MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS METODOS GENERALES DE ANALISIS MICROBIOLOGICO DE LOS ALIMENTOS. II.

ANALISIS DE LOS MICROORGANISMOS TOTALES

Recuento de microorganismos viables totales. Mtodos fsicos para la deteccin de microorganismos. Mtodos qumicos para la deteccin de microorganismos. Mtodos inmunolgicos. Exmen de superficies. Recuentos de mohos y levaduras.

1. Recuento de microorganismos viables totales. (Muestras lquidas u homogeneizadas). - Se trata de conocer el nmero total de microorganismos presentes en el alimento. Este nmero no guarda relacin con el de microorganismos patgenos por lo que no puede usarse como ndice de su presencia y slo debe considerarse un indicador de las caractersticas higinicas generales del alimento. - Dependiendo de las caractersticas del medio utilizado (medio rico, medio limitado en nutrientes para medida de la flora no lctica de alimentos fermentados) y de las condiciones de incubacin (mesfilos, psicrfilos) los microorganismos analizados sern miembros de poblaciones diferentes. En general se investiga la presencia de microorganismos aerobios o aerotolerantes (anaerobios facultativos); aunque, en ciertas situaciones (alimentos envasados al vaco), puede ser de inters hacer recuentos de anaerobios totales. - Se han desarrollado tcnicas que hacen posible la automatizacin del proceso. - Hay cuatro tcnicas biolgicas bsicas tcnicas de recuento de viables:. 1.- Contaje en Placa Standard (Standard Plate Count). 2.- Determinacin del nmero ms probable. 3.- Mtodos basados en la reduccin de colorantes por viables. 4.- Contaje microscpico directo.

1.- Contaje de Placa: Consiste en el plaqueo de una muestra de volumen conocido del alimento que se analiza. El resultado es funcin de una serie de factores como son el mtodo de muestreo, el tipo de microorganismo, el tipo de alimento y las caractersticas del medio de cultivo. Los cultivos pueden hacerse tanto en masa como en superficie, aunque hay que considerar que los cultivos en masa son letales para la flora psicotrofa. Cada bacteria viable formar una colonia, el plaqueo puede hacerse en una placa normal o por medio de un plaqueador en espiral que va depositando concentraciones progresivamente ms diludas de la muestra. 2.- Filtros de membrana: utilizados cuando el nmero de bacterias es bajo. Son filtros con un poro de 0,45 mm que retienen las bacterias. Se filtra un volumen dado y se coloca el filtro sobre una placa del medio de cultivo apropiado. La muestra puede haber sido procesada para epifluorescencia previamente, lo que facilita el recuento (la epifluorescencia se puede provocar con naranja de acridina que tie especficamente los cidos nucleicos). 3.- Microcolonias en DEFT: DEFT son las iniciales en ingls de Direct Epifluorescence Filter Technique (tcnica deepifluorescencia directa en filtro). En esta tcnica las bacterias se filtran para retenerlas en una membrana apropiada que posteriormente se trata con un agente fluorescente (como la naranja de acridina) para teir las clulas bacterianas (se somete el filtrado a un tratamiento previo con detergentes para destruir las clulas somticas). La deteccin de los microorganismos ha de hacerse mediante microscopa de fluorescencia o por cualquier otro mtodo de medida de la epifluorescencia. En ciertos casos, las membranas se incuban para producir colonias que son ms fcilmente dtectables. 4. Contaje de microcolonias al microscopio: Se aade un pequeo volumen de agar-cultivo a un porta y se incuba para seguir la formacin de microcolonias al microscopio. 5.- Gotitas de agar: Se hacen diluciones de la muestra (solucin madre) y se depositan gotitas de 10 ml en una placa Petri (gotitas de cultivo + agar). Se examina el crecimiento de las colonias en las gotitas tras la incubacin.

6.- Films secos (Petrifilm): Son pelculas deshidratadas de medios de cultivos generales o selectivos en las que se deposita 1 ml de la muestra que rehidrata el medio. Tras la incubacin se hace el recuento. 7.- Mtodo del nmero ms probable: Basado en series de diluciones y clculo estadstico del nmero de bacterias presentes en las diluciones ms altas. Se puede hacer con 3 5 tubos. El mtodo es popular aunque poco excto. 8.- Mtodos basados en la reduccin de colorantes: Usando azul de metileno o resazurina. Colorantes reducidos por las bacterias; al reducirse cambian de color y esto es medible. Usado en medios lquidos (lcteos). 9.- Tubos rodantes: son tubos hermticamente cerrados en los que hacindolos girar se forma una fina capa de agua. Utiles para recuento de anaerobios. 10.- Contaje microscpico directo: Usando cmaras de cuenta, se coloca un volumen determinado y se recuentan las bacterias. ---------------- X ---------------- Adems de las tcnicas de recuento basadas en la formacin de colonias observable (tcnicas biolgicas) hay una serie de procedimientos de recuento basado en tcnicas qumicas, fsicas e inmunolgicas.

2. Mtodos fsicos para la detencin de microorganismos. A) Impedancia: Es la resistencia aparente presentada a la corriente alterna. En un cultivo los microorganismos alteran las substratos cambiando su conductividad elctrica y esto vara la impedancia. El mtodo se basa en detectar estos cambios y la cantidad de microorganismos se expresa como funcin del tiempo que tarda el cultivo en alcanzar unos valores de impedancia correspondientes a 106 107 clulas por ml-1. (IDT: Imdepedance Detection Time). Es necesario que el medio de cultivo permite un crecimiento homogneo sin escalones.

