PROCESOS BIOTECNOLOGICOS UNIVERSIDAD TECNOLOGICA DE SAN JUAN DEL RIO

UNIVERSIDAD TECNOLOGICA DE SAN JUAN DEL RIO. QRO. LABORATORIO DE PROCESOS BIOTECOLOGICOS

QUIMICA INDUSTRIAL

9. CUATRIMESTRE

_____ PARCIAL

NOMBRE:

GRUPO:

NOMBRE DE LA PRACTICA Q.en A. LUZ CARMEN CASTILLO MARTINEZ.

FECHA: ________________

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PRCTICA # 1 PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO PARA MICROBIOLOGIA OBJETIVO: El alumno aprender la preparacin de los diferentes medios de cultivo INTRODUCCION MATERIAL Cajas petri estriles Potencimetro Tubos de ensaye con tapn Buffer pH 4, 7, 10 2,Mecheros 2 matraz erlenmeyer (250ml) 1probeta de 100ml Balanza granataria Parrilla Esptula Autoclave Cinta testigo 2 Cajas petri 2 Tubos de ensayo medianos 1 Pipeta graduada de 10ml. 1 Pipeta graduada de 1ml. 1 Probeta de 100ml. Solucin salina al 0.9% 1 Frasco de dilucin 1 Balanza Granatara REACTIVOS Agua destilada Sal y manitol Agar MIO, TSI Caldo lactosado Agar Nutritivo Agar Salmonella o TCBS} Caldo de infusin cerebro corazn Algodn, papel manila, agua destilada Solucin de hipoclorito de sodio al 2 ppm

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PROCEDIMIENTO
Leer cuidadosamente la etiqueta en la preparacin del medio de cultivo. 2) Hacer una relacin de gr. de acuerdo a los ml de medio 3) Colocar en el matraz EM y se la mitad de agua destilada, de acuerdo a los ml que sean cada tipo de medio. 4) Pesar el medio de cultivo, vaciar en el matraz, agitar vigorosamente y despus agregar la otra parte del agua destilada, seguir mezclando. 5) Colocar el medio (si as lo indica la etiqueta) a la parrilla a calentar a ebullicin; se quita de la parrilla cuando comienza a hervir y se deja enfriar un poco, para medir pH. 6) Tapar etiquetar, pegar con cinta testigo. 7) Introducir en el autoclave el material por 15Lb/ 15 min. Sacar de la autoclave y se hace el vaciado respectivo si es necesario. 8) Se dejan enfriar y se colocan invertidas en bolsas de plstico, etiquetar correctamente y se guardar en refrigeracin. 9) Anotar en la bitcora de medios de cultivo.
1)

RESULTADOS Realizar un diagrama de flujo de la preparacin de los medios de cultivos de cada una de las tcnicas usadas. Menciona cuales serian los puntos crticos en la preparacin. Describir cada uno de los componentes de los medios de cultivo. CUESTIONARIO 1.- Qu norma mexicana nos indica el procedimiento para la realizacin de medios de cultivo? 2.- Qu pasa si el medio de cultivo se excede en el calentamiento? 3.- Cuntos tipos de medio de cultivo existen menciona un ejemplo de cada uno de ellos? 4.- Cul es la diferencia entre un medio lquido y un slido? 5.- Defina que es un medio de cultivo 6.- Qu sucede si el medio est muy fro y se desea vaciar? 7.- Diferencie entre los trminos: Desarrollo y Crecimiento

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8.- Usos y cuidados del potencimetro. 9.- Investiga la tcnica Gram

OBSERVACIONES CONCLUSIONES MSD BIBLIOGRAFIA

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PRCTICA # 2 REVISIN DE TECNICAS MS USADAS EN MICROBIOLOGA OBJETIVO: Que el alumno recuerde o aprenda las tcnicas que ms frecuentemente sern utilizadas en el presente curso. INTRODUCCION MATERIAL 1 Matraz Erlenmeyer de 300ml. 2 Cajas petri 2 Tubos de ensayo medianos 1 Pipeta graduada de 10ml. 1 Pipeta graduada de 1ml. 1 Porta-asa con asa 1 Agitador de vidrio REACTIVOS Agar nutritivo Reactivos de Gram Aceite de inmersin Algodn, papel manila, agua destilada Solucin de hipoclorito de sodio al 2 ppm Solucin salina al 0.9% (3 a 5 tubos con 9 mL y un frasco con 90 mL) Muestra o alimento lquido Inoculo fresco (18 a 24 horas) 1 Microscopio 1 Porta objetos 1 Probeta de 100ml. 1 Frasco de dilucin 1 Licuadora 1 Balanza Granatara

PROCEDIMIENTO 1. Realizar diluciones de muestras alimenticias en frascos y tubo con solucin salina estril al 0.9%.

