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Quim. Nova, Vol. XY, No.

00, 1-5, 200_ ESTUDO DO COMPORTAMENTO DA LIPASE COMERCIAL LIPOZYME RM IM EM REAES DE ESTERIFICAO PARA OBTENO DE BIODIESEL

Erika C. G. Aguieiras* Instituto de Qumica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Av. Athos da Silveira Ramos, 149, 21949-909 Rio de Janeiro RJ, Brasil Susana L. Souza e Marta A. P. Langone Instituto de Qumica, Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Rua So Francisco Xavier, 524, 20550-013 Rio de Janeiro RJ, Brasil Recebido em 14/6/12; aceito em 29/11/12; publicado na web em 28/2/13

A r t i g o
s I N
A t A C o
* e

c u

STUDY OF IMMOBILIZED LIPASE LIPOZYME RM IM IN ESTERIFICATION REACTIONS FOR BIODIESEL SYNTHESIS. The aim of this work was to study monoalkyl ester synthesis catalyzed by immobilized lipase Lipozyme RM IM via the esterification reaction. Yields of over 90% were obtained with butanol in esterification reactions with oleic acid. In the reactions with deodorizer distillates of vegetable oils and butanol, the conversion obtained was greater than 80% after 2.5 h. For the esterification reaction of palm fatty acid deodorizer distillate (PFAD) and butanol, seven reuse cycles of Lipozyme RM IM were carried out and the final conversion was 42% lower than the initial conversion. Keywords: lipase; monoalkyl esters; biodiesel.

utilizao de uma matria-prima barata, agrega valor ao resduo e possibilita produzir biodiesel atravs de uma tecnologia limpa e ambientalmente compatvel.
Esse trabalho teve como objetivo investigar a sntese enzim-tica de steres monoalqulicos a partir de reaes de esterificao entre os destilados de desodorizao dos leos de soja (DDOS) e de palma (DDOP) com alcois de

c curta. As matrias-primas a utilizadas foram escolhidas d por se tratarem de resduos de e grande disponibilidade no ipas, uma vez que o Brasil se a encontra entre os maiores produtores mundiais de leo

de soja e de palma. Alm disso, o comportamento da lipase comercial empregada, Lipozyme RM IM, frente a alguns parmetros reacionais, como seletividade em relao

Aguieiras et al.

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esterificao com os cidos palmtico e oleico foram ao lcool e aos cidos graxos predominantes no DDOS e no DDOP e investigados empregando-se concentrao de biocatalisador, tambm foi avaliado. A influncia do razo estequiomtrica dos tamanho da cadeia do lcool na estabilidade da lipase foi investigada reagentes (razo molar a partir da reutilizao do biocatalisador em reaes de esterificao entre os alcois etanol e butanol com os cidos oleico e palmtico e com os subprodutos DDOS e DDOP. PARTE EXPERIMENTAL Materiais
O destilado de desodorizao do leo de soja (DDOS) e o des-tilado de desodorizao do leo de palma (DDOP), provenientes do refino destes leos, foram cedidos pela Piraqu S.A. (Brasil). A lipase comercial Lipozyme RM IM (lipase 1,3 especfica de Mucor miehei, imobilizada em resina de troca inica) foi gentilmente doada pela Novozymes Latin America Ltda. (Araucria, PR, Brasil). A atividade de esterificao da enzima foi de 1909 mol de cido/min g de enzima, determinada de acordo com o mtodo descrito em Corra et al..13 cido oleico extra puro, cido palmtico P.A., butanol P.A., hexano P.A. e etanol P.A. foram obtidos da Merck (SP, Brasil). Hidrxido de sdio P.A., cido esterico puro e acetona P.A. foram obtidos da Vetec Qumica Fina Ltda. (Rio de Janeiro, Brasil).

