2 PO 4 , 5 g de NH 4 Cl, 1 g de MgSO 4 heptahidratado, 0.75 g de KCl, 1 g de CaCO 3 , 5 g de extracto de levadura Difco, 5 g de Difco tryptone, 3 ml de glicerol, y 50 mL de 1 M TrisHCl, pH 7,5. Pruebas de inhibicin de crecimiento. Las bacterias se cultivaron a OD 630 de 0,2 y posteriormente diluido al 1 / 100 en LB caldo (2 ml) complementado con 0,2, 0,6, 2, 6, y 10 mol de la particular aceite esencial de componentes (correspondientes a las concentraciones finales de 0,1, 0,3, 1, 3, y 10 mm, respectivamente), y luego cultivadas durante 20 h. El OD 630 valores de las culturas se midieron, y la ms baja concentracin que inhibe completamente bacterial de crecimiento se tom como la concentracin mnima inhibidora (MIC). Photobacter Ensayo de toxicidad. Este mtodo es una modificacin cin de la norma DIN 38412 mtodo diseado originalmente para ecotoxi cological examen de muestras de agua, con P. leiognathi como la prueba organismo. De una cultura crecido durante 24 h se un 1% (v / v) de la dilucin en el 2% (w / v) de NaCl. Despus de 15 min a 25 C, se midi la bioluminiscencia (BioOrbit 1253 Luminom - eter, BioOrbit, Turku, Finlandia), y la prueba de los componentes adecuadamente diluida en 2% (w / v) de NaCl se aadieron en las cantidades que van desde 0,0125 a 0,5 mol. La bioluminiscencia es medirse de nuevo despus de 15 minutos de incubacin. Los valores obtenidos fueron corregidos por la disminucin de la bioluminiscencia observada en los tubos de control sin tratar, y los resultados son expresados como porcentajes de inhibicin calculados a partir de dos ejemplares mediciones de la bioluminiscencia. La adopcin de NPN. La asimilacin de la hidrfobas fluores NPN por ciento sonda clulas bacterianas en la suspensin de amortiguacin se fluorometrically determinada segn lo descrito recientemente (Helander et al., 1997a). En resumen, las culturas se han cultivado a OD 630 de 0,5 y se lavarn despus con y suspendido en 5 mM tampn HEPES, pH 7,2. Las muestras de esta suspensin con un 10 M NPN se controlaron con un Shimadzu RF-5000-spectropho tometer a 420 nm (longitud de onda de excitacin de 350 nm, ancho de corte, 5 mn), y los niveles de fluorescencia (en unidades arbitrarias) se registrados antes y despus de la adicin de concentraciones deseado de sustancias de ensayo. La estabilidad del nivel de fluorescencia, por lo general alcanza despus de 30 s de la adicin de la sustancia de ensayo, se tomarse como el resultado de valor. En la prueba, el efecto de MgCl 2 para el carvacrol, timol o inducida fluoresecence, esta sal se aadido a la memoria antes de NPN. El aumento de fluorescencia indica la aceptacin de NPN por la membrana bacteriana (s), como la rendimiento cuntico de NPN es mucho mayor en lpidos versus medio acuoso (Loh et al., 1984). Bacteriolysis. El efecto del aceite esencial de los componentes detergente o lisozima inducida bacteriolysis se ensayaron en placas de microtitulacin como se describe recientemente (Helander et al., 1997a). Las bacterias fueron cultivadas y lavado que el anterior y entonces en suspensin en un volumen similar de 10 mM HEPES contiene 50 mM de NaCl, pH 7,2. La suspensin fue dividida en dos partes, y se aadi a un aceite esencial componente en la concentracin indicada y el otro sirve como control. Las suspensiones fueron incubadas a temperatura ambiente durante 10 minutos, centrifugado y resuspendido en el tampn sin aceite esencial de los componentes. De la suspensin, alcuotas (10 8 clulas en 100 l) pipeta en los pozos de microtitulacin, que ya la figura indica las concentraciones de lisozima, Triton X-100, o EDS. Lisis celular se vigila spectropho tometrically a 405 nm por un Multiskan MCC/340 spectropho - tometer, Labsystems; resultados se expresan en porcentajes sobre la base de absorbancias de los componentes-pretratados-frente a un suspensiones de clulas tratadas en 4 min despus de la adicin de detergente o lisozima. Por lo tanto, no es igual a 100% de lisis; los porcentajes ms bajos ltico indicar accin. Cada determinacin se realiz en cuadruplicado. Por lo menos tres pruebas independientes de lisis hecho. Lipopolisacrido y liberacin de protenas. La posible liberacin de componentes OM [vase Vaara (1992)] se ha investigado por los anlisis de las clulas libres de sobrenadantes despus del tratamiento con el Aceite esencial de los componentes. Las bacterias se cultivaron a OD 630 de 0,5, y las culturas fueron divididas en porciones de 1 ml en tubos de microcentrfuga. Despus de la centrifugacin en la sala de humor - ATURALEZA (12000 revoluciones / min, 2 min, Eppendorf microfuge), las clulas se suspendieron en 10 mM Tris-HCl buffer, pH 7,2, y se centrifuga de nuevo que el anterior. Depositado las clulas se volvieron a suspendido en el buffer de Tris, a la que la sustancia de ensayo (aceite esencial de los componentes o EDTA) se ha aadido, y la suspensiones se mantuvieron a 37 C durante 10 min. El control muestras se suspendieron en tampn Tris sin adiciones. Despus de centrifugacin, 0,9 mL de la clula-libre sobrenadante fue removido y liofilizado. Para cada sustancia de ensayo, dos viales se prepararon de manera que el volumen total de recuperarse sobrenadante fue de 1,8 ml. El liofilizado sobrenadantes fueron disueltos en 100 L de SDS PGINA muestra buffer (Novex) y calentado a 100 C durante 10 min. Cada muestra fue dividida en dos partes iguales, a uno de los cuales 10 L de proteinasa K solucin (2,5 mg / mL) se aadi. Posteriormente, los viales se a 60 C durante 1 h. Las muestras fueron analizadas por SDS PGINA Novex prefabricados en 12% geles de acrilamida, 10 L de lisado se aplic al

gel. Los geles con proteinasa K-tratados muestras fueron teidas con plata (Silver Xpress kit de tincin,Novex), as como los geles de las muestras no tratadas, que se alternativamente, manchado de la protena por la Novex coloidal CooMassie mancha. Lpidos (fosfolpidos y LPS incluido) liberado de la clulas bacterianas por encima de los tratamientos se ensayaron en el base de los cidos grasos encontrados en la celda sin sobrenadantes despus tratamiento de las culturas con aceite esencial de los componentes. El bacterias se cultivaron a OD 630 de 0,6, se lava con 10 mM Tris - HCl, pH 7,2 (centrifugacin a 3000 g, 10 min, 25 C), y resuspendido en el mismo buffer, que se complement con aceite esencial de los componentes (la concentracin final ) 2 mM) o EDTA (1 mM). Muestras de control fueron suspendidos slo en amortiguacin. Despus de las suspensiones (10 ml) haban sido incubados a 37 C durante 10 minutos, se centrifuga a 11.000 rpm (1 min, Eppendorf microfuge, 25 C), con lo cual claro sobrenadantes (volumen total ) 9,1 mL) fueron cuidadosamente removidos y liofilizados. Despus de Adems de la norma interna de cidos grasos (cido n-heptadecanoic ster metlico, 105 g), las muestras fueron procesadas por Saponicin y metilacin descrita por Moore et al. (1994). Se reconoce que este procedimiento lleva a una underestima de 3-hydroxytetradecanoic cido, que es parcialmente amida relacionados en el componente lpido A del LPS (Zhringer et al. 1994) y, por tanto, convierten a la correspondiente metilo ster slo un ~ 65% de rendimiento (y Haikara Helander, 1995). El resultante steres metlicos de cidos grasos se analizaron por capilaridad cromatografa de gases (CG), la instrumentacin y las condiciones de las cuales fueron descritas recientemente (Helander et al., 