TEMA 2 CULTIVO IN VITRO DE TEJIDOS

INDICE

1. Introduccin 2. Historia del cultivo in vitro de tejidos vegetales 3. Estudios bsicos sobre nutricin y morfognesis 4. Aplicaciones 5. Tipos de cultivo in vitro 6. La biologa de las clulas vegetales cultivadas 6.1. Iniciacin de cultivo de callo 6.2. Cultivos celulares 6.3. Manipulacin del crecimiento y diferenciacin in vitro

1. Introduccin

Crecimiento y desarrollo de las plantas

GENOMA

-Intra e intercelular -Factores externos: luz ,T, nutrientes

MEDIO AMBIENTE

Comunicacin intercelular 1. Corta distancia -plasmodesmos -sistemas de reconocimiento 2. Larga distancia -transporte xilema/floema de hormonas, metabolitos, nutrientes

Qu grado de autonoma tienen los rganos, tejidos y clulas vegetales? El inters por definir la relacin funcional de un tejido con otro y por investigar el potencial de desarrollo de las clulas aisladas de la planta intacta fue lo que dio lugar, a finales del siglo XIX, al cultivo de los tejidos vegetales

2. Historia del cultivo in vitro de tejidos vegetales

1838-39. Schleiden y Schawnn. Teora celular.
Autnoma CELULA Totipotente Posibilidad de regeneracin Posibilidad de cultivo

*Sin evidencias experimentales, salvo zigoto y espora

Trcul (1853), Vochting (1878) y Rechinger (1893).

Descripcin de cicatrizacin de heridas y formacin de callo en numerosas especies. Callo= masa desorganizada dividindose activamente Tamao mnimo de explante Influencia del sistema vascular

2. Historia del cultivo in vitro de tejidos vegetales

Haberlandt o la visin de futuro de la Biologa celular

1902. Hasta donde yo se, no se ha hecho ningn intento sistemtico de cultivar clulas vegetativas aisladas de plantas superiores en soluciones nutritivas simples. Los resultados de dichos experimentos conduciran a una importante visin de conjunto de las propiedades y potencialidades que posee la clula como organismo elemental. Adems, proporcionara informacin acerca de las interrelaciones e influencias complementarias a las que estn expuestas las clulas de un organismo multicelular completo Trabaj con clulas aisladas del parnquima en empalizada de tejido foliar
Clulas muy diferenciadas y medio de cultivo inadecuado Si hubiera escogido explantes de zanahoria o sauce, que proliferan sin hormona exgena, hubiera obtenido el primer cultivo de tejidos

2. Historia del cultivo in vitro de tejidos vegetales

Cultivo de rganos. White (1934). Cultivos indefinidos de races de tomate en medio nutritivo con extracto de levadura. Cultivo de tejidos= cualquier cultivo multicelular creciendo sobre un medio que contiene muchas clulas en continuidad protoplasmtica. Normalmente, consiste en un callo sin homologa, ni estructural ni funcional, con ningn tejido de una planta normal. Gautheret, Nobcourt y White (1939) consiguen, por separado, el primer cultivo in vitro de tejidos vegetales. Los dos primeros utilizan tejido cambial (c. meristemticas) de zanahoria y el ltimo, tejido tumoral de tabaco. La adicin de auxina AIA (Went, 1927) y de las vitaminas B fue esencial en el xito de los callos de Gautheret y Nobcourt. Asimismo, el hecho de que hubiera clulas meristemticas en el tejido

3. Estudios bsicos sobre nutricin y morfognesis

Van Overbeek et al. (1941). Calidad nutritiva del endospermo de coco en cultivos de embriones hbridos de Datura. Descubrimiento de que la adenina derivada de cidos nucleicos aumentaba la proliferacin celular y la formacin de yemas en cultivos de callos (Skoog, 1948). Miller (1955) descubre la kinetina en el esperma de arenque. Skoog & Miller (1957). Efecto del balance auxina/citoquinina en la induccin de respuestas morfognicas en callo de tabaco. Reinert (1958). Embriognesis somtica en callo de zanahoria. Cultivo de clulas aisladas. Totipotencia. Vasil & Hildebrandt (1965). Consiguen regenerar una planta de tabaco a partir de una clula aislada. Kohlenbach consigue finalizar la tarea de Haberlandt en 1966. Cultiva con xito clulas de mesofilo de Macleaya cordata y obtiene embriones somticos.

