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PPTIDOS ANTIMICROBIANOS: UN MECANISMO DE DEFENSA ANCESTRAL CON MUCHO FUTURO Karla Montao-Prez y Francisco Vargas-Albores

PALABRAS CLAVES / Pptidos Antimicrobianos / Inmunidad Innata / PAM / Karla Montao-Prez. Maestra en Ciencias. Estudiante de Doctorado, CIAD. Francisco Vargas-Albores. Doctor en Biotecnologa, Universidad Nacional Autnoma de Mxico. Investigador Titular, Laboratorio de Biotecnologa Marina, Centro de Investigacin en Alimentacin y Desarrollo (CIAD). Direccin: Centro de Investigacin en Alimentacin y Desarrollo. Apartado Postal 1735, Hermosillo, Son. 83000, Mxico. e-mail: fvargas@cascabel.ciad.mx Resumen Los microorganismos son las formas de vida ms abundantes en el planeta, siendo muchos de ellos potencialmente patgenos para otros seres vivos. Tanto plantas como animales han evolucionado combatiendo al ataque constante de microorganismos mediante el desarrollo de sistemas de defensa que varan en complejidad de acuerdo al grado evolutivo del organismo. En todos los seres vivos donde se ha estudiado, se ha descrito un mecanismo de defensa conocido como inmunidad innata, la cual es una respuesta no especfica e inmediata que se activa por el contacto con agentes extraos. En los ltimos aos se han descrito diversas molculas efectoras de la respuesta innata dentro de las que se encuentran las protenas de bajo peso molecular, conocidas como pptidos antimicrobianos. Aunque combaten un amplio espectro de microorganismos, debido a su mecanismo de accin, estos pptidos no afectan a las clulas eucariticas. Por ello, los pptidos antimicrobianos se estn estudiando intensamente y se estn ensayando como agentes antimicrobianos con aplicacin en la produccin de alimentos y como agentes teraputicos. Summary Microbes are the most abundant living forms on the planet, yet many of them are potentially pathogens to other living creatures. Plants and animals have survived fighting against microbes through the development of defense systems which vary in complexity according to the evolutionary position of each organism. In all studied organisms, a defense mechanism named innate immunity been described. It is a non-specific and immediate response following the contact with a foreign particle. In the last years diverse effector molecules of the innate immunity have been described, including low molecular weight proteins, known as antimicrobial peptides. Although they can kill a wide range of microbes, due to its action mechanism these peptides are harmless to eukariotic cells. Antimicrobial peptides are the subject of intense research and are being tested as antimicrobial agents in food industry and as therapeutic agents.

Resumo Os microorganismos so as formas de vida mais abundantes no planeta, sendo muitos deles potencialmente patognicos para outros seres vivos. Tanto plantas como animais tm evoludo combatendo ao ataque constante de microorganismos mediante o desenvolvimento de sistemas de defesa que variam em complexidade de acordo ao grau evolutivo do organismo. Em todos os seres vivos onde foi estudado, se descreveu um mecanismo de defesa conhecido como imunidade inata, a qual uma resposta no especfica e imediata que se ativa pelo contato com agentes estranhos. Nos ltimos anos foram descritas diversas molculas da resposta inata dentro das que se encontram as protenas de baixo peso molecular, conhecidas como pptidos antimicrobianos. Ainda que combatem um amplo espectro de microorganismos, devido ao seu mecanismo de ao, estes pptidos no afetam s clulas eucariticas. Por isso, os pptidos antimicrobianos esto sendo estudados intensamente e esto sendo experimentados como agentes antimicrobianos com aplicao na produo de alimentos e como agentes teraputicos.

