UNIVERSIDAD DE ORIENTE NCLEO DE SUCRE ESCUELA DE CIENCIAS DEPARTAMENTO DE BIOANLISIS

CURSO DE ESPERMATORAMA ACTUALIZACIN SEGN CRITERIOS DE LA OMS, 2010

ANLISIS ESTNDAR DEL SEMEN HUMANO

Equipo docente: Lcda. Evelin M. Flores Fernndez Prof. Agregado Dr. Anbal Lobo Prof. Asociado Lcda. Solange Vsquez Prof. Instructor Cuman, octubre 2010

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INTRODUCCIN

La Organizacin Mundial de la Salud (OMS), en respuesta a una gran necesidad de estandarizar los procedimientos para el anlisis del lquido seminal humano, publica por primera vez, en el ao 1980, el manual de laboratorio para la examen del semen humano e interaccin de espermatozoides con el moco cervical (WHO laboratory manual for the examination of human semen and spermcervical mucus interaction).

En los ltimos 30 aos, se ha reconocido que este manual ha proporcionado las normas mundiales, siendo usado ampliamente en la investigacin y por los laboratorios clnicos de todo el mundo.

A pesar de este xito, se ha comprobado que algunas recomendaciones de ediciones anteriores del manual necesitaron revisarse a la luz de nuevas pruebas, y algunos conceptos precisaron ms explicaciones en su apoyo.

La falta de detalles en ediciones anteriores, ha hecho que algunos laboratorios hayan preferido utilizar mtodos descritos en otras partes, o hayan desarrollado sus propias versiones de los mtodos, mientras que an se solicitan realizar anlisis de semen de acuerdo con el manual de la OMS.

Movidos por estas consideraciones, la OMS estableci un comit editorial para revisar todos los mtodos descritos en el manual, con miras a suscribir, a cambiar o actualizarlos, crendose la quinta edicin del Manual para el Anlisis de Lquido Seminal.

Los mtodos descritos en esta nueva edicin, son creados como directrices para mejorar la calidad de anlisis de semen y la comparacin de los resultados. No necesariamente, deben tomarse como obligatorias por instituciones locales, nacionales o mundiales de acreditacin de laboratorios. El anlisis del semen es til tanto en clnica como en investigacin, para estudiar la fertilidad del hombre.

Pgina |3 Este curso de Espermatograma: Actualizacin segn criterios de la OMS, 2010, tiene actividades tericas-prcticas. En l se describir el anlisis estndar del lquido seminal que incluir procedimientos, clculos e interpretacin, y valores de referencia actuales. Adicionalmente, el curso incluir una parte clnica, que abordar aspectos como causas de la infertilidad masculina, haciendo hincapi en el eje hipotlamo-hipfisis-testculo y en malformaciones congnitas, as como recomendaciones mdicas.

OBJETIVO

Describir el anlisis estndar del lquido seminal y las causas de infertilidad masculina.

PROPSITO

El propsito es capacitar a Profesionales y Estudiantes del rea del Bioanlisis en el anlisis del semen segn criterios de la OMS 2010.

PROGRAMA

MARTES 26 DE OCTUBRE- ACTIVIDADES TERICAS Lugar: Sala de conferencias Museo del Mar

8:00-8:30 AM: 8:30-10:00 AM:

Entrega de material. Aspectos clnicos del espermatograma. Instructor: Dr. Anbal Lobo - Introduccin. - Anatoma, histologa y fisiologa del sistema reproductor masculino. - Definicin de infertilidad. - Historia clnica. - Causas de Infertilidad. - Hipogonadismo-Hipogonadotrpico. - Algunas malformaciones congnitas. - Recomendaciones mdicas.

Pgina |4 - Espermatograma y otras pruebas de laboratorio (test de penetracin espermtica y test postcoital). - Recuperacin espermtica (REM).

10:00-10:15 AM: Refrigerio.

10:15 AM - 12:15 PM: Anlisis clsico del lquido seminal. Instructor: Lcda. Solange Vsquez. - Recoleccin de la muestra. - Caractersticas macroscpicas: licuefaccin, viscosidad,

apariencia, volumen, pH, valores de referencias. - Caractersticas microscpicas: preparacin hmeda (muestra representativa, preparacin, observacin microscpica, clulas redondas, agregacin y aglutinacin de espermatozoides), motilidad. - Motilidad espermtica: categoras de movimientos del

espermatozoide, preparacin y evaluacin de la muestra, clculo de la motilidad espermtica, ejemplos de trabajo, lmite inferior de referencia. 2:00 5:45 PM:

Continuacin. Anlisis clsico del lquido seminal. Instructor: Lcda. Evelin M. Flores F. Vitalidad espermtica: prueba de eosina, otras pruebas, clculo del porcentaje de espermatozoides vivos, ejemplos de trabajo, lmite inferior de referencia. Concentracin y nmero total de espermatozoides: Importancia del contaje de un nmero suficiente de espermatozoides, determinacin de la dilucin requerida, preparacin de las diluciones, evaluacin del nmero de espermatozoides en la cmara Neubauer mejorada, clculo de la concentracin de espermatozoides en el semen, ejemplos de trabajos, lmite inferior de referencia, clculo del nmero total de

espermatozoides en el eyaculado, lmite inferior de referencia.

Pgina |5 Morfologa: estructura al MO, concepto de espermatozoide normal, clasificacin de la morfologa espermtica, criterio estricto de Kruger, preparacin del frotis, mtodos de coloracin, coloracin Papanicolaou modificada, observacin microscpica y ejemplos, clculo del porcentaje de formas normales, ejemplos de trabajo, lmite inferior de referencia.

MIRCOLES 27 DE OCTUBRE-ACTIVIDADES PRCTICAS Lugar: Laboratorio de Histologa, Departamento de Bioanlisis.

8:30-11:30 AM: Grupo A (10 PARTICIPANTES). Prctica de anlisis del lquido seminal. Entrega de certificados.

2:30-5:30 PM: Grupo B (10 PARTICIPANTES). Prctica de anlisis del lquido seminal. Entrega de certificados.

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ANATOMA Y FISILOGA DEL APARATOR REPRODUCTOR MASCULINO

Para estudiar al hombre en quien se sospecha problemas de infertilidad hay que hacerlo desde dos puntos de vista:

1.- Desde el punto de vista ANATMICO. 2.- Desde el punto de vista FUNCIONAL.

Anatmicamente, el aparato reproductor masculino est compuesto por un sistema glandular, las vas espermticas, el rgano de cpula y las glndulas anexas.

El sistema glandular est representado por los testculo, cada uno se aloja en el escroto y est compuesto por una estructura lobulillar donde se encuentran los tbulos seminferos y el epiddimo. Los tbulos seminferos estn formados por un epitelio complejo, correspondiendo a ese epitelio las espermatogonias, los espermatocitos, las clulas de Sertoli y los espermtides. En el intersticio se encuentran las clulas de Leydig.

A partir de la cola del epiddimo se inicia el conducto deferente, el cual se contina con las vesculas seminales y sta con el conducto eyaculador, desembocando en la uretra prosttica.

El rgano de cpula, el pene, es una estructura que est formado por dos cuerpos cavernosos, uno esponjoso y la uretra peneana; siendo los cuerpos cavernosos los responsables de la ereccin del pene.

Para que el testculo cumpla con su funcin de producir espermatozoides es indispensable que exista una integridad del eje hipotlamo-hipfisis-testculo.

La hormona que se produce en el testculo responsable de las caractersticas sexuales secundarias del hombre y de la espermatognesis, conjuntamente con las funciones que

Pgina |7 cumplen las clulas de Sertoli es la TESTOSTERONA, la cual circula en forma libre y unida a la protena transportadora. El espermatozoide una vez que se transporta a lo largo de las vas espermticas y an en el aparato sexual femenino, sufre un proceso de capacitacin para poder cumplir con su funcin de fertilidad.