1997a). Determinacin de la intra y extracelular de ATP. Para estudiar el posible efecto de los aceites esenciales sobre la permeabilidad de la membrana citoplsmica para los pequeos solutos, internos y ATP piscinas exteriores de E. coli se determin la presencia en y la ausencia de carvacrol, timol, (+ )-carvona, y la traduccin cinnamaldehyde. Clulas de E. coli ATCC 35150 fueron cosechadas en la fase de crecimiento exponencial (OD 660 de 0,8), lavadas dos veces en tampn HEPES 5 mM, pH 7,2, y se concentra (~ 50 veces). Posteriormente, se lavan las clulas diluidas en tampn HEPES a ~ una densidad de 0,2 mg de protena / ml a temperatura ambiente. Glucosa se ha aadido en el momento cero a una concentracin final de 0,5% (w / v). Despus de 5 min de incubacin, aceite esencial de los componentes (carvona, el carvacrol, timol, o trans-cinnamaldehyde) fueron aadido a una concentracin final de 2 mM. En el control de expetos, no hay aceite esencial componente aadido. El intracelular y extracelular se determinaron las concentraciones de ATP a intervalos de tiempo regulares, separando las clulas del medio externo por aceite de silicona centrifugado (Ten Brink et al., 1985). Brevemente, las muestras (200 L) de una suspensin celular microcentrifugation fueron transferidos a tubos que contienen 200 Accin de los componentes esenciales de petrleo en bacterias Gram-negativas L 2:1 de una mezcla de aceite de silicona AR200 ( F) 1,05 g / ml) y aceite de silicona AR20 ( F) 0,96 g / ml) en la parte superior de una capa de 100 L de 10% (w / v) de cido tricloroactico con 2 mM EDTA. Las clulas se hilar a travs de la aceite de silicona (5 min, 12000 g), y muestras (5 l) de las dos capas acuosas se tomaron para determinar la ATP contenido utilizando el ensayo de las lucirnagas luciferase (Lundin y Thore, 1975). Luminiscencia fue grabado usando un BioOrbit 1250 luminometer (BioOrbit, Turku, Finlandia). RESULTADOS Efecto de aceite esencial sobre los componentes bacterianos Crecimiento. Cada uno de los cuatro componentes del aceite esencial inhibi el crecimiento de E. coli y S. typhimurium. El concentraciones inhibitorias mnimas que figuran en la Tabla 1 revelan que E. coli fue igualmente inhibidas por el timol, carvacrol, y transcinnamaldehyde, mientras que ( + ) -- carvona inhibitorio fue considerablemente menor. Algo similar patrn se ha obtenido para S. typhimurium, que se ligeramente ms sensibles que E. coli hacia el carvacrol y el timol. Toxicidad de los componentes esenciales de petrleo a P. leiognathi. La prueba de toxicidad basado en la inhibicinde bioluminiscencia de las Gram-negativas Photobact rium revel la actividad inhibitoria para cada uno de los componentes, como se muestra en la Figura 1. transeuropeas Cinnamaldehyde fue ms inhibitorio, seguido (en el orden de toxicidad) por el carvacrol, timol, y ( + )-carvona. Efecto de los componentes esenciales de petrleo en el up tomar de NPN. timol y carvacrol trado aumento de la absorcin de ambos NPN E. coli y S. typhimu rium, a diferencia de ( + )-y trans-carvona cinnamalde - hyde, que mostraron ningn efecto sobre la absorcin de NPN o bien las especies. Ninguno de los componentes dado fluorescencia en las pruebas, sin las clulas bacterianas. Como se muestra en la Tabla 2, existe una gran variacin en la NPN valores de absorcin con S. typhimurium. Esta cepa tendido a tomar relativamente altas cantidades de NPN tambin en el permeabilizing falta de componentes, lo que indica una menor OM estable que el de la E. coli cepa. Magnesio iones (suministrado como MgCl 2 ), En concentraciones equimolar a los de timol y carvacrol, sin afectar a la NPN inducida por la absorcin de este ltimo sustancias (Tabla 2).

