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Juan B. Ochoa, Mauricio Di Silvio, Alejandro Lichtinger, Luis Padilla Snchez, Timothy R. Billiar Efectos de las citocinas esplnicas sobre la funcin hepatocelular: la esplenectoma disminuye la produccin heptica de xido ntrico Revista de Especialidades Mdico-Quirrgicas, vol. 8, nm. 3, septiembre-diciembre, 2003, pp. 47-51, Instituto de Seguridad y Servicios Sociales de los Trabajadores del Estado Mxico
Disponible en: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=47380313

Revista de Especialidades Mdico-Quirrgicas, ISSN (Versin impresa): 1665-7330 revespmedquir@issste.gob.mx Instituto de Seguridad y Servicios Sociales de los Trabajadores del Estado Mxico

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Efectos de las citocinas esplnicas sobre la funcin hepatocelular: la esplenectoma disminuye la produccin heptica de xido ntrico.
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Dr. Juan B. Ochoa, 2Dr. Mauricio Di Silvio, 3Dr. Alejandro Lichtinger, 2Dr. Luis Padilla Snchez, 1Dr. Timothy R. Billiar.

1 Universidad de Pittsburgh, Departamento de Ciruga. Pittsburgh, PA. USA.2Centro Mdico Nacional 20 de Noviembre, ISSSTE. Unidad de Enseanza e Investigacin Biomdica. Mxico, D.F.,3Universidad Anhuac, Escuela de Medicina. Estado de Mxico, Ttulo corto: Esplenectoma y disminucin heptica de xido ntrico

Correspondencia: Dr. Mauricio Di Silvio. Sierra Nevada 779 1230, Correo electrnico: mdisilvio@issste.gob.mx

Lomas de Chapultepec, Mxico 11000, D.F., Fax 5290-

Resmen Objetivo Investigar los efectos del bazo intacto en co-cultivos de clulas de Kupffer (KC) y hepatocitos (HC) as como determinar el efecto de la esplenectoma en la habilidad de los HC para sintetizar xido ntrico (N=O) en respuesta a un estimulo. Antecedentes : Las citocinas regulan muchas funciones en el hgado, formandose en las KC adyacentes a los HC. Mtodos: Utilizamos ratas Sprague-Dawley de 200300g para todos los experimentos, siete das despus de esplenectoma o control, los animales recibieron Corynebacterium parvum (C. Parvum) 50 mg/kg IV. Los hgados fueron extrados el da 14 y los HC obtenidos por digestin enzimtica, las KC fueron obtenidas a los 7 das por digestin con pronasa y colocadas en co-cultivo con HC de ratas esplenectomizadas y controles a concentraciones de 106 clulas/pozo. Determinndose, 24 horas despus, la produccin total de nitratos (NO2-). Resultados: Los niveles plasmticos de nitritos (NO3-) antes de la esplenectoma y 7 das despus de esta no difieren en forma significativa. Los niveles de NO3- 7 das despus de inyeccin con C. parvum fueron significativamente mayores en los controles (n = 5) que en ratas esplenectomizadas (n = 8) (p < 0.01). Los HC de ratas esplenectomizadas produjeron menores cantidades de NO2- ,en cultivo, vs controles. Conclusiones: la produccin de N=O est disminuida posterior a esplenectoma, afectando directamente la respuesta normal de los HC. Un organismo incapaz de producir una respuesta de fase aguda, con los cambios en las prioridades metablicas que conocemos, tiene un riesgo mayor de muerte. Palabras clave: esplenectoma, citocinas esplnicas, xidontrico

