UNIVERSIDAD AUTNOMA DE CHIAPAS

CenBio CENTRO DE BIOCIENCIAS LICENCIATURA DE INGENIERO BIOTECNOLOGO

UNACH

Ttulo del protocolo de investigacin

Transformacin de un simbionte de Triatoma dimidiata con el homlogo de la protena de unin a grupos hemo de Rhodnius prolixus

Que presenta Zaira Marisa Velzquez Magdaleno

INTRODUCCIN
La Tripanosomiasis Americana o enfermedad de Chagas es causada por el parsito Trypanosoma cruzi; se puede contraer por picaduras de chinches, infeccin congnita, transfusin sangunea o trasplante de rganos de un donante infectado, por transmisin oral o accidente de laboratorio (WHO, 2002).

Esta enfermedad presenta dos fases sucesivas: aguda y crnica; la primera dura de 6 a 8 semanas. Una vez que esta etapa pasa, la mayora de las personas infectadas presentan buena salud y junto con el diagnstico clnico actual no se detecta ninguna lesin orgnica (WHO, 2002).

La fase crnica de la enfermedad de Chagas en la que no se detectan signos clnicos recibe el nombre de forma indeterminada y en la mayora de los pacientes persiste de por

vida. En esta etapa la infeccin solo se puede detectar mediante pruebas serolgicas o parasitolgicas. (WHO, 2002).

Sin embargo, varios aos despus del inicio de la fase crnica, aproximadamente 30% de las personas infectadas, segn la zona geogrfica, manifiestan lesiones en diversos rganos; principalmente en el corazn y el aparato digestivo. Estos signos son indicados a travs de exmenes mdicos y reciben el nombre de forma cardiaca o digestiva de la fase crnica de la enfermedad de Chagas. La fase crnica se extiende a lo largo del resto de la vida de las personas (WHO, 2002).

Los vectores, quienes son portadores y hospederos del parasito Trypanosoma cruzi, son insectos triatominos hematfagos que se alimentan de sangre (Reyes-Novelo et. al. 2011). Estos insectos conforman 141 especies agrupadas en 18 gneros que forman 6 tribus y ms de la mitad de ellos son infectados naturalmente con T. cruzi. (Dorn et al. 2009).

De esta subfamilia Triatominae, los vectores ms importantes epidemiolgicamente son: Triatoma infestans, Rhodnius prolixus y Triatoma dimidiata. Triatoma infestans es actualmente el principal vector en la parte meridional de Amrica del Sur, incluidas las regiones del norte de Argentina, Bolivia, Paraguay y el sur del Per. Rhodnius prolixus por el contrario se distribuye en el norte de Amrica del Sur (principalmente en Colombia y Venezuela) y tiene pocos focos en Amrica Central. Y Triatoma dimidiata, est presente en Amrica Central y Mxico, y tambin tiene limitados focos en el norte de Sudamrica (Avila et al. 2011). El control de esta especie es difcil debido principalmente a su

capacidad de reinfestar las casas tratadas (Panzera et al. 2006).

En Mxico han sido reportadas por lo menos 31 especies de triatominos de los cuales 18 se han encontrado con infeccin natural por T. cruzi. Todas estas especies, con excepcin de Triatoma dimidiata, son endmicas de Mxico (Brenire et al. 2010).

Existen programas de control que utilizan como principal mtodo el rociamiento intradomiciliar de insecticidas; los inconvenientes de este control son la sostenibilidad del mtodo, que est limitado por la necesidad de repetir los rociados y por la resistencia que podran desarrollar los triatominos (Schofield et al. 2006).

Una alternativa al control qumico, que adems es altamente txico para el ambiente, es el control gentico de los vectores, es decir, la modificacin de los insectos transmisores para hacerlos menos capaces de sostener el desarrollo de los parsitos (Terenius et al., 2008).

Desde algn tiempo se encuentran bajo estudio los simbiontes que forman parte de la microbiota del intestino de los triatominos, a travs de ensayos como los siguientes: la transformacin gentica de la microbiota nativa de estos vectores, mediante molculas que interfieran con la transmisin del patgeno y as modular la capacidad de los insectos para transmitir el parsito (Durvasula et al. 2011).