cido graxo/lcool = 1). As reaes com cido oleico foram condu-zidas a 40 C e com cido palmtico a 70 C.O acompanhamento das reaes foi feito por cromatografia em fase gasosa. Reutilizao da lipase Lipozyme RM IM
As reaes de reutilizao da lipase comercial Lipozyme RM IM foram conduzidas com teor de lipase de 3% (m/m), razo estequiomtrica dos reagentes (razo molar cido graxo/lcool = 1), a 40 ou a 70 C para os cidos oleico e palmtico, respectivamente. Ao trmino de cada batelada, a enzima foi inicialmente separada do meio reacional por decantao, lavada com 10 mL de hexano e filtrada a vcuo. A enzima recuperada foi mantida em dessecador durante 24 h para secagem e, ento, reutilizada em uma nova reao em batelada.

Caracterizao dos subprodutos DDOS e DDOP A caracterizao das matrias-primas foi feita de acordo com as metodologias oficiais da AOCS.14 A determinao da acidez e do ndice de acidez foi realizada de acordo com o mtodo Te 1a-64. As anlises de ndice de iodo e de umidade foram feitas conforme os mtodos Cd 1d-92 e Ca 2e-84, respectivamente. A anlise da composio qumica em cidos graxos presentes nos subprotudos DDOS e DDOP foi realizada por cromatografia em fase gasosa segundo o mtodo Ce 1f-96, utilizando um cromatgrafo 6890N a gs com detector tipo ionizao de chama (FID) e coluna capilar SP 2340 (60 m x 0,25 mm de interno). Reao de esterificao
As reaes de esterificao foram conduzidas em reator batelada fechado, com capacidade de 15 mL, provido de condensador e de agitao magntica. O sistema reacional consistiu na mistura dos reagentes e da enzima imobilizada. A temperatura do meio reacional foi mantida constante atravs da circulao de etileno glicol pela camisa do reator. O progresso das reaes foi acompanhado atravs de titulometria de neutralizao ou cromatografia em fase gasosa.

Reao de esterificao com o destilado de desodorizao do leo vegetal (DDOS e DDOP) Efeitos do tipo de lcool
As reaes de esterificao para sntese de biodiesel foram conduzidas com 1,75 g de etanol ou 2,63 g de butanol adicionados de forma escalonada (0 e 30 min), 8 g de DDOS ou DDOP, a 50 e 60 C, respectivamente. O teor de Lipozyme RM IM empregado foi de 3% (m/m). O acompanhamento das reaes foi feito por titulometria de neutralizao para determinao do consumo de cidos graxos no meio.

Reao de esterificao com os cidos graxos puros Efeitos do tipo de cido graxo
As reaes de esterificao entre os cidos graxos (cido oleico, cido esterico, cido palmtico) e etanol foram conduzidas a 80 C para completa fuso dos cidos saturados, com teor de lipase de 3% (m/m), na razo molar dos reagentes igual a 1 e com o etanol adicionado em trs etapas (0, 30 e 60 min). O acompanhamento das reaes foi feito por titulometria de neutralizao para determinao do consumo de cidos graxos no meio.

Efeitos do tipo de lcool e da concentrao de biocatalisador Os efeitos da concentrao de Lipozyme RM IM (1,5; 3; 5; 7 e 9 %m/m) e do tipo de lcool (etanol e butanol) nas reaes de

Reutilizao da lipase Lipozyme RM IM As reaes de reutilizao da lipase comercial Lipozyme RM IM na esterificao dos cidos graxos livres presentes no DDOS e DDOP foram conduzidas com 8 g de DDO, adio do lcool em 2 etapas (t = 0 e 30 min), 3% (m/m) de Lipozyme RM IM a 50 e 60 C para DDOS e DDOP, respectivamente. Aps cada reao em batelada, a lipase foi recuperada do meio reacional,

