0141 BIOQUIMICA

EXPERIMENTAL

PARTE II. FACTORES QUE MODIFICAN LA ACTIVIDAD DE LAS ENZIMAS: EFECTO DE LA CONCENTRACIN DE SUSTRATO Y DE UN INHIBIDOR.
Objetivos: - Determinar la concentracin de sustrato en la cual la enzima alcanza su velocidad mxima. - Entender el significado de los parmetros cinticos Vmax y Km. - Calcular los parmetros cinticos de la reaccin catalizada por la lactato deshidrogenasa utilizando diferentes grficos de la ecuacin linealizada de MichaelisMenten. - Determinar el efecto de una inhibidor en la actividad de la lactato deshidrogenasa - Analizar el efecto de un inhibidor sobre los parmetros cinticos de la enzima. Introduccin El trmino cintica enzimtica implica el estudio de la velocidad de una reaccin catalizada por una enzima y los efectos que pueden tener factores como los inhibidores. Uno de los principales estudios que se realizan en una enzima es medir el efecto en la velocidad de la reaccin cuando se modifican las concentraciones del sustrato y se mantienen constantes la concentracin de enzima, el pH, la fuerza inica del medio, la temperatura, entre otros. Se evala la influencia de estos factores en la reaccin catalizada por enzimas con la finalidad de determinar los intermediarios en una reaccin y el papel que juegan en la reaccin enzimtica, es decir, para predecir mecanismos de reaccin. Es esencial entender estos mecanismos para desarrollar nuevas herramientas moleculares, por ejemplo, para combatir enfermedades en las que se conoce a la enzima que la produce. Tambin es usual medir la actividad enzimtica con diferentes sustratos para entender su especificidad o bien, medir la actividad de la enzima de diferentes tejidos u organismos para entender cmo las diferencias en actividad estn relacionadas con la funcin y/o la fisiologa del organismo del que proceden. Efecto de la concentracin de sustrato en la actividad de la enzima En las reacciones no catalizadas por enzimas la formacin de producto depende linealmente de la concentracin de sustrato aadido (Fig. 3.2A). Mientras que en las reacciones catalizadas por enzimas, generalmente se obtiene una dependencia hiperblica de la velocidad respecto a la concentracin de sustrato, distinguindose 3 partes distintas en la curva (Fig. 3.2B). En la primera parte, a bajas concentraciones de sustrato, la velocidad es proporcional a la concentracin de sustrato, de tal manera que si se duplica la concentracin de sustrato, se duplica la velocidad (reaccin de primer orden). La segunda parte de la curva, a concentraciones intermedias de sustrato, la velocidad se incrementa menos que en la primera parte con el incremento de la concentracin, iniciando alrededor de la de la Vmax. La ltima parte de la curva, a altas concentraciones de sustrato, la velocidad es independiente de la concentracin de sustrato (reaccin de orden cero), as la velocidad alcanzada es cercana a la mxima.

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A
3

B
2

Figura 3.2 Efecto de la concentracin de enzima en una reaccin no catalizada y una catalizada por enzimas. A) Reaccin no catalizada por enzimas, la formacin de producto depende proporcionalmente de la [S]. B) Curva de saturacin de una enzima. La curva se ajust a la ecuacin michaeliana. Se muestran los parmetros cinticos caractersticos de una enzima, Km y Vmax. A pesar de que la curva del efecto de la concentracin de sustrato en la velocidad de la enzima es compleja, existe una ecuacin matemtica que expresa la relacin que existe entre las variables: la hiprbola cuadrtica o tambin denominada ecuacin de Michaelis- Menten (ecuacin 1), llamada as debido al trabajo pionero de Michaelis y Menten y de Bringgs y Haldane. La deduccin de la ecuacin se describe en el Apndice I.