Para poder saber si un hombre es frtil o no, se debe tener bien claro el concepto de FERTILIDAD, el cual se define como El hombre que durante un ao ha tenido relaciones sexuales, sin usar mtodos anticonceptivos y no ha logrado embarazar a una mujer; en ese momento se hace indispensable hacer una buena historia clnica, con un interrogatorio que evale antecedentes importantes con la fertilidad, un examen fsico detallado para conocer las caractersticas androlgicas del paciente, un espermatograma y todos los exmenes de laboratorio indispensables que permitan conocer el estado funcional de ese paciente.

Las causas de infertilidad ms importantes, se pueden mencionar: 1) el varicocele, 2) infecciones, principalmente, Chlamydia trachomatis, 3) inmunolgicas por anticuerpos antiespermticos, toxicolgicas por metales pesados, organofosforados, cigarrillo, alcohol, entre otros, 4) obstrucciones de las vas espermticas, enfermedades sistmicas como la diabetes mellitus, otras 5)

enfermedades

endocrinolgicas como el hipotiroidismo hipogonadotrfico, 6) congnitas como el sndrome de Klinefelter 47 XXY.

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ANLISIS DEL SEMEN Durante la eyaculacin, el semen es producido a partir de una suspensin concentrada de espermatozoides, almacenados en los epiddimos, mezclados y diluidos, por secreciones de los rganos sexuales accesorios. Es emitido como diversas masas redondas y pequeas. La comparacin del volumen del semen pre y post-vasectoma, revela que alrededor del 90% del volumen del semen est formado por las secreciones de los rganos accesorios, principalmente, de la prstata y las vesculas seminales, con contribuciones menores de las glndulas bulbouretrales (de Cowper).

El semen tiene dos atributos cuantificables principales: El nmero total de espermatozoides. Esto refleja la produccin de espermatozoides en los testculos y la permeabilidad del sistema de conductos post-testiculares. El volumen total de lquido, aportado por las glndulas accesorias. Esto refleja la actividad secretora de las glndulas.

La naturaleza de los espermatozoides (vitalidad, motilidad y morfologa) y la composicin del lquido seminal tambin son importantes para la funcin espermtica.

Durante las relaciones sexuales, la fraccin inicial prosttica del eyaculado, rica en espermatozoides, puede entrar en contacto con el moco cervical extendido dentro de la vagina, el resto del lquido queda como una piscina en la vagina. Por el contrario, en el laboratorio, el eyaculado se recoge completamente en un envase, donde los espermatozoides se encuentran atrapados en un cogulo formado por protenas de la vescula seminal. Este cogulo es posteriormente licuado por la accin de las proteasas prostticas, tiempo durante el cual su osmolalidad se eleva.

Existe alguna evidencia de que la calidad de muestras de semen vara en funcin de cmo se produce la eyaculacin. Los eyaculados derivados de la masturbacin

Pgina |9 recogidos dentro de un recipiente en una habitacin cerca del laboratorio pueden ser de menor calidad que los recuperados de condones no espermicidas, usados durante la relacin sexual en el hogar. Esta diferencia puede reflejar una forma distinta de excitacin sexual, ya que el tiempo dedicado a la produccin de una muestra por masturbacin - que refleja la extensin de la emisin seminal antes de la eyaculacin tambin influye en la calidad del semen.

Bajo determinadas condiciones de recoleccin, la calidad del semen depende de factores que, por lo general, no se pueden modificar, como la produccin de espermatozoides en los testculos, secreciones de los rganos accesorios y enfermedad reciente (en particular febriles), as como otros factores, tales como tiempo de abstencin, que deben ser registrados y tomarse en cuenta en la interpretacin de la resultados.

Los resultados del laboratorio que miden la calidad del semen dependen de: La recoleccin de una muestra completa. Durante la eyaculacin las primeras fracciones del semen son, principalmente, los fluidos prostticos ricos en espermatozoides, mientras que las fracciones posteriores estn dominadas por el fluido de las vesculas seminales. Por lo tanto, perder la primera porcin del eyaculado (rica en espermatozoides) repercute ms en los resultados del anlisis de semen, que si se pierde la ltima porcin. La actividad de las glndulas sexuales accesorias, los fluidos que diluyen el concentrado de espermatozoides del epiddimo en la eyaculacin. La concentracin de espermatozoides no es una medida directa de la produccin de espermatozoides en el testculo, ya que est influenciada por el funcionamiento de otros rganos reproductivos, sin embargo, s lo es, el nmero total de espermatozoides eyaculados (concentracin espermtica multiplicada por el volumen del semen). Por ejemplo, las concentraciones de espermatozoides en el semen de hombres jvenes y viejos, pueden ser las mismas, no obstante, el nmero total de espermatozoides puede diferir, ya que tanto el volumen de lquido seminal y produccin total de espermatozoides disminuye con la edad, al menos en algunas poblaciones.

P g i n a | 10 El tiempo transcurrido desde la ltima actividad sexual. Los espermatozoides se acumulan en los epiddimos, luego pasan a la uretra y se expulsan en la orina. La vitalidad espermtica y la cromatina, se ven afectadas por una mayor duracin de la abstinencia a no ser que la funcin del epiddimo sea perturbada. El penltimo perodo de abstinencia. Como los epiddimos no estn completamente vacos por una eyaculacin, algunos espermatozoides

permanecen desde el momento de la eyaculacin previa. Esto influye en el rango de edad y la calidad de los espermatozoides en el eyaculado. El alcance de esta influencia es difcil de determinar y rara vez se toma en cuenta. El tamao de los testculos. Influye en el nmero total de espermatozoides por eyaculado. El tamao testicular refleja el nivel de actividad espermatognica, lo que tambin afecta la morfologa espermtica.

Comentario: La gran variacin biolgica en la calidad del semen, refleja los muchos factores antes mencionados, y requiere que todas las mediciones en semen sean muy precisas.

Tal variabilidad tiene consecuencias para la interpretacin de los anlisis de semen: Es imposible caracterizar la calidad del semen de un hombre a partir de una muestra de semen. Es til examinar dos o tres muestras para obtener datos de referencia.

Mientras que las mediciones efectuadas en toda la poblacin de espermatozoides eyaculados no pueden definir la capacidad fecundante de los pocos que llegan al sitio de fertilizacin, el anlisis de semen, sin embargo, proporciona informacin esencial sobre el estado clnico de un individuo. Todos los aspectos sobre la recogida y anlisis deben ser realizados por procedimientos estandarizados apropiados, as los resultados

P g i n a | 11 proporcionan informacin vlida y til. Los ensayos descritos son procedimientos aceptados, los cuales constituyen los pasos esenciales en la evaluacin del semen. El anlisis del semen implica los siguientes pasos:

En los primeros 5 minutos: Colocar el recipiente con la muestra en la mesa de trabajo o en la incubadora a 37C, durante la licuefaccin.

Entre los 30 y 60 minutos: Evaluar la licuefaccin y apariencia de la muestra. Medir el volumen del semen. Medir el pH del semen (si es requerido). Preparacin del directo para la evaluacin de la apariencia microscpica, la motilidad espermtica y la dilucin requerida para el contaje del nmero de espermatozoides. Evaluacin de la vitalidad espermtica (si el porcentaje de espermatozoides mviles es bajo). Elaborar el frotis de semen para la evaluacin morfolgica. Hacer las diluciones del semen para determinar la concentracin de espermatozoides. Evaluar el nmero de espermatozoides. Realizar la prueba de la reaccin de antiglobulina mixta (MAR test), si es requerida. Determinar clulas peroxidasa positivo (si las clulas redondas estn presentes). Preparacin de espermatozoides para la prueba de Inmunobead. Centrifugacin del semen (si los marcadores bioqumicos se analizaron).

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Dentro de las 3 horas: Enviar las muestras al laboratorio de microbiologa (si es requerido).

Despus de 4 horas: Fijar, colorear y observar microscpicamente los frotis para la evaluacin morfolgica.

Ms tarde y el mismo da (o el da posterior si las muestras se congelan): Analizar los marcadores de las glndulas accesorias (si es requerido). Realizar la prueba del inmunobead indirecta (si es requerida).

