1 METABOLISMO OXIDATIVO Utilizacin de la energa almacenada en los nutrientes para la generacin de ATP

Entonces, para qu comemos? La ingesta de alimentos constituye una necesidad fisiolgica primordial porque cuando comemos ingerimos una fuente de energa. Qu significa esto? Los alimentos son combustibles, y al quemarlos (u oxidarlos, qumicamente hablando) obtenemos energa, que conservada en forma de ATP, se utiliza para suplir las necesidades energticas del organismo. En todas las clulas ocurren sistemas complejos de reacciones qumicas fuertemente reguladas que producen y utilizan energa. Todos los procesos que ocurren en nuestras clulas son procesos de transformacin de energa. Los combustibles metablicos (glcidos, lpidos y protenas) son molculas que contienen una gran cantidad de enlaces C-C y C-H, que al romperse permiten obtener energa. Algunos ejemplos de utilizacin de energa son: el gradiente electroqumico de energa potencial que permite crear un medio intracelular de composicin diferente a la del medio externo, o el movimiento organizado de grupos de clulas. Los procesos de transformacin involucrados en la utilizacin de la energa del enlace qumico de los combustibles pueden dividirse en tres fases: 1) obtencin de energa a partir de la oxidacin de las molculas combustibles, 2) conversin de esa energa a una forma biolgicamente til, que es la que se encuentra en las uniones de alta energa del ATP y 3) utilizacin de la energa de las uniones del ATP. Las primeras dos fases son parte del proceso de respiracin celular. En bioqumica, al hablar de respiracin celular, nos referimos a los procesos celulares que al oxidar los combustibles a CO2, consumen oxgeno y generan ATP. Los procesos que constituyen la respiracin celular pueden dividirse en 3 fases (ver Figura). En la Fase 1 se produce la oxidacin enzimtica de los combustibles metablicos con transferencia de electrones a las coenzimas aceptoras NAD+ y FAD que se reducen a NADH y FADH2, respectivamente. En esta Fase, la mayora de los combustibles metablicos (glcidos, cidos grasos y muchos aminocidos) convergen en la generacin del grupo acetilo (de 2 C) activado del acetil-CoA. En la Fase 2 ocurre la oxidacin completa del grupo acetilo del acetil-CoA a CO2 (el compuesto ms estable del carbono) en el Ciclo de los cidos tricarboxlicos (o ciclo de Krebs, o ciclo del cido ctrico) y tambin aqu la energa se almacena principalmente como NADH y FADH2. La Fase 2 es exclusivamente mitocondrial. En la Fase 3 la energa obtenida a partir de la oxidacin de los combustibles (en forma de coenzimas reducidas) es convertida en energa de las uniones del ATP a travs del proceso de Fosforilacin oxidativa. Los electrones se transfieren desde el NADH y

2 del FADH2 (las coenzimas se reoxidan) al oxgeno, a travs de la cadena de transporte de electrones. Este proceso genera un potencial electroqumico en la forma de un gradiente de protones a travs de la membrana mitocondrial interna que puede utilizarse para la sntesis de ATP a partir de ADP y fosfato inorgnico (Pi).

Lpidos

Glcidos polisacridos protenas

cidos grasos glucosa

aminocidos

Fase 1

Acetil-CoA

Ciclo de Krebs

NADH + FADH2

Fase 2

Fosforilacin oxidativa

Fase 3

Figura 1. Representacin esquemtica de las fases de la respiracin celular

La velocidad de las reacciones involucradas en la oxidacin de los combustibles est coordinada en forma ajustada con la velocidad de utilizacin del ATP por un mecanismo de retroalimentacin (feedback). Como consecuencia de este mecanismo de regulacin, los combustibles que no se van a utilizar inmediatamente se almacenan en vez de oxidarse. Se denominan vas catablicas a las reacciones metablicas a travs de las cuales los combustibles ingeridos o almacenados, tales como glcidos, lpidos o protenas son degradados secuencialmente para obtener energa. Las reacciones catablicas resultan generalmente en la conversin de molculas grandes y complejas a molculas pequeas (y finalmente a CO2 y H2O), en la produccin de energa almacenable o conservable, y, en general en el consumo de oxgeno

3 (es decir, generalmente son reacciones de oxidacin). De hecho, la nica va que puede generar ATP sin oxgeno es la gluclisis anaerbica. Por el contrario, las vas metablicas involucradas en la biosntesis de macromolculas se denominan vas anablicas y generalmente resultan en la sntesis de molculas grandes y complejas a partir de precursores pequeos. A diferencia de las reacciones catablicas, los procesos anablicos son reductivos (reacciones de reduccin) y consumen energa. Los cidos grasos son el principal combustible metablico del organismo. Luego de una comida rica en glcidos (por ejemplo pastas, pan, azcar, o papas), su exceso se almacena en las unidades glucosilo del glucgeno. Sin embargo, esta forma de almacenamiento es relativamente limitada, de manera que el exceso de glcidos, que sobrepasa la capacidad de ser convertido en glucgeno, se transforma en triacilglicridos (depsitos lipdicos) que se almacenan en el tejido adiposo. Obviamente, tambin el exceso de lpidos de la dieta se almacena de esta forma. Entre las comidas se liberan cidos grasos de estos depsitos, circulan por la sangre unidos a albmina y se oxidan a acetil-CoA en el msculo, hgado y muchos otros tejidos, por la va de la -oxidacin. Uno de los principales destinos metablicos del acetil-CoA es el tema de

esta clase. En el hgado, el acetil-CoA tambin puede convertirse en cuerpos cetnicos que se oxidan en msculo y otros tejidos y se convierten en el combustible principal del cerebro en un ayuno prolongado. Las vas de oxidacin de cidos grasos y de cuerpos cetnicos utilizan NAD+ y FAD como aceptores de electrones. Todas las clulas requieren ATP en forma continua. Sin embargo, el aporte de combustibles para obtener energa no es un proceso continuo. La disponibilidad constante de combustibles a pesar de la discontinuidad de las ingestas alimenticias y de la variacin en la velocidad de su utilizacin se denomina homeostasis metablica y se logra a travs de la regulacin hormonal de las vas de almacenamiento y de movilizacin de combustibles, principalmente mediada por las hormonas metablicas, esencialmente la insulina y las hormonas contrarregulatorias de la insulina, el glucagon, la adrenalina y el cortisol. La glucosa tiene un rol central en la homeostasis metablica debido a que el cerebro y algunos otros tejidos requieren glucosa para una gran parte de sus necesidades energticas. Los niveles sanguneos de glucosa en personas sanas se mantienen en alrededor de 80 mg%. Niveles inadecuados de insulina o resistencia de los tejidos a los efectos de la insulina ocasionan la hiperglucemia caracterstica de la Diabetes Mellitus. El ciclo de Krebs constituye la etapa intermedia del metabolismo. Adems de ser la va final de oxidacin de los combustibles, tambin provee de intermediarios para procesos

4 anablicos. Este rol central en el metabolismo hace de la comprensin de su funcionamiento y regulacin, un tema clave para el estudio del metabolismo normal y de su alteracin en diferentes patologas.

PIRUVATO: DE DONDE PROVIENE Y CUL ES SU DESTINO METABOLICO?