4. Aplicaciones
Propagacin industrial de plantas Micropropagacin -Cultivo de meristemos. Planta sana -Embriognesis somtica Semilla sinttica Conservacin de germoplasma Mejora de plantas Generacin de Variabilidad -Variacin somaclonal -Mutagnesis Recuperacin de embriones Cultivo de anteras y microsporas -Obtencin de haploides Cultivo de protoplastos -Hbridos somticos

Produccin de compuestos de inters industrial por suspensiones celulares

5. Tipos de cultivo

Desarrollo organizado
Desarrollo in vitro de la estructura inherente al explanto
Meristemo Primordio foliar Yemas florales Frutos pequeos

Desarrollo desorganizado
Ausencia de estructuras reconocibles Nmero limitado de tipos celulares especializados, morfolgica y funcionalmente

 Cultivo de estructuras organizadas

Explantos meristemticos Races Embriones

Cultivo de estructuras no organizadas

Callos Suspensiones celulares Protoplastos

Iniciando el cultivo
Explanto Aislamiento e incubacin Contaminacin/exudados fenlicos Medio de cultivo Subcultivo Densidad mnima de inculo

Cultivo de estructuras organizadas

Cultivos de rganos
Determinados
Destinados a tener tamao y forma definido (hojas, flores, frutos)

Indeterminados
Crecimiento potencialmente ilimitado (meristemo apical caulognico y radicular)

Cultivo de rganos determinados

Ruddat et al. 1979. Silene alba. Rastogi and Sawhney 1988. Lycopersicon sculentum Deaton et al. 1980. Nicotiana offinis Reversion floral meristem to vegetative one

Cultivo de rganos indeterminados

Meristemos

Cultivo de rganos indeterminados

Embriones

Cultivo de callo Formacin de plntula Salvar dormicin Hbridos no viables

INCOMPATIBILIDAD PREZIGTICA
No hay germinacin polen/crecimiento tubo polnico

INCOMPATIBILIDAD POSTZIGTICA
Nutricin deficiente a partir del endospermo RESCATE DE EMBRIONES (EMBRYO RESCUE) -Hu and Sussex 1986

Cultivo de rganos indeterminados

Ovario/ovulo

Semillas de Orqudeas cultivadas in vitro Protocolo general de Yeung et al. (1981)

Cultivo de rganos indeterminados

Cultivo de races aisladas Meristemo de la raz principal o laterales Indefinidos Dormicin en los meristemos Acumulacin de auxinas??? Said and Murashige 1979

Cultivo de rganos indeterminados

Cultivo de races aisladas
Infecciones de nemtodos Micorrizas Fijacin nitrgeno Alta estabilidad gentica
conservacin germoplasma Tallos adventicios
Zelcer et al. 1983 Mudge et al. 1986

Micropropagacin

Tallos y/o embriones de callo Conversin del meristemo radicular en caulognico

Philip and Nainar 1986

Cultivo de clulas desorganizadas

Callo Suspensiones celulares Clulas inmovilizadas Clulas aisladas

6.1. Cultivo de callos

Cultivo de callos
Herida Insectos Estrs In vitro
Colocando un explanto con un balance hormonal adecuado Reversin de la diferenciacin y especializacin celular previa
Formacin de clulas parenquimticas sin diferenciar Regeneracin: formacin de planta a partir de callo

6.1. Cultivo de callo

Efecto de la lesin
Cicatrizacin de heridas Injerto

DIVISIN CELULAR

Aislamiento del tejido lesionado

Inhibicin de los mecanismos naturales que limitan las divisiones Cultivo en medio nutritivo artificial (nutrientes y reguladores adecuados)

Cambios en la ultraestructura y metabolismo celular

Incrementa la respiracin celular (nmero de mitocondrias) y la actividad de enzimas glicolticas Desaparecen productos de reserva (grnulos de almidn) Sntesis de RNA (aumenta el nmero de ribosomas y polirribosomas)

DESDIFERENCIACIN del tejido organizado

Material vegetal o Explanto Parte de la planta de crecimiento rpido o en un estadio temprano de su desarrollo: hipocotilo, hojas jvenes, embriones e inflorescencias inmaduros Prdida de capacidad con la edad del explante. -Diferencias epigenticas. Meins (1986). Cada vez existen ms evidencias de que los tejidos cultivados no son una pgina en blanco. Por el contrario, en ocasiones recuerdan de qu parte de la planta proceden y este recuerdo influye en la morfognesis y en la estabilidad gentica del cultivo

Medio de cultivo Sales minerales Vitaminas Reguladores del desarrollo (auxina/citoquinina) Habituacin= Las clulas pueden ser cultivadas en ausencia del regulador (auxina o citoquinina). Otro ejemplo de diferencias epigenticas. Explante prximo al pice caulinar. Decrece con la edad. Espontneo o inducible. Alta frecuencia (no mutacin). Fuente de carbono (sacarosa) pH=5.8 Fotoperodo

CELULAS CULTIVADAS

DESORGANIZACIN DEL METABOLISMO

6.2. Cultivos celulares en suspensin

Clulas y agregados celulares dispersos en un medio lquido. Se consiguen por transferencia de callos friables a medio lquido con agitacin (90-150 rpm): aireacin y dispersin. 20-75 ml medio/100-250 ml contenedor El incremento en material celular tiene lugar durante un perodo de tiempo. La dilucin de un inculo en el momento de mayor rendimiento en un volumen = inicial, permite realizar cultivos prolongados-BATCH CULTURES -Densidad mnima efectiva= cantidad mnima de inculo por unidad de volumen de medio a partir del que puede crecer reproduciblemente un nuevo cultivo (0.5-2.5 x 105 cells /ml) *** (4-6 divisiones) ***(18-25 das cultivo)

f (clon, historia de cultivo, composicin del medio)