1. RECOGIDA DE LA MUESTRA

1.1. PREPARACIN La muestra se debe recoger en un cuarto privado cerca del laboratorio, con el fin de limitar la exposicin del semen a las fluctuaciones de temperatura y para el control del tiempo entre la recogida y el anlisis. La muestra se debe recoger despus de un mnimo de 2 das y un mximo de 7 das de abstinencia sexual. Si se requieren muestras adicionales, el nmero de das de abstinencia sexual debe ser lo ms constante posible en cada visita. Al hombre se le debe dar instrucciones claras escritas y habladas sobre la obtencin de la muestra de semen. Asimismo, hacer hincapi en que la muestra de semen debe ser completa y que ante cualquier prdida de alguna fraccin debe informarlo.

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La siguiente informacin se debe registrar en el formulario de informe: nombre del hombre, fecha de nacimiento, nmero de identificacin, perodo de abstinencia, fecha y hora de recogida, si la muestra se recogi completamente, dificultades en la recogida de la muestra y el intervalo entre la recogida y el inicio del anlisis del semen (vase apndice 1).

1.2. RECOGIDA DE LA MUESTRA CON FINES DE DIAGNSTICO O DE INVESTIGACIN La muestra se debe recoger por masturbacin y eyaculacin en un recipiente limpio, de boca ancha, de vidrio o plstico, que se haya confirmado no ser txico para los espermatozoides. La muestra se debe mantener a temperatura ambiente, entre 20C y 37C, para evitar grandes cambios en la temperatura que puedan afectar los

espermatozoides una vez eyaculados y recogidos en el envase. El recolector se debe etiquetar con el nombre del paciente, nmero de identificacin, fecha y hora de recoleccin de la muestra. Tenga en cuenta en el informe si la muestra fue incompleta, especialmente, si la primera fraccin, rica en espermatozoides, es la faltante. Si la muestra es incompleta se debe recolectar una segunda muestra, luego de un perodo de abstencin de 2 a 7 das.

Recuadro 1. Confirmacin de la compatibilidad de los recipientes de recoleccin de la muestra de semen. Seleccione variasDE muestras de semen con buenaEN concentracin y motilidad de 1.3. RECOGIDA LA MUESTRA DE SEMEN CASA espermatozoides. Coloque la mitad de cada muestra en un recipiente que se sabe no es txicos para los espermatozoides (control) y la otra mitad en el recipiente a prueba. Evalu la motilidad espermtica (vase seccin en intervalos de una hora a Una muestra se puede recoger en la casa en3.6) circunstancias excepcionales, como temperatura ambiente o a 37C durante 4 h. Si no hay diferencias en cada momento una incapacidad demostrada para producir muestra la entre el control y el evaluado (p>0,05 segn lo una juzgado por por un masturbacin t de student),en los recipientes de o ensayo pueden ser considerados txicos para los espermatozoides y clnica falta de instalaciones adecuadas no cerca del laboratorio. satisfacen las necesidades de recogida de semen.

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Al hombre se le debe dar instrucciones claras escritas y habladas sobre la obtencin y transporte de la muestra de semen. Asimismo, hacerle hincapi en que la muestra de semen debe ser completa, incluyendo la primera fraccin, rica en espermatozoides y que ante cualquier prdida de alguna fraccin debe informarlo. Esto debe ser anotado en la hoja de reporte si la muestra es incompleta. El hombre debe disponer de un recipiente previamente pesado, etiquetado con su nombre y nmero de identificacin. El hombre debe registrar la hora de recogida la muestra y transportarla al laboratorio dentro de una hora. Durante el transporte al laboratorio la muestra debe conservarse entre 20C y 37C. Debe registrarse en la hoja de reporte que la muestra fue recogida en la casa u otro lugar fuera del laboratorio.

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2. EXAMEN MACROSCPICO

El anlisis del semen debe comenzarse con una simple inspeccin poco despus de la licuefaccin, preferiblemente a los 30 min, pero no despus de una hora de la eyaculacin, para evitar deshidratacin o cambios en la temperatura que afecten la calidad del semen.

2.1. LICUEFACCIN

Inmediatamente, despus de la eyaculacin dentro del recolector de semen, tpicamente, el semen es una masa coagulada semislida. Dentro de unos minutos a temperatura ambiente, el semen, por lo general, comienza a licuarse (se vuelve ms delgado), momento en el que una mezcla heterognea de grumos se ver en el lquido. Continuando la licuefaccin, el semen se vuelve ms homogneo y muy acuoso, y en la fase final slo pequeas reas de coagulacin permanecen. La licuefaccin completa de la muestra, usualmente, ocurre dentro de los 15 min a temperatura ambiente, aunque rara vez puede tardar 60 min o ms. Si no ocurre la licuefaccin completa a los 60 min esto debe ser reportado.

Es normal que las muestras de semen licuadas, contengan grnulos gelatinosos (cuerpos gelatinosos) que no se lican, lo cual no tiene importancia clnica.

La presencia de filamentos de moco, sin embargo, pueden interferir con el anlisis de la muestra de semen.

Nota 1: La licuefaccin se puede reconocer tanto macroscpicamente, como se describi anteriormente, y microscpicamente. Los espermatozoides inmovilizados obtienen la capacidad de moverse en el semen licuado. Si se observan espermatozoides inmovilizados en el examen microscpico, se debe disponer de ms tiempo para que el proceso de licuefaccin sea completo.

Nota 2: Durante la licuefaccin, se mezcla continuamente, la muestra con movimientos suaves o por rotacin del recolector en un agitador de dos dimensiones, ya sea a

P g i n a | 16 temperatura ambiente o en una incubadora a 37C, lo que ayuda a obtener una muestra homognea.

Nota 3: Si el semen no se ha licuado dentro de los 30 min, no proceder con el anlisis, hay que esperar otros 30 min. Si no se ha licuado dentro de los 60 min, proceder como en la seccin de licuefaccin tarda.

2.1.1. Licuefaccin tarda

Ocasionalmente, las muestras de semen no se lican, pudiendo dificultar el anlisis. En estos casos, es necesario un tratamiento adicional, como mezcla mecnica o digestin enzimtica.

1. La licuefaccin de las muestras se puede inducir, mediante la adicin de un volumen igual de medio fisiolgico, por ejemplo, buffer fosfato salino de Dulbecco (vase apndice 2), seguido por pipeteo repetido.

2. La falta de homogeneidad se puede reducir pasando suavemente (6-10 veces) a travs de una aguja unida a una jeringa calibre 18 (dimetro interno 0,84 mm) o 19 (dimetro interno de 0,69 mm).

Comentario: Estos tratamientos pueden afectar la bioqumica del plasma seminal, motilidad y morfologa de los espermatozoides y se debe reportar su uso.

2.2. VISCOSIDAD DEL SEMEN

Despus de la licuefaccin, la viscosidad de la muestra se puede estimar aspirando suavemente con una pipeta de plstico desechable de gran calibre (aproximadamente 1,5 mm de dimetro), permitiendo que el semen caiga por gravedad y se observe la longitud de cualquier filamento. Una muestra normal sale de la pipeta en pequeas gotas

P g i n a | 17 discretas. Si la viscosidad es anormal, la gota forma un filamento de ms de 2 cm de largo.

Alternativamente, la viscosidad puede ser evaluada introduciendo una varilla de vidrio en la muestra y observar la longitud del filamento que se forma al retirar la varilla. La viscosidad debe reportarse como anormal cuando el filamento excede los 2 cm de longitud.

En contraste, para una muestra parcialmente licuada, una muestra de semen viscosa exhibe pegajosidad homognea y su consistencia no vara con el tiempo. Una muestra altamente viscosa se reconoce por sus propiedades de elasticidad. La muestra se adhiere firmemente a s misma cuando se hacen intentos para pipetearla. Los mtodos para reducir la viscosidad, son los aplicados para la licuefaccin tarda.

Comentario: La viscosidad aumentada, puede interferir con la determinacin de la motilidad y concentracin de espermatozoides, deteccin de anticuerpos que revisten a los espermatozoides y medicin de marcadores bioqumicos.