Summary Objective: In order to know the effects of the intact spleen in co-cultures of Kupffer cells (KC) and hepatocytes (HC), and determine the effect of the splenectomy in the ability of the HC to synthesize nitric oxide (N=O) in response to an inflammatory stimulus. Background: Cytokines regulate many liver functions, released by KC adjacent to the HC. Methods: Male Sprague-Dawley rats weighing 200-300g were used for all the experiments, seven days after splenectomy or sham operation, they received Corynebacterium parvum (C.Parvum) 50mg/kg IV. The livers were harvested at the 14th day and the HC obtained by enzymatic digestion, KC were obtained at the 7th day by pronase digestion and placed in co-culture KC:HC from splenectomized and control rats at 106 cells/well., nitrates (NO2-) were determined 24 hours later. Results: Plasmatic levels of nitrites (NO3-) before splenectomy and 7 days after did not differ in a significant way. NO3 - levels seven days after the injection with C. parvum were significantly higher in control rats (n=5) than in splenectomized rats (n=8) (p<0.01) HC of splenectomized rats produced fewer quantities of NO2- in cultiure vs controls. Conclusions: The production of N=O is diminished after splenectomy, directly affecting the normal response of HC. An organism incapable of producing an acute phase response, with the changes in the metabolic priorities that we know, has a higher risk of death Key words: splenectomy, cytokines, nitric oxide.

Introduccin Actualmente, ha sido claramente establecido el principio de que las citocinas regulan una gran variedad de funciones metablicas en el hgado. El ejemplo mas claro de esto es el hallazgo de que las interleucinas 1beta y 6 (IL-1b, IL-6) y el factor de necrosis tumoral alfa (TNFa, por sus siglas en ingls) son responsables de la respuesta de fase aguda, una

respuesta caracterizada por la produccin de ciertas protenas mediadoras bajo condiciones de estrs.1-4 Algunas de estas citocinas surgen en tejidos inflamados o daados mientras que otras se forman en las clulas de Kupffer (KC) adyacentes a los hepatocitos (HC).5 Algunos de los estmulos para las KC son bien conocidos; el lipopolisacarido (LPS) 47