Figura a 5

BIOTECNOLOGIA UNIVERSIDAD TECNOLOGICA DE SAN JUAN DEL RIO 2. Preparacin de 100 ml. de agar nutritivo. 3. Esterilizacin. 4. Vaciado de medio e inoculacin en una caja petri por la tcnica de estra cruzada (estra mltiple)) y otra por la tcnica de placa vaciada (Tcnica de Barry).

Figura b 5. Inoculacin del tubo de ensayo con agar inclinado (pico de flauta).

Figura c 6. Tincin de Gram y observacin al microscopio. 7. Observacin de las placas y tubos inoculados despus de incubacin a 36C 24 Horas.

RESULTADOS Realizar una tabla donde expliques cada una de las colonias su morfologa, borde y caractersticas de elevacin, el nmero Realiza una tincin de Gram.

CUESTIONARIO 1) Por qu es posible aislar microorganismos por las tcnicas de dilucin y siempre en placas? Si usted tiene una poblacin homognea de 105 microorganismos/ml en la muestra original Cuntas colonias espera encontrar en una placa sembrada con 1 ml de la dilucin 10-3, despus de haber incubado el tiempo y las condiciones adecuadas?

BIOTECNOLOGIA UNIVERSIDAD TECNOLOGICA DE SAN JUAN DEL RIO 2) Por qu la esterilizacin es eficiente en una autoclave que en un horno, a la misma temperatura? 3) Cules son las diferencias morfolgicas y bioqumicas de los microorganismos Gram positivos y Gram negativos? 4) Indique Qu caractersticas deben observarse al estudiar la morfologa colonial de las bacterias y de los rganos? 5) De los medios MIO y LIA explique la ruta metablica de cada uno de ellos.

OBSERVACIONES CONCLUSIONES MSD BIBLIOGRAFIA

BIOTECNOLOGIA UNIVERSIDAD TECNOLOGICA DE SAN JUAN DEL RIO PRCTICA # 3 DETERMINACIN DE LOS REQUERIMIENTOS MNIMOS PARA EL CRECIMIENTO MICROBIOANO. OBJETIVO: Que el alumno recuerde la importancia de los nutrientes y sus combinaciones de las sustancias qumicas de manera que los microorganismos cuenten con los elementos necesarios para su desarrollo. INTRODUCCION MATERIAL 1 Matraz Erlenmeyer de 300ml. 4 Cajas petri 2 Tubos de ensayo medianos 1 Pipeta graduada de 10ml. 1 Pipeta graduada de 1ml. 1 Porta-asa con asa 1 Agitador de vidrio REACTIVOS Agar- agar glucosa Peptona Fosfato de amonio KCl Sulfato de magnesio Aceite de inmersin Algodn, papel manila, agua destilada Solucin de hipoclorito de sodio al 2 ppm Solucin salina al 0.9% Inoculo de 3 microorganismos cultivos jvenes. 1 Microscopio 1 Porta objetos 1 Probeta de 100ml. 1 Frasco de dilucin 1 Licuadora 1 Balanza Granatara

PROCEDIMIENTO 1) Experimento 1: Preparar un medio donde solo contenga agar-agar 10 g/L. Esterilizar. Enfriar a 45 C. Vierta a cada una de las cajas petri estril separada, enfriar y etiquetar. Con un marcador trace divisiones Figura 1 (4 por caja) enumere cada sector.

BIOTECNOLOGIA UNIVERSIDAD TECNOLOGICA DE SAN JUAN DEL RIO Inocule con tcnica cruzada (estra mltiple Figura b con asa de platino) cada sector con un microorganismo, deje el cuarto sector de cada caja sin inocular. Invierta las cajas incbelas a 35C por 48 horas y observe el crecimiento en cada caja. Escoja una colonia y realice una tincin de gram.

