EXTRACCIN DEL ADN Introduccin

La extraccin de ADN consta de una etapa de lisis, que consiste en romper las estructuras que confinan el citoplasma y liberar al medio su contenido y otra de purificacin, que implica la retirada de la solucin final de la mayora de elementos que pueden interferir en la PCR. La extraccin del ADN de las clulas o virus donde se halla confinado es un paso previo en muchos procedimientos analticos y diagnsticos. Etapas en la extraccin de ADN Los pasos necesarios para una correcta extraccin y purificacin del ADN mediante un procedimiento qumico son: 1. Lisis de las clulas o virus. Las sales caotrpicas ayudan a romper la estructura tridimensional de macromolculas como las protenas o los cidos nucleicos consiguiendo su desnaturalizacin. La adicin de un detergente como el SDS es necesaria a menudo para eliminar las membranas. 2. Degradacin de la fraccin proteica asociada al ADN. Se consigue mediante la adicin de una proteasa. La fraccin proteica puede precipitarse mejor con la ayuda de sales como el acetato de amonio o el acetato sdico. 3. Purificacin. Consta de 3 fases: Precipitacin del ADN. El ADN es insoluble en alcohol, por lo que se puede precipitar etanol fro o isopropanol i recuperar mediante una centrifugacin. El alcohol del sobrenadante se llevar las sales aadidas previamente. Lavado del pellet. Se realiza con alcohol fro volviendo a centrifugarse Recuperacin. El sedimento se puede resuspender en agua o tampn Tris tras ser secado completamente. La confirmacin de la presencia de ADN se lleva a cabo mediante electroforesis en un gel de agarosa i posterior tincin con bromuro de etidio y observacin con luz UV o directamente al espectrofotmetro mediante espectro de absorcin de 200 a 350 nm. El ADN purificado se puede cuantificar con un espectrofluormetro mediante el uso de fluorforos especficos (Picogreen, Molecular Probes) El paso 3 puede realizarse con la ayuda de minicolumnas equipadas con una membrana de slica que retiene especficamente el ADN permitiendo el paso de las molculas y sales que acompaan la reaccin de lisis. Finalmente se lava con alcohol y se eluye el contenido Inhibidores de la PCR Se trata de substancias que interfieren con las ADN polimerasas termoestables ya sea mediante el bloqueo directo total o parcial de su actividad cataltica o mediante la unin directa al ADN de doble cadena. Por ejemplo, algunas substancias interaccionan con los iones Mg2+ (un cofactor crtico de la actividad cataltica) o disminuyen su disponibilidad pudiendo inhibir la PCR. En la tabla 1 se recogen algunas de las principales substancias inhibidoras conocidas. Otra importante fuente de inhibicin son los propios reactivos que se usan en el proceso de extraccin de ADN, como por ejemplo, el exceso de KCl, NaCl y otras sales, detergentes inicos, etanol e isopropanol, fenol y otros.

METODOS DE EXTRACCION
FENOL CLOROFORMO
Tcnica organica (solventes) Adn de muy buena calidad y cantidad pptidos y protenas son extraidas en la fase organica (FENOL), despus se realiza digestin con PROTEINA K - El cloroformo permite que todo el fenol pueda ser salvado DESVENTAJAS: + reactivos altamente toxicos. + perdidas significativas de ADN y mucho mas si esta degradado.

CHELEX
Tcnica inorgnica Previene la deradacion de ADN por quelacion de los iones metlicos durante la ebullicin al 5 %. - Tiene polmeros de estireno dibenzeno iones iminodiacetato - Lo sreactivos no son toxicos y no se pierde ADN DESVENTAJAS: + el ADN aislado es de cadena sencilla, utilizado en PCR pero no en RFLPS.

SALTING OUT
- Tcnica inorgnica utiliza reactivos bajos en toxicidad - Permite visualizar la malla de ADN DESVENTAJAS: + requiere una mayor cantidad de muestra PASOS: 1. Lisis celular: o Buffer de Lisis I : (lisis globulos rojos) o Sucrosa o MgCl2 1M o Triton x100 o Buffer de lisis II : (lisis de globulos blancos) o EDTA de Na o NaCl 2. Extraccin: o Lauril sulfato de sodio al 10 %: despolariza las protenas o Perclorato de sodio 5M o NaCl 6M 3. Precipitacin: o Isopropanol o Etanol al 70 % lava el exceso de sales 4. Resuspencin: o Se realiza el buffer T.E. (Tris EDTA) o tambin se puede realizar en agua