lavada com 10 mL de hexano e filtrada a vcuo. A enzima recuperada mtico com os alcois etanol e foi mantida em dessecador durante 24 h para secagem e, ento, butanol foi acompanhado por reutilizada em uma nova reao em batelada. croma-tografia gasosa a partir da anlise de amostras do meio Titulometria de neutralizao reacional (20 mL, em duplicata) coletadas ao longo do processo. O progresso das reaes de produo de biodiesel a partir de DDOS e A quantificao foi realizada DDOP foi acompanhado a partir da quantificao dos cidos graxos livres em cromatgrafo a gs Varian, presentes no meio reacional. Alquotas de 100 L do meio reacional, em modelo CP 3380, equi-pado duplicata, foram dissolvidas em 40 mL de acetona/etanol 1:2 e tituladas com detector de ionizao de contra uma soluo de NaOH a 0,02 mol L -1, empregando-se tituladorchama (FID) e coluna capilar CP WAX 52 CB de 30 m x 0,25 automtico Mettler modelo DL25. mm x 0,25 m a partir da Anlise cromatogrfica metodologia descrita por Vieira et al..15 O progresso das reaes de esterificao dos cidos oleico e pal-

RESULTADOS E DISCUSSO Caracterizao dos subprodutos DDOS e DDOP


Os resultados de composio qumica em relao aos resduos de cidos graxos presentes nas matrias-primas utilizadas esto apre-sentados na Tabela 1. No DDOS, pode ser observada predominncia

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monoalqulicos a partir de reaes de esterificao. O dos cidos oleico (24%), palmtico (31%) e esterico (24%). J no ndice de iodo, indicativo do DDOP foi observado um maior percentual de cido palmtico (46%), grau de insaturao nas seguido dos cidos oleico (37%) e linoleico (9%). molculas, apresentou valores similares para ambas as Tabela 1. Composio em cido graxos do DDOS e DDOP matrias-primas. reconhecido DDOS DDOP que, quanto maior for o grau de cido graxo (%) (%) insaturao do biodiesel, menor cido caprlico (C8) ser a sua estabilidade cido cprico (C10) 0,1 0,1 oxidativa, acarretando em cido lurico (C12) 0,1 0,3 polimerizao e formao de cido mirstico (C14) 0,7 0,9 depsitos de goma, o que 31 46 cido palmtico (C16) prejudica as aplicaes cido palmitoleico (C16:1) 0,2 0,3 industriais do biocombustvel.16 24 cido esterico (C18) 6 Entretanto, cabe ressaltar que, 24 37 cido oleico (C18:1) de acordo com a resoluo n 14 9 cido linoleico (C18:2) 6 da ANP, de 11/05/2012, no cido linolnico (C18:3) 0,3 0,3 cido araqudico (C20) 0,4 0,3 existe um limite de ndice de cido gadoleico (C20:1) 0,1 iodo mximo especificado.
cido be-hnico (C22) cido lignocrico (C24) Outros cidos graxos cidos graxos saturados cidos graxos monoinsaturados cidos graxos poli-insaturados Total ismero trans

est presente no meio. Os resultados obtidos mostram que ambas as matrias-primas apresentaram baixos teores de gua (inferiores a 1%), o que interessante para aplicao em reaes de esterificao.

Efeitos do tipo de cido graxo Tendo em vista a composio dos subprodutos DDOS e DDOP, o efeito do tipo de cido graxo foi avaliado em reaes de esterifi-cao entre os cidos graxos de maior predominncia nos destilados de desodorizao (oleico C18:1, palmtico C16 e esterico C18) e etanol. Os resultados esto apresentados na Figura 1, onde possvel observar que a lipase Lipozyme RM IM exibiu preferncia pelo cido graxo insaturado (69% de converso). A converso dos cidos graxos saturados foi praticamente igual (44 e 46% para os cidos palmtico e esterico, respectivamente).