Antes de empezar a hablar en detalle del ciclo de Krebs (ciclo de los cidos tricarboxlicos o CAT) vamos a analizar primero una de las reacciones que generan acetil-CoA. Nos referimos a la reaccin de descarboxilacin oxidativa del piruvato catalizada por el complejo de la piruvato deshidrogenasa. Esta reaccin NO FORMA PARTE DEL CICLO DE KREBS pero la mayor parte de los libros de texto la incluyen en esta unidad, posiblemente porque no forma parte de ninguna otra va metablica. Esta reaccin tambin ocurre en las mitocondrias y el complejo enzimtico que la cataliza es similar a uno que interviene en una de las reacciones del ciclo. Sin embargo, no confundirse, esta reaccin NO ES LA UNICA FUENTE DEL AcetilCoA para el CAT y su importancia como fuente de acetil-CoA depende del tejido analizado. El piruvato es el producto final de la gluclisis aerbica que ocurre en el citosol y tambin de la degradacin de algunos aminocidos como alanina, serina y cistena. El destino del piruvato depende del tejido en el que se produce y de su estado metablico. Adems de ser sustrato del complejo de la piruvato deshidrogenasa, el piruvato puede ser utilizado en otras vas metablicas como por ejemplo: a) transaminacin a alanina, b) carboxilacin para generar oxaloacetato (sustrato gluconeogentico) y c) reduccin a lactato (gluclisis anaerbica)

PIRUVATO DESHIDROGENASA

Como ya hemos dicho, el piruvato se transforma en acetil-CoA por descarboxilacin oxidativa, en una reaccin catalizada por un complejo multienzimtico denominado Piruvato Deshidrogenasa. La reaccin es la siguiente:

Piruvato + NAD+ + CoASH

acetil CoA + CO2 + NADH + H+

G= -8 kcal/mol

Esta enzima se localiza exclusivamente en mitocondrias, en altas concentraciones en tejidos como el msculo cardaco y el rin. Dado el alto valor negativo del G de la reaccin, en condiciones fisiolgicas la reaccin es esencialmente irreversible, y este hecho es la principal razn por la cul la conversin neta de cidos grasos a carbohidratos no puede ocurrir en nuestro organismo. El peso molecular del complejo enzimtico de rin, corazn o hgado vara entre 7 y 8.5 x 10 y en mamferos consta de tres tipos diferentes de subunidades catalticas:
6

Nmero de subunidades 20 30 60 6

Tipo Piruvato deshidrogenasa (E1) Dihidrolipoil transacetilasa (E2) Dihidrolipoil deshidrogenasa (E3)

peso molecular 154.000 52.000 110.000

estructura
2- 2

tetrmero idnticas 2 Dmero

El complejo de la piruvato deshidrogenasa est compuesto por tres actividades enzimticas, denominadas: Piruvato Deshidrogenasa propiamente dicha (E1), Dihidrolipoil Transacetilasa (E2) y Dihidrolipoil Deshidrogenasa (E3). Cinco coenzimas diferentes o grupos prostticos participan de la reaccin de la Piruvato Deshidrogenasa: pirofosfato de tiamina, cido lipoico, coenzima A, FAD y NAD+ (ver captulo de reacciones rdox y cadena de transporte de electrones). La E1 tiene covalentemente unido pirofosfato de tiamina, la E2 tiene covalentemente unido cido lipoico y la E3 tiene covalentemente unido FAD. En la siguiente figura se indican las estructuras del pirofosfato de tiamina y del cido lipoico y su modificacin en la reaccin catalizada por el complejo de la piruvato deshidrogenasa.

Pirofosfato de tiamina (TPP)

Hidroxietil pirofosfato de tiamina

Forma oxidada Forma oxidada

Forma reducida

Forma acetilada

Forma acetilada

cido lipoico

Residuo de lisina de E2 de lisina E2 sw

Mecanismo de la reaccin: 1) El piruvato interacta con el pirofosfato de tiamina de la subunidad Piruvato Deshidrogenasa y sufre una decarboxilacin convirtindose en un grupo hidroxietilo. 2) A continuacin, se transfiere el grupo acetilo y 2 electrones al grupo lipoico unido a la Dihidrolipoil Deshidrogenasa para formar el acetil-tioster del cido lipoico en su forma reducida. 3) En el siguiente paso, se transfiere el grupo acetilo desde el cido lipoico a la coenzima A. Noten que en ambos casos se trata de tiosteres. 4) El cido lipoico reducido es reoxidado en una reaccin catalizada por la Dihidrolipoil Deshidrogenasa que cataliza la transferencia de dos tomos de hidrgeno del cido lipoico reducido a la coenzima FAD, su grupo prosttico. 5) El ltimo paso consiste en la transferencia de un ion hidruro al NAD+, regenerando la forma oxidada del FAD. El complejo se encuentra ahora en condiciones de producir la transformacin de una nueva molcula de piruvato.

De la descripcin del mecanismo de la reaccin se desprende que existe una activa participacin de grupos tioles en el mecanismo cataltico de la enzima y por lo tanto agentes que oxiden o formen complejos los grupos tioles sern inhibidores potentes del complejo enzimtico, por ej. el arsenito.

piruvato Lipoamida oxidada

Lipoamida reducida

acetilCoA

REGULACIN DE LA ACTIVIDAD PIRUVATO DESHIDROGENASA

La actividad del complejo de la Piruvato Deshidrogenada presenta dos tipos de regulacin. En primer trmino, dos de los productos, el acetil-CoA y el NADH la inhiben en forma alostrica. Por otra parte, el complejo existe en dos formas, una activa, desfosforilada y otra inactiva, fosforilada. La inactivacin del complejo es catalizada por una protena quinasa dependiente de ATP-Mg2+ que est fuertemente unida al complejo. La reactivacin del complejo est catalizada por una fosfoprotena fosfatasa, que desfosforila al complejo en forma dependiente de Mg2+ y de Ca2+. Tres residuos diferentes en la subunidad de la piruvato

deshidrogenasa se fosforilan por la protena quinasa, pero la fosforilacin de slo uno de ellos est relacionada con la actividad del complejo. La regulacin diferencial de la quinasa y de la fosfatasa es la clave de la regulacin de la actividad del complejo. La formacin de acetil-CoA est coordinada con la velocidad de utilizacin del ATP. Esto es consecuencia del efecto que tienen en su actividad las variaciones en las concentraciones de ADP, piruvato, CoASH, NAD+, acetil-CoA y Ca2+ intramitocondrial. Todos estos compuestos regulan la conversin de la enzima a la forma inactiva (fosforilada). La quinasa es inhibida por ADP, cuyos niveles aumentan cuando aumenta el consumo de ATP. Esta inhibicin mantiene a la Piruvato Deshidrogenasa en la forma activa, no fosforilada. En algunos tejidos, el aumento del Ca2+ intramitocondrial, que estimula la fosfatasa, contribuye al incremento de la forma defosforilada y por lo tanto, activa. El acetil-CoA y el NADH, productos de la reaccin, inhiben a la forma desfosforilada (activa) de la enzima, y tambin activan a la quinasa, llevando a un desplazamiento del complejo a su forma inactiva. Adems, la CoASH y el NAD+ inhiben a la quinasa. Por lo tanto, cuando se produce un aumento en las relaciones NADH/NAD+ o acetil-

8 CoA/CoA (como por ejemplo durante la -oxidacin de cidos grasos, situacin en la que se produce un gran aporte de sustratos al CAT), la actividad del complejo enzimtico disminuye marcadamente. Adems, el piruvato es un poderoso inhibidor de la quinasa, y por lo tanto, en presencia de altas concentraciones de piruvato, la quinasa estar inhibida y el complejo tendr su mxima actividad. Finalmente, se ha demostrado que la administracin de insulina puede activar a la piruvato deshidrogenasa del tejido adiposo y que las catecolaminas (como la adrenalina) pueden activar a la del tejido cardaco. Los mecanismos an no estn aclarados completamente, pero podra estar involucrada una alteracin en la distribucin intracelular de calcio, de modo de afectar a la fosfoprotena fosfatasa. Estos efectos hormonales no estn mediados directamente por alteraciones en los niveles de AMPc dado que tanto la quinasa como la fosfatasa del complejo son independientes de AMPc.