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dispara la secrecin de estas citocinas por las KC, el LPS puede surgir en el intestino o dentro de los focos de infeccin. Aunque el LPS puede iniciar y disparar la liberacin de citocinas por parte de clulas del linaje macrfagomonocitico (como las KC), el interfern-gamma (IFNg) es el principal activador de stas.6 La fuente del IFNg nunca ha sido investigada sistemticamente aunque se cree que se origina en el tejido linftico sistmico o esplacnico. Hemos mostrado anteriormente, por ejemplo, que las KC de ratas esplenectomizadas estn incapacitadas para modular la sntesis proteica de los HC como respuesta a LPS en cultivos mixtos de KC y HC.7 Posteriormente, encontramos que la regulacin de la sntesis proteica de los HC es resultado del efecto citocinas derivadas de las KC que llevan a la induccin de la xido ntrico (N=O) sintetasa en los HC. El N=O liberado por los hepatocitos a partir de la arginina acta directamente sobre los procesos de sntesis proteica tanto constitutiva, como de fase aguda para reducir la produccin de protenas.8 Previamente habamos concluido que el efecto completo de la esplenectoma resultaba de una regulacin a la baja de la funcin de las KC atribuida a la deficiencia relativa de citocinas esplnicas. Desde entonces hemos demostrado que el IFNg acta directamente sobre los HC para modular la funcin de la N=O sintetasa en combinacin con citocinas derivadas de las KC, IL-1b,TNFa y LPS bacteriano.7,9,10 Este estudio fue diseado para investigar si los efectos trficos del bazo intacto en cultivos de KC:HC(10) se deben a un efecto trfico directo del bazo sobre los HC. Determinamos el efecto de la esplenectoma en la habilidad de los HC para secretar N=O en respuesta a un estimulo determinado. Lo cual no pudo ser realizado in vitro ni in vivo por los HC de animales esplenectomizados. Hemos escogido un modelo de mxima induccin de N=O sintetasa en los HC. La produccin de N=O en el hgado se ve altamente inducida por la inyeccin de Corynebacterium parvum (C. parvum) el cual produce una intensa reaccin inflamatoria en el hgado y el bazo. izquierda con exposicin del bazo, el cual despus fue regresado a la cavidad abdominal. Siete das despus, los animales recibieron C. parvum (25 o 50 mg/kg) por va intravenosa. Siete das despus de la inyeccin de C. parvum, se tom una muestra de sangre para determinacin de nitrito (NO3-), y se obtuvieron los hgados para cultivo celular. Los niveles de nitrato (NO2) fueron medidos en el medio de cultivo veinticuatro horas despus. Obtencin y cultivo de HC. Los hgados fueron extrados el da 14 posterior a la esplenectoma (da 7 despus de la inyeccin con C. parvum) y los HC obtenidos por digestin con colagenasa y centrifugacin diferencial, como ha sido descrito previamente.11 Las clulas fueron cultivadas a una concentracin de 2 x 105 clulas /pozo en platos de cultivo. Veinticuatro horas despus se tomo el sobrenadante para determinacin de NO2-/NO3-. El medio utilizado para el cultivo fue Williams Eagle suplementado con penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 mg/ml, 10% suero bovino fetal, L-glutamina 2 mM (todos de Gibco Labs, NY), e insulina 10,000 U/ml (Eli Lilly Co.) Obtencin y cultivo de KC. Las KC fueron obtenidas a partir de ratas macho Sprague-Dawley de 200-300 gramos 7 das despus de la inyeccin con C. parvum (50 mg/kg) por digestin con pronasa y colocadas en cocultivo con HC de ratas esplenectomizadas y controles a concentraciones de 106 clulas/pozo.12,13 veinticuatro horas despus, se determino la produccin de NO2- (grfica1). Determinacin de NO2-/NO3-. El NO3- fue reducido a NO2utilizando una columna de cadmio en un sistema modificado de cromatografa lquida de alta presin (HPLC, por sus siglas en ingles) basado en la reaccin de Griess. La reaccin postcolumna con reactivo de Griess permiti la determinacin total de NO3- + NO2-. Para determinar la concentracin de NO3-, los niveles de NO2- fueron restados del total NO2- + NO3-. Antes del anlisis, muestras de suero fueron alcalinizadas con 0.5 N NaOH y desproteinizadas con 10% ZnSO4. La recuperacin de NO2/NO3- por este mtodo consistentemente ha sobrepasado el 95%. Reactivos y citocinas. El IFNg recombinante de rata fue comprado con Amgen, el TNFa recombinante murino a Genzyme e, IL-1b e IL-6 humana a Cistron. Se ha documentado un Material y mtodos Protocolo de esplenectoma. Fueron utilizadas ratas macho efecto medible de todas estas citocinas en HC de rata. A Sprague-Dawley de 200-300 gramos de peso para todos RIBI Co se le compro C. parvum. los experimentos. Para la anestesia se utilizo Nembutal (40 Para asegurar la significancia estadstica tanto de las variamg/kg) va intraperitoneal. Le esplenectoma fue realizada bles control, as como para las independientes, se realiz por una incisin subcostal izquierda. La operacin simula- anlisis estadstico por prueba-t de student. da en los animales control consisti en una incisin subcostal Resultados. Los niveles plasmticos de NO3- antes de la esplenectoma y 7 das despus de sta, no difieren en forma significativa. Los ni$Vy$Vy Vy $Vy$Vy Vy DG EUIADDAIJ veles de NO3- 7 das despus de la inyeccin con C. parvum (14 @yrrpth !$ !$ %  #& das despus de la esplenectoma) 8y "  '% "(( !% fueron significativamente mayores en los animales control (n = 5) que 2 1& $ en las ratas esplenectomizadas (n = 8) (p < 0.01) (grfica 2). 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Cuadro II a.-Estimulacin de hepatocitos con interleucina 1beta (IL-1) Efectos de la interleucina 1beta (IL-1) en la produccin de nitratos (NO2-) por hepatocitos en micromolas ( M). Los resultados representan experimentos por triplicado (5 esplenectomas y 3 controles) p (T de student).

Cuadro II b.- Estimulacin de hepatocitos con factor de necrosis tumoral alfa (TNF) Efectos del factor de necrosis tumoral alfa (TNF) en la produccin de nitratos (NO2-) por hepatocitos en micromolas ( M). Los resultados representan experimentos por triplicado (5 esplenectomas y 3 controles) p (T de student).