Las plantas y los animales han logrado sobrevivir en coexistencia con microorganismos, muchos de ellos potencialmente patgenos, siendo sorprendente el ndice de sobrevivencia logrado gracias a las diversas estrategias de defensa desarrolladas. Estas estrategias incluyen la llamada inmunidad innata y una forma ms evolucionada conocida como inmunidad adquirida. El estudio de la inmunologa se ha centrado en los mecanismos de defensa adquirida, la cual involucra clulas especializadas (efectoras y de memoria) y la sntesis de inmunoglobulinas dirigidas a blancos especficos. Este mecanismo parece estar presente nicamente en vertebrados, los cuales representan un reducido nmero de las especies vivientes. Investigaciones recientes han demostrado la existencia, tanto en el reino animal como en el vegetal, de la inmunidad innata o inmediata (Boman, 1996; 2000; Hoffmann et al., 1999; Nissen-Meyer y Nes, 1997). En este mecanismo participan molculas que son las primeras en reconocer e intentar la destruccin de las partculas extraas y que muestran especificidad hacia componentes de la pared celular microbiana como lipopolisacridos (LPS) de bacterias Gram-, glicolpidos de micobacterias, el cido lipoteicnoico de bacterias Gram+, -glucanos de levaduras y dobles cadenas de RNA virales, entre otros (Boman, 2000; Hoffmann et al., 1999). Aunque el espectro parece ser reducido, es lo suficientemente eficiente para reconocer la mayora de los microorganismos. La inmunidad innata comprende tambin la accin de clulas fagocticas, activacin del sistema del Complemento y la liberacin de pptidos bioactivos (Raa, 1996; Ratcliffe, 1985). Estos elementos de inmunidad han sido detectados en todos los animales, vertebrados e invertebrados, aunque con ligeras variaciones (Figura 1). Por ejemplo, mientras que los vertebrados poseen el sistema del Complemento, los invertebrados cuentan con el sistema de activacin de la profenoloxidasa, el cual podra considerarse como un sistema anlogo (Vargas-Albores y Yepiz-Plascencia, 1998). Uno de los elementos de la inmunidad innata que tiene un papel crucial para combatir las infecciones son los pptidos antimicrobianos (PAM). Estas protenas de bajo peso molecular aparecen en organismos primitivos y se han conservado hasta los mamferos donde, curiosamente, han sido de los ltimos en descubrirse (Boman, 1995; 1996; 2000).

Los PAM fueron reportados por vez primera a mediados de la dcada 1980-1990 a travs de dos lneas de investigacin: la primera dirigida a la definicin de los mecanismos de la hemolinfa (sangre) de los insectos inmunizados para combatir crecimiento microbiano; mientras que la segunda estudiaba los mecanismos de las clulas fagocticas de mamferos para matar bacterias despus de haberlas ingerido (Boman, 1995). En trminos generales, los PAM son pptidos de bajo peso molecular (usualmente menores de 10kDa) codificados en el genoma, a diferencia de otros antimicrobianos producidos por accin enzimtica, como la penicilina. Tpicamente, son molculas catinicas debido a su alto contenido de lisina y arginina. Son anfipticas, lo que les concede estabilidad en ambientes tanto acuosos como hidrofbicos. Pueden presentar modificaciones posttraduccionales como glicosilacin, circularizacin, amidacin de los extremos y modificacin de aminocidos incluyendo D-aminocidos (Boman, 1995; Nissen-Meyer y Nes, 1997; Rao, 1995). Los PAM se sintetizan principalmente en tejidos epiteliales regularmente expuestos al ataque microbiano como la piel, intestino y pulmones. Las clulas sanguneas de defensa tambin son importantes productoras de PAM, donde constituyen parte de los mecanismos efectores no-oxidativo contra patgenos potenciales (Nissen-Meyer y Nes, 1997; Rao, 1995). Los PAM se sintetizan hasta cien veces ms rpido que una inmunoglobulina y a mucho menor costo metablico, pueden almacenarse en altas concentraciones, estar disponibles para actuar inmediatamente y se liberan o producen cuando las clulas se estimulan por contacto con microorganismos (Nissen-Meyer y Nes, 1997; Rao, 1995). Son un medio rpido, no especfico para combatir una amplia variedad de bacterias, hongos, virus e incluso protozoarios (Evans y Harmon, 1995). Distribucin de los PAM A la fecha se han descrito cerca de 500 PAM provenientes de diversos organismos incluyendo humanos, plantas, invertebrados marinos, anfibios, peces y microorganismos. A pesar de la diversidad de organismos de donde provienen, los PAM comparten similitudes funcionales y estructurales (Tabla I) que han permitido su clasificacin. PAM de plantas Las plantas no producen ningn tipo de inmunoglobulinas; sin embargo, al igual que los animales, producen sustancias que controlan el crecimiento e invasin de microorganismos. La lista de PAM de plantas contina creciendo y algunas parecen ser representativas. Las thioninas se sintetizan predominantemente en hojas y flores y tienen una clara actividad contra hongos y bacterias. Del mismo modo, las defensinas tienen una marcada actividad contra hongos (Broekaert et al., 1995; Evans y Harmon, 1995). Aparentemente la funcin de los PAM es proteger a las semillas durante la germinacin, perodo en el que su concentracin llega a ser hasta el 30% del total de protenas liberadas. Otros ejemplos de PAM de origen vegetal son las heveinas y knottinas que son eficientes en combatir infecciones causadas por hongos y bacterias Gram+ (Broekaert et al., 1995; Evans y Harmon, 1995), as como las circulinas A y B del rbol tropical africano Chassalia