(1) En la ecuacin de Michaelis-Menten hay dos variables que son la velocidad (v) y la concentracin de sustrato [S]. La Km y la Vmax son constantes. La Km es llamada la constante de Michaelis-Menten. El valor de Km de una enzima para un sustrato especfico es la concentracin del sustrato a la cual la velocidad de la reaccin es la mitad de la velocidad mxima. La Vmax es la velocidad terica mxima de la reaccin catalizada por la enzima. A concentraciones muy altas de sustrato el valor de la velocidad se aproxima al de la velocidad mxima de la reaccin, pero nunca se llega a sta. Los valores de Km y Vmax son caractersticos de una enzima, y se conocen como parmetros cinticos de la enzima. Aunque son constantes, dependen de las condiciones en las que se lleva a cabo la reaccin, ya que hay que recordar que la enzima es una protena cuya estructura y carga elctrica se modifican cuando los componentes de la solucin cambian. Una manera para obtener los valores de Km y Vmax de una enzima es graficando los valores de velocidad contra la concentracin de sustrato. Este mtodo tiene la desventaja de que se grafica una curva y no una lnea recta, por lo que la interpolacin es difcil. Otra manera para obtener los valores de Km y Vmax es la de utilizar alguna de las expresiones matemticas que producen una lnea recta como son la de Eadie-Hosftie, la de Hanes o la de

0141 BIOQUIMICA EXPERIMENTAL Lineaweaver-Burk, tambin llamada de dobles recprocos (Fig. 3.3), que es la ms popular y se muestra a continuacin:
1 1 Km 1 [ S ] V max ? ? v V max *

y ??m * x ??b Puedes observar en la ecuacin que las formas lineales de la ecuacin de Michaelis-Menten son expresiones matemticas simples y son tiles para obtener los valores de Km y Vmax. Y son ampliamente usados para evaluar o analizar el efecto de inhibidores sobre la actividad enzimtica.

Figura 3.3 Grfica de dobles recprocos. Efecto de inhibidores en la actividad enzimtica Una de las formas de regulacin de la actividad de una enzima es a travs de molculas que disminuyen su velocidad de reaccin, llamadas inhibidores. Los inhibidores pueden encontrarse de manera natural en las clulas para controlar la velocidad de una reaccin metablica, o bien pueden ser compuestos sintticos que se utilizan como herramientas experimentales para el estudio de las reacciones enzimticas. Muchos compuestos txicos como antibiticos, pesticidas o herbicidas son inhibidores de enzimas responsables de reacciones vitales para la clula. La interaccin de un inhibidor y una enzima vara dependiendo de la naturaleza qumica del inhibidor y de la reaccin qumica que cataliza la enzima. Para dilucidar el tipo de interaccin entre ambas molculas se determina el efecto del inhibidor en las constantes cinticas de la enzima. Tipos de inhibidores: Inhibidor competitivo. Son molculas que tienen una similitud estructural y qumica con el sustrato de la enzima, por lo que se pueden unir al sitio activo. Sin embargo, debido a que el inhibidor no es idntico al sustrato, la enzima no es capaz de convertirlo en producto y el inhibidor simplemente bloquea el sitio activo, porque no es posible que tanto el inhibidor como el sustrato se encuentren al mismo tiempo dentro de ste. Si se adiciona ms sustrato

0141 BIOQUIMICA EXPERIMENTAL (y el inhibidor no se une de manera irreversible a la enzima) se reduce la inhibicin. En un grfico de dobles recprocos el intercepto en y es el mismo en ausencia y presencia del inhibidor, es decir el inhibidor no afecta la Vmax de la enzima, sin embargo la pendiente de la curva se incrementa. El incremento en la pendiente indica la fuerza de unin del inhibidor. De tal manera que el valor de la Km de la reaccin catalizada por la enzima se incrementa a este nuevo valor de Km se le llama Km aparente (Figura 3.4).