Se ha propuesto que el bazo contribuye con citocinas que potencialmente tienen la capacidad de afectar la funcin heptica; por lo tanto, fue evaluada la produccin de xidos de nitrgeno por los HC obtenidos a partir de animales expuestos a inyecciones con C. parvum posterior a la esplenectoma en respuesta a la adicin de IL-1b, TNFa, o INFg. Ninguna de estas citocinas, ya sea en conjunto (cuadro I) o por separado (cuadros IIa, IIb y IIc), fueron capaces de aumentar la produccin de NO2- por parte de los HC obtenidos de animales esplenectomizados en comparacin con la produccin de NO2- producido por HC en animales control (grfica 3). Las KC afectan directamente la produccin de xidos de nitrgeno por parte de los HC. Con el fin de determinar si las KC normales (activadas con C. parvum) podan aumentar la produccin de xidos de nitrgeno por parte de los HC de animales esplenectomizados, se estableci un cocultivo con KC:HC. La produccin de xidos de nitrgeno del cocultivo KC:HC se debi principalmente a las KC. La produccin por parte de los HC tanto de las ratas esplenectomizadas as como de las control no aument el estar en cocultivo
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con KC y se vi significantemente disminuida en los HC obtenidos a partir de las ratas esplenectomizadas (grfica 4). Adems los hepatocitos de ratas esplenectomizadas fueron incapaces de responder in vitro a la adicin de IL-6 para la produccin de fibringeno en comparacin con los controles(Cuadro3) Discusin La esplenectoma produce diversas anormalidades inmunolgicas, incluyendo una disminucin en los niveles circulantes de IgM, disfuncin de macrfagos pulmonares, respuesta anormal a la estimulacin con antigenos y patrones anormales de subpoblaciones de linfocitos circulantes.14,15,16 Clnicamente estas mltiples anormalidades se traducen en un riesgo aumentado para infecciones bacterianas y sepsis. Se ha demostrado que la disfuncin de las KC secundariamente afecta la modulacin de la sntesis proteica total de los HC en presencia de endotoxina. El presente estudio ha determinado que la produccin de N=O se ve disminuida posterior a la esplenectoma.17,18 Se sabe que los HC responden a diferentes citocinas. La IL6, producida por varios tipos celulares incluyendo macrfagos (KC), clulas endoteliales y fibroblastos, es responsable para la modulacin de la sntesis de protenas de fase aguda.19,20 Citocinas, como la IL-1, TNF e INF, estimulan la produccin de N=O a partir de la arginina en los HC. El N=O producido por los HC es conocido por su modulacin de la totalidad de la sntesis proteica, es esencial para la destruccin de parsitos intracelulares, previene el depsito de plaquetas y la coagulacin en los sinusoides hepticos y protege en contra de los radicales libres. El N=O tambin aumenta la produccin y liberacin de AMPc en los HC. Nos hemos enfocado principalmente en el estudio de la liberacin del N=O como una funcin final de la clula que puede ser potencialmente afectada por la falta de citocinas estimulantes, como es esperado despus de una
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Grfica 1: Ratas macho Sprague-Dawley fueron sujetas a una operacin simulada o a esplenectoma. Siete das despus se les inyect IV Corynebacterium parvum (C. Parvum) 25 mg/kg., misma dosis para ratas esplenectomizadas y control. Cinco a siete das despus fueron aislados los hepatocitos (HC), los cuales fueron: 1)Cultivados por separado (2 x 105 clulas/pozo); 2)Cultivados por separado en presencia de interleucina 1 beta (IL-1b), interfern gama (IFNg) o factor de necrosis tumoral alfa (TNFa), o bien 3)Cultivados junto con KC obtenidas de ratas normales inyectadas siete das antes con C. parvum. La produccin de nitratos (NO2-) fu determinada 24 horas despus en todos los cultivos.

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Cuadro II c.- Estimulacin de hepatocitos con interfern gama (IFN ) Efectos del factor de interfern gama (IFN) en la produccin de nitratos (NO2-) por hepatocitos en micromolas ( M) Los resultados representan experimentos por triplicado (5 esplenectomas y 3 controles) p (T de student).

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PRODUCCION DE NITRITOS POR HC ESPLENECTOMIZADOS Y CONTROL



PRODUCCION BASAL DE NITRITOS POR HC DE RATAS ESPLENECTOMIZADAS Y CONTROL EN PRESENCIA DE KC ACTIVADAS CON C. PARVUM

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Grfica 2: Los niveles plasmticos de nitrtitos (NO3-) de las ratas esplenectomizadas no fueron significativamente diferentes antes de la operacin o de la inyeccin de Corynebacterium parvum (C. parvum). Sin embargo, siete dias despus de la inyeccin con C. parvum, los niveles plasmticos en las ratas control se elevaron 5 a 7 veces por encima de lo normal y significativamente por arriba de los animales esplenectomizados.