Sensibilizacin de las bacterias a los efectos ltico. Desde el aumento de la absorcin de NPN observ para el carvacrol y el timol celda indicada dotacin permea-actividad, adems se realizaron experimentos para medir la sensi zacin de las bacterias a detergente o lisozima bacteriolysis inducida. La prueba fueron sometidos a los tratamientos con aceites esenciales y componentes, posteriormente, a los detergentes SDS o Triton X-100 o a la lisozima. El ltico para cada uno de los efectos de la prueba las bacterias se muestran en los cuadros 3 y 4. SDS solo tena un ltico ligero efecto sobre E. coli, pero un fuerte efecto sobre S. typhimurium. Probado en una concentracin del 1%, Triton X-100 solo ligeramente lisis tanto E. coli y S. typhimrium. La exposicin a carvacrol sensibilizados E. coli a SDS y S. typhimurium a Triton X-100, mientras que no sensibilizacin a la lisozima se observ. Hubo marcado por la sensibilizacin hacia el timol SDS, mientras que S. typhimurium fue sensibilizado por timol a un pequeo medida hacia el Triton X-100. ( + )-Carvona haba un pequeo efecto hacia la sensibilizacin de SDS en E. coli, mientras que la traduccin cinnamaldehyde no expuestos sensibilizacin para cualquier combinacin o especies. Cuadro 5 muestra que para un efecto de sensibilizacin de timol a SDS y Triton X-100 en S. typhimurium, un timol concentracin de al menos 2 mm y se requera que el efecto fue ligeramente pero no totalmente invertido por MgCl 2 Liberacin de LPS y de protenas. Se muestra en la Figura 2 es una plata-en el que se tien de gel tratada con proteinasa K muestras de clulas libres de sobrenadantes de suspensiones tratados con el aceite esencial de los componentes o con EDTA se electrophoresed. En contraste con el sobrenadante de las clulas sin tratar, el EDTA sobrenadante revel una prominente escalera patrn tpico de buen tipo LPS. Sobrenadantes de carvacrol y el timol tratados suspensines puso de manifiesto que los patrones escalera manchada con intendad similar a la del material de EDTA sobrenadante. Sobre la base de la intensidad de la tincin, ( + )-y carvona transeuropeas cinnamaldehyde sobrenadantes figura mucho LPS menos. Los patrones se observ LPS todas las cualifidad similar. Despus de tincin de plata, las muestras que no fueron tratados con proteinasa K puso de manifiesto una serie bandas de protenas en los patrones que no fue diferente entre aceite esencial o EDTA sobrenadantes; de nuevo, el timol y carvacrol dado ms fuerte coloracin (no se muestra). En el gel teido con Coomassie azul, hay una sola prominente banda presente en el sobrenadante de clulas de las muestras tratada con EDTA, el timol, el carvacrol y. La estimacin de masa molecular de esta protena fue de 37 kDa, y por lo que es ms probable que sea una de las principales protenas Porin de la E. OM coli (Nikaido y Vaara, 1985). Tabla 1. Las concentraciones inhibitorias mnimas (CIM), de Componentes de aceite esencial de E. coli O157: H7 y S. typhimurium Figura 1. La inhibicin de la bioluminiscencia de P. leiognathi por aceite esencial de los componentes. Cuadro 2. La adopcin de valores NPN inducida por Esenciales Componentes del petrleo en suspensiones de E. coli O157: H7 y S. typhimurium fluoresecence aumento un (unidades de fluorescencia rel ( SD) un Total de los valores de fluorescencia en presencia de la prueba componente restarse de los antecedentes valor obtenido despus de NPN adicionales cin. Cada determinacin se realiz por triplicado. Anlisis de Puesto de lpidos. Anlisis de los cidos grasos de la clula-libre sobrenadantes de E. coli tratados con la aceite esencial de los componentes celulares revel tpico grasos cidos (Tabla 6). Hubo una considerable liberacin de lpidos por 1 mM EDTA, segn lo indicado por los casi 5 veces mayor cantidad de cidos grasos en el sobrenadante de EDTA en comparacin con la muestra de control. Adems, el timol y carvacrol sobrenadantes figura mucho de lpidos, mientras que ( + )-carvona ha