Figura 3.4. Efecto de los inhibidores sobre los parmetros cinticos de una enzima. Inhibidor incompetitivo o acompetitivo. Es un inhibidor que no es capaz de unirse a la enzima libre sino que slo se une al complejo enzima-sustrato. Lo anterior puede deberse a que la unin del sustrato expone o crea sitios de acceso o unin para el inhibidor, en el sitio activo o fuera de ste. Una vez que el inhibidor se une la enzima se previene la formacin de producto. El inhibidor incompetitivo altera tanto la Km como la Vmax de la enzima pero no afecta la pendiente, por lo que las curvas de dobles recprocos a diferentes concentraciones de inhibidor son paralelas (Figura 3.4). Los valores nuevos de las constantes cinticas son Km aparente y Vmax aparente. Inhibidor no competitivo. El inhibidor se une tanto a la enzima libre como al complejo enzima-sustrato. Un inhibidor no competitivo puro es aquel que modifica tanto la Km de la enzima como la pendiente de la curva de dobles recprocos, as las curvas en ausencia y presencia del inhibidor presentan diferencias en ambos interceptos, 1/Vmax y 1/Km. La mayor parte de los inhibidores no competitivos en realidad son inhibidores mixtos es decir no slo se afecta la unin del sustrato sino tambin la conversin del sustrato a producto. Debido a lo anterior, los inhibidores mixtos alteran tanto el valor de la Vmax como el de la Km. Sin embargo, la grfica de dobles recprocos muestra que adems de que se afectan ambos interceptos las curvas en ausencia y presencia de inhibidor se intersectan en el segundo cuadrante (Figura 3.4).

0141 BIOQUIMICA EXPERIMENTAL En la prctica se determinarn las constantes cinticas, Km y Vmax, de la lactato deshidrogenasa de msculo de pollo, para la reaccin en el sentido de piruvato a lactato, manteniendo constante la concentracin de enzima, el pH y la temperatura de reaccin. Tambin se determinar el tipo de inhibicin que el oxamato (un cido carboxlico) produce en la actividad de la enzima (Figura 3.5). Para la determinacin de las constantes se medir la actividad de la enzima a diferentes concentraciones de sustrato y a una sola concentracin de inhibidor. A travs del anlisis del efecto del inhibidor en los parmetros cinticos de la enzima se determinar el tipo de inhibicin que produce el oxamato.

Figura 3.5 Estructuras del piruvato y el inhibidor que se usar en la prctica, el oxamato. Material biolgico Fraccin 3 obtenida en la prctica de purificacin. Materiales y equipo 10 celdas de plstico Tubos para microfuga 1 recipiente para hielo 1 vaso de precipitados de 25 mL 3 tubos de ensayo 13x100mm 1 micropipeta de 1000 ?L 1 micropipeta de 200 ?L 1 micropipeta de 10 ?L 1 micropipeta de 50 ?L Puntas para micropipeta de diferentes capacidades 1 Vortex Parafilm Espectrmetro (por grupo) Reactivos ? 100 mM amortiguador de fosfatos pH 7.0 ? 10 mM piruvato de sodio ? 10 mM oxamato de sodio ? 4 mM NADH. Desarrollo experimental Efecto de la concentracin de sustrato. 1. Numerar las celdas. 2. En una celda de plstico adicionar el amortiguador de fosfatos, el agua y el piruvato de acuerdo a lo que se indica en la Tabla 3.3. Mantener a temperatura ambiente.

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Soluci n *Concentracin final de piruvato (mM) 100 mM Amortiguador de fosfatos pH 7.0 (?L) H O c.b.p. 1000 ?L (?L) 2 10 mM Piruvato (?L)

Tabla 3.3. Efecto de la concentracin de sustrato. 1 2 3 4

0.06* 600 0.09* 600 0.15* 600 0.25* 600

5 0.36* 600

6 0.5* 600

321 6

318 9

312

302 2 5 6 3 1 0

291 3 6 6 3 1 0

277 5 0 6 3 1 0

1 5 6 6 6 4 mM NADH (?L) 3 3 3 1 1 1 Enzima (diluida**) (?L) 0 0 0 **Usar la dilucin apropiada de enzima, preguntar a su profesor.