Tambin se investigan las interacciones de estos organismos simbiontes con el parsito T. cruzi, su implicacin en la transmisin de la enfermedad y la implementacin de estos organismos como una forma indirecta de tipificacin de algunos triatominos que presentan dificultad en su identificacin y diferenciacin correcta; adems de contribuir como un instrumento para el estudio de su filogenia (Azambuja et al. 2004).

La primera bacteria simbionte que se encontr en triatominos fue Rhodococcus rhodnii en Rhodnius prolixus. Estudios subsecuentes en Triatoma infestans, T. srdida y en Panstrongylus megistus hallaron especies de actinomicetos como simbiontes; los cuales son Nocardia sp., Gordonia sp. y Rhodococcus sp., respectivamente (Eichler et al. 2002).

El vector de la familia Reduviidae, Rhodnius prolixus mantiene una simbiosis con el actinomiceto Rhodoccus rhodnii que reside extracelularmente en el lumen del intestino del insecto (Durvasula et al. 2008). Este microbio se transmite eficazmente de los triatominos adultos a su progenie a travs de la coprofagia, la ingestin de materia fecal de otros insectos. El papel de R. rhodnii es vital en el crecimiento y desarrollo de R. prolixus. Y a travs de la modificacin gentica de la bacteria simbitica R. rhodnii se ha expresado el pptido anti-parasitario cecropina A (Durvasula et al. 2008).

Adems se ha aislado una amplia variedad de bacterias, incluyendo Nocardia, Corynebacteria y Estreptococos del intestino medio de Triatoma infestans. Estos

organismos proveen al insecto nutrimentos esenciales como el cido pantotnico a las ninfas que son tiles para su desarrollo y supervivencia (Durvasula et al. 2011).

Por otra parte se efectu un ensayo, donde se llevo acabo una transformacin de un microorganismo Corynebacterium, que logro expresar un anticuerpo de cadena sencilla inmunolgica activa denominada rDB3 (Durvasula et al. 2011).

A pesar de que el insecto Triatoma dimidiata es una de las 3 especies epidemiolgicamente ms importantes (Avila et al. 2011), hasta el momento no se han reportado estudios que describan a los simbiontes de T. dimidiata y si estos organismos simbiontes podran expresar una molcula externa.

Dado que existen ensayos sobre simbiontes de insectos del mismo gnero, los microoganismos simbiontes de Triatoma dimidiata podran ser factibles para expresar molculas externas.

Objetivo General: Determinar la expresin de la protena homologa RHBP de Rhodnius prolixus en un simbionte de Triatoma dimidiata. Objetivos especficos: Validar la transformacin del simbionte con el gen homlogo de RHBP de Triatoma dimidiata. Analizar la estructura primaria del homlogo de la protena RHBP en Triatoma dimidiata Caracterizar la expresin del gen homlogo en varios tiempos despus de la alimentacin. Hiptesis: Es factible la expresin del gen de la protena homologa de RHBP en la bacteria simbionte de Triatoma dimidiata.

DISEO DE INVESTIGACIN
~*El proyecto constar de tres fases principalmente: El anlisis in silico que ser paralelo a la recoleccin de muestras; en la segunda fase se llevar a cabo una Retrotranscripcin, para la clonacin y secuenciacin del homlogo de la protena RHBP; y finalmente se realizar el aislamiento y transformacin de una bacteria simbionte de Triatoma dimidiata, donde adems se verificar la expresin del gen introducido.*~

Para conocer en qu momento se expresa el homlogo de la protena RHBP de Rhodnius prolixus, una vez que transcurran los perodos de tiempo establecidos de alimentacin, se realizarn extracciones de ARNm del cuerpo graso del insecto, utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen).

Posteriormente se llevar a cabo una Retro-transcripcin del ARNm extrado empleando como iniciadores una mezcla de hexanucleotidos de cadena sencilla con grupos hidroxilo en sus extremos 5- y 3- (primers al azar). A continuacin se amplificar por PCR (Reaccin en Cadena de la Polimerasa) la cadena sencilla de ADNc (ADN complementario) para obtener una doble cadena de ADNc. Los primers que sern utilizados, se obtendrn a partir de un anlisis in silico, empleando la secuencia del gen de la protena RHBP de Rhodnius prolixus en txBLAST para el diseo de cebadores TdRHBP.

Una vez que se obtenga la doble cadena de ADNc, se enviar a secuenciar y con los resultados se realizar una anlisis in silico en BLAST para identificar y analizar la secuencia del gen homlogo de la protena RHBP de Rhodnius prolixus en Triatoma dimidiata. Se localizarn los aminocidos importantes para la funcin y se determinarn porcentajes de identidad y homologa entre las dos especies.

