Biologa II

Cuantificacin de Protenas

Integrantes:

Turno: Maana
Introduccin Para estimar el valor de una concentracin de proteinas en una muestra hay dos mtodos. Uno es la absorcin de luz ultravioleta (UV) y la otra es por mtodos colorimtricos.

Absorcin de luz ultravioleta Se caracteriza por la absorcin de la luz ultravioleta por parte de las proteinas. Presenta dos picos mximos respecto a la absorcin. 280 y 200 nm -280 nm: Existen protenas constituidas por aminocidos que tienen anillos aromticos, los cuales absorben fotones por medio de sus electrones. Ejemplos: tirosina, fenilanina, triptofano, histidina. - 210nm: Por debajo de este, absorben fotones los encales peptdicos. Este mtodo se procede sin agregar ningn reactivo a la muestra, no requiere incubacin, por lo tanto se lleva a cabo rpidamente y la relacin entre la absorcin y la concentracin proteica es lineal.

Mtodos colorimtricos Este segundo mtodo se lleva a cabo agregando diferentes reactivos qumicos que reaccionan con las protenas, en consecuencia se tie de color y es medido en el espectofotmetro. Al igual que la luz ultravioleta, la relacin entre la absorcon y la concentracin proteica es lineal, en un determinado rango. Mientras se lleva a cabo la coloracin, se realiza una curva con diferentes diluciones de una solucin patrn, a la cual se le conoce la concentracin. Se estima que los valores que se obtienen, mantienen relacin con la curva realizada, tomada como referencia. Todo se realiza en simultneo con la muestra incgnita, a tener en cuenta variaciones de tiempo y temperatura, la reaccin de los reguladores utilizados y su descomposicin.

Objetivos - Determinar la concenctracin de una muestra proteica mediante el mtodo de coloracin de Bradford

Materiales

- Solucin madre de Albmina bovina (BSA) - Solucin cida del reactivo de color (Coomassie Blue G)

- Alcohol - Tubos de hemlisis - Micropipetas - espectrofotmetro

Metodologa

Procedimiento

- Realizar diluciones de muestra conocida y de muestra incgnita - Encender el espectrofotmetro - Agregar 1 ml de Bradford e incubar 5 minutos - Medir la absorbancia correspondiente de cada dilucin - Obtener la curva patrn - Calcular las concentraciones de las muestras incgnitas

Resultados

Muestra patrn 1
0.6 0.5 Absorbancia 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 2 4 Concentracin (mg/ml) 6 8 y = 0.0743x R = 0.8646

Muestra patrn 2
0.7 0.6 Absorbancia 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 2 4 6 8 10 Concentracin (mg/ml) y = 0.074x R = 0.6977

Referencias: Muestra patrn 1: curva punto a punto Muestra patrn 2: curva seriada La muestra patrn 2 no la usaremos ya que presenta mayor error. Obtencin de las concentraciones de la muestra incgnita que se midieron (punto a punto): Y=0.00743x (ecuacin de la cual se obtienen las concentraciones)

Concentraciones obtenidas (mg/ml) A 4.56 B 6.42 C 7.15 D 7.62

Absorbancia 0.339 0.477 0.531 0.566

Muestra incgnita
0.6 0.5 Absorbancia 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 2 4 6 8 10 Concentracin (mg/ml) y = 0.0743x R = 1

Obtencin de las concentraciones del promedio de las muestras medidas punto a punto:

Concentraciones obtenidas A B C D 2.73 6.33 6.72 7.06

Absorbancia (promedio) 0.203 0.4705 0.4995 0.5245

Promedio muestra incgnita

0.6 0.5 Absorbancia 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Concentracion (mg/ml) y = 0.0743x R = 1

Conclusiones: A partir de una curva de calibracin (curva patrn), que fue medida con concentraciones conocidas, se pudo determinar aproximadamente la concentracin de protenas presentes en una solucin incgnita. Las concentraciones obtenidas no fueron las esperadas, esto puede deberse a un error experimental o de medicin. Por otro lado el hecho de que la muestra c se hallaba en el lmite de curva patrn y la muestra d fuera del l los resultados al no estar incluidos en la curva, no tenamos patrones para comparar que fueran cercanos a lo que se obtuvo. Para que las muestras entraran en la curva, se debi diluir al medio la solucin y a la concentracin obtenida multiplicarla por dos. Esto no pudo realizarse por cuestiones de tiempo.

Luego se realiz un promedio de las absorbancias medidas punto a punto y se obtuvo unos resultados ms cercanos a los esperados.

Cuestionario

1- Cul es la longitud de onda a la que deber leer las muestras luego de reaccionar con el reactivo de color? Deber utilizar una longitud de onda que oscile entre los 465 y 595 nm, ya que es el pico mximo de absorcin del colorante luego de haber agregado la protena, a consecuencia de las interacciones inicas e hidrofbicas.

2- Usted cuenta con una solucin de albmina pura y quiere determinar su concentracin. Se le ha acabado el Coomassie y por problemas presupuestarios no puede comprarlo por ahora y no tiene a nadie que le preste un poco. Sin embargo cuenta en el laboratorio con un espectrofotmetro que lee hasta 280 nm, cubetas de plstico y de cuarzo. Podr calcular la concentracin de la solucin? Qu precauciones debera tener? Podr hacer lo mismo con una solucin mezcla de protenas?

Si, se podr calcular la concentracin de la solucin utilizando el espectrofotmetro, ya que es posible cuatificar mediante luz ultravioleta (UV) con una longitud de onda entre 200 y 280 nm (lmite). La cubeta deber ser de cuarzo debido a que debajo de esa longitud de onda, el vidrio y el plstico absorven. Se deber tener en cuenta el tipo de proteinas a cuantificar en solucin, ya que cada una tiene una estructura y un enlace peptdico diferente; por eso mismo en la solucin mezcla ser ms difcil de calcular sus concentraciones individuales. En conclusin, es preferible calcular las concentraciones por separado y luego la absorvancia total de la solucin.