O teor de gua na matriaprima desempenha papel importante em reaes de esterificao catalisadas por lpases, uma vez que essas enzimas requerem uma interface leo-gua para que ocorram as mudanas conformacionais da De acordo com os resultados obtidos, as matrias-primas utilizadas molcula necessrias para a expoapresentam composio de cidos graxos interessante para a obteno de sio e reestruturao do stio

0,3 1 56 24 7 12

0,1 53 37 10 0,2

steres monoalqulicos para aplicao como biodiesel, com pre-sena deativo.17 Por outro lado, um cidos graxos saturados e monoinsaturados em propores equilibradas, como excesso de gua no meio pode observado pela anlise de composio qumica. promover a reao reversa de

Os resultados das anlises de determinao da acidez, do ndice hidrlise dos produtos formados. de acidez, do ndice de iodo e da umidade no DDOS e DDOP estoNo caso das reaes de sntese de apresentados na Tabela 2. biodiesel a partir de matriasTabela 2. Anlise fsico-qumica do DDOS e DDOP Anlise Acidez (% cido oleico) ndice de acidez (mg KOH/g amostra) ndice de iodo (% do iodo absorvido) Umidade (% m/m) DDOS 72,6 144,4 58,8 0,17 DDOP 96,3 191,5 63,8 0,70

primas com altos teores de cidos graxos livres, as taxas de converso so favorecidas quando um menor teor de gua

Figura 1. Efeito do tipo de cido graxo na converso em steres aps 2,5 h de reao dos cidos graxos com etanol, adicionado em trs etapas (0,46 g a cada 30 min), razo

Pode ser observado que ambos, DDOS e DDOP, apresentaram acidez elevada, podendo ser utilizados para obteno de steres

estequiomtrica dos reagentes (R = 1), a 80 C, com 3% (m/m) de lipase. de reao os rendimentos obtidos Converso determinada por titulometria de neutralizao foram prximos. Dessa forma, o

aumento no teor de Lipozyme RM IM no justificaria o emprego dessa grande quantidade de lipase. Para os steres de cido Os cidos oleico e palmtico foram escolhidos para o estudo do palmtico, o aumento da comportamento da lipase Lipozyme RM IM frente a alguns parme-tros concentrao de lipase de 3 para reacionais por serem os cidos predominantes nas matrias-pri-mas 9% (m/m) promoveu aumento de (DDOS e DDOP). Os alcois selecionados foram etanol, devido sua apenas 5% no rendimento aps 2 obteno a partir da biomassa e sua ampla disponibilidade no Brasil, e h de reao. Com relao ao tipo butanol, por ser menos polar e promover menor desativao da enzima de lcool, observou-se que as durante a reao de sntese dos steres alqulicos. 6,8,18 menores converses foram Como mostrado na Figura 2, o efeito da concentrao de enzima obtidas nas reaes com cido sobre o rendimento foi positivo para as snteses dos steres de cido palmtico e etanol, o que pode ser oleico, como esperado. Embora o aumento da concentrao de 3 para 9% atribudo aos efeitos sinrgicos da (m/m) tenha promovido aumento nas taxas iniciais das reaes, aps 2 h maior temperatura (70 C) e do

Reaes de esterificao entre os cidos oleico e palmtico: efeitos do tipo de lcool e da concentrao de biocatalisador

lcool mais polar sobre o biocatalisador. A concentrao de 3% (m/m) foi escolhida para os ensaios posteriores de reutilizao da enzima.

Reutilizao da lipase nas reaes com cido oleico ou palmti-co com etanol ou butanol
Considerando-se que uma das grandes desvantagens da catlise enzimtica o custo do biocatalisador, a reutilizao da Lipozyme

Aguieiras et al.