parvifolia. Estos ltimos son pptidos circularizados, resistentes a la accin de proteasas y adems tienen actividad antiviral (Tam et al., 1999). PAM de insectos Los insectos, al igual que el resto de los invertebrados, no son capaces de producir anticuerpos especficos. An as, pertenecen al grupo mas exitoso en trminos de sobrevivencia y dominio de hbitats (Ratcliffe, 1985). Gran parte de este xito se debe a sus mecanismos de defensa, donde los PAM tienen un papel decisivo. En los insectos, los PAM son producidos en el cuerpo graso (equivalente al hgado en vertebrados) y en los hemocitos (Bullet, 1999; Gillespie et al., 1997; Hetru et al., 1998). Los PAM fueron descritos primero en insectos por Boman y Steiner 1981, y son, seguramente, los ms estudiados y mejor caracterizados. La cecropina es una protena de poco mas de 3kDa, capaz de inhibir el crecimiento de bacterias Gram- y se produce al inyectar bacterias a la pupa de Hyalophora cecropia (Boman, 1995; 1996). Las cecropinas conforman una familia de protenas relacionadas, con secuencias similares, un alto contenido de prolina y libres de cistena, fuertemente catinicas y particularmente activas contra bacterias Gram-. Estn ampliamente distribuidas y se han detectado en varios grupos de insectos, ascideas e incluso en vertebrados, como en el intestino de puerco (Lee et al., 1989). Miembros de la familia de las defensinas tambin han sido descritos en insectos como pptidos catinicos conteniendo 3 puentes disulfuros y con especificidad contra bacterias Gram+. Otros PAM activos contra bacterias Gram- descritos en insectos son las apidaecina, abaecina y royalisina de la abeja Apis mellifera o drosocina de Drosophila, los cuales tienen alto contenido de prolina. Tambin se han descrito PAM de aproximadamente 20kDa y ricos en glicina conocidos como atacinas, sarcotoxinas y diptericinas, entre otros, los cuales actan en sinergismo con otros pptidos, intensificando su accin. Adems, en insectos se han descrito pptidos con actividad fungicida, como la drosomycina, la cual tiene una secuencia similar a las defensinas vegetales (Gillespie et al., 1997; Hetru et al, 1998). Al igual que en todos los animales estudiados, la lisozima ha sido descrita en insectos y durante mucho tiempo se pens que era el principal factor antimicrobiano de estos organismos y su secuencia ha sido altamente conservada a travs de la evolucin. Aunque, por su actividad y tamao molecular, originalmente se incluy dentro de los PAM, la lisozima es una enzima que rompe enlaces glicosdicos -(1,4) de los peptidoglicanos de la pared celular bacteriana y su funcin puede ser digestiva o antimicrobiana (Hetru et al., 1998). Por tratarse de una enzima con diferente estructura y mecanismo de accin, actualmente la lisozima no se considera dentro de los tpicos PAM. Por otra parte, algunos insectos se han utilizado como modelos en estudios genticos, incluyendo la expresin de los genes de PAM. En Drosophila se ha demostrado que la respuesta antimicrobiana humoral no es especfica; sin embargo, puede producir diferentes PAM segn el tipo de microorganismo que ha propiciado la infeccin (Lemaitre et al., 1997). La expresin de los genes de PAM en insectos se da mediante la activacin de rutas reguladoras que guardan una estrecha similitud con la regulacin y expresin de diversos