Pi PDH inactiva (-) ADP quinasa Mg2+ ATP (-) Piruvato CoASH NAD+ PDH activa (-) Acetil CoA CO2 NADH + H+ (-) (+) fosfatasa Ca2+ Mg2+ Pi

(-)
En conclusin, la actividad del complejo enzimtico aumenta cuando se requiere un aporte de acetil-CoA al CAT o cuando aumentan sus sustratos, aunque en ese ltimo caso el destino final del acetil-CoA no ser nicamente el ciclo. Acetil-CoA Como ya dijimos, la mayor parte de las principales vas catablicas genera la unidad de dos carbonos del acetil-CoA. El catabolismo de los glcidos almacenados o ingeridos, a travs de la va glucoltica, el de los cidos grasos de cadena larga provenientes de la liplisis de los triacilglicridos por la secuencia de -oxidacin, la oxidacin de cuerpos cetnicos y de etanol o

9 el catabolismo de ciertos aminocidos, producto de protelisis, luego de su transaminacin o desaminacin y posterior oxidacin proveen precursores para la formacin de acetil-CoA. La coenzima A, cuya estructura se muestra en la Figura, se compone de betamercaptoetilamina, la vitamina cido pantotnico y un nucletido de adenina, adenosina 3fosfato 5-disfosfato. Su grupo tiol se encuentra reducido y est involucrada en muchas reacciones de transferencia de grupos acilo en las que la coenzima A alternativamente funciona como el aceptor y luego el dador de la funcin acilo.

O S C H CH3

grupo acetilo

ACETIL COENZIMA A

CH2 CH2 NH C CH2 CH2 NH C HO C O H CH3 O P O OO P OO O 4' 5' CH2 O 1' O N

beta-mercaptoetilamina
NH2
N

adenina cido pantotnico

N N

H3C C

CH2

D-ribosa 3' fosfato

3' 2'

-O P
O -

3' fosfoadenosina difosfato

En muchas vas metablicas, los intermediarios son compuestos donde participa la coenzima A, como por ejemplo, en la -oxidacin de cidos grasos y en la degradacin de

aminocidos ramificados. Como muchos otros nucletidos, los derivados de la CoASH no se transportan libremente a travs de las membranas celulares, sino que lo hacen a travs de transportadores o mecanismos especficos. Tambin es importante sealar que el enlace tioster del acetil-CoA es un enlace rico en energa, y por lo tanto estos compuestos pueden servir como dadores eficientes de grupos acilo en reacciones de transferencia de acilo. En la sntesis de acetilCoA catalizada por la enzima acetato tioquinasa debe utilizarse una molcula de ATP, pero la reaccin se produce con gasto de 2 enlaces de alta energa:

acetato + CoASH + ATP

acetil-CoA + AMP + PPi

10 El destino del acetil-CoA generado en la mitocondria puede ser: a) oxidacin completa del grupo acetilo en el CAT con generacin de energa, b) conversin a cuerpos cetnicos (cuando hay exceso): acetoacetato y -hidroxibutirato (en hgado) c) transferencia de acetilos al citosol con la subsecuente biosntesis de molculas complejas como esteroles y cidos grasos de cadena larga. CICLO DE LOS CIDOS TRICARBOXLICOS Como ya mencionamos, en la mayora de las vas de oxidacin de combustibles metablicos se terminan formando los dos carbonos activados del acetil-CoA. Su destino principal es la oxidacin completa a CO2 en una serie de reacciones oxidativas cclicas, denominadas ciclo de los cidos tricarboxlicos (CAT). Tambin se lo conoce como ciclo del cido ctrico o ciclo de Krebs, en homenaje al investigador que postul las caractersticas esenciales del ciclo en el ao 1937. Todas las enzimas del ciclo se localizan en la mitocondria, lo que coincide con la localizacin del complejo de la piruvato deshidrogenasa y de las enzimas de la -oxidacin, las dos fuentes principales de acetil-CoA. Una de las funciones principales del ciclo es la generacin de equivalentes de reduccin, que se utilizan para generar energa (ATP), en la secuencia de transporte de electrones y fosforilacin oxidativa, procesos que tambin ocurren en las mitocondrias. La oxidacin del acetil-CoA ocurre en cuatro reacciones que transfieren electrones a las coenzimas aceptoras NAD+ o FAD. En otras reacciones del ciclo se rearreglan los enlaces para facilitar esta transferencia. Inicialmente la porcin acetilo del acetil-CoA se combina con el intermediario de cuatro carbonos oxaloacetato para formar citrato (6 carbonos). Un rearreglo subsecuente de enlaces en el citrato es seguido por dos decarboxilaciones oxidativas. Estas reacciones transfieren los electrones al NAD+ y liberan 2 carbonos como CO2. En el siguiente paso, se genera un enlace de alta energa del GTP por fosforilacin a nivel de sustrato. En la porcin remanente del ciclo hay dos reacciones de transferencia electrnica adicionales y se regenera el oxaloacetato. El proceso completo ocurre con la conservacin de la mayor parte de la energa de los enlaces qumicos del grupo acetilo como 3 NADH, 1 FADH2 y 1 GTP. Aproximadamente 2/3 del NADH y del FADH2 generados en todas las vas de oxidacin de combustibles provienen del CAT. La velocidad del ciclo est fuertemente coordinada a la velocidad de utilizacin de ATP a travs de la regulacin de enzimas individuales por compuestos relacionados con el ATP, por el estado de reduccin del NAD+ y por la concentracin mitocondrial de Ca2+. Otra de las caractersticas del CAT es la existencia de

11 puntos de fuga, es decir reacciones en las cuales algunos de los intermediarios del ciclo pueden salir del ciclo y actuar como sustratos de otras reacciones ajenas a ste.
acetilCoA

citrato oxalacetato isocitrato

malato fumarato

-cetoglutarato

succinilCoA succinato

OXIDACIN DE Acetil-CoA EN EL CICLO DE LOS ACIDOS TRICARBOXLICOS

La primera reaccin del CAT involucra la condensacin del grupo acetilo con la funcin -ceto del cido dicarboxlico oxaloacetato, para formar el intermediario de 6 carbonos, citrato. Esta reaccin es catalizada por la enzima Citrato Sintasa y es una reaccin altamente exergnica ( G= -9 kcal/mol) que se encuentra desplazada hacia la formacin del citrato. La citrato sintasa se localiza en la matriz mitocondrial. Se supone que esta reaccin est considerablemente desplazada del equilibrio en condiciones fisiolgicas, lo que hace a este paso un candidato principal para la regulacin. Se ha demostrado que la enzima se inhibe por ATP, NADH, succinil CoA y acil-CoA (acilos de cadena larga), pero estos experimentos se han realizado con la enzima aislada y no se ha demostrado que funcionen dichos reguladores en los sistemas intactos en condiciones fisiolgicas. Lo ms probable es que el regulador principal de la enzima sea el aporte de sus sustratos: acetil-CoA y oxaloacetato.