Figura 1 2) Experimento 2. Al agar-agar 10 g/L agregue las siguientes cantidades de sales: Fosfato de amonio 5 g/L, cloruro de potasio 2.9 g/L, Sulfato de magnesio 3.8 g/L. Disuelva en caliente y esterilice. Vierta el contenido en cajas petri. Realice las divisiones segn figura 1. Inocule por el mtodo de estra cruzada (estra mltiple Figura b con asa de platino). Incube a 35C /24 horas. Escoja una colonia y realice una tincin de Gram 3) Experimento 3. Realizar un medio como en el experimento 2, agregue ahora como fuente de Carbohidratos glucosa 5 g/L. Disuelva en caliente y esterilice. Vierta el contenido en cajas petri. Realice las divisiones segn figura 1. Inocule por el mtodo de estra cruzada (estra mltiple Figura b con asa de platino). Incube a 35C /24 horas. Escoja una colonia y realice una tincin de Gram

4) Experimento 4 Realizar un medio como en el experimento 3, pero ahora agregue fuente de nitrgeno, usando peptona bacteriolgica 5 g/L. Disuelva en caliente y esterilice. Vierta el contenido en cajas petri. 9

BIOTECNOLOGIA UNIVERSIDAD TECNOLOGICA DE SAN JUAN DEL RIO Realice las divisiones segn figura 1. Inocule por el mtodo de estra cruzada (estra mltiple Figura b con asa de platino). Incube a 35 C /24 horas. Escoja una colonia y realice una tincin de Gram.

RESULTADOS A la luz de sus observaciones, con respecto a la composicin de cada medio de cultivo, explique. Qu interpretaciones puede hacer respecto a la habilidad de los distintos organismos para proliferar en los distintos medios de cultivo? Describa las colonias. Si es necesario realice una tincin de Gram

CUESTIONARIO

1.- Mencione los componentes que debe tener un medio de cultivo sinttico para cumplir con los requerimientos de un medio de cultivo simple, un diferencial. 2.- Cul es la diferencia entre organismos auttrofos y hetertrofos? 3.- Cundo se emplea un medio selectivo y por qu? Menciona 3. 4.- Qu indica el colorante en la formulacin del medio sinttico y cul es su importancia en el desarrollo de los microorganismos? 5.- A qu se le llama cultivo puro?

OBSERVACIONES CONCLUSIONES MSD BIBLIOGRAFIA

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BIOTECNOLOGIA UNIVERSIDAD TECNOLOGICA DE SAN JUAN DEL RIO PRACTICA # 4 IMPACTO DE LOS AGENTES FISICO Y AMBIENTES SOBRE EL DESARROLLO DE LOS MICROORGANISMOS OBJETIVO: Proponga uno INTRODUCCION MATERIALES 1 Vidrio de reloj grande 1 Mechero 1 Porta-asa con asa 1 Gradilla Pipeta Graduada de 10, 5 , 2 ml estriles Bao mara a 61 C y 100 C Autoclave 10 Tubos de ensayo medianos con tapa y estriles Tiras de pH Pipetas pasteur estriles

REACTIVOS 2 cajas petri con agar nutritivo. Cultivo de 10 ml por equipo joven de 18 a 24 horas de E coli y Saccharomyces cereviceae. 14 Tubos por equipo de caldo lactosado o caldo nutritivo. HCl 1N estril NaOH estril

ESPERIMENTO 1. a.- Colocar 1 ml del cultivo de E coli en un tubo estril. b.- Hacer lo mismo con los siguientes 4 tubos (total 5) c.- Marqu los tubos perfectamente y calintelos de la siguiente forma: Tubo 1: 61 C por 10 min. Tubo 2: 61C por 20 min. Tubo 3: 100 C por 10 min. Tubo 4: 121 C por 15 min. Tubo 5: No calentar (control) 11

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d.- Dividir la caja de Petri con agar nutritivo en 6 partes y sembrar cada uno de los tubos con una azada. Dejar un blanco de medio de cultivo como testigo. e.- Incubar a 35 C / 24 horas. f.- Haga lo mismo, pero ahora con la cepa de Sccharomyces cereviceae. g.- Llene la siguiente tabla de resultados para el efecto del calor en las bacterias:
BACTERIA CONTROL MC CONTROL M.O. 61C/10 min 61 C/20 min 100C/10 min 121 min C/15

h.- Anote sus observaciones y conclusiones. i.- Haga los esquemas representativos.