3. Preparar la dilucin de la enzima. El volumen preparado debe ser suficiente para que alcance para la determinacin del efecto de la concentracin de sustrato y para la del efecto del inhibidor. 4. Justo antes de medir en el espectrmetro aadir a la celda 63 ?L de NADH 4 mM, tapar con parafilm y mezclar por inversin. Registrar la lectura. Este paso se realiza para asegurarse de que la mezcla de reaccin contiene NADH. 5. Posteriormente aadir a la celda 10 ?L de la muestra de la enzima diluida, fraccin 3 obtenida en la prctica de purificacin. Tapar la celda con parafilm y agitar 2 veces por inversin. 6. Ajustar el espectrofotmetro con agua y leer la absorbancia de la muestra a una longitud de onda de 340 nm. Tabla 3.4. Lecturas de absorbancia de la actividad de la LDH a diferentes concentraciones de sustrato.
Tiempo (min) 0. 0 0. 0 0. 1 Piruvato (mM) 0. 2 0. 3 0 .

0
0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5

0141 BIOQUIMICA EXPERIMENTAL 7. Los valores de la absorbancia se registran cada 30 segundos durante 5 minutos (Tabla 3.4). Sugerencia: Se puede registrar la actividad a tiempos menores de 30 seg, por ejemplo cada 15 seg por 3 min, reduce el tiempo de uso del espectrofotmetro y an se tiene un buen nmero de puntos para construir una curva y obtener la pendiente. 8. Obtener la pendiente y calcular la actividad, segn la siguiente frmula:
?? Abs ? m ? ? ??*Vol ?? min reaccin * b ?cm ?* cantidad de enzima

Actividad ? ? M ?1 cm ?1 (mg )

??mmol min
?1

mg

?1

Donde: m: es la pendiente de la recta (?Abs/?t) en unidades de abs / min ?: es el coeficiente de extincin molecular para el NADH, 6.22 x 103 M-1 cm-1. b: es la distancia de la celda, que corresponde a 1 cm Cantidad de enzima: En vista de que no se comparar la actividad de la enzima de un proceso de purificacin, hay que calcular la cantidad de enzima que se aade al medio de reaccin tomando en cuenta la concentracin de protena de la muestra, la dilucin y el volumen que se tom para el ensayo de esta dilucin. Por ejemplo, si la concentracin de la enzima F3 es 22 g/L e hiciste una dilucin 1:300 de la fraccin y de sta tomaste 10 L, entonces la cantidad de enzima que aadiste a la celda fue de 7.33X10-4 mg de acuerdo a la siguiente operacin:

9. Posteriormente se grafican: A) Actividad vs. concentracin de sustrato (grfica de MichaelisMenten) B) La actividad de acuerdo a la ecuacin de LineweaverBurk. C) La actividad de acuerdo a la ecuacin de Hanes o Eadie-Hosftie 10. Calcular las constantes cinticas Km y Vmax con los datos obtenidos de los tres grficos anteriores y tabular los datos. 11. Analizar los valores de las constantes cinticas de la lactato deshidrogenasa. Efecto de un inhibidor en la actividad de la LDH. Al igual que en la seccin anterior se mide la actividad de la lactato deshidrogenasa a diferentes concentraciones de piruvato, pero ahora se adiciona el oxamato de sodio, compuesto que inhibe la actividad de la LDH (Tabla 3.5). 1. Adicionar en una celda de plstico los reactivos de acuerdo a los volmenes y el orden indicados en la Tabla 3.5.