liberado un poco ms de lpidos que encontr en la muestra de control. El contenido en lpidos de la traduccin cinnamaldehyde sobrenadante fue similar al control. En particular, la proporcin de LPS-especfica de los cidos grasos se casi 2 veces superior en el timol y carvacrol sobrenadantes que en la muestra de control, y esto proporcin es tambin mayor en el sobrenadante de EDTA. Efecto de los componentes esenciales de petrleo en la ATP Piscinas. Adicin de glucosa a las clulas de E. lavado coli no no cambiar el tamao de la piscina interior de ATP (Figura 3A), que muestran que el lavado de la cosecha y no tenan importantes efecto en el estado bioenergtico de las clulas. Adems carvacrol del resultado en una disminucin gradual de la ATP piscina interior de 3,1 a < 0,3 nmol / mg de protena en 10 minutos (Figura 3A). En el mismo perodo de tiempo, una pequea pero significativo aumento de la ATP se observ externos a un nivel que corresponda a 0,75 nmol de ATP / mg de protena (Figura 3B). Asimismo, disminuy el timol intracomunitario ATP piscina celular con la aparicin extracelular de ATP (Figura 3C, D), aunque los cambios fueron menos destacado que las observadas para el carvacrol. El cantidad de ATP que se halle fuera no puede ser enteramente explica por la disminucin de la piscina intracelular, lo que indica que tambin aument el volumen de negocios se produce ATP, ya sea dentro o fuera de las clulas. Adems de ( + )-carvona (Figura 3A) o trans-Cinnamaldehyde (Figura 3C) no tienen un efecto notable sobre el tamao de la piscina interior de la ATP durante la incubacin perodo. Adems, la exposicin de las clulas a ( + ) -- carvona (Figura 3B) o transcinnamaldehyde (Figura 3D) no indujo la aparicin de la ATP extracelular. Estos resultados muestran que la

prueba de todos los componentes de petrleo el carvacrol y el timol aumento de la permeabilidad de la membrana de la ATP. DISCUSIN Con respecto a la actividad bactericida y membrana - desintegracin de las propiedades, el aceite esencial de los componentes Cuadro 3. Ltico de actividad de lisozima, Triton X-100 y SDS contra E. coli O157: H7 con Tabla 4. Ltico de actividad de lisozima, Triton X-100 y SDS contra S. typhimurium con ( Tabla 5. Efecto de la concentracin de Timol y de MgCl 2 Figura 2. SDS PGINA de proteinasa K-libre de clulas tratadas sobrenadantes de E. coli O157: H7 expuestos a aceites esenciale componentes (2 mM) o EDTA (1 mM). Un volumen igual (10 L) de cada muestra se electrophoresed, con lo cual el ge se tien con plata. Carriles: 1, sin tratar (control), 2, EDTA sobrenadante, 3, sobrenadante timol; 4, el carvacrol aupernatant; 5, ( + )-carvona sobrenadante; 6, trans-cinnamaldehyde supernatant Accin de los componentes esenciales de petrleo en bacterias Gram-negativas investigados en este estudio se dividen en diferentes categoras. Timol y carvacrol tanto han destacado OM desintegracin de las propiedades, segn lo indicado por sus aumentando cin NPN efecto sobre la absorcin y liberacin LPS, as como sensibilizacin a los detergentes. Estos compuestos tambin inhibi el crecimiento bacteriano a concentraciones similares a los necesarios para el OM y el aumento de la desintegracin permeabilidad de la membrana citoplsmica de la ATP. transeuropeas Cinnamaldehyde fue similar a un inhibidor concentracin como el carvacrol y el timol para el crecimiento de las bacterias entricas y exhibidos en la alta toxicidad photobacter prueba, sin embargo, no exhibi OM-desintegra - rallado, ni el agotamiento de la actividad intracelular de ATP. (+ ) -- Carvona era ineficaz en la OM y expuestos bajo tanto en la actividad de inhibicin de crecimiento y en photobacter pruebas y no afecta a la piscina de ATP celular. El MIC valores presentados aqu para el carvacrol, timol, y trans-cinnamaldehyde de acuerdo previamente con reportado valores de E. coli y S. typhimurium (Karapinar y Aktug, 1987; Didry et al., 1993). A pesar de que la NPN mayor captacin ya se observ en