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enzima do seu suporte, aps usos repetidos. Reaes de esterificao com DDOS ou DDOP e etanol ou butanol
A lipase comercial Lipozyme RM IM foi utilizada em reaes de esterificao dos cidos graxos presentes nos DDOs com os alcois etanol e butanol. Baseado em resultados de trabalhos anteriores, o lcool foi adicionado no meio em etapas para evitar os efeitos de desativao do mesmo sobre a enzima.9 Os resultados foram expres-sos em termos de converso dos cidos graxos livres e, de acordo com os dados apresentados na Figura 4, pode-se observar que as curvas de converso dos cidos graxos com o tempo apresentaram perfis semelhantes para os substratos utilizados como matria-prima. Quando o lcool utilizado foi butanol foram obtidas converses de 82 e 76% para DDOP e DDOS, respectivamente. Cabe ressaltar que as converses foram obtidas em tempos curtos de reao (2,5 h). O emprego de etanol promoveu menores converses (63%) para ambas as matrias-primas, resultados similares aos obtidos por Souza et al.9 e Corra et al..13

da enzima devido aos efeitos combinados da exposio ao etanol e alta temperatura (70 C). Watanabe et al.21 investigaram a reao de esterificao de cidos graxos presentes no leo residual de atum com metanol empregando Novozym 435 como catalisador. Aps 4 reutilizaes da enzima, foram obtidas redues maiores nas converses a 50 C em s atingidas nas Figura 2. Efeito da concentrao de Lipozyme RM IM no rendimento em ster aps relao 2 h de reao na sntese de oleato de butila e de etila (a 40 C) e de palmitato de temperaturas menores (20, 30 e butila e de etila (a 70 C), empregando razo estequiomtrica dos reagentes (R = 40 C), devido ao sinergismo entre os efeitos do metanol e da 1). Rendimento determinado por cromatografia em fase gasosa temperatura sobre a lipase. RM IM foi estudada nas reaes de sntese dos steres monoalquli-cos Resultados semelhantes foram 22 derivados dos cidos palmtico e oleico com os alcois etanol e butanol. obtidos por Ghamgui et al. na sntese de oleato de butila Os resultados esto apresentados na Figura 3, onde se pode observar que pela lipase rendimentos superiores a 80% foram obtidos at a 7 reao em batelada catalisada imobilizada de Rhizopus com cido oleico e butanol. Na 10 reutilizao, o rendimento obtido aps 2,5 h de reao foi 68% do rendimento obtido na 1 reao em batelada. oryzae. A reao forneceu 73% de rendimento por 6 uti-lizaes Portanto, a estabilidade operacional da lipase comercial Lipozyme RM consecutivas. O declnio na IM foi elevada para a sntese de oleato de butila. No entanto, quando o atividade da enzima aps o 7 lcool empregado foi etanol, observou-se uma queda contnua no experimento em batelada foi rendimento com o nmero de reutilizaes, sendo o rendimento da 10 atribudo dissociao da
reutilizao igual a apenas 10% do rendimento na 1 reao em batelada.

C), empregando razo estequiomtrica (m/m) de dos enzima. por reagentes (R = 1) e 3% Rendimento determinado Figura 3. Reutilizao da lipase Lipozyme RM IM nas reaes de sntese de oleato de butila e de etila (a 40 C) e de palmitato de butila e de etila (a 70 gasosa cromatografia em fase

Segundo AlZuhairet al.,19 a principal desvantagem do emprego de alcois

de cadeia curta em reaes de esterificao atividade cataltica catalisadas por lipases a inativao da enzima causada por esses substratos. De acordo com os autores, a inibio da enzima pelo lcool afeta diretamente a possibilidade de reutilizao do biocatalisador. Alm dos efeitos diretos do lcool sobre a lipase, fenmenos de dissociao e dissoluo do suporte no meio na presena do lcool tambm esto relacionados perda de atividade do biocatalisador imobilizado.20 Para as snteses conduzidas com cido palmtico, o decrscimo no rendimento das reaes foi mais evidente. O rendimento alcanado na 1 reutilizao da lipase na sntese de palmitato de butila foi de apenas 26% do rendimento obtido na 1 batelada (83%). Para a sntese de palmitato de etila no foi observada formao de ster aps a 1 reao em batelada. A eficcia da enzima decaiu na 2 batelada (1 reutilizao), o que pode ser atribudo perda de

adicionado em duas etapas (0 e 30 min), 3% (m/m) de Lipozyme RM IM a 50 ou 60 C para DDOS e DDOP, respectivamente. Converso determinada por titulometria de neutralizao

al.23 obtiveram 95% de rendimen-to aps 10 h na metanlise do DDOS catalisada pela Novozym 435.