Cultivo nodriza Cultivo condicionante Monocotiledneas recalcitrantes: arroz y mazF

capa de agar

cultivo nodriza

cultivo condicionante

6.2.1. Fases del ciclo de crecimiento

FASE DE LATENCIA Preparacin de la clula a la mitosis Poder reductor y ATP Oxidacin de carbohidratos Sntesis de protenas FASE DE DIVISION CELULAR Aumenta el n de clulas Retraso del aumento de tamao de la clula (peso fresco) Relacin peso seco-nclulas Descenso del tamao celular medio FASE ESTACIONARIA Disminucin de la tasa de divisin celular Comienza la expansin celular Sntesis de metabolitos secundarios

Peso fresco N clulas Peso seco

Tamao cel.

tiempo

6.2.2. Tipos de cultivos celulares en suspensin

Tipos
Batch cultures 1. Un volumen finito de medio durante todo el ciclo de cultivo 2. Cambio constante -Patrn de crecimiento celular -Metabolismo -Composicin medio

dx/dt=ux (u=tasa de crecimiento (h-1) u=1/x . dx/dt

x t

x0

dx/x = udt
t0

x0= Nclulas a t0 x= N clulas a t X= X0 eut

Ln (x/x0)=ut x=2x0 / t= dt x/x0 = eut 2xo/x0= eutd

Para calcular td= t que dobla la poblacin celular

Ln 2= utd

td= ln 2/u= 0.693/u

6.2.3. Cultivos celulares en suspensin

Cultivos continuos Se persiguen estados estables de crecimiento y metabolismo celular, a base de renovar el medio de cultivo. Sincronizacin y Amplificacin de la respuesta celular. Cerrado: Entra medio y sale medio. Se recuperan las clulas Abierto: Entra medio y salen medio y clulas Quimiostatos. Flujo continuo.-Nutriente limitante Turbidostatos. Flujo intermitente.-Turbidez

6.2.4. Clulas inmovilizadas

Se emplean en la obtencin de metabolitos secundarios de inters. Se trata de cultivos de agregados multicelulares, sostenidos por algn tipo de sustrato biolgicamente inerte. Existen dos tcnicas de uso habitual: Imbibicin: las clulas estn embebidas en un gel polimrico
Alginato clcico, agar, agarosa

Atrapamiento: las clulas estn inmovilizadas en espumas o mallas preformadas o sistemas de membrana de fibra hueca.
Acetato de celulosa (fibra) Policarbonato de silicona (fibra) Poliuretano reticulado (espuma)

6.2.5. Cultivos de clulas aisladas

Tcnicas de cultivo Plating en medio semi-slido (Bergman, 1960) -A. Suspensin de clulas en medio lquido, a una densidad doble de la deseada en la placa. -B. Medio con agar disuelto (0.6-1%) y mantenido a T=35 C -Mezclar A y B y distribuir uniformemente en placa Petri, una capa de medio de cultivo de 1 mm de espesor. PE= Ncolonias/ placa x 100
N clulas /placa

 Separacin mecnica
Colman et al. 1979 Schwenk (1980,1981)

Separacin enzimtica
Pectinasa polygalacturonasa
Dow and Callow (1979)

6.2.6. Aplicaciones de los cultivos celulares

Seleccin de mutantes Industrial Produccin de metabolitos secundarios Biotransformacin Induccin de poliploida

6.2.7. Citodiferenciacin en cultivos celulares Formacin de traqueidas

Estados iniciales del desarrollo de tallo

Diferenciacin de plastos
Amiloplastos Cloroplatos (asociado con morfognesis)

6.3. Manipulacin del crecimiento y diferenciacin in vitro

Skoog & Miller (1957)

Auxina /Citoquinina
LOS EXPERIMENTOS DE LA CAPA FINA DE Tran Thanh Van. Thin layer 1-7 capas de clulas de tallo y hoja Induccin de divisin celular y organognesis en las clulas epidrmicas (tallo, raz, floral) a) Seguimiento del desarrollo organognico a partir de una clula b) La ausencia de tejido vascular y cambium reduce el efecto materno

6.3.1.Patrones de organizacin estructural

Patrones de organizacin

ORGANOGENESIS Tallos Races

EMBRIOGENESIS Embrioide

6.3.2. Organognesis in vitro

1 FASE DESDIFERENCIACION =ADQUISICIN DE LA COMPETENCIA
cyclins

Divisin celular Organognesis raz

Organognesis de tallo

cyclin-dependent kinases (CDKs)

Auxinas

2 FASE DETERMINACIN= FORMACIN DE ORGANOS ESPECIFICOS raz tallos

Citoquininas

3 FASE MORFOGNESIS DE ORGANOS

6.3.3. Embriognesis somtica

Especialmente importante en gramneas (cereales) falla el mtodo clsico de Skoog & Miller (1957) ver Vasil (1987). Journal of Plant Physiology (1987) Callo tipo II 2,4-D NH4 No embriognico Callo tipo I Embriognico 2,4-D Embriones somticos
blanco-amarillo compacto crecimto lento cels. meristemticas

Explantes embriones inmaduros inflorescencias hojas

disgregable

SEEDLING

plntula plntula de maz