B) Microcalorimetria: Estudio de los pequeos cambios de calor producidos como consecuencia del antabolismo de nutrientes. Los diferentes tipos de microorganismos metabolizan los substratos de forma diferente y, por ello, se ha usado la microcalorimetra para poder identificar las especies presentes en un alimento: usando un medio de cultivo con una composicin definida de azcares pueden llegar a identificarse diferentes tipos de bacterias lcticas mediante los termogramas de su metabolizacin de los azcares presentes en el medio. C) Citometria de flujo: Mtodo basado en hacer pasar una a una las clulas de una suspensin por un sistema de deteccin; este sistema puede contener un detector capaz de medir diferentes parmetros (diferentes tipos de fluorescencia, absobancia, dispersin de luz, etc.) lo que permite identificar las bacterias durante su paso por el detector.

3. Mtodos qumicos de deteccin de microorganismos. A) Nucleasa Termoestable: S. aureus produce una nucleasa termoestable con mayor rapidez y en mayor cantidad que la enterotoxina responsable de la intoxicacin. La endonucleasa puede detectarse experimentalmente como un ndice de la presencia de S. aureus incluso en concentraciones demasiado bajas para que hayan producido unas cantidades detectables de enterotoxina. B) Lisado de Limulus: Usado para deteccin de endotoxinas (derivadas del lipopolisacrido LPS de las bacterias Gram negativas). Se basa en la aglutinacin de extractos de amebocito de sangre de Limulus (cangrejo de mar) producido por cantidades del orden de picogramos de LPS. Puede detectar 300 clulas de E. coli. El mtodo detecta clulas viables y no-viables. Es muy rpido. C) Sondas de cidos nucleicos: Sirven para identificar microorganismo desconocidos por medio de Southern. D) PCR: Mtodo para detectar nmero extremadamente bajos de microorganismos con una cierta rapidez basado de la produccin de copias de genes especficos de un microorganismo en cuestin.

E) Medida de ATP-: Se detecta la presencia de ATP usando luciferasa, aunque hay algunos problemas experimentales que hacen que la tcnica sea controvertida. F) Radiometria: Medida de la transformacin de un substrato con 14C en 14CO2: el tiempo necesario para detectar el 14CO2 es inversamente proporcional a la cantidad de microorganismos presente. G) Substratos Fluoro y Cromognicos: Se aaden como aditivos a los medios de cultivos para facilitar y acelerar la deteccin de los microorganismos.

4. Mtodos inmunolgicos. Normalmente se usan antisueros que detectan flagelos (responsables de las formas mviles de Salmonella y otras bacterias) A) Anticuerpo fluorescentes: Se utiliza anticuerpo marcado con una molcula fluorescente o un segundo anticuerpo que reconozca el primero. Se pueden usar antisueros complejos en el primer anticuerpo y de esta forma detectar cualquier tipo de Salmonella sin necesidad de aislarlas. El mtodo tambin se ha usado para Clostridios aunque su mayor aplicacin ha sido enSalmonella donde es muy conveniente por la sensibilidad y rapidez. B) Serologia de enriquecimiento: En este procedimiento especialmente desarrollado para la deteccin de Salmonella, el antisuero no se aade al alimento sino que se efecta un paso previo de enriquecimiento del cultivo y de seleccin para evitar falsos positivos. C) Test 1 - 2 de Salmonella: Sistema con dos cmaras de agar blando. Una de las cmaras (la de siembra) contiene un medio selectivo para Salmonella, las bacterias mviles de este gnero atraviesan la cmara selectiva y pasan a la no selectiva pero portadora de un anticuerpo especfico por lo que se forma una banda de aglutinacin cuando entre Salmonella. D) Radioinmunoensayo: se basa en el marcaje con un radioistopo de un antgeno determinado (toxina producida por una bactera patgena) y su

posterior deteccin por anticuerpos especficos fijados sobre un soporte slido. E) ELISA: El mtodo es similar al radioinmunoensayo: el antgeno se fija en un soporte slido, se trata con el antisuero correspondiente y la interaccin se detecta mediante una actividad marcadora (peroxidesa) unida al anticuerpo en cuestin o a un segundo anticuerpo de revelado. El mtodo se ha usado para deteccin de Salmonellas. Toxinas de S aureus, micotoxinas, toxinas de C. botulinum, enterotoxinas de E. coli. F) Difusin en gel: Mtodo de Ouchterlony para deteccin de antgenos.

5. Examen de superficies. - Mtodos dirigidos a detectar y medir los nmeros de microorganismos presentes en superficies contaminadas. - Algunas veces es necesario aadir agentes neutralizantes para eliminar el efecto de detergentes que han sido utilizados para limpiar la superficie. - El mtodo ms clsico de obtencin de muestra es el uso de torundas de algodn o de alginato clcico. Las muestras se recogen en seco o en hmedo y se depositan sobre medios de cultivo lquido (generales o de enriquecimiento). - En algunos casos se usan otros metodos como el contacto con placa o la jeringa de agar. 6. Recuento de mohos y levaduras. Se realiza o bien directamente en el alimento humedecido e incubado a 22C o bien mediante diluciones sucesivas y siembra en placa en superficie. Es necesario aadir agentes antibacterianos al medio de cultivo para evitar el crecimiento de las bacterias, que es ms rpido que el de los mohos.