0141 BIOQUIMICA EXPERIMENTAL Tabla 3.5. Composicin de medio de reaccin para medir el efecto del oxamato en la actividad de la lactato deshidrogenasa. Solucin 1 2 3 4 5 6
*Concentracin final de piruvato (mM) 100 mM Amortiguador de fosfatos pH 7.0 H O c.b.p. 1000 ?L 2 10 mM Oxamato (?L) 10 mM Piruvato (?L) 4 mM NADH (?L) Enzima (diluida) (?L) 0.06* 600 287 3 4 6 6 3 1 0 0.09* 600 284 3 4 9 6 3 1 0 0.15* 600 278 3 4 1 5 6 3 1 0 0.25* 600 268 3 4 2 5 6 3 1 0 0.36* 600 257 3 4 3 6 6 3 1 0 0.5* 600 243 3 4 5 0 6 3 1 0

2. Registrar los valores de la absorbancia cada 30 segundos durante 5 minutos (Tabla 3.6). Sugerencias: Se puede registrar la actividad a tiempos menores de 30 seg, por ejemplo cada 15 seg durante 3 min. Esto reduce el tiempo de uso del espectrofotmetro y an se tiene un buen nmero de puntos para construir una curva y obtener la pendiente. Tabla 3.5. Registro de absorbancias de la actividad de la LDH en presencia de un inhibidor.
Tiempo (min) 0. 0 0. 0 Piruvato (mM) + Oxamato 0.35 mM 0. 1 0. 2 0. 3 0 .

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5

3. Obtener la pendiente y calcular la actividad enzimtica especfica, de manera similar a como se seal en el punto 8 de efecto de la concentracin de sustrato.

0141 BIOQUIMICA EXPERIMENTAL 4. Realizar los siguientes grficos: A) Actividad vs. concentracin de sustrato; B) Grfica de actividad de acuerdo a Lineweaver-Burk y C) Curva de acuerdo al mtodo de Hanes-Wolff. 5. Calcular las constantes cinticas Km y Vmax con los datos obtenidos de los tres grficos anteriores. 6. Determinar el tipo de inhibicin que oxamato ejerce sobre la LDH a travs de la comparacin de los grficos de las cinticas sin inhibidor y en presencia del inhibidor. Cuestionario 1. Por qu es importante determinar los valores de Km y Vmax de una enzima? 2. Disea un protocolo diferente al presentado en esta seccin para determinar la actividad de la lactato deshidrogenasa. 3. Cul fue el blanco de la reaccin? 4. En qu intervalo de concentracin la reaccin de la LDH muestra un comportamiento de primer orden? 5. En qu intervalo de concentracin la reaccin de la LDH muestra un comportamiento de orden cero? 6. En qu intervalo de concentracin la reaccin de la LDH muestra un comportamiento de orden cero y en cul ser de orden mixto? 7. Define Km e indica qu unidades tiene. 8. Define Vmax e indica qu unidades tiene. 9. Compara los valores de Km y Vmax obtenidos en las tres diferentes grficas que realizaste. 10. Qu tipo de inhibidor es el oxamato? Fundamenta tu respuesta. 11. Cules son los inhibidores naturales de la LDH de msculo? 12. En el humano, cules tejidos contienen LDH? 13. Qu es el ciclo de Cori y cmo participa la LDH en l?
Referencias ? Mathews C. 1992. Bioqumica, 2da edicin, Ed. McGraw-Hill pp. 398-433. Localizacin QP514.2 ? Nelson D. 2004. Principles of Biochemistry. 2004, 4a edition Ed. Freeman and company, pp. 202-233. QH345 L43 ? Voet D, Voet JG. 1992. Bioqumica. Ed. Omega S.A. pp. 342-378. Localizacin QP514.2 ? Bennett NG, Gutfreund H. 1973. The Kinetics of the interconversion of intermediates of the reaction of pig muscle lactate dehydrogenase with oxidized nicotinamide-adenine dinucleotide and lactate. Biochemistry Journal 135, 81-85. Sitios recomendados para 1. aprender utilizar los conceptos de Km, Vmax ? http://csm.jmu.edu/biology/courses/bio220/aotw3.html en la pgina pulsar la tecla kinetics_model.xls, despus regresa a la pgina inicial y contesta las preguntas que se te hacen. ? http://www.mhhe.com/biosci/genbio/biolink/j_explorations/ch07expl.htm NOTAS Y CLCULOS