EXPERIMENTO 2. EL EFECTO DEL pH SOBRE LOS MICOORGANISMOS. a.- Ajustar cada tubo de caldo a un pH Tubo 1: pH 3.0 Tubo 2: pH 5.0 Tubo 3: pH 7.0 Tubo 4: pH 9.0 Tubo 5: pH 11.0 b.- Sembrar cada uno de los tubos con dos o tres asadas del inoculo de E coli. c.- Incubar a 35 C /24 horas. d.- Repita el procedimiento ahora con Saccaromyces cereviceae. e.- Anote los resultados empleando la siguiente escala: ++++ 4+ para el crecimiento mximo. +++ 3 + , ++ 2+ para el crecimiento medio + 1+ para el crecimiento mnimo. _ Para el nulo

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Microorganismo pH 3.0

pH 5.0

pH 7.0

pH 8.0

pH 9.0

pH 11.0

f.- Escriba sus observaciones g.- Haga esquemas.

CUESTIONARIO 1.- Cules son los intervalos de temperatura as como la ptima de los siguientes grupos de microorganismos? a.- Psicotrficos b.- Mesofilos c.- Termfilos 2.- Cules son las temperaturas empleadas en la Pasteurizacin y la ultra pasteurizacin? 3.-Qu diferencia existe entre la Esterilizacin por calor seco y hmedo? Mencione las temperaturas a las que se aplica cada una de ellas. 4.- Cul es el efecto del agua en la Esterilizacin? 5.- Qu efectos tiene la Congelacin en las Bacterias? OBSERVACIONES CONCLUSIONES MSD BIBLIOGRAFIA

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PRACTICA # 5 CURVA DE CRECIMIENTO BACTERIANO OBJETIVO: Propn un objetivo de manera personal. INTRODUCCION MATERIALES Y REACTIVOS Cultivo de 24 horas de Escherichia coli 1 Mechero 1 Porta-asa con asa 1 Gradilla Pipeta Graduada de 10, 5 , 2 ml estriles Matraz de Erlenmeyer con 100 ml de Caldo Soya tripticasa (CST) Tubos con Agar nutritivo AN) o Agar Soya tripticaseina (AST). 10 tubos con solucin salina estril al 0.85 %. 24 Tubos de ensayo medianos con tapa y estriles Espectrofotmetro

METODOLOGIA. a.- De un cultivo de 24 horas de AN AST, resembrar en CST la bacteria durante 12 horas a 37C. b.- Tomar 1 mL del cultivo y adicionarlo a 100 mL de CST se incuba a 35 C. c.- Toma de lecturas: 1.- ESPECTROFOTOMETRO: 1.1. Tomar 5 mL del punto b. cada hora y leer en el espectrofotmetro. A 600 nm ajustar a cero con el cultivo sin inocular. 1.2. Realizar 10 lecturas 1.3. Graficar en papel milimtrico: D.O. contra tiempo. 2.- LECTURA EN VACIADO EN PLACA (Tcnica de Barrry). 2.1. Cada vez que se toman las lecturas hacer diluciones hasta 1:10,000,000 y se toma 1 ml de las dos ltimas, se colocan en ST AN (esterilizado y fundido a 45C), se homogeniza y se vacia en cajas Petri estriles. 2.2. Incubar a 35 C/24 horas. 14

BIOTECNOLOGIA UNIVERSIDAD TECNOLOGICA DE SAN JUAN DEL RIO 2.3. Contar el nmero de colonias. (Descartar las cajas cuyo nmero de colonias sea mayor de 300 o menor de 30).

d.- Reportar: 1.- Haga esquemas. 2.- Realice las grficas en papal milimtrico de los dos mtodos. 3.- Realice sus observaciones 4.- Conclusiones de manera particular.

TIPO DE GRAFICAS A REALIZAR A) CUENTA VIABLE B) POR TUBIDEZ (Biomasa)

Log del No. De bacterias Viables Tiempo

Observancia

Tiempo

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PRACTICA # 6 MICROBIOLOGA DE LA FERMENTACIN ALCOHOLICA OBJETIVO Estudiar los factores ambientales que principalmente afectan a una fermentacin alcohlica. INTRODUCCION