algunos concentraciones ms bajas de lo que el PRM, el timol o carvacrol no actuar directamente como OM-permeabilizing agentes tales como EDTA o polyethylenimine, que disintegrar la OM en concentraciones que no afectan supervivencia o crecimiento bacteriano (Vaara, 1992; Helander et al., 1997a). Adems, la observacin de que MgCl 2 no ha tenido grandes efectos sobre la OM-capacidad de desintegracin el carvacrol y el timol sugiere otros mecanismos de accin de quelacin de cationes divalentes de la OM (EDTA) o intercalacin en el OM con la sustitucin de la estabilizacin de cationes y concomitante de las perturbaciones interacciones entre los constituyentes OM (polyethylen imina). De los compuestos estudiados, el transporte cinnamalde hyde es excepcional, ya que, sin ejercer desintegra grativeeffectsontheOM, itstronglyinhibitedenterobacterial el crecimiento y la bioluminiscencia de P. leiognathi. El conclusin puede, pues, que trans-cinnamalde hyde y en parte tambin el timol y carvacrol acceder a la periplasm y la parte ms profunda de la clula; de hecho, la OM-atravesando Porin protenas han sido muestra para permitir la penetracin de las sondas en lipfilos tasas significativas (Plsiat y Nikaido, 1992; Nikaido, 1996). Ser de inters para medir los antibacterianos accin de estos componentes en un dficit de Porin Gram bacterias mutantes negativos; tal experimento ser especialmente til en un intento de revelar el objetivo de accin de trans-cinnamaldehyde. Por qu la exposicin a la traduccin cinnamaldehyde no da lugar a la desintegracin de OM, mientras que el carvacrol y el timol causar importantes liberacin de componentes OM, podran estar relacionados con la fenlicos carcter de timol y carvacrol, fenoles son conocido por su membrana-inquietante actividades (Keweloh et al., 1990; Sikkema et al., 1995). Esta propiedad de fenol es muy utilizado en la extraccin de LPS de bacterias (Helander et al., 1985). Una posible razn subyacentes a la incapacidad de (+ )-carvona para inhibir el crecimiento o pueda afectar a la OM podra ser que se bombea desde la periplasm a un ritmo superior a su tasa de penetracin (Nikaido, 1994). (+)-Carvona, por otro lado, posesses una fuerte actividad antifngica (Oosterhaven et al. 1996; Smid et al., 1996). Lo mismo se aplica para el transporte cinnamaldehyde. En un estudio con Saccharomyces cerevisiae se demostr que la trans-cinnamaldehyde (5 mM) provoc un (parcial) colapso de la integridad de la membrana citoplsmica, dando lugar a fugas excesivo de los metabolitos y las enzimas de la clula y, por ltimo, la prdida de la viabilidad (Smid et al., 1996). Adems de arrojar luz sobre las diferencias de toxicidad de aceite esencial de los componentes de las bacterias Gramnegativas, nuestro Tabla 6. Anlisis de cidos grasos libres sobrenadantes de clulas de E. Culturas coli tratada con EDTA o con el indicado un LPS-cidos grasos especficos: 12:0, 14:0, 14:0 (3-OH). Figura 3. Efecto de los principales componentes del petrleo (cada uno a 2 mM) en intracelular (A, C) y extracelular (B, D) ATP piscinas de E. coli ATCC 35150. Paneles A y B muestran los niveles de ATP despus de Adems de carvacrol (crculos slidos) o ( +

)-carvona (slido cuadrados), a 5 minutos (indicado por la flecha). Paneles C y D muestran Los niveles de ATP despus de la adicin de timol (crculos slidos) y la traduccin cinnamaldehyde (cuadrados slidos). Como control, la ATP piscinas se controlaron en la ausencia de aceite esencial de los componentes (crculos abiertos). Los datos provienen de un conjunto de experimentos con duplicar las mediciones (( 0,07 nmol). validacin de datos an ms la importancia de moleculares bajos compuestos lipfilos masa. A pesar de su limitada soluciones bilidad en agua, estos compuestos son capaces de penetrar Las bacterias Gram-negativas y, por consiguiente, ser capaces de influencia la proliferacin de determinados patgenos o deterioro bacterias en los alimentos relacionados con el medio ambiente.