2.3. APARIENCIA DEL EYACULADO

Una muestra normal de semen licuado tiene un aspecto homogneo, de color gris opalescente. Puede aparecer menos opaco si la concentracin de espermatozoides es muy baja y el color tambin puede ser diferente, es decir, rojo-marrn cuando los glbulos rojos estn presentes (hemospermia) o amarillo en un paciente con ictericia o por administracin de vitaminas o medicamentos.

2.4. VOLUMEN DEL SEMEN

El volumen del eyaculado es proporcionado por las glndulas vesculas seminales y prstata, con una pequea cantidad de las glndulas bulbouretrales y los epiddimos tambin aportan. La medicin precisa del semen es esencial en la evaluacin, porque

P g i n a | 18 permite que el nmero total de espermatozoides y clulas no espermticas en el eyaculado se calculen.

El volumen es mejor medirlo pesando la muestra en el recipiente donde se recogi: Recoger la muestra en un recipiente, prepesado, limpio y desechable. Pesar el recipiente con el semen. Calcular el volumen a partir del peso de la muestra, suponiendo que la densidad del semen es 1 g/ml. La densidad del semen vara entre 1,043 y 1,102 g/ml.

Nota: Los envases vacos para recoger la muestra pueden tener pesos distintos, por lo que cada envase debe, individualmente, pesarse previamente. El peso se puede registrar en el recipiente antes de entregrselo al paciente. Se debe usar un marcador de tinta permanente para rotular o una etiqueta. Si se utiliza etiqueta para registrar el peso, debe colocarse antes de pesar el recolector vaco.

Nota: Medir el volumen por aspiracin de la muestra con una pipeta o jeringa, o por decantacin en un cilindro, no es recomendable, porque no toda la muestra es recuperada y el volumen, por lo tanto, es subestimado. El volumen perdido puede ser entre 0,3 y 0,9 ml.

Comentario 1: Un volumen bajo de semen, es caracterstico de obstruccin del conducto eyaculador o ausencia congnita bilateral de los conductos deferentes (ACBCD), condicin en la cual las vesculas seminales tambin estn mal desarrolladas.

Comentario 2: El volumen bajo del semen, puede ser tambin por problema en la recogida de la muestra (prdida de una fraccin del eyaculado), eyaculacin retrgrada parcial o deficiencia de andrgenos.

Comentario 3: Un volumen de semen alto, puede indicar exudacin activa en los casos de una activa inflamacin de los rganos accesorios.

P g i n a | 19 Lmite inferior de referencia

El lmite inferior de referencia del volumen del semen es 1,5 ml (percentil 5, intervalo de confianza del 95% (IC), 1,4-1,7).

2.5. pH DEL SEMEN

El pH del semen refleja el equilibrio entre los valores de pH de las secreciones de las diferentes glndulas accesorias, principalmente, la secrecin alcalina de las vesculas seminales y la secrecin cida de la prstata. El pH debe ser medido despus de la licuefaccin en un tiempo uniforme, preferiblemente, despus de 30 min, pero en cualquier caso dentro de la primera hora despus de la eyaculacin, ya que, est influida por la prdida de CO2 que se produce despus de la eyaculacin.

Para las muestras, de modo normal, se debe utilizar el papel pH en el rango de 6,0 a 10,0. Mezclar bien la muestra de semen (vase recuadro 1). Aplique una gota de semen uniformemente en el papel de pH. Espere a que el color de la zona impregnada sea uniforme (<30 s). Comparar el color con la tira de calibracin para leer el pH.

Nota: La precisin del papel de pH debe verificarse con los estndares conocidos.

Para muestras viscosas, el pH de una pequea alcuota del semen se puede medir utilizando un pHmetro, diseado para la medicin de soluciones de viscosidad.

P g i n a | 20 Valores de referencia

Actualmente, existen pocos valores de referencia para el pH del semen de hombres frtiles. En espera de ms datos, este manual mantiene el valor de consenso de 7,2 como valor umbral menor.

Comentario 1: Si el pH es inferior a 7,0 en una muestra de semen con bajo volumen y nmero de espermatozoides, puede haber obstruccin del conducto eyaculador o ausencia congnita bilateral de los conductos deferentes, una condicin en la cual las vesculas seminales estn tambin poco desarrolladas.

Comentario 2: El pH del semen aumenta con el tiempo, a medida que disminuye la amortiguacin natural. Valores de pH muy altos, pueden proporcionar poca informacin de utilidad clnica.

P g i n a | 21 3. ANLISIS MICROSCPICO

Se recomienda el uso de un microscopio de contraste de fase para la evaluacin de motilidad, contaje de espermatozoides y otras clulas, y microscopio de campo brillante para la morfologa espermtica y vitalidad. El examen microscpico inicial implica una exploracin de la preparacin, con una magnificacin de 100x (objetivo de 10x con ocular de 10x).

A continuacin la preparacin, debe observarse, con magnificacin de 200x o 400x (objetivo de 20x o 40x con ocular de 10x). Esto permite: Evaluacin de la motilidad espermtica. Determinacin de la dilucin necesaria para una evaluacin precisa del nmero de espermatozoides.

3.1. MEZCLA COMPLETA Y MUESTRA DE SEMEN REPRESENTATIVA

La naturaleza del eyaculado licuado, contribuye a obtener una muestra representativa de semen para su anlisis. Si la muestra no se mezcla bien, el anlisis de dos alcuotas por separado puede mostrar marcadas diferencias en la motilidad, vitalidad, concentracin y morfologa espermtica. Para estar seguro de obtener datos reproducibles, la muestra debe mezclarse bien antes de tomar las alcuotas para la evaluacin y los resultados de las alcuotas deben concordar antes de aceptar los valores. La concordancia entre las rplicas se ha determinado en el nmero de espermatozoides por la distribucin de Poisson y para porcentajes en la distribucin binomial (tabla 1).

Recuadro 1. Mezcla completa del semen. Una vez licuada la muestra de semen se inicia el estudio microscpico, no obstante, debe tomarse en cuenta que antes de extraer una alcuota de semen para la evaluacin, debe mezclarse bien la muestra en su envase original, no vigorosamente, evitando la formacin de burbujas. Esto puede lograrse por aspiracin de la muestra 10 veces con una pipeta de plstico desechable (estril cuando sea necesario) con cavidad amplia (aproximadamente 1,5 mm de dimetro). No mezclar con un vrtex a alta velocidad ya que podra daar los espermatozoides.

P g i n a | 22 3.2. ELABORACIN DE LA PREPARACIN HMEDA

Una vez mezclada la muestra, tomar inmediatamente una alcuota de 10 l, de manera que no d tiempo a los espermatozoides de sedimentar, colocarla en un portaobjeto limpio y cubrirla con un cubreobjetos de 22 mm x 22 mm, evitando la formacin de burbujas de aire. La preparacin debe examinarse rpidamente.

El volumen del semen y las dimensiones del cubreobjetos estn estandarizados, de manera que el anlisis se lleva a cabo en una preparacin de profundidad fija, aproximadamente, de 20 m (vase recuadro 2), que permite a los espermatozoides nadar libremente.

Recuadro 2. Profundidad de las preparaciones hmedas La profundidad de una preparacin (D, m) es el volumen de la muestra ( V, l= mm3 ) por el rea sobre la cual est esparcida (A, mm2), de modo que: D= V/A As pues, 10 l de semen sobre un portaobjetos cubierto con un cubreobjetos de 22 mm x 22 mm (rea= 482 mm2), proporciona una cmara con una profundidad de 20,7 m; 6,5 l de muestra cubierta con un cubreobjetos de 18 mm x 18 mm (rea de 324 mm2) proporciona una profundidad de 20,1 m; 11 l de muestra cubierta por un cubreobjetos de 21 mm x 26 mm (rea 546 mm2) proporciona una profundidad de 20,1 m. En ocasiones, se requiere de una cmara ms profunda: 40 l de muestra cubierta por un cubreobjetos de 24 mm x 50 mm (rea de 1.200 mm2) proporciona una profundidad de 33,3 m.