MATERIALES 1 Matraz Erlenmeyer de 250ml 1 Matraz Erlenmeyer de 1000ml 1 Microscopio 1 Cmara de Neubauer 1 Gradilla 1 Pipeta graduada de 10ml 5 Pipetas graduadas de 1ml 3 Tubos de ensayo medianos 1 Probeta de 250ml 1 Probeta a 1000ml 1 Potencimetro 3 Vasos de precipitados de 50ml 1 Mechero 1 Anillo 1 Tela de asbestos 1 Bixmetro 40 Bx 1 Picnmetro de 50ml 1 vaso de precipitados de 500ml 1 Matraz volumtrico de 100ml 1 Equipo de destilacin: 1 Matraz redondo de 300ml con junta esmerilada 1 Codo de destilacin con juntas esmeriladas 1 Refrigerante con junta esmerilada 2 Soportes 2 Pinzas de tres dedos 2 Mangueras para refrigerante 1 Termmetro 1 Pizeta con agua destilada Perlas de ebullicin

REACTIVOS Matraz Erlenmeyer de 250ml con 100ml de un cultivo de Saccharomyces Cereviceae en jugo de caa enriquecido o remolacha (betabel). KH2PO4 H3PO4 (NH4)2SO4 100 ml de solucin diluida en NH4OH (1:10) 100 ml de solucin diluida de H2SO4 (1:10) 1 Solucin amortiguadora de pH= 7.0 16

BIOTECNOLOGIA UNIVERSIDAD TECNOLOGICA DE SAN JUAN DEL RIO 1 Solucin amortiguadora de pH= 4.0 100ml de Sol. Diluida de NaOH (1:10)

PROCEDIMIENTO Se colocan 100 ml de jugo de caa o de betabel en un matraz erlenmeyer de 250 ml. Se le adiciona 3.8 gr/lt. de (NH4)2SO4 y 5 gr/lt de KH2PO4 se ajusta el pH a 3.5 con una solucin diluida de H2SO4 1:10. Se esteriliza y se inocula aspticamente con una azada de Saccharomyces Cereviceae. Se incuba durante 48 hrs. con agitacin constante. Este cultivo se usara como inoculo en las siguientes fermentaciones (cultivo madre): A. Condiciones anaerobias normales. Se mide el contenido inicial de slidos solubles (como sacarosa) del jugo de caa con un brixmetro de escala adecuada. A 475 ml de este jugo se le adicionan 3.8 gr/lt de (NH4)2SO4 y 5 gr/lt de KH2PO4 y 100mg/lt de meta bisulfito de potasio. Posteriormente se ajusta el pH a 3.5 con una solucin diluida 1:10 de H2SO4. Se coloca esto mosto en un matraz de 1l. Se inocula con 25ml de S. cereviceae (solucin madre) 5% v/v de mosto total. Se efecta una cuenta directa de levaduras en la cmara de Neubauer al microscopio. La cuenta total de levaduras se reportara como # levadura/ml de mosto. Se incuba a 30C. B. Efecto del pH. (lo efectuara otro equipo). A 475ml de jugo de caa de Bx conocido se le adicionan 3.8gr/lt de (NH4)2SO4 y 2ml de H3PO4 concentrado. Sea ajusta el pH inicial a 3.5 con una sol. diluida de NH4OH 1:10 o de H2SO4 1:10, segn sea necesario. Se coloca el mosto preparado en un matraz de 1l. Se inocula con 25ml de cultivo de S. cereviceae (solucin madre) 5% v/v del mosto total y se efecta la cuenta total de levaduras en cmara de Neubauer. Cada 12hrs. se medir el pH sin ajustarlo, se medir el Bx y se efectuara la cuenta total de levaduras como se indic en el inciso A. La fermentacin se considerar terminada cuando el Bx o la cuenta total de levadura den un valor constante. C. Efecto de aeracin. (La efectuara otro equipo). Se prepararan 475ml de mosto de caa de la misma manera que se indico en el inciso A. Se coloca este mosto en un matraz de 1l. Se inocula con 25ml del cultivo de S. cereviceae (solucin madre). Se efecta una cuenta directa de levaduras como se indica en el inciso A. A este matraz se le adapta un sistema de aeracin continua, con un consistente en una 17