Citrato sintasa acetilCoA oxalacetato citrato

12 El citrato, que es el primer producto del ciclo, es tambin el primer punto de fuga dado que adems de intermediario en el ciclo, puede funcionar como efector regulatorio o como fuente de carbonos en otras vas metablicas que ocurren en el citosol:

CITRATO

Fuente de equivalentes
de reduccin para procesos

Fuente de carbonos para la

biosntesis citoslica de cidos grasos y esteroles

de sntesis citoslicos Regulador de actividad enzimtica: (-) de la fosfofructoquinasa I (+) de la acetilCoA carboxilasa

En el siguiente paso, catalizado por la Aconitasa, se forma isocitrato por la transferencia de un grupo hidroxilo a un carbono adyacente, que posee un enlace C-H.

Esta reaccin involucra la generacin de un intermediario unido a la enzima, el cis-aconitato. En el equilibrio existe un 90% de citrato, 3% de cis-aconitato y un 7% de isocitrato. Por lo tanto, en el equilibrio, predomina el citrato. Aunque la reaccin no requiere cofactores, si requiere hierro (Fe2+) y existe evidencia de que ste estara involucrado en un centro Fe-S, componente esencial de la actividad hidratasa de la aconitasa.

aconitasa

aconitasa

citrato

Cis-aconitato

isocitrato

La Isocitrato Deshidrogenasa cataliza la primera reaccin de deshidrogenacin del ciclo. El isocitrato se convierte en -cetoglutarato en una reaccin de descarboxilacin oxidativa. En este paso del ciclo se produce el primero (de los dos) CO2 y se genera el primero (de los tres) NADH + H+.

13

Isocitrato-deshidrogenasa

isocitrato

-cetoglutarato

La enzima requiere NAD+ como aceptor oxidado de los equivalentes de reduccin. Si bien existe otra actividad de isocitrato deshidrogenasa en el citosol que requiere NADP+ como coenzima oxidada, no es sta la que participa del ciclo y su funcin en el citosol sera la de proveer equivalentes de reduccin para procesos citoslicos reductivos. El equilibrio de la reaccin est muy desplazado hacia la formacin de -cetoglutarato con un G'= -5 kcal/mol.

La enzima tiene un peso molecular de 380.000 y est constituida por 8 subunidades idnticas. Se requiere un metal divalente (Mn2+ o Mg2+) para la descarboxilacin de la posicin del isocitrato. La enzima se activa por ADP y en algunos casos por AMP y se inhibe por ATP y NADH. Por lo tanto, se inhibe en condiciones de alta energa (alto ATP/ADP + Pi y alto NADH/NAD+). En situaciones de baja energa, la actividad de la enzima se estimula, lo que permite acelerar la generacin de energa por el ciclo. El -cetoglutarato es otro punto de fuga del CAT porque puede ser sustrato de una reaccin que intersecta el ciclo, en la cual el -

cetoglutarato se condensa con amonaco (o amonio) en presencia de NADH o NADPH y se sintetiza glutamato y NAD+ o NADP+. Esta reaccin ocurre en las mitocondrias, y es catalizada por la enzima glutamato-deshidrogenasa, una de las enzimas ms importantes en el metabolismo de aminocidos
GLUTAMATO DESHIDROGENASA
COO CH2 NH4+ + CH 2 C COO O NAD(P)+ COO NAD(P)H CH2 CH 2
+

C COO

NH3 -

ALFA-CETOGLUTARATO

GLUTAMATO

La conversin de

-cetoglutarato a succinil-CoA es catalizada por el complejo

multienzimtico de la -Cetoglutarato Deshidrogenasa que est compuesto por 3 actividades enzimticas diferentes: -cetoglutarato deshidrogenasa, dihidrolipoil transuccinilasa y

14 dihidrolipoil deshidrogenasa. Su peso molecular es de varios millones de daltons y pertenece a una familia de complejos similares que descarboxilan oxidativamente al piruvato, al -cetobutirato y a los leucina e isoleucina). -cetoglutarato, al

-cetocidos de los aminocidos de cadena ramificada (valina,

-cetoglutarato deshidrogenasa Succinil-CoA

-cetoglutarato

Este complejo es casi idntico al de la piruvato deshidrogenasa en cuanto al tipo de reaccin que cataliza y a algunas de sus caractersticas estructurales. Tambin en este caso, el pirofosfato de tiamina, el cido lipoico, la CoASH, el FAD y el NAD+ participan del mecanismo cataltico. El equilibrio est desplazado hacia la formacin de succinil-CoA con un G= -8

kcal/mol. En esta reaccin se genera la segunda molcula de CO2 y el segundo equivalente de reduccin del ciclo (NADH + H+). El otro producto, el succinil-CoA, es un ejemplo de tioster rico en energa similar al acetil-CoA. A diferencia del complejo de la piruvato deshidrogenasa, la actividad de este complejo no est regulada por fosforilacin. Los nuclesidos trifosfato, ATP y GTP, NADH y succinil-CoA inhiben su actividad, mientras que el aumento en la concentracin de Ca2+ lo activa. La energa del enlace tioster del succinil-CoA se conserva en una reaccin de fosforilacin a nivel de sustrato en el siguiente paso del ciclo (fosforilacin a nivel de sustrato es la formacin de un nuevo enlace de fosfato de alta energa en una reaccin en la que no participa directamente el oxgeno). La reaccin catalizada por la Succinil-CoA Sintetasa o Succinato Tioquinasa convierte el succinil-CoA a succinato y, en tejidos de mamferos resulta en la fosforilacin del GDP para generar GTP. La reaccin es libremente reversible con un G= -0.7 kcal/mol.

Succinato tioquinasa o Succinil- CoA Sintetasa SuccinilCoA Succinato

15 Dada la presencia de la nuclesido difosfato quinasa, el grupo generar ATP por transferencia al ADP. NDQ (Mg2+) ADP + GTP <===>ATP + GDP fosfato del GTP puede

El succinil-CoA es otro punto de ramificacin (de fuga) metablica, pues los intermediarios pueden entrar o salir del ciclo a partir de este intermediario. El succinil-CoA puede formarse a partir de -cetoglutarato o a partir de metilmalonil-CoA en los pasos finales de la degradacin de cidos grasos de nmero impar de carbonos o de aminocidos ramificados como valina e isoleucina. Su destino metablico incluye la conversin a succinato por la reaccin de la succinil-CoA sintetasa y su condensacin con glicina para formar el -aminolevulinato en la reaccin catalizada por la -aminolevulinato sintetasa, que es la reaccin inicial de la sntesis de porfirinas.

Propionil CoA -cetoglutarato

Metilmalonil CoA

Ciclo de Krebs

Metabolismo de cidos grasos de n impar de C y de aminocidos ramificados Succinil CoA Ciclo de Krebs Acetoacetato Utilizacin de cuerpos cetnicos AcetoacetilCoA Succinato -aminolevulinato Biosntesis de Porfirinas

El succinato se oxida a fumarato en la reaccin catalizada por la succinato deshidrogenasa. Se transfiere un electrn de cada grupo metileno adyacente del succinato a un FAD unido a la succinato deshidrogenasa, formndose entonces el doble enlace del fumarato.