Nota 1: Una profundidad de la cmara menor a 20 m, restringe el movimiento de rotacin de los espermatozoides.

Nota 2: Si la cmara es demasiada profunda, ser difcil de evaluar los espermatozoides que se mueven dentro y fuera de foco.

Nota 3: Si el nmero de espermatozoides por campo visual vara de forma considerable, la muestra no es homognea. En tales casos, la muestra de semen se debe mezclar otra vez y realizar una nueva preparacin.

P g i n a | 23 3.3. AGREGACIN DE ESPERMATOZOIDES

La adherencia de los espermatozoides inmviles ya sea entre s o de espermatozoides mviles a las hebras de moco, clulas no espermticas o detritos se considera que la agregacin no es especfica (figura 1) y debe reportarse como tal.

Fotomicrografa cortesa de C Brazil

Figura 1. Agregacin no especfica de espermatozoides. Observe los espermatozoides agregados con una clula epitelial (a), detritos (b) y espermatozoides (c y d).

3.4. AGLUTINACIN DE ESPERMATOZOIDES

La aglutinacin se refiere, especficamente, a la adherencia de espermatozoides mviles entre s, cabeza a cabeza, cola a cola o en forma mixta. La movilidad es a menudo vigorosa con un movimiento frentico agitado, sin embrago, a veces los espermatozoides estn tan aglutinados que su movimiento es limitado. Cualquier espermatozoide mvil que se pega el uno al otro por sus cabezas, colas o piezas intermedias debe reportarse.

Se debe registrar el tipo principal de aglutinacin (el que refleja el grado (grados 1-4) y el sitio de unin (grados A-E)) (figura 2):

Grado 1: aislado (<10 espermatozoides aglutinados, muchos espermatozoides sueltos). Grado 2: moderado (10-50 espermatozoides aglutinados, espermatozoides sueltos). Grado 3: abundante (>50 espermatozoides aglutinados, algunos espermatozoides sueltos).

P g i n a | 24 Grado 4: denso (todos los espermatozoides estn aglutinados y las aglutinaciones estn interconectadas).

Grados de aglutinacin: Sitios de unin: A. Cabeza a cabeza.

B. Cola a cola (las cabezas se ven sueltas y el movimiento de aglutinacin es claro.

C. Punta de la cola a punta de la cola.

D. Mixta (aglutinaciones claras de cabeza a cabeza y cola a cola). E. Maraa (cabezas y colas enredadas. No son claras las aglutinaciones de las cabezas, como lo son las aglutinaciones cola a cola).

Reproducido por Rose et al. (1976) con permiso de Wiley-Blackwell

Figura 2. Tipos de aglutinacin.

Comentario 1: La presencia de aglutinacin no es evidencia suficiente para deducir una causa inmunolgica de infertilidad, sin embargo, es sugestivo de la presencia de anticuerpos antiespermatozoides, por lo que se requiere de exmenes adicionales.

Comentario 2: La aglutinacin severa puede afectar la evaluacin de la motilidad y concentracin espermtica.

3.5. MOTILIDAD DE LOS ESPERMATOZOIDES

La importancia de la motilidad espermtica progresiva se relaciona con las tasas de embarazo.

P g i n a | 25 La motilidad en el semen se debe evaluar lo antes posible despus de la licuefaccin de la muestra, de preferencia a los 30 min, en cualquier caso dentro de una hora, despus de la eyaculacin, para limitar los efectos nocivos de la deshidratacin, el pH o los cambios de temperatura sobre la motilidad.

Nota 1: El procedimiento se puede realizar a temperatura ambiente o a 37C con una platina del microscopio con calefaccin, cada laboratorio debe estandarizarlo. Si la motilidad espermtica se evalu a 37C, la muestra debe ser incubada a esta temperatura y la preparacin hacerse con portaobjetos y cubreobjetos precalentados.

Nota 2: Se recomienda el uso de un ocular con retcula cuadriculada (figura 3a) para limitar el rea vista, lo que permite que la misma zona de la lmina, sea evaluada en ambas fases del conteo. Evaluar en primer lugar la motilidad progresiva, a continuacin, la motilidad no progresiva y los inmviles. Limitar la zona y, por lo tanto, el nmero de espermatozoides evaluados, asegura que varias reas de la preparacin sean examinadas para la motilidad.

3.5.1. Categoras de los movimientos de los espermatozoides

Se recomienda un sistema simple de clasificacin de la motilidad, que distingue a los espermatozoides con motilidad progresiva o no progresiva de los que son inmviles. La movilidad de cada espermatozoide se clasifica de la siguiente manera:

Motilidad progresiva (PR): espermatozoides que se mueven activamente, ya sea de forma lineal o en un crculo grande, independientemente de la velocidad.

Motilidad no progresiva (NP): todos los otros patrones de movilidad con una ausencia de progresin.

Inmviles (IM): sin movimiento.

Comentario 1: La edicin anterior de este manual recomienda que los espermatozoides con motilidad progresiva deben ser catalogados como rpidos o lentos, con una

P g i n a | 26 velocidad superior a 25 m/s a 37C, denominado "grado A". Sin embargo, es difcil para el analista definir la progresin hacia adelante con exactitud y sin sesgo.

Comentario 2: Es importante especificar la motilidad total (PR + NP) o la motilidad progresiva (PR).

3.5.2. Preparacin y evaluacin de una muestra para la motilidad La preparacin hmeda descrita arriba, es la que se utiliza para evaluar la motilidad espermtica. Se deben montar dos preparaciones hmedas, reiterando que se debe mezclar bien la muestra de semen antes de tomar cada alcuota y que stas deben tomarse, inmediatamente, despus de mezclar, para as no dar tiempo de que los espermatozoides sedimenten. Antes de observar al microscopio, esperar hasta que los espermatozoides y otros elementos dejen de moverse por la corriente (dentro de 60 s). Examinar la preparacin con microscopio de contraste de fase con magnificacin de 200x o 400x. La evaluacin se puede realizar en un rea de al menos 5 mm desde el borde del cubreobjetos (figura 3b), para evitar que se sequen los artefactos que afectan la motilidad. Explorar sistemticamente la lmina para evitar ver varias veces la misma zona. Cambiar con frecuencia los campos. No se deben elegir los campos sobre la base del nmero de espermatozoides mviles visto (la eleccin del campo debe ser al azar). Empezar a sumar en un campo determinado al azar. No espere a que los espermatozoides naden dentro del campo o cuadrcula para anotar.

P g i n a | 27 Evale la motilidad de todo espermatozoide dentro de un rea definida del campo. Esto es ms fcil de lograr usando un ocular con retcula cuadriculada (figura 3a). Seleccione la porcin del campo o cuadrcula que se contar dependiendo de la concentracin de espermatozoides, es decir, cuente slo la fila superior de la cuadrcula si la concentracin de espermatozoides es alta; cuente la cuadrcula completa si la concentracin es baja. Explore y cuente, rpidamente, para evitar sobreestimar el nmero de espermatozoides mviles. El objetivo es contar todos los espermatozoides mviles en la cuadrcula instantneamente, evitando contar tanto los presentes inicialmente, ms los que nadan en la cuadrcula durante la calificacin, lo cual inclinara el resultado a favor de espermatozoides mviles. Luego, en la misma cuadrcula cuente los espermatozoides no progresivos y finalmente los inmviles. Con experiencia se pueden anotar las 3 categoras de movimientos de los espermatozoides al mismo tiempo y anotar grandes reas de la cuadrcula. La cuenta para cada una de las categoras de motilidad de los espermatozoides se puede llevar con la ayuda de un contador de laboratorio. Evaluar al menos 200 espermatozoides en un total de al menos 5 campos en cada preparacin hmeda, a fin de lograr un error de muestreo bajo aceptable. Calcular la media y la diferencia entre los dos porcentajes para los grados de motilidad ms frecuente (PR, NP o IM) en las preparaciones hmedas. Determinar la aceptabilidad de la diferencia a partir de la tabla 1. Si la diferencia entre los porcentajes es aceptable, se reporta la media de los porcentajes para cada categora de motilidad (PR, NP e IM). Si la diferencia es demasiado alta, se toman dos alcuotas de la muestra de semen, se hacen dos nuevos preparados y se repite la evaluacin.