Reutilizao da lipase comercial A reutilizao da lipase Lipozyme RM IM tambm foi avalia-da nas reaes de esterificao dos cidos graxos livres presentes no DDOS e DDOP com etanol e butanol. Os resultados esto

Figura 4. Converso utilizaram uma dos cidos graxos em mistura de Novozym funo do tempo nas 435 e Lipozyme TL reaes de IM na metanlise do esterificao de 8 g de destilado DDOS e DDOS e DDOP, com obtiveram 84% de 1,75 g de etanol ou steres metlicos aps 2,63 g de butanol 12 h de reao. Du et

Wang

et

al.7

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Estudo do comportamento da lipase comercial Lipozyme RM IM 5

tanol. A estabilidade da lipase foi maior no leo residual em relao apresentados na Figura 5. Na 1 reao com etanol, foram obtidos ao leo refinado, o que foi 62% de converso dos cidos graxos presentes no DDOS, sendoatribudo ao fato do lcool ser observada reduo para 6% de converso aps a 2 reutilizao da mais solvel em cidos graxos, o lipase. Nas reaes com butanol, a converso em steres butlicos que reduz sua concentrao no obtida na 1 reao foi superior a 75%, com reduo nas converses microambiente da lipase. A ao longo das reutilizaes da lipase. Aps a 3 reutilizao, foram reutilizao das lipases obtidas converses de 16%. Foram encontrados resultados similaresimobilizadas Lipozyme TL IM e nas reaes entre DDOP e butanol, com converso de 82% na 1 Novozym 435 na reao de reao e de 40% aps a 7 reutilizao. No entanto, quando etanol foi alcolise do destilado de empregado a converso reduziu de 63 para 13% na 1 reutilizao da desodorizao de leo de soja

lipase.

(DDOS) com metanol a 40 C foi investigada por Wang et al..7 Aps 120 ciclos (60 dias) no foi observada variao significativa no rendimento em steres metlicos. No entanto, todas as reaes foram conduzidas na presena de t-butanol. Segundo os autores, a presena de tbutanol aumentou a solubilidade do metanol na mistura reacional, fazendo com que a lipase mantivesse elevada atividade Figura 5. Reutilizao da lipase Lipozyme RM IM nas reaes de mesmo na presena do substrato esterificao do DDOS (50 C ) e DDOP (60 C) com 1,75 g de etanol ou 2,63 polar (metanol).
g de butanol adicionado em duas etapas (0 e 30 min) e 3% (m/m) de enzima. Converso determinada por titulometria de neutralizao CONCLUSES

(biodiesel) a partir de reaes de esterificao catalisadas pela lipase comercial Lipozyme RM IM. Aps 2 h de reao, rendimentos supe-riores a 90% foram obtidos nas snteses de oleato de etila e butila. A enzima manteve 68% do rendimento obtido na 1 reao em batelada aps 10 reutilizaes nas snteses de oleato de butila. Nas reaes de esterificao dos cidos graxos presentes nos destilados de desodori-zao dos leos de soja e palma foram obtidas converses superiores a 75% aps 2,5 h quando foi utilizado butanol e de 63% quando o lcool empregado foi etanol. A enzima foi mais estvel e manteve-se mais ativa nas reaes com DDOP. A maior estabilidade da enzima nas reaes com cidos graxos puros em relao s reaes com os resduos (DDOS e DDOP) pode estar relacionada presena de componentes nos resduos que podem promover em alguma extenso a inibio do biocatalisador.

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Neste trabalho foi estudada a sntese de steres monoalqulicos

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