Succinato Deshidrogenasa

Succinato

Fumarato

16 Del FAD reducido unido a la enzima, los electrones pasan a la cadena de transporte de electrones. La enzima, compuesta por dos subunidades, est fuertemente unida a la membrana mitocondrial interna. La mayor de las subunidades contiene el sitio de unin del sustrato, el FAD covalentemente unido a una lisina, varios tomos de hierro no-hmico y de azufre lbiles, mientras que la menor contiene hierro no-hmico y azufre lbil. Esta enzima es un ejemplo tpico de una protena hierro-azufre en la cual el hierro no-hmico sufre un cambio de valencia durante la remocin de los electrones y de los protones del succinato y la subsecuente transferencia de estos equivalentes de reduccin por el FAD covalentemente unido a la cadena de transporte de electrones a nivel de la coenzima Q-citocromo b. La succinato deshidrogenasa es inhibida fuertemente por malonato y oxaloacetato y activada por ATP y succinato. Dada su similitud estructural el malonato es un inhibidor competitivo de la enzima. El fumarato se hidrata para formar L-malato en el siguiente paso del ciclo, reaccin catalizada por la enzima Fumarasa. Un grupo OH- y un protn del agua se agregan al doble enlace del fumarato transformndolo en malato. La fumarasa es un tetrmero de PM 200.000 y es estereoespecfica para la forma trans del sustrato (la forma cis, el maleato o cido maleico, no es sustrato de esta enzima) y el producto de la reaccin es solamente L-malato (no su ismero, el Dmalato). La reaccin es libremente reversible en condiciones fisiolgicas.

fumarasa

Fumarato (trans)

L-malato

La ltima reaccin del ciclo, catalizada por la Malato Deshidrogenasa, que remueve el ltimo (de tres) de los equivalentes de reduccin como NADH + H+. El grupo alcohol del malato se oxida a grupo ceto cediendo sus electrones a la coezima. En el equilibrio predomina el malato, dado que para esta reaccin el G= + 7.0 kcal/mol. La reaccin es por lo tanto endergnica considerada en la direccin de formacin de oxaloacetato. Sin embargo, las reacciones siguientes catalizada por la citrato sintasa y otras, permiten la formacin del oxaloacetato pues mantienen sus niveles muy bajos, ya que es utilizado en las siguientes reacciones. Adems, el NADH producido se oxida rpidamente en la cadena de transporte de electrones. El malato constituye otro punto de ramificacin, pues puede ser transportado al citosol, donde genera oxaloacetato en

17 la reaccin catalizada por la enzima malato deshidrogenasa citoslica. ste, a su vez, es un sustrato gluconeognico.

Malato deshidrogenasa L-Malato Oxalacetato

Es importante destacar que esta ltima secuencia de reacciones: oxidacin por formacin de un doble enlace, adicin de agua al doble enlace y oxidacin del alcohol resultante a cetona, se encuentra en muchas vas metablicas tales como la oxidacin de los cidos grasos y de los aminocidos ramificados. Qu transformacin neta ocurre entonces en el ciclo? En primer lugar, el grupo acetilo de dos carbonos del acetil-CoA se oxida generando 2 molculas de CO2. Una funcin del ciclo es conservar la energa de esta oxidacin en forma de coenzimas transportadoras de electrones, en estado reducido. El balance global del ciclo muestra que el grupo acetilo funciona como fuente de carbonos para el CO2 y como fuente de electrones para la transferencia a las coenzimas.
Acetil CoA + 3 NAD+ + FAD + GDP + Pi + 2 H2O 2 CO2 + CoASH + 3 NADH + 3 H+ + FADH2 + GTP

18 El acetil-CoA es el combustible del CAT, su oxidacin no involucra O2 directamente, y se lleva a cabo removiendo electrones como hidrgeno o in hidruro y agregando H2O. Los 4 oxgenos de los 2 CO2 provienen del grupo carbonilo del acetil-CoA, 2 H2O y la adicin de un PO43- al GDP. Las diferentes reacciones del ciclo involucran el rearreglo de los carbonos y los electrones donados por el grupo acetilo de modo que los mismos carbonos y electrones no entran y salen del ciclo en una sola vuelta. En el esquema anterior se muestran marcados (en rojo) los C que provienen del acetilCoA y, como se observa, en la primera vuelta del ciclo, estos C no abandonan el ciclo como CO2 sino que quedan en el oxalacetato.

El rendimiento completo en compuestos que contienen energa es de 3 NADH, 1 FADH2 y 1 GTP. Las reacciones rdox son catalizadas por 4 deshidrogenasas: isocitrato deshidrogenasa, alfa-cetoglutarato deshidrogenasa, succinato deshidrogenasa y malato deshidrogenasa. El enlace de alta energa del GTP se origina en una reaccin de fosforilacin a nivel de sustrato catalizada por la succinato tioquinasa.

Coenzimas Diferencias entre NAD+ y FAD En la oxidacin del succinato a fumarato y en la oxidacin del lipoato reducido a lipoato disulfuro, el FAD es el aceptor de electrones. En las otras oxidaciones esa funcin la cumple el NAD+. Por qu? Estas coenzimas tienen diferentes propiedades y realizan funciones diferentes. El FAD puede aceptar electrones individuales (H ) y formar un intermediario semirreducido con

19 un electrn. Por lo tanto, participa en reacciones donde se transfieren electrones individuales desde dos tomos diferentes tales como los dos C-H adyacentes en el succinato o los dos grupos SH del cido dihidrolipoico. El NAD+ acepta un in hidruro (H ) en reacciones tales como la conversin de un alcohol a cetona. Las diferencias en la estructura qumica de las dos coenzimas determinan que ambas cumplan roles fisiolgicos diferentes. La forma radical libre del FAD, con un electrn extra, es muy reactiva y el FADH puede perder su electrn por exposicin a agua o por iniciacin de reacciones en cadena. Por lo tanto, el FAD permanece unido fuertemente (a veces covalentemente) a la enzima mientras acepta y transfiere electrones a otro grupo de la enzima. El FADH2 en la succinato deshidrogenasa, por ejemplo est unido covalentemente y no se disocia de la enzima que se encuentra en la membrana mitocondrial interna donde los electrones del FAD son cedidos a la coenzima Q, parte de la cadena de transporte de electrones. Todas las otras enzimas del CAT se encuentran en la matriz mitocondrial. El NAD+ por el contrario est generalmente libre en solucin, se une a la deshidrogenasa y acepta electrones y luego se libera y difunde. Por lo tanto el NAD+ y el NADH funcionan ms como sustratos y productos que como coenzimas. Esta caracterstica le permite al NADH ser un regulador de la funcin celular. El NADH generado por una deshidrogenasa puede inhibir a otra si no es reoxidado por la cadena de transporte de electrones. La regulacin del ciclo por la relacin NADH/NAD+ es parte del mecanismo para coordinar la oxidacin de combustibles con la utilizacin de ATP.
-