P g i n a | 28 Reportar el porcentaje promedio para cada categora de motilidad al nmero entero ms prximo.

Nota 1: Se debe evaluar slo los espermatozoides intactos (definido como aquellos que poseen una cabeza y una cola, ya que slo los espermatozoides intactos se cuentan para la concentracin de espermatozoides. No contar cabezas de alfiler mviles.

Nota 2: Si los espermatozoides se contaron en dos fases (es decir, primero PR, seguido de NP e IM en una misma rea) y se realiza un recuento de 200 espermatozoides antes de contar todas las categoras de motilidad en esa misma zona, se debe continuar contando ms all de 200 espermatozoides, hasta que todas las categoras se hayan contado, con el fin de evitar inclinacin hacia la categora de la motilidad que se registra primero.

Nota 3: Es comn sobrestimar la motilidad espermtica, sin embargo, a menudo esto se puede evitar, invirtiendo el orden del anlisis (NP e IM, primero), utilizando ocular con retcula, y siendo conscientes de, y evitando en la medida de lo posible, las fuentes potenciales de sesgo.

Nota 4: En raras ocasiones, con muestras no homogneas, incluso una tercera serie de repeticiones puede ofrecer diferencias inaceptables. En este caso, calcular la media de todas las rplicas y tomar en cuenta esto en el reporte.

P g i n a | 29

(a)

(b)

>5 mm

Figura 3. Apoyo en la evaluacin de la motilidad espermtica. (a) Un ocular con retcula, facilita el recuento de espermatozoides mviles e inmviles. (b) Seleccin sistemtica de los campos de evaluacin de la motilidad de los espermatozoides, por lo menos 5 mm separado de los bordes del cubreobjetos.

Tabla 1. Diferencias aceptables entre dos porcentajes para un promedio dado, determinado a partir del contaje de 200 espermatozoides por rplica (total 400 contados). Media (%) 0 1 2 3-4 5-7 8-11 12-16 17-23 24-34 35-65 Diferencia aceptable* 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Media (%) 66-76 77-83 84-88 89-92 93-95 96-97 98 99 100 Diferencia aceptable* 9 8 7 6 5 4 3 2 1

*Basado en el intervalo de confianza del 95%

P g i n a | 30 3.5.3. Ejemplos de trabajo

Ejemplo 1: Los valores del recuento de 200 espermatozoides por duplicado son:

Progresivos: 30% y 50%. No progresivos: 5% y 15%. Inmviles: 65% y 35%.

La categora ms comn es inmviles, con una media de 50% y una diferencia de 30%. Para una media de 50%, la diferencia aceptada es 10%, como la diferencia= 30%, es mayor a 10% (tabla 1), los valores se rechazan, y se deben montar dos nuevas preparaciones hmedas y evaluarlas otra vez.

Ejemplo 2: Los valores del recuento de 200 espermatozoides por duplicado son:

Progresivos: 37% y 28%. No progresivos: 3% y 6%. Inmviles: 60% y 66%.

La categora ms comn es inmviles, con una media de 63% y una diferencia de 6%. Se espera que para una media de 63%, una diferencia de hasta 10% ocurra por azar. Como la diferencia= 6%, es menor, los valores son aceptados y la media de los valores se reportan: PR: 32%; NP: 4%; IM: 63%.

3.5.4. Lmite inferior de referencia

El lmite inferior de referencia de la motilidad total (PR + NP) es de 40% (percentil 5, IC 95%: 38-42).

El lmite de referencia inferior de la motilidad progresiva (PR) es de 32% (percentil 5, IC 95%: 31-34).

Comentario: El nmero total de espermatozoides progresivamente mviles en el eyaculado es de gran importancia biolgica. Este resultado se obtiene multiplicando el

P g i n a | 31 nmero total de espermatozoides en el eyaculado por el porcentaje de espermatozoides con motilidad progresiva (PR).

3.6. VITALIDAD ESPERMTICA

La vitalidad espermtica, como evaluador de la integridad de la membrana de las clulas, puede determinarse rutinariamente en todas la muestras, no obstante, es especialmente importante para muestras con menos de un 40% de espermatozoides progresivamente mviles. Este examen puede proporcionar un chequeo de la evaluacin de la motilidad, ya que el porcentaje de clulas muertas no debe exceder (dentro de error de muestreo) el porcentaje de espermatozoides inmviles. El porcentaje de clulas viables, normalmente, es superior al de las clulas mviles.

El porcentaje de espermatozoides vivos se evala identificando aquellos con una membrana celular intacta, por exclusin de colorantes o por hinchamiento hipotnico. El mtodo de exclusin del colorante se basa en el principio de que las membranas citoplasmticas daadas, como las que se encuentran en las clulas muertas, permite la entrada del colorante a travs de la membrana impermeable. La prueba de hinchamiento hipoosmtico supone que slo las clulas con membranas intactas (clulas vivas) aumentarn en soluciones hipotnicas. Algunos ejemplos de cada prueba se describen a continuacin.

La vitalidad espermtica debe evaluarse lo antes posible despus de la licuefaccin de la muestra de semen, preferiblemente, a los 30 min, sin embargo, en cualquier caso dentro de una hora de la eyaculacin, para limitar los efectos nocivos de la deshidratacin o de los cambios de temperatura sobre la vitalidad.

Comentario 1: Es clnicamente importante saber si los espermatozoides inmviles estn vivos o muertos. Los resultados de la vitalidad deben evaluarse junto con los resultados de la motilidad de la misma muestra de semen.

P g i n a | 32 Comentario 2: La presencia de una gran proporcin de clulas vivas, pero inmviles puede ser indicativo de defectos estructurales en el flagelo; un alto porcentaje de clulas inmviles y no viables (necrozoospermia) puede indicar patologa del epiddimo.

3.6.1. Prueba de vitalidad con eosina

Este mtodo es fcil y rpido, sin embargo, las lminas no pueden conservarse para fines de control de calidad.

3.6.1.1. Preparacin de reactivos

1. ClNa 0,9% (p/v): disolver 0,9 g de NaCl en 100 ml de agua destilada.

2. Eosina Y 0,5% (p/v): disolver 0,5 g de esosina Y (ndice de color 45380) en 100 ml de NaCl 0,9 g.

Nota: Algunas soluciones de eosina disponibles en el mercado son soluciones acuosas hipotnicas que producir tensin en los espermatozoides y dar resultados falsos positivos. Si se utiliza esta solucin, aadir 0,9 g de NaCl en 100 ml de solucin para elevar la osmolalidad.

3.6.1.2. Procedimiento

1. Mezclar bien la muestra de semen.

2. Tomar una alcuota de 5 l de semen y combinarlo con 5 l de la solucin de eosina sobre un portaobjetos. Mezcle con la punta de una pipeta la muestra con movimientos giratorios rpidos sobre el portaobjetos.

3. Coloque un cubreobjetos de 22 mm x 22 mm y espere 30 s.

4. Mezclar, nuevamente, la muestra de semen y monte un duplicado, repitiendo los pasos 2 y 3.

P g i n a | 33 5. Examinar cada lmina, preferiblemente, con ptica de contraste de fase negativa a 200x o 400x de magnificacin.

6. Contar el nmero de clulas coloreadas (muertas) y no coloreadas (vivas) con la ayuda de un contador de laboratorio.

7. Evaluar 200 espermatozoides en cada replicado, a fin de lograr un error de muestreo bajo aceptable. 8. Calcular la media y la diferencia de los dos porcentajes de clulas vivas, evaluados en las lminas.

9. Determinar la aceptabilidad de la diferencia a partir de la tabla 1.

10. Si la diferencia entre los porcentajes es aceptable, reportar la media de los porcentajes de vitalidad. Si la diferencia es demasiada alta, hacer dos nuevos preparados a partir de dos nuevas alcuotas de semen y repetir la evaluacin.