BIOTECNOLOGIA UNIVERSIDAD TECNOLOGICA DE SAN JUAN DEL RIO bomba para pecera, un filtro de algodn, tubera de ltex y una bombilla para la dispersin de aire. Este cultivo se incuba a 37 C. Los controles y mediciones se efectuarn conforme a las mediciones del inciso A, salvo que a partir del segundo da, las mediciones se realizaran 3 veces al da. La fermentacin se considera terminada cuando el Bx o la cuenta total de levaduras den un valor constante. D. Efecto de la deficiencia de nitrgeno. (Lo efectuara otro equipo). A 475ml de jugo de caa de Bx desconocido se le adicionan 5gr/l de KH2PO4 y 100mg/l de metabisulfito de potasio. Posteriormente se a justa el pH a 3.5 con H2SO4 1:10. Se vierte en un matraz EM de 1l. Se inocula con 25ml de cultivo de S. cerevieae. Se efecta la cuenta total de levaduras y se incuba a 30 C. Cada 12hrs. se efectan las determinaciones indicadas en el inciso A ( Bx, # lev./ml, medicin y ajuste de pH, solo que este ltimo se efectuara con una sol. Diluida de NaOH (1:10). La fermentacin se considera terminada cuando el Bx o la cuenta total de levaduras sean constantes. Al trmino de cada fermentacin los matraces se guardan en el refrigerador hasta tener tiempo de realizar una destilacin para la determinacin del contenido de etanol. Con este fon se decanta el mosto sobre un vaso de precipitados. De este lquido decantado se colecta exactamente 100 ml en un matraz volumtrico. Este mosto se vierte en un matraz de destilacin que ya contiene algunas perlas de ebullicin, se le adicionan 50 ml de agua y se destila con llama suave colectando el destilado en un matraz volumtrico de 100ml hasta llegar a 2/3 de su volumen (60 ml). Despus se afora a 100 ml a una temperatura de 20 C y se mide la gravedad especfica con ayuda de un picnmetro. Con este dato se busca en tablas el contenido de alcohol. RESULTADO Se escriben en una tabla todos los datos obtenidos para las cuatro experiencias: Experiencia A Tiempo horas 0 12 18 24 ETC Bx # lev/ ml Experiencia B-D pH GL A,B,C,D

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BIOTECNOLOGIA UNIVERSIDAD TECNOLOGICA DE SAN JUAN DEL RIO En una sola grfica se dibujan las curvas de log # levad./ml (ordenadas contra tiempo en horas (abscisas de las cuatro experiencias (A.B.C.D.). En otra grfica se dibujan las curvas en Bx (ordenadas) contra tiempo en horas (abscisas) de las cuatro experiencias. CUESTIONARIO 1) Explique en qu consiste el efecto Pasteur. 2) Escriba con formulas qumicas las ecuacin estequiometria de Gay-Lussac. Considerando que en base a esta ecuacin se puede establecer el rendimiento ideal para la fermentacin alcohlica, calcule cul fue la eficiencia de la fermentacin obtenida experimentalmente por usted (un solo equipo), considere la relacin siguiente: Alcohol esperado ----------------- 100% de eficiencia

Alcohol obtenido ---------------------x % de eficiencia, x = 7 Considere que tambin debe efectuar un ajuste, ya que la ecuacin Gay-Lussac en un balance con respecto a glucosa y usted tiene sacarosa como fuente de carbono. Escriba paso por paso, todos los clculos. 3) Cules son los nombres de las levaduras que se utilizan para las fermentaciones alcohlicas industriales? Indique en una tabla el nombre del producto y su respectiva levadura. 4) Si durante una fermentacin alcohlica industrial usted observa que el contenido de acidez voltil (cido actico) se incrementa en forma alarmante. Cules cree usted que sean las posibles causas? Cmo cree usted que pueda evitar que ese mosto fermentado se tenga que retirar? 5) Qu controles microbiolgicos, qumicos y fisicoqumicos deben efectuarse en una fermentacin alcohlica. OBSERVACIONES CONCLUSIONES MSD BIBLIOGRAFIA

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BIOTECNOLOGIA UNIVERSIDAD TECNOLOGICA DE SAN JUAN DEL RIO NOTAS TECNICA PARA LECTURA DE LEVADURAS: Existen varios mtodos para conteo de la viabilidad celular, uno es el coteo en placa y al microscopio con azul de metileno. Para contar clulas vivas solo se contaran las que aparecen incoloras, las muestras se coloran de color azul. TECNICA: 1.- Pipetaer 10 ml de la muestra y colocarlos en un matraz volumtrico de 100 ml. 2.- Agregar 5 ml de azul de metileno al 1 % aforar con agua. 3.- Mezclar perfectamente 4.- Dejar reposar de 5 a 10 min. 5.- Mezclar perfectamente y tomar 10 l de la mezcla en la cmara de Newvawer. 6.- Colocar la cmara en el microscopio enfocar a 40 X 7.- Realizar el conteo de clulas en 5 cuadros grandes de la cmara. CALCULOS Y RESULTADOS Para obtener la concentracin celular:

A = Nmero de cuadros contados (5) CC = concentracin celular / ml N = Nmero de clulas totales D= dilucin usada (10)

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PRACTICA # 7 MICROBIOLOGA DE LA FERMENTACIN LACTICA OBJETIVO Plantearlo Durante la cintica de crecimiento se tomaran muestras a diferentes tiempos para determinacin de biomasa, sustrato residual y producto (ac. Lctico). Con los datos generados se prende estimar la velocidad mxima de crecimiento ( max) rendimiento con respecto al sustrato ( p/s) y los parmetros que explica la fermentacin de cido lctico. INTRODUCCION MATERIAL Y REACTIVOS Termmetro Autoclave Agitador magntico Algodn Papel de estraza Cinta testigo Potencimetro Buffer pH 4, 7 y 10 10 Matraces EM 250 mL Bureta Pinzas para bureta Soporte universal Yakutl (especifiqu otra posibilidad) NaOH H2SO4 Medio MRS - Compuesto g/L - Peptona 10 - Extracto de carne 8.0 - Glucosa (indicado) - Extracto de levadura 5.0 - Fosfato dipotsico 2.0 - (NH4)2HPO4 0.2 - Acetato de sodio 5.0 - Citrato de amonio 5.0 - Sulfato de magnesio 0.05 - Sulfato de magnesio 0.2 - Agua destilada

PROCEDIMIENTO: 1.- Obtencin inoculo. Se emplear un frasco de Yakutl (o otra posibilidad) en un litro de medio definido arriba el MRS. 2.- Preparacin del reactor: 21

BIOTECNOLOGIA UNIVERSIDAD TECNOLOGICA DE SAN JUAN DEL RIO - El reactor se esterilizaran colocando tapones de algodn en las entradas y una entrada del termmetro. El reactor convencional ser agitado mediante un agitador magntico. Se deber implementar una toma de muestra y esterilizar (10 tubos de ensaye de 15 mL con tapn de rosca) para la muestra. 3.- Preparacin del Medio: Preparar un litro de medio MRS cuya composicin se menciona arriba ajustar a pH 6.4 y esterilizar a 112 C y 15 Lb de presin /15 min. Nota: la concentracin de glucosa que se usar por cada equipo ser especificada por el profesor. 4.- Inoculacin del reactor: En condiciones aspticas vaciar el medio de cultivo al reactor e inocular ambos con el contenido del Yakult (especificar otra fuente). Conectar la lnea de aire e inocular a temperatura ambiente, tomar 10 mL de muestra cada 12 horas durante 72 horas. Las muestras debern conservarse en congelacin hasta su anlisis. RESULTADOS A cada tiempo se analizaran: 1.- La biomasa por peso seco. 2.- Glucosa 3.- pH. 4.- cido lctico por titulacin con NaOH. a) El estudiante deber proponer la metodologa a seguir, para las determinaciones antes citadas. Sus propuestas debern basarse en una revisin seria bibliogrfica y una vez que los maestros autoricen la propuesta podr ponerse en prctica. b) Anlisis de resultados: 1.- Cuantifiqu las tcnicas revisando la concentracin de cido lctico produciendo en cada tiempo.

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BIOTECNOLOGIA UNIVERSIDAD TECNOLOGICA DE SAN JUAN DEL RIO 2.- Mediante la tcnica de peso seco, estime la biomasa producida en cada tiempo, expresndola en mg/mL. 3.- Mediante la curva de glucosa estime la glucosa residual en mg/mL. 4.- Con los datos anteriores construya grficas de concentracin contra tiempo y estime, los parmetros cinticos de acuerdo a la metodologa sugerida con apoyo del maestro. 5.- Compar el valor de los parmetros obtenidos en la literatura y explica los resultados. Prepare una conclusin con base en los resultados y el objetivo planteado.

DISCUSION DE RESULTADOS CONCLUSIONES. BIBLIOGRAFIA MSD

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BIOTECNOLOGIA UNIVERSIDAD TECNOLOGICA DE SAN JUAN DEL RIO PRACTICA # 8 REALIZACION DEL PROYECTO.

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