O C NH2

O C NH2

+ N R
+

2e + H 2e- + 2H+

N R

NAD

NADH + H+

20 Coenzima A La CoASH, la coenzima de acilacin y participa en reacciones en las que se forma un enlace tioster con un grupo acilo (acetil-CoA, succinil-CoA). El carbono carbonlico, el carbono y el carbono del grupo acilo se activan en diferentes tipos de reacciones por la formacin del enlace tioster con el grupo sulfhidrilo de la coenzima A. La hidrlisis de este enlace tiene un gran valor negativo del G (aprox. -13 kcal/mol). El enlace tioster es mucho menos estable que un enlace ster con oxgeno, pues el azufre no comparte sus electrones en estados de resonancia. La energa liberada por la ruptura del tioster cumple dos funciones en el CAT: provee la energa para la generacin del GTP y hace que la entrada del acetil-CoA al ciclo sea ms favorable termodinmicamente. En la condensacin de la porcin acetilo con el oxaloacetato para formar citrato, la ruptura del enlace tioster del acetil-CoA ocurre con un G= -7.7 kcal/mol. Cuando este valor negativo se agrega al gran valor positivo para la reaccin de la malato deshidrogenasa, se obtiene un valor neto cercano a 0 para la conversin de malato a citrato. Por lo tanto la entrada del acetilCoA al ciclo se facilita por la ruptura del enlace tioster. Dado que el enlace tioster del acetil-CoA tiene un G de hidrlisis de -13 kcal, su

formacin requiere energa, como ya se mencion. La energa es aportada por la descarboxilacin oxidativa del piruvato en la reaccin catalizada por el complejo de la piruvato deshidrogenasa o de reacciones de oxidacin y ruptura de enlaces C-C de cidos grasos o aminocidos. El acetato tambin puede convertirse directamente en acetil-CoA utilizando la energa aportada por el ATP, en una reaccin catalizada por la acetato tioquinasa, que ya se describi.

BALANCE ENERGETICO DEL CICLO DE KREBS

Las reacciones del ciclo son extremadamente eficientes en la conversin de la energa de las uniones qumicas del acetato. La energa total contenida en el acetato, liberada como calor en la combustin completa de un mol de acetato a CO2 en un calormetro, es de 243 kcal/mol. Para activar el acetato a acetil-CoA se requiere el equivalente a dos enlaces de alta energa o alrededor de 15 kcal/mol, de modo que slo se producen 228 kcal/mol de la oxidacin del acetato. Los productos del ciclo almacenan alrededor de 206 kcal/mol, por lo tanto las reacciones del ciclo son capaces de conservar alrededor del 90% de la energa accesible de la oxidacin del acetil-CoA. Tres reacciones del ciclo tienen valores muy negativos de G: son las catalizadas por la citrato sintasa, la isocitrato deshidrogenasa y la -cetoglutarato deshidrogenasa. Estas reacciones

21 son irreversibles en condiciones fisiolgicas debido a sus altos valores (negativos) de G y

porque las enzimas involucradas catalizan las reacciones inversas muy lentamente. Estas reacciones realizan la contribucin principal al elevado G negativo del ciclo.

Enzima Citrato Sintasa Aconitasa Isocitrato Deshidrogenasa -Cetoglutarato Deshidrogenasa Succinato Tioquinasa Succinato Deshidrogenasa Fumarasa Malato Deshidrogenasa

G (kcal/mol) -7.7 + 1.5 -5.3 -8.0 -0.7 0 0 + 7.1

Como ya hemos mencionado, durante el proceso de oxidacin completa del grupo acetilo se producen 4 equivalentes de reduccin, que se usan subsecuentemente para generar energa. Como se discutir ms adelante, la oxidacin de cada mol de NADH + H+ resulta en la formacin de 2,5 moles de ATP mientras que la de FADH2 en 1,5. Tambin se forma un enlace de alta energa en la reaccin de la succinil-CoA sintetasa. Por lo tanto la ganancia neta para la oxidacin de cada mol de acetil-CoA en el CAT es de 10 moles de ATP.

REACCIONES ANAPLEROTICAS Teniendo en cuenta los ya mencionados puntos de fuga del ciclo, para que ste siga funcionando los tejidos aportan intermediarios para compensar su salida hacia otras vas como la gluconeognesis o la sntesis de cidos grasos. En cada tejido, los puntos de fuga intersectan al ciclo y remueven intermediarios como el citrato, el -cetoglutarato, el succinil-CoA y el malato. En el tejido nervioso, el -cetoglutarato se convierte en glutamato y luego en GABA. El succinil-CoA se utiliza para la sntesis de hemo en el hgado. Los esqueletos carbonados de algunos aminocidos tambin derivan de intermediarios del ciclo. El oxaloacetato que es imprescindible para la oxidacin del acetil-CoA siempre se regenera: en cada ciclo, 2 carbonos se incorporan en la forma del grupo acetilo, 2 se eliminan como CO2, y la unidad de 4 carbonos est presente en el succinato, fumarato, malato y oxaloacetato. Sin embargo, si un intermediario entra en otra va, el nivel de intermediarios debe restaurarse para que el ciclo (y con ello la obtencin de energa) no se detenga.

22 Las reacciones que aportan intermediarios al CAT se denominan reacciones anaplerticas o de relleno. Una de las principales reacciones anaplerticas es la conversin de piruvato y CO2 a oxaloacetato, catalizada por la piruvato carboxilasa. Esta enzima contiene biotina, que en presencia de ATP y Mg2+ forma un intermediario covalente con el CO2 que se agrega luego como grupo carboxilo al piruvato, para formar oxaloacetato. Las carboxilasas de otras vas metablicas tambin requieren biotina y su mecanismo de accin es similar. El acetil-CoA es un efector alostrico positivo de la piruvato carboxilasa. PIRUVATO CARBOXILASA COOATP + HCO3- + C=O CH3 COOC=O + ADP + Pi CH2 COOOXALOACETATO

PIRUVATO

La piruvato carboxilasa se encuentra en altas concentraciones en el hgado y el tejido nervioso ya que estos tejidos tienen un constante eflujo de intermediarios. Como la mayora de las reacciones anaplerticas, esta reaccin forma parte de una va que intersecta al ciclo. En el hgado, es parte de la va gluconeognica que convierte alanina y lactato en glucosa. A partir de cidos grasos con nmero impar de C se obtiene propionil-CoA (ver reacciones de la -oxidacin). Este intermediario puede convertirse en succinil-CoA en una

reaccin anaplertica.
Propionil-CoA PropionilCoA

D-Metilmalonil-CoA

L-Metilmalonil-CoA

Succinil-CoA

23 Los aminocidos son otra fuente de intermediarios para el CAT. La va que convierte isoleucina, valina, metionina y otros compuestos en succinil-CoA es una ruta anaplertica importante. La mayor parte de los tejidos, incluidos cerebro, msculo esqueltico, y corazn degradan isoleucina y valina a succinil-CoA por esta ruta. En el hgado, el ciclo es parte de la va que convierte valina e isoleucina en glucosa, en el msculo esqueltico es parte de la va que los convierten en glutamina. La reaccin catalizada por la glutamato deshidrogenasa, que ya hemos mencionado, cataliza la conversin reversible de -cetoglutarato en glutamato y tambin es un buen ejemplo de reaccin anaplertica. En cambio la reaccin catalizada por la glutamato-oxaloacetato transaminasa no es una reaccin anaplertica. Por qu? Otra reaccin anaplertica es la catalizada por la enzima mlica (diferente de la enzima mlico deshidrogenasa) que convierte el piruvato en malato, consume NADPH y requiere del aporte de 1C como CO2. ENZIMA MALICA COON ADPH + H+ NADP+ HO COO C H