11. Reportar el porcentaje medio de espermatozoides vivos, redondeado al valor entero ms cercano.

3.6.1.3. Anotaciones

1. Los espermatozoides vivos tienen cabezas blancas y rosado claro, mientras que los espermatozoides muertos tienen cabezas coloreadas de rojo o rosado oscuro.

2. Si la coloracin se limita a una parte de la regin del cuello y el resto de la cabeza no est coloreada, esto se considera una fuga en la membrana del cuello, no un signo de muerte celular y desintegracin total de la membrana. Estas clulas deben reportarse como vivas.

3. Si es difcil discernir cabezas coloreadas rosado plido, usar nigrosina para incrementar el contraste del fondo.

P g i n a | 34 3.6.1.4. Lmite de referencia inferior

El lmite de referencia inferior para la vitalidad (espermatozoides con membrana intacta) es de 58% (percentil 5, IC 95%: 55-63).

Comentario: El nmero total de espermatozoides con membrana intacta en el eyaculado, es de gran importancia biolgica. Este resultado se obtiene multiplicando el nmero total de espermatozoides en el eyaculado por el porcentaje de clulas con membrana intacta.

3.7. NMERO DE ESPERMATOZOIDES

El nmero total de espermatozoides por eyaculado y la concentracin de espermatozoides estn relacionados tanto con el tiempo de embarazo como con las tasas de embarazo y son predictores de la concepcin. Ms datos correlacionados con el nmero total de espermatozoides con resultados reproductivos estn garantizados.

El nmero de espermatozoides en el eyaculado se calcula a partir de la concentracin de espermatozoides, que se mide durante la evaluacin del semen. En el eyaculado normal, cuando el tracto en el hombre no est obstruido y el tiempo de abstinencia es corto, el nmero total de espermatozoides en el eyaculado se correlaciona con el volumen testicular, por lo tanto, es una medida de la capacidad de los testculos para producir espermatozoides y de la permeabilidad del sistema de conductos del hombre. La concentracin de espermatozoides en el semen, mientras se relaciona con tasas de fecundacin y embarazo, es influida por el volumen de las secreciones de las vesculas seminales y la prstata y no es una medida especfica de la funcin testicular.

Comentario 1: Los trminos "nmero total de espermatozoides" y "concentracin de espermatozoides" no son sinnimos. La concentracin espermtica se refiere al nmero de espermatozoides por unidad de volumen de semen y es una funcin del nmero de espermatozoides emitidos y el volumen de fluido que los diluye. El nmero total de espermatozoides se refiere al nmero total de espermatozoides en el eyaculado

P g i n a | 35 completo, se obtiene multiplicando la concentracin de espermatozoides por el volumen del semen.

3.7.1. Pasos para la determinacin del nmero de espermatozoides Examinar una preparacin bien mezclada de semen licuado sin diluir entre cubreobjetos y portaobjetos, para determinar la dilucin apropiada y cmaras adecuadas a usar. Esto es, por lo general, la preparacin hmeda utilizada para la evaluacin de la motilidad. Mezclar la muestra de semen y preparar las diluciones con fijador. Cargar el hemocitmetro y permitir que los espermatozoides se asienten, usando una cmara hmeda. Evaluar la muestra dentro de 10-15 min (despus de que la evaporacin tiene efectos notables sobre la posicin de los espermatozoides dentro de la cmara). Contar 200 espermatozoides por rplica. Comparar la cuenta de los replicados, para determinar si son aceptable. En caso afirmativo, proceder a los clculos, si no, preparar las diluciones de nuevo. Calcular la concentracin de espermatozoides por ml. Calcular el nmero total de espermatozoides por eyaculado.

3.7.2. Hemocitmetro de Neubauer mejorado

El hemocitmetro de Neubauer tiene dos cmaras separadas para contar, cada una tiene gravada unas lneas de cuadrcula microscpica de 3 x 3 mm sobre la superficie del vidrio. Se utiliza con un cubreobjetos grueso especial (nmero 4, 0,44 mm de espesor),

P g i n a | 36 que se coloca sobre las cuadrculas y se apoya en pilares de vidrio de 0,1 mm por encima del piso de la cmara. Cada rea de conteo se divide en nueve cuadrados de 1 mm x 1 mm. Estos cuadrados son referidos por los nmeros que aparecen en la figura 4.

Fotomicrografa cortesa de C Brazil.

Figura 4. Diagrama del hemocitmetro de Neubauer: los nueve cuadrados grandes de la cmara de Neubauer (panel izquierdo), cuadrado grande central (nmero 5), con los 25 cuadrados medianos (panel central), y una fotomicrografa de una parte de una cmara llena (derecha), mostrando uno de los 25 cuadrados medianos del cuadrado grande central (el crculo en el cuadrado en el panel del medio) delimitado por lneas triples y contiene 16 cuadrados pequeos.

Con una profundidad de 100 m cada cuadrado grande tiene una capacidad en volumen de 100 nl. Los cuadrados grandes enumerados como 1, 3, 7 y 9, contienen 4 filas de 4 cuadrados medianos, con 6,25 nl de capacidad cada uno. Los cuadrados grandes nmeros 2 y 8 contienen 4 filas de 5 cuadrados medianos, cada uno de 5 nl; y el cuadrado grande central nmero 5, contiene 5 filas de 5 cuadrados medianos, cada uno de 4 nl (figura 4, panel central). Cada uno de los 25 cuadrados medianos del cuadrado grande central es subdividido en 16 cuadrados pequeos (figura 4, panel derecho). Por lo tanto, los cuadrados 1, 2, 3, 7, 8 y 9 tienen 4 filas que sostienen 25 nl en volumen por fila, mientras que los cuadrados 4, 5 y 6, tienen 5 filas que sostiene 20 nl por fila.

Dependiendo de la dilucin y el nmero de espermatozoides contados, se usan diferentes reas de la cmara para determinar la concentracin de espermatozoides. Para diluciones 1+19 (1:20) y 1+4 (1:5), las filas del cuadrado grande central nmero 5 se deben contar y, cuando es necesario, los cuadrados grandes nmero 4 y 6. Para la dilucin 1+1 (1:2), se deben contar todos los 9 cuadrados grandes, si es necesario para lograr una cuenta de 200 espermatozoides.

P g i n a | 37 3.7.3. Usando la cuadrcula del hemocitmetro Contar slo los espermatozoides completos (con cabeza y cola). En los espermatozoides la cuenta est determinada por la ubicacin de la cabeza; la orientacin de la cola no es importante. El lmite de un cuadrado est indicado por la lnea media de las tres lneas que rodean al cuadrado mediano, por lo que, un espermatozoide se cuenta si la mayor parte de su cabeza se encuentra entre las dos lneas internas, y no se cuenta, si la mayor parte de su cabeza se encuentra entre las dos lneas externas (figura 5, panel izquierdo). Para evitar el recuento del mismo espermatozoide en los cuadrados adyacentes, un espermatozoide con la cabeza sobre la lnea que divide dos cuadrados adyacentes se debe contar slo si esa lnea es una de las dos lneas del lmite perpendicular. Por ejemplo, la clula puede ser contada si la mayor parte de la cabeza del espermatozoide se encuentra sobre lnea central inferior o izquierda, que forman una "L" (figura 5, panel central), y no se cuenta, cuando se encuentra en la lnea central superior o derecha (figura 5, panel derecho).

Nota: Si hay muchos espermatozoides sin cabezas (cabezas de alfiler) o sin colas (cabezas solas), su presencia debe ser reportada. Si se considera necesario, su concentracin puede ser evaluada de la misma manera que para los espermatozoides o su frecuencia relativa puede determinarse a partir de preparaciones teidas.

P g i n a | 38

Fotomicrografa cortesa de C. Brazil.