El fragmento de ADNc de doble cadena se introducir a un plsmido: pCR 2.1, por medio de extremos cohesivos A y T. Este plsmido que contiene el ADNc del homlogo de la protena RHBP, se emplear para transformar a una bacteria simbionte del intestino de Triatoma dimidiata cuya identidad ser determinada por la amplificacin y secuenciacin del gen que codifica para el RNA ribosomal 16S, mismo que se comparar con las bases

de datos existentes para bacterias. Se verificar si el ADNc se expresa dentro de la bacteria, por medio de una RT-PCR con los iniciadores especficos de la secuencia, ya descritos. BIBLIOGRAFA

a)

Avila, M.L., V. Tekiel, G. Moretti, S. Nicosia, J. Bua, E. M. Lammel, M. M. Stroppa,

N. M. Gerez de Burgos, D.O. Sanchez. 2011. Gene discovery in Triatoma infestans. Parasites & Vectores. 4:39. b) Azambuja, P., D. Feder, E.S. Garcia. 2004. Isolation of Serratia marcescens in the

midgut of Rhodnius prolixus: impact on the establishment of the parasite Trypanosoma cruzi in the vector. Experimental Parasitology 107: 89-96. c) Brenire, S.F., MF. Bosseno, E. Magallon G., M.M. Soto G., M. J. Kasten M., J. H.

Barraza S., J. J. Romero P., and F. J. Lozano K. 2010. Community Participation and Domiciliary Occurrence of Infected Meccus longipennis in Two Mexican Villages in Jalisco State. The American Society of Tropical Medicine and Hygiene 83 (2): 382-387. d) Dorn, P.L., C. Calderon, S. Melgar, B. Moguel, E. Solorzano, E. Dumonteil, A.

Rodas, N. De la Rua, R. Garnica, C. Monroy. 2009. Two Distinct Triatoma dimidiata (Latreille, 1811) Taxa Are Found in Sympatry in Guatemala and Mexico. PLOS Neglected Tropical Diseases. Vol 3: 1-13. e) Durvasula, R. V., R.K. Sundaram, P. Kirsch, I. Hurwitz, C. V. Crawford, E. Dotson,

and C.B. Beard. 2008. Genetic transformation of a Corynebacterial symbiont from the Chagas disease vector Triatoma infestans. Exp Parasitol 119 (1): 94-98. f) Durvasula, R., I. Hurwitz, F. Annabeth, A. Lee, H. Heidi, K. Nichole, K. Agray. 2011.

Paratransgenic control of Vector Bone Diseases. International Journal of Biological Sciences. 7(9):1334-1344. g) Eichler S., G. A. Schaub. 2002. Development of Symbionts in Triatomine Bugs and

the Effects of infections with Trypanosomatids. Experimental Parasitology 100: 17-27. h) Organizacin Mundial de la Salud. 2002. CONTROL DE LA ENFERMEDAD DE

CHAGAS, SEGUNDO INFORME DEL COMIT DE EXPERTOS DE LA OMS (OMS SERIES DE INFORMES TCNICOS 905). Comit de Expertos de la OMS en Control de la Enfermedad de Chagas. Organizacin Mundial de la Salud. Printed in Singapur. ( i.e., pp: 3-10).

i)

Panzera, F., I. Ferrandis, J. Ramsey, R. Ordoez,P.M. Salazar-Schettino, M.

Cabrera, M.C. Monroy, M.D. Bargues, S. Mas-Coma, J.E. OConnor, V.M. Angulo, N. Jaramillo, C. Cordn-Rosales, D. Gmez, R. Prez. 2006. Chromosomal variation and genome size support existence of cryptic species of Triatoma dimidiata with different epidemiological importance as Chagas disease vectors. Tropical Medicine and International Health 2: 1092-1103. j) Reyes-Novelo, E., H.A. Ruiz P., J. Escobedo O., M.A. Barrera P. 2011. Biologa y

ecologa de Triatoma dimidata (Latreille, 1811), algunos aspectos de estudio. Dugesiana 18 (1): 11-16. k) Schofield, C.J., J. Jannin, R. Salvatella. 2006. The future of Chagas disease

control. Trends Parasitol. 22: 583-588.