C=O + CO2 CH3

COO-

REGULACION DEL CICLO DE LOS ACIDOS TRICARBOXILICOS

La oxidacin del acetil-CoA y la conservacin de la energa en las coenzimas reducidas para la generacin de ATP son esenciales en todos los tejidos que contienen mitocondrias. La velocidad de utilizacin de ATP es, por lo tanto, la fuerza fisiolgica primaria impulsora del ciclo. Existen dos seales principales de la velocidad de utilizacin de ATP: a) el estado de fosforilacin de los nucletidos de adenina, que se refleja en los niveles de ATP y ADP, y b) el estado de reduccin del NAD+, reflejado en la relacin NADH/NAD+. Dentro de la clula y an dentro de la mitocondria, la suma de la concentracin de nucletidos de adenina (AMP, ADP y ATP) y la de NAD+ (NAD+ y NADH) son relativamente constantes. Sin embargo, la velocidad de interconversin de los nucletidos de adenina vara considerablemente como lo hace la velocidad de oxidacin y reduccin de las coenzimas. Por lo tanto, un aumento en la utilizacin de ATP resultara en una pequea disminucin en sus niveles y un aumento en la concentracin de ADP. Anlogamente, un aumento en la oxidacin de NADH por la cadena de transporte provocara un aumento en el contenido de NAD+ y una disminucin en el NADH.

24 Dado que las deshidrogenasas principales son dependientes del aporte continuo de NAD+ y de FAD, sus actividades son estrictamente controladas por la cadena respiratoria que es responsable de su oxidacin y que est obligatoriamente acoplada a la generacin de ATP. De este modo la actividad del ciclo es muy dependiente del control respiratorio, que a su vez est afectado por el aporte de ADP + Pi y de oxgeno. Un agente inhibitorio o una condicin metablica que interrumpa el aporte de oxgeno, el aporte continuo de ADP o la fuente de equivalentes de reduccin, anularn la actividad del ciclo. Este tipo de control se conoce como control grueso. Hay tambin un nmero de interacciones mediadas por efectores entre intermediarios, nucletidos y las enzimas del ciclo que pueden ejercer un control fino de su actividad. Los conceptos generales con respecto a los mecanismos de regulacin que se aplican a todas las vas metablicas pueden ser aplicados tambin en este caso. La regulacin de la velocidad de la va se da sobre las enzimas que catalizan los pasos limitantes de la velocidad, o sea los ms lentos. Se puede hacer una analoga considerando la velocidad promedio en una autopista cuando en alguna zona hay un bloqueo que slo deja libre un carril. En ese caso, el trnsito en esa zona se hace ms lento y esta disminucin de la velocidad se transmite hacia el principio de la autopista. Suponiendo que el lugar del bloqueo constituya la etapa limitante de la velocidad, una modificacin en el mismo, por ejemplo, la apertura de un nuevo carril para el trnsito, aumentar significativamente la velocidad global en la autopista. En forma semejante, la velocidad de toda una va metablica est determinada por la de la reaccin ms lenta y por lo tanto la regulacin de la actividad de la va ocurre principalmente a ese nivel. Otro de los conceptos generales que tambin se aplica aqu, es que las vas que deben mantener un nivel constante de un producto final, como el ATP se regulan por un feedback de ese producto o un metabolito relacionado. En este caso, ATP, ADP, NADH y NAD+ participan en la regulacin por feedback (o retroalimentacin). Dos de los principales sitios de regulacin del ciclo son la isocitrato deshidrogenasa y la -cetoglutarato deshidrogenasa. La capacidad de ambas enzimas es relativamente baja en condiciones fisiolgicas y por lo tanto constituyen los pasos limitantes. La isocitrato deshidrogenasa es una enzima oligomrica (formada por varias subunidades) activada alostricamente por ADP e inhibida por NADH. En ausencia de ADP exhibe cooperatividad positiva, cuando el isocitrato se une a la primera subunidad, las otras subunidades se convierten a una conformacin activa. En presencia de ADP cambia la conformacin de todas las subunidades de modo que el isocitrato se une ms rpidamente y el Km aparente cambia a un valor mucho menor. Por lo tanto, a la concentracin de isocitrato encontrada en la matriz mitocondrial, un

25 pequeo cambio en la concentracin de ADP puede producir un gran cambio de flujo. Pequeos cambios en la concentracin del producto NADH y del cosustrato NAD+ tambin afectan la velocidad de la enzima ms de lo que lo haran en una enzima no alostrica. La -cetoglutarato deshidrogenasa, aunque no es alostrica, es inhibida por los productos NADH y succinil-CoA. Por lo tanto, ambas enzimas responden directamente a cambios en el estado de fosforilacin o de reduccin. Ambas se activan por aumento en la concentracin de Ca2+ mitocondrial. En el msculo esqueltico en contraccin y posiblemente en otros tejidos musculares, la liberacin de Ca2+ del retculo sarcoplsmico y el aumento en la concentracin mitocondrial de Ca2+ durante la contraccin puede proveer una activacin adicional de estas enzimas cuando el ATP se est hidrolizando rpidamente. Ninguna de estas enzimas cataliza la primera reaccin del ciclo, y por lo tanto no afectan directamente la entrada del acetil-CoA. La citrato sintasa, es una enzima simple en tejidos de mamferos y no se regula alostricamente. Su velocidad se controla principalmente por la concentracin de citrato, el producto inhibidor y por la de oxaloacetato, su sustrato. Cuando la isocitrato deshidrogenasa se activa, la concentracin de citrato disminuye, liberando la inhibicin por producto y aumentando su velocidad. Dado que el equilibrio malato-oxaloacetato favorece al malato la concentracin de oxaloacetato es muy baja dentro de la mitocondria, por debajo del Km aparente para la citrato sintasa. Cuando la relacin NADH/NAD+ disminuye, la relacin de oxaloacetato/malato aumenta. El aumento en los niveles de oxaloacetato aumenta la velocidad de la reaccin de la citrato sintasa. En el hgado el cociente de las formas reducida a oxidada de esta coenzima determina si el acetil-CoA entra al ciclo o se utiliza para la sntesis de cuerpos cetnicos. Adems de lo ya mencionado, otros factores estn involucrados en la regulacin de la actividad del CAT. Por ejemplo, el aporte de sustratos como las unidades de acetilo que provienen del piruvato o de cidos grasos, es un factor crucial para determinar la velocidad del ciclo. Por lo tanto, la regulacin de la piruvato deshidrogenasa tendr un efecto importante en la velocidad del ciclo. De modo similar, cualquier mecanismo que regule los procesos de transporte y -oxidacin de cidos grasos ser un determinante efectivo de la actividad del ciclo. En conclusin la regulacin de la actividad del ciclo le permite a la clula adaptarse para afrontar diferentes situaciones metablicas, es decir, en aquellas donde se requiera una gran actividad para producir la oxidacin completa de molculas combustibles las enzimas funcionarn con su mxima capacidad y en aquellas donde el requerimiento sea menor, tambin disminuir la oxidacin del acetil-CoA que se desviar hacia la formacin de triacilglicridos que

26 se depositarn principalmente en el tejido adiposo. De este modo, el organismo logra mantener la homeostasis calrica a pesar de las variaciones en el aporte de combustibles y en su utilizacin. A modo de resumen,