Grfica 3: La produccin de nitritos (NO3-) por los hepatocitos (HC) de animales esplenectomizados fue significativamente menor que en las ratas control.

esplenectoma. Se han demostrado receptores para citocinas en la membrana de los HC normales. Es tambin conocido que el numero y funcin de los receptores de citocinas de los HC pueden verse afectados por otras citocinas, como ocurre en otro tipo de clulas. Bien puede ser que la falta de seales de citocinas secundarias a la falta del bazo, potencialmente pudiese disminuir los receptores de los HC, llevando esto a una falta de respuesta por parte de los HC a la estimulacin antignica. Otro mecanismo probable por medio del cual la esplenectoma puede alterar la produccin de N=O por parte de los HC pudiera ser por alteracin en la activacin y funcin de las KC. Debido a esto cultivamos juntos KC normales (activados in vivo con C. parvum) con HC de animales esplenectomizados y determinamos que las KC activadas no aumentaban la produccin de N=O por parte de los HC a los valores observados en los grupo control. Por lo tanto parece ser que la esplenectoma afecta directamente la respuesta normal de los HC. Se desconoce el significado clnico de la produccin deficiente de N=O heptico durante la infeccin bacteriana. Aunque parece, que la produccin de N=O es un componente esencial de la respuesta fisiolgica a la sepsis. Se sabe que un organismo incapaz de producir una respuesta de fase aguda, con los cambios en las prioridades metablicas que conocemos, tiene un riesgo mayor de muerte. Es tentador especular que una falta de respuesta por parte del hgado ante un estimulo sptico podra contribuir a un relativo desconocimiento del devastador proceso infeccioso con consecuencias potencialmente desastrosas. Para responder a esta pregunta, actualmente se estn desarrollando modelos in vivo. Conclusiones La produccin de N=O est disminuida posterior a esplenectoma., afectando directamente la respuesta normal de los HC. Un organismo incapaz de producir una respuesta de fase aguda, con los cambios en las prioridades metablicas que conocemos, tiene un riesgo mayor de muerte. Palabras clave: esplenectoma, citocinas esplnicas, xido ntrico 50

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Cuadro III.- Efectos de la interleucina 6 (IL-6) en la produccin de fibringeno por hepatocitos Produccin de fibringeno por hepatocitos activados in vivo con Corynebacterium parvum y estimulados in vitro con interleucina 6 (IL-6) en miligramos por decilitro ( mg/dl). Los resultados representan experimentos por triplicado (5 esplenectomas y 3 controles) p (T de student).

NIVEL PLASMATICO DE NITRATO EN RATAS CON C. PARVUM (25MG/KG) EFECTO DE LA ESPLENECTOMIA

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Grfica 4: Las clulas de Kupffer (KC) fueron incapaces de aumentar la produccin de nitratos (NO2-) por los hepatocitos (HC) de animales esplenectomizados HCE: (Hepatocitos de animales esplenectomizados), HCC: (Hepatocitos control), KC:HCE (Cocultivo de HCE con clulas de Kupffer), KC:HC: (Cocultivo de HCC con clulas de Kupffer) y KC: (clulas de Kupffer).

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El primer frmaco antiepilptico... En la primera mitad del siglo XIX, se crea que la excesiva actividad sexual, especialmente la masturbacin, contribuan de manera importante a la actividad epilptica. Conociendo que los bromuros causaban impotencia y cese de la menstruacin, Sir Charles Locock, quien trabajaba dentro del equipo de obstetricia de la Reina Victoria, propuso esta sustancia para el tratamiento de la epilepsia con buena eficacia, pero evidentemente con un sustento farmacolgico errneo, sin embargo, dada su toxicidad se abandono este tratamiento.

Saba Ud que? La incidencia de cncer de mama y embarazo oscila en Mxico entre el 0.08 y 0.1 %, es decir 1 en 3000 embarazos. Para definir esta entidad es necesario que el diagnstico de cncer mamario se realice durante el embarazo y hasta un ao despus del parto o bien en cualquier momento de la lactancia.

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