Figura 5. Cuadrados de la cuadrcula en las que se cuentan los espermatozoides. La lnea media de las tres lneas define los lmites del cuadrado (lnea negra, panel izquierdo). Todos los espermatozoides dentro del cuadrado central se cuentan, as como aquellos con la cabeza entre las dos lneas internas (crculos blancos), pero no aquellos cuyas cabezas se encuentran entre las dos lneas exteriores (crculos negros). Un espermatozoide con la mayor parte de su cabeza localizada sobre la lnea central se cuenta, slo si esa lnea es la lnea inferior o izquierda del cuadrado (crculos blancos, panel central), no se cuenta, si es la lnea superior o derecha del cuadrado (crculos negros, panel derecho).

3.7.4. Fijador para diluir el semen

1. Disolver 50 g de bicarbonato de sodio (NaHCO3) y 10 ml de formalina al 35% (v/v) en 1000 ml de agua destilada.

2. Si lo desea, aadir 0,25 g de azul tripano (ndice de color 23859) o 5 ml de violeta de genciana (ndice de color 42555) saturado (>4 mg/ml) para resaltar las cabezas de los espermatozoides.

3. Almacenar a 4C. Si se forman cristales en la solucin, pasar sta a travs de un filtro de 0,45 m, antes de su uso.

P g i n a | 39 3.7.5. Importancia de contar suficientes espermatozoides

Para reducir los errores de muestreo, un nmero crtico de espermatozoides tienen que ser contados (de preferencia un total de al menos 400, a partir de las rplicas con recuentos de aproximadamente 200 cada uno) (vase tabla 2).

Tabla 2. Errores de muestreo redondeados (%) de acuerdo al nmero total de espermatozoides contados. Total (N) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 15 20 Error de muestreo (%) 100 70,7 57,7 50 44,7 40,8 37,8 35,4 33,3 31,6 25,8 22,4 Total (N) 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 Error de muestreo (%) 20 18,3 16,9 15,8 14,9 14,1 13,5 12,9 12,4 12 11,5 11,2 Total (N) 85 90 95 100 150 200 250 300 350 400 450 500 Error de muestreo (%) 10,8 10,5 10,3 10 8,2 7,1 6,3 5,8 5,3 5 4,7 4,5

Comentario 1: Contando muy pocos espermatozoides producir un resultado incierto, que puede tener consecuencias para el diagnstico y tratamiento. Esto es inevitable cuando se toman espermatozoides con fines teraputicos y el nmero de espermatozoides es bajo.

Comentario 2: Cuando el volumen del semen es pequeo y se cuentan

menos

espermatozoides de lo recomendado, la precisin de los valores obtenidos se reducir considerablemente. Si menos de 200 espermatozoides se cuentan por rplica, se reporta el error de muestreo indicado en tabla 2.

P g i n a | 40 3.7.6. Procedimiento de rutina para el recuento

Las diluciones 1+4 (1:5) y 1+19 (1:20) son apropiadas para un amplio rango de concentraciones de espermatozoides, obtenindose alrededor de 200 espermatozoides en uno o todos los cuadrados del hemocitmetro enumerados como 4, 5 y 6 (vase recuadros 1 y 3).

Recuadro 3. Lograr 200 espermatozoides por rplica en los tres cuadrados centrales de la cmara de Neubauer. Si hay 100 espermatozoides por campo de alto poder (CAP), de 4 nl (vase recuadro 4) en la preparacin hmeda inicial, hay tericamente 25 espermatozoides por nl (25.000/l o 25. 000.000/ ml). Como el cuadrado grande central (nmero 5) almacena 100 nl, habra 2.500 espermatozoides dentro del mismo. Diluir la muestra 1+4 (1:5) reducira el fondo y el nmero de espermatozoides a alrededor de 500 por cuadrado, lo cual es suficiente para un error de muestreo bajo aceptable. Si hay 10 espermatozoides por CAP de la preparacin hmeda, habra 2,5 por nl y 250 en el cuadrado grande central. Diluir la muestra 1+1 (1:2), reducira el fondo y el nmero de espermatozoides a alrededor de 125 por cuadrado, lo que dara 375 espermatozoides, en los tres cuadrados enumerados como 4, 5 y 6, esto es suficiente para un aceptable error de muestreo bajo.

3.7.7. Determinacin de la dilucin requerida

La dilucin necesaria del semen, que permite que el nmero de espermatozoides se mida con precisin, se determina a partir de una preparacin de semen sin diluir. Esto es, por lo general, la preparacin hmeda utilizada para la evaluacin de la motilidad. Examine una de las preparaciones hmedas para estimar el nmero de espermatozoides por CAP (200x o 400x). Un CAP es equivalente a 16 nl (a 200x) o 4 nl (a 400x) (vase recuadro 4). Si se observan los espermatozoides, cuntelos, determine la dilucin necesaria a partir de la tabla 3.

P g i n a | 41 Si los espermatozoides no se observan, examine el duplicado de la preparacin.

Recuadro 4. Volmenes observados por CAP, en una preparacin hmeda de 20 m de profundidad. El volumen de semen observado en cada campo microscpico depende del rea del campo (r2, donde es de aproximadamente 3,142 y r es el radio del campo microscpico) y la profundidad de la cmara (20,7 m, para la preparacin hmeda). El dimetro del campo microscpico se puede medir con un micrmetro o se puede calcular dividiendo el dimetro de la apertura del ocular por el aumento del objetivo. Con un objetivo de 40x y un ocular de 10x, la apertura es de 20 mm, el campo microscpico tiene un dimetro, aproximadamente, de 500 m (20 mm/40). En este caso, r = 250 , r2 = 62.500 m2, r2 = 196.375 m2 y el volumen es de 4.064.962 m3o cerca de 4 nl. Con un objetivo de 20x y un ocular de 10x, la apertura es de 20 mm, el campo microscpico tiene un dimetro, aproximadamente, de 1.000 m (20 mm/20). En este caso, r = 500 , r2 = 250.000 m2, r2 = 785.500 m2 y el volumen es de 16.259.850 m3o cerca de 16 nl.

Tabla 3. Diluciones de semen requeridas de acuerdo al campo microscpico de alto poder, cmara a usar y reas a evaluar.
Espermatozoides por campo de 400x >101 16-100 2-15 Espermatozoides por campo de 200x >404 64-400 8-60 Dilucin requerida 1:20 (1+19) 1:5 (1+4) 1:2 (1+1) 1:2 (1+1) l de semen 50 50 50 l de fijador 950 200 50 Cmara Neubauer mejora Neubauer mejorada Neubauer mejorada Neubauer mejorada o Gran volumen rea a evaluar
cuadrados

5, 4, 6
cuadrados

5, 4, 6
cuadrados

5, 4, 6
todos los 9 cuadrados lmina completa

<2

<8

50

50

P g i n a | 42 Nota 1: Las pipetas de clulas blancas de la sangre y las automticas que dependen del desplazamiento de aire, no son lo suficientemente exactas como para hacer diluciones volumtricas del semen viscoso, usar pipetas de desplazamiento positivo.

Nota 2: Con fines de diagnstico, las muestras de semen para su anlisis no deben ser inferiores a 50 l de volumen, para evitar errores asociados al pipetear volmenes pequeos.

Nota 3: Si hay muy pocos espermatozoides por campo a la dilucin recomendada, preparar otra a una menor dilucin. Si hay demasiada superposicin de espermatozoides por campo a la dilucin recomendada, preparar otra, de mayor dilucin.

Comentario 1: Si el nmero de espermatozoides en la preparacin hmeda inicial es bajo (<4 por CAP 400x: aproximadamente 1x106/ml) un nmero exacto de espermatozoides puede no ser necesario. En estos casos, no se toman nuevas acciones. Un nmero de espermatozoides por CAP de 400x <4 es, aproximadamente, <1x106/ml, esto es suficiente para la mayora de los propsitos clnicos, reportar la concentracin de espermatozoides como <2x106/ml (tomar en cuenta el alto error de muestreo asociado con bajo nmero de espermatozoides), con una nota que indique si se observaron o no espermatozoides mviles.

3.7.8. Preparacin de las diluciones y carga de las cmaras del hemocitmetro Humedecer