Sistemas de lanzaderas o mecanismos de oxidacin del NADH citoslico

Como ya hemos dicho, tanto las enzimas del CAT como la cadena de transporte de electrones se localizan en la mitocondria. Tambin son mitocondriales las enzimas de la -

oxidacin y de otras vas oxidativas. Ahora bien, en estas vas, cuando se oxidan los sustratos, se reducen las coenzimas (NAD+, FAD). La cantidad de coenzimas dentro de la mitocondria y en general dentro de la clula es muy baja, por lo tanto para que la va metablica pueda continuar funcionando es necesario que se produzca su reoxidacin. Las coenzimas se reoxidan cediendo sus electrones a la cadena de transporte de electrones. Para las vas metablicas intramitocondriales esto es bastante sencillo porque las coenzimas se reducen y luego se reoxidan en la misma organela. Pero, qu ocurre con las coenzimas reducidas en el citosol? Un mecanismo de reoxidacin del NADH citoslico consiste en el transporte de los equivalentes de reduccin a la mitocondria por las lanzaderas del glicerol 3-fosfato o del malatoaspartato y finalmente al oxgeno a travs de la cadena de transporte de electrones (sistemas de lanzaderas).

27 La membrana mitocondrial interna es impermeable al NADH y no existen protenas transportadoras. Los equivalentes de reduccin (en forma de in hidruro) se transfieren por una reaccin rdox citoslica a un compuesto que tiene un transportador en la membrana mitocondrial interna. En ese paso inicial se regenera el NAD+ en el citosol. Los electrones se transfieren a la cadena donde se generan aproximadamente 1,5 moles de ATP por mol de NADH transportado por la lanzadera del glicerol 3-fosfato y 2,5 moles de ATP si la lanzadera es la del malato-aspartato.

Lanzadera del glicerol 3-fosfato Es la lanzadera predominante en el msculo esqueltico y en el cerebro. En el citosol, los electrones se transfieren del NADH a la dihidroxiacetona fosfato formando el glicerol 3-fosfato (catalizada por la glicerol 3-fosfato deshidrogenasa citoslica). Este compuesto se transporta a la membrana mitocondrial interna donde cede sus electrones a la glicerol fosfato deshidrogenasa que contiene FAD, la que a su vez los cede a la coenzima Q. Esta va, como otras que ceden sus electrones a la coenzima Q, genera aproximadamente 1,5 ATP por la transferencia de estos electrones al oxgeno. La dihidroxiacetona fosfato vuelve al citosol.

Lanzadera del malato-aspartato Es una lanzadera ms compleja que la anterior pero funciona en forma similar. Se regenera el NAD+ en el citosol por la reduccin del oxaloacetato a malato catalizada por la enzima malato deshidrogenasa citoslica. El malato es translocado por una protena transportadora (transporta malato y -cetoglutarato) a la matriz mitocondrial donde se regenera el NADH por la malato deshidrogenasa mitocondrial. La reoxidacin del NADH por esta va genera 2,5 moles de ATP por mol de NADH reoxidado. El oxaloacetato, que no puede atravesar la membrana mitocondrial interna es convertido a aspartato en la mitocondria (transaminacin).

28 El aspartato se trasloca (transportador de glutamato-aspartato) hacia el citosol donde es transaminado nuevamente a oxaloacetato. Esta lanzadera es la ms activa y funciona en el hgado y en el corazn. Los tejidos con mitocondrias poseen ambos sistemas de lanzaderas.

CUESTIONARIO DE CICLO DE KREBS

1) La malato deshidrogenasa mitocondrial cataliza una reaccin en la que, en condiciones estndar, la concentracin de sustratos es mayor que la de productos? Produce un compuesto de alta energa? Cataliza una reaccin anaplertica? Utiliza NADH como sustrato? 2) Cul de las enzimas del ciclo de Krebs (CAT) cataliza la sntesis de un compuesto de alta energa? 3) Relacione con flechas los intermediarios (de la columna de la izquierda) con sus posibles productos biosintticos (columna de la derecha) Alfa-cetoglutarato Succinil CoA Cis-aconitato Piruvato citrato ninguno grupo hemo glutamato cidos grasos oxaloacetato

4) Con respecto a la reaccin que cataliza la enzima alfa-cetoglutarato deshidrogenasa responda: cataliza una reaccin en la que, en condiciones estndar, la concentracin del producto es menor que la del sustrato? el producto de la reaccin es sustrato de la fumarasa? cataliza una reaccin anaplertica? utiliza pirofosfato de tiamina como cofactor? 5) Con respecto a la lanzadera del glicerol 3-fosfato responda: en qu compartimiento se reducen la dihidroxiacetona fosfato y el NAD+? en la mitocondria se oxida el FAD y se reduce el glicerol 3 P? Cul es el balance neto de la transferencia de NADH del citosol a la mitocondria? Escriba la reaccin e indique cunto ATP se genera por cada NADH transferido. 6) Indique la secuencia de eventos que ocurre en la reaccin catalizada por la piruvato deshidrogenasa, las coenzimas intervinientes y la composicin del complejo enzimtico. De dnde proviene el sustrato? 7) Nombre los compuestos del ciclo de Krebs que tiene 4C, 5C y 6C 8) Aunque el O2 no participa directamente en las reacciones del ciclo de Krebs, ste slo funciona en condiciones aerbicas. Por qu? 9) Responda con respecto a la actividad de enzima alfa-cetoglutarato deshidrogenasa: en qu direccin ocurrir la reaccin en condiciones estndar? El producto de esta reaccin, de qu reaccin es sustrato? Cataliza una reaccin anaplertica? Utiliza pirofosfato de tiamina como cofactor? 10) Decriba la lanzadera de malato-aspartato e indique: Cul es su funcin? Qu procesos se producen en el citosol y cuales en la mitocondria? Cul es el balance energtico?

11) Cul de las enzimas del ciclo de Krebs cataliza la transformacin de un sustrato en un producto con menor nmero de C? 12) En cul de las reacciones de oxidacin del ciclo de Krebs NO se utiliza NAD + como sustrato? 13) Nombre 3 reacciones anaplerticas e indique su funcin? Por qu no se considera la reaccin catalizada por la glutamato-oxaloacetato transaminasa como una reaccin anaplertica? 14) Explique la regulacin de la actividad del complejo de la Piruvato Deshidrogenasa indicando el efecto de: a) relacin de coenzimas NADH/NAD, b) relacin ATP/ADP, c) niveles de Ca2+, c) relacin CoA-SH/acetil-CoA. Explique el efecto de la fosforilacin/defosforilacin en la actividad del complejo e indique las enzimas que lo catalizan. 15) Qu caracterstica tiene la enzima que cataliza la sntesis de oxalacetato del resto de las enzimas del ciclo de Krebs? 16) Explique cmo se regula la actividad del CAT e indique las principales reacciones regulables y los mecanismos de regulacin involucrados. 17) Indique el balance energtico de la oxidacin de 1 mol de Acetil-CoA en el CAT. 18) Cules son las fuentes de acetil CoA del CAT? Indique las vas metablicas involucradas. 19) Indique 3 compuestos que puedan sintetizarse a partir de intermediarios del CAT (nombre los compuestos y los intermediarios) 20) Se puede sintetizar glucosa a partir de acetil-CoA? Por qu?