genes de la respuesta inmune en mamferos. Estas similitudes sugieren que quizs los genes de la respuesta inmune, as como su regulacin, tengan un ancestro comn (Gillespie et al., 1997). PAM de invertebrados marinos Al igual que el resto de los invertebrados, los de origen marino carecen de sistema inmune adquirido, pero tienen varios mecanismos de defensa que responden a la presencia de microorganismos. Estos sistemas incluyen la coagulacin de la hemolinfa, melanizacin, aglutinacin celular, fagocitosis, produccin de oxgeno activo y liberacin de PAM (Ratcliffe, 1985; Vargas-Albores y Yepiz-Plascencia, 1998). Actualmente se investigan los PAM en los invertebrados marinos de inters comercial, como crustceos y moluscos (Charlet et al., 1996; Chisholm y Smith, 1992, 1994, 1995; Hubert et al., 1996), para explicar los mecanismos de defensa de estos organismos y evitar infecciones que afectan la produccin. Tambin la investigacin busca de informacin bsica para estudios de evolucin a nivel molecular, donde se ha utilizado como modelo al cangrejo cacerola (Limulus polyphemus), un organismo considerado fsil viviente (Iwanaga y Kawabata, 1998). Varios PAM han sido detectados en diferentes especies de cangrejo cacerola existentes (L. polyphemus, Tachypleus tridentatus, T. gigas y Carcinoscopius rotundicauda). Entre ellos estn tachyplesinas, tachyticina, tachystatina y defensinas que cubren un amplio rango de actividad antimicrobiana (Armstrong et al., 1996; Ehret-Sabatier et al., 1996; Kawano et al., 1990; Morvan et al., 1997; Nakamura et al., 1988; Saito et al., 1995). As mismo, se han detectado PAM en algunas especies comerciales como el cangrejo de arena Carcinus maenas (Chisholm and Smith, 1992, 1994), el camarn blanco Penaeus vannamei (Destoumieux et al., 1997, 1999, 2000) y el mejilln Mytillus edulis (Charlet et al., 1996; Hubert et al., 1996), lo cual ha abierto la posibilidad de manipular genes codificadores de PAMs para obtener organismos cultivables ms resistentes a enfermedades (Bachre et al., 1995). PAM de vertebrados Un grupo interesante para el estudio de PAM son las ranas. Los estudios se iniciaron al observar que animales con heridas en la piel y viviendo en aguas estancadas no presentaban infecciones (Boman, 2000; Rao, 1995). Hoy en da se conocen varios PAM de la piel de diferentes especies de ranas, incluyendo las magaininas, xenopinas y bombininas (Schrder, 1999). Todas presentan un amplio espectro de actividad contra bacterias Gram+ y Gram-, hongos y protozoarios. La piel humana, adems de actuar como barrera fsica protectora, produce una considerable cantidad de PAM, entre los que se encuentran los del tipo cathelicidinas y defensinas, con efectividad contra bacterias Gram+, Gram- y la levadura Candida albicans (Gallo y Huttner, 1998; Schrder, 1999). Otros epitelios que estn constantemente en contacto con microorganismos, tambien expresan defensinas. En las clulas de Panneth del intestino, el cual posee una flora microbiana especfica que rara vez est fuera de control, se han identificado defensinas-

(de mayor tamao que las defensinas-) responsables del control de la flora entrica (Boman, 2000; Evans y Harmon, 1995; Rao, 1995). En los epitelios de la mucosa traqueal, lengua, pulmn, bronquios, colon y recto de bovinos se ha demostrado la presencia de defensinas que in vitro son efectivas contra E. coli, Kleibsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosas y C. albicans (Evans y Harmon, 1995; Rao, 1995). Por otra parte, los grnulos de los leucocitos de vertebrados contienen altas concentraciones de defensinas- capaces de combatir bacterias Gram+ y Gram-, hongos filamentosos, muchos virus envueltos y algunas especies de micobacterias. Su importancia se ha demostrado al observar que los pacientes cuyos neutrfilos no producen defensinas, sufren frecuentes infecciones y presentan una respuesta inflamatoria tarda (Evans y Harmon, 1995). PAM de bacterias La produccin de PAM por bacterias se considera tambin un mecanismo de defensa, ya que as combaten a otros microorganismos que compiten por nutrientes. Los PAM de origen microbiano generalmente se conocen como bacteriocinas y en su mayora presentan muchas modificaciones postraduccionales entre las que se incluye circularizacin y aminocidos inusuales como los D-aminocidos y lantioninas (Ryan et al., 1999). Las bacterias Gram- producen dos tipos de PAM: a) bacteriocinas que pesan alrededor de 20kDa, como las colicinas producidas por E. coli, y b) microcinas menores de 10kDa, producidas por Enterobacteriaceae. Estas ultimas son altamente modificadas y presentan tres diferentes mecanismos de accin: inhibicin de enzimas metablicas, inhibicin de la replicacin del DNA e interferencia en los procesos energticos (Nissen-Meyer y Nes, 1997; Rao, 1995; Ryan et al., 1999). Las bacterias Gram+ producen bacteriocinas menores de 6kDa, usualmente catinicas, anfiflicas y permeables en membranas, como los PAM de eucariotes. Existen dos grupos de bacteriocinas de bacterias Gram+. El primero no presenta modificaciones postraduccionales (pediocina PA1, sakacina P, leucocina A y mesentericina Y105), mientras que el segundo grupo lo conforman bacteriocinas modificadas o lantibiticos. Estos ltimos son pptidos menores de 4kDa con extensas modificaciones postraduccionales incluyendo aminocidos inusuales, conocidos como lantioninas (3metilantionina, dehidroalanina y dehidrobutirina), derivados de serina y treonina. Los lantibiticos mejor conocidos son nicina, subtilina y epidermina, los cuales presentan actividad contra bacterias Gram+, aparentemente a travs de la formacin de poros en la membrana y provocando la lisis celular (Nissen-Meyer y Nes, 1997; Rao, 1995; Ryan et al., 1999). Clasificacin de los PAM Pese a la diversidad de origen y las modificaciones evolutivas, los PAM han podido ser clasificados basndose en su secuencia y estructura (Boman, 1995; Hwang, 1990). En la actualidad se conocen 5 grupos de PAM que caractersticamente tienen: 1) hlice-, 2) alto

contenido de cistena, 3) hojas-, 4) alto contenido de un aminocido y 5) aminocidos modificados. Estos ltimos se han descrito en bacterias y hongos. Pptidos hlice-. A este grupo pertenecen las cecropinas y las magaininas, entre otros. Estos PAM no contienen cistena, en sistemas acuosos son lineares, pero adoptan una conformacin de hlice- en solventes orgnicos como trifluoroetanol (reproduce las condiciones hidrofbicas de membrana), lo cual explica su accin a nivel de membrana. La hlice presenta una superficie hidrofbica y otra altamente positiva que les permite interactuar con los lpidos de las membranas (Boman, 1995; Hwang, 1990; Matsuzaki, 1998) como se explica en la seccin Mecanismos de Accin. Pptidos ricos en cistena. A este grupo pertenecen las defensinas, las cuales van de 3 a 5kDa y se agrupan en varias clases segn la localizacin de los pares de cistena, estructura tridimensional y similitud de secuencias. Se incluyen las defensinas- y de vertebrados y las defensinas de plantas e insectos. Estas ltimas son las de mayor tamao y tienen una estructura hlice- que no presentan las defensinas de vertebrados. Las defensinas- fueron detectadas primero en los grnulos de leucocitos y posteriormente en clulas de Panneth del intestino delgado. Las defensinas- se expresan en clulas epiteliales y en leucocitos de algunas especies. En su conjunto, las defensinas son activas contra muchas bacterias, hongos, levaduras y virus envueltos. Se ha demostrado que algunas defensinas tambin presentan actividad quimotctica, mitognica, corticosttica y citotxica (Evans y Harmon, 1995; Yang et al., 1999; Yu et al., 2000). Pptidos de hoja-. Se caracterizan por tener aproximadamente 20 residuos y uno o dos enlaces disulfuro que estabilizan su estructura de hojas- antiparalelas. A este grupo pertenecen polyphemusina II, y lactoferricina B (Hwang, 1990). PAM con alto contenido de un aminocido. Tienen una alta concentracin relativa de un mismo aminocido, el cual puede ser triptofano, prolina o histidina como es el caso de las apidaecinas, abaecina, drosocina, protegrinas y cathelicidinas. Su estructura presenta diferentes patrones en soluciones acuosas, pero se vuelven estables en presencia de fosfolpidos (Boman, 1995; Evans y Harmon, 1995; Hwang, 1990). PAM de origen microbiano. Como su nombre lo indica, a este grupo pertenecen los PAM producidos por bacterias y hongos, los cuales caractersticamente tienen aminocidos modificados, como se describi anteriormente. Mecanismo de Accin Para llevar a cabo su funcin microbicida, los PAM utilizan uno de los siguientes mecanismos: a) interferir en la sntesis de enzimas metablicas del DNA, como en el caso de algunos PAM de origen microbiano, cuyo proceso an no es bien conocido; o b) actuar directamente a nivel de la membrana celular ya sea alterando la permeabilidad o lisndola mediante la formacin de canales o poros, como en el caso de los pptidos hlice- (Nissen-Meyer y Nes, 1997; Shai, 1998).

Aunque se desconocen muchos detalles sobre los mecanismos de accin de los PAM hlice-, como las magaininas, se considera que actan directamente en la membrana celular y que su secuencia de aminocidos es importante (Matsuzaki, 1998), ya que si se sustituyen aminocidos que alteren la polaridad del pptido, su actividad disminuye. Aparentemente no requieren receptores especficos, como se ha demostrado al sustituir aminocidos por sus correspondientes D-enantimeros sin alterar su actividad. sto ha sido reforzado al demostrar, por resonancia magntica nuclear y dicroismo circular, que el mecanismo de dao se inicia por una interaccin electrosttica. Este comportamiento molecular y su carcter catinico hacen que los PAM presenten una mayor afinidad por los fosfolpidos cidos de las bacterias Gram- y polisacridos de las bacterias Gram+, que por los fosfolpidos anfipticos de las membranas de clulas de mamferos. Lo anterior permite explicar la falta de citotoxicidad para las clulas animales y permite proponer a los PAM como agentes teraputicos altamente especficos (Matsuzaki, 1998; Nissen-Meyer y Nes, 1997; Shai, 1998). En general, se ha propuesto que el mecanismo de accin de los PAM est dado por los siguientes pasos (Figura 3) 1) La reaccin inicia con la unin del PAM y los fosfolpidos cidos (LPS) de las membranas microbianas mediante fuerzas electrostticas. Los monmeros de los pptidos anfipticos se acomodan en la superficie de la membrana de manera que la carga positiva de los aminocidos bsicos concuerden con las cabezas de fosfolpidos con carga negativa. Cuando la concentracin relativa entre el pptido y el lpido (P/L) localmente es baja el pptido tiende a orientarse paralelamente en la membrana y es inactivo. 2) Cuando la concentracin local relativa del PAM se incrementa, el pptido tiende a tomar una posicin perpendicular a la membrana y se inserta, orientando los residuos hidrofbicos hacia la regin hidrofbica de la membrana. La capacidad de "aceptacin" de la membrana por una mayor cantidad de pptido depender de la composicin lipdica y propiedades fisicoqumicas de la misma. Esto explica los diferentes grados de susceptibilidad de una clula por un determinado PAM y la especificidad hacia ciertas bacterias. 3) Finalmente, la insercin de los pptidos en la bicapa lipdica alteran la permeabilidad de la membrana o bien ocurre la lisis celular por la presencia de los poros (Huang, 2000; Matsuzaki, 1998; Nissen-Meyer y Nes, 1997; Shai, 1998). Estructura y regulacin de los genes de PAM En los ltimos aos se han logrado importantes avances en los conocimientos bioqumicos y genticos sobre la estructura y mecanismos de regulacin de los genes de PAM en mamferos e insectos (Figura 3), particularmente en Drosophila (Barillas-Mury et al., 2000; Boman, 1995; Bullet et al., 1999; Hetru et al., 1998; Hoffmann et al., 1999; Lemaitre et al., 1997). Por ejemplo, se ha demostrado que en el genoma pueden presentarse una o varias copias de estos genes, con variado nmero de intrones e incluso transposones (Boman, 1995; 2000).

En Drosophila se ha demostrado que los genes codificadores de PAM contienen secuencias de DNA reguladoras conocidas como elementos B. Este tipo de secuencias son similares a las responsables de la regulacin de la expresin de la cadena ligera de la inmunoglobulina y de protenas de respuesta de fase aguda en mamferos. Por otra parte, en las clulas del cuerpo graso de Drosophila tambin se han caracterizado tres factores de transcripcin del tipo rel conocidos como Dorsal, Dif y Relish, los cuales se translocan al ncleo celular en respuesta a un estmulo microbiano. Estos factores nucleares B (NFB) reconocen secuencias B en la regin reguladora del gen y, consecuentemente, promueven la produccin de PAM (Barillas-Mury et al., 2000; Engstrm, 1999; Hoffmann et al., 1999; Lemaitre et al., 1997). La activacin de los genes de PAM estn bajo el control de diversas rutas reguladoras, donde la mejor caracterizada es la ruta Toll, la cual incluye la activacin de protenas de reconocimiento (Spaetzle) que se unen a receptores (Toll). La unin al receptor activa una cascada de fosforilacin de protenas citoplasmticas (Tir, Tube, Pelle) que a su vez inactivan al inhibidor IB (cactus), para permitir la translocacin de los factores de transcripcin B (Dorsal, Dif) al ncleo, activando la expresin de genes de la respuesta inmune, incluyendo los PAM (Barillas-Mury et al., 2000; Engstrm, 1999; Hoffmann et al., 1999; Lemaitre et al., 1997). Estudios recientes han revelado la presencia de receptores homlogos de Toll en humanos. Estos receptores se activan por la presencia de LPS y participan en la transduccin de seales de los LPS a travs de la membrana y activan la transcripcin de citocinas y molculas co-estimuladoras como IL-1, IL-6, IL-8 y TNF-. A su vez, estas molculas estimulan el sistema inmune adquirido, activando la respuesta celular o a la produccin de anticuerpos especficos. As, en los vertebrados, la participacin del sistema inmune innato se manifiesta al detectar la presencia de antgenos no propios, activar los primeros mecanismos (respuesta inmediata) y estimular al sistema inmune adquirido (Barillas-Mury et al., 2000; Engstrm, 1999; Hoffmann et al., 1999; Lemaitre et al., 1997; Yang et al., 1999). Las similitudes funcionales y estructurales de las rutas de sealizacin de la inmunidad innata tanto en Drosophila como en mamferos, indican que este mecanismo tiene una importancia vital y que ha tenido que ser conservado a travs de la evolucin hasta los organismos mas avanzados (Barillas-Mury et al., 2000; Engstrm, 1999; Hoffmann et al., 1999; Lemaitre et al., 1997). Perspectivas Por sus caractersticas estructurales y funcionales, as como por su baja toxicidad para clulas eucariticas, los PAM estn siendo evaluados como agentes teraputicos y profilcticos. Por ejemplo, las magaininas, dermaseptinas y otros PAM aislados de la piel de ranas se estn probando como tratamiento contra infecciones cutneas (Gallo et al., 1998; Schrder, 1999). Se ha visto adems que clulas cancergenas presentan alteraciones en la composicin lipdica de la membrana hacindola ms cida que las de clulas normales. Bajo este principio, los PAM tambin se estn evaluando como agentes anticancergenos (Shai, 1998). Debido al potencial que los PAM tienen como agentes teraputicos, se estn diseando pptidos de novo basados en las caractersticas de los pptidos naturales, tales como su

estructura tridimensional (Figura 4), su tendencia anfiptica y carcter catinico. Aunque la tcnica de produccin de pptidos es an nueva, promete importantes logros en un futuro cercano en el diseo de pptidos ms eficientes o que sean estables en diferentes ambientes. Tal es el caso de las defensinas circulares, las cuales son ms estables a los cambios de salinidad, y se ha propuesto su aplicacin en pacientes con fibrosis cstica (Yu et al., 2000). Por otra parte el lantibitico Nisin, producido por varias cepas de lactococos, ya se est usando como conservador de alimentos en la industria lctea (Nissen-Meyer y Nes, 1997; Rao, 1995). Desde el punto de vista bioqumico, los PAM son interesantes modelos para el estudio del mecanismo de incorporacin de D-aminocidos y la modificacin post-traduccional de los aminocidos (Ryan et al., 1999). Para la biotecnologa vegetal se abre la posibilidad de disear plantas transgnicas resistentes a enfermedades y a plagas a travs de la introduccin de genes de PAM (Broekaert et al., 1995). Esto mismo crea expectativas para introducir genes de defensa a organismos cultivables, incluyendo a los invertebrados marinos de inters comercial, principalmente moluscos y crustceos (Bachere et al., 1995). Por ltimo, estudios comparativos sobre la actividad de los PAM en varias especies podran ayudar a comprender por qu algunos organismos que son comensales en una especie pueden ser patgenos para otra. Conclusiones Aunque al principio los PAM se consideraron una curiosidad biolgica de menor importancia, hoy se ha confirmado que estas molculas, adems de su accin antimicrobiana directa, tambin intervienen en procesos reguladores. La inmunidad adquirida surgi hace unos 450 millones de aos en los primeros vertebrados mandibulados, quienes desarrollaron la capacidad de "recordar" los patgenos con los que estuvieron en contacto y la seleccin natural hizo de esta adaptacin una caracterstica de los vertebrados. Sin embargo, la ancestral respuesta innata no se elimin, sino que se integr al estimular y orientar a la respuesta adaptativa controlando la expresin de molculas co-estimuladoras. Los estudios sobre los constituyentes y los mecanismos de este ancestral sistema de defensa han ayudado a comprender las estrategias de sobrevida ante microorganismos y han abierto perspectivas en la concepcin de tratamientos teraputicos contra infecciones. Debido a la aparicin de cepas resistentes, muchos antibiticos comerciales ya no son efectivos. Por ello, una solucin prometedora es la produccin de nuevos antibiticos lo ms diferentes posibles a aquellos que han perdido efectividad y cuya resistencia no parece ser fcil de alcanzar, ya que no solamente depende de la neutralizacin de un agente qumico, sino de la alteracin de la membrana celular. Los PAM, cuya accin protectora han usado plantas y animales por millones de aos, llenan muchos requerimientos que demanda la industria farmacutica, la agricultura, acuacultura y produccin de alimentos en general. Ante esta perspectiva se abre un amplio campo de investigacin tanto en ciencia bsica como en la biotecnologa y bioingeniera de agentes teraputicos ms durables. Aunque forman parte de un mecanismo de defensa

ancestral, los PAM representan un futuro prometedor en la lucha contra microorganismos patgenos. AGRADECIMIENTOS Los autores agradecen a Rogerio Sotelo Mundo por su ayuda en la elaboracin de las figuras de estructuras tridimensionales y a CONACyT por el apoyo a travs del Proyecto No. 31544-B.

Figura 1. Diagrama simplificado de activacin del sistema inmune. En la primera etapa de la infeccin se da el reconocimiento del elemento extrao mediante protenas plasmticas y/o receptores celulares. Se da as mismo una sealizacin extracelular por la liberacin de citocinas que "alertan" a otras clulas. Una vez reconocido el elemento extrao el organismo reacciona ante la infeccin dando una respuesta de activacin celular, extracelular e intracelular expresndose genes que contrarrestan la infeccin. Este proceso de reconocimiento y reaccin se conoce como inmunidad innata, presente en vegetales y animales tanto vertebrados como invertebrados. La proliferacin y diferenciacin celular que lleva a la produccin de inmunoglobulinas contra antgenos especficos se conoce como inmunidad adquirida, exclusiva de los vertebrados.

Figura 2. Esquema representativo del mecanismo de accin de pptidos antimicrobianos del tipo hlice alfa. a: El pptido que en solucin acuosa tiene una conformacin lineal, al contacto con una membrana adquiere una estructura de hlice donde se polarizan los aminocidos hidrofbicos y los aminocidos catinicos. b: La interaccin electrosttica entre los lipopolisacridos de la membrana microbiana y los pptidos hace que stos tomen una posicin paralela a la membrana. c: Al aumentar la concentracin del PAM, estos se insertan perpendicularmente en la membrana dando lugar a la formacin de canales o poros por los que fluyen elementos celulares. Basada en Hetru et al., 1998, Huang, 2000; Shai, 1998.

Figura 3. Rutas de sealizacin conservadas del sistema inmune innato en mamferos y en Drosophila. Izquierda: activacin de genes de protenas co-estimuladoras por unin del complejo LPS-LBP-CD14 con el receptor homlogo Toll. Derecha: induccin del gen antifngico, drosomicina, activado por el receptor transmembranal Toll. Ntese la similitud de los componentes en ambos organismos: 1) activacin del receptor por una protena de reconocimiento del agente microbiano; 2) activacin de una cascada de fosforilacin; 3) fosforilacin del inhibidor del factor de transcripcin; 4) translocacin del factor de transcripcin que intensifica la expresin de genes de la respuesta inmune. Basada en Bullet et al., 1999; Engstrm, 1999; Hetru et al., 1998.

Figura 4. Estructura tridimensional de algunos pptidos antimicrobianos. a: Defensina de planta Tomada del archivo PDB 1BK8 Determination of the three-dimensional solution structure of Aeusculus hippocastanum antimicrobial protein 1 (Ah-AMP1) by 1H NMR. b: Defensina A de insecto. Tomada del archivo PDB 1ICA Source flesh fly (Phormia terranovae) larva recombinant form expressed in Saccharomyces cerevisiae. c: Lantibitico, vista del hexmero mostrando la posicin de las fenilalaninas que forman el canal hidrofbico. Tomada del archivo PDB 1QOW Mersadicidin from Bacillus strain: HILY-85,54728. d: Vista de una subunidad del lantibitico. En lnea gruesa se muestra el

esqueleto polipeptdico y en lnea delgada los puentes covalentes entre las cistenas y el residuo del alfa-amino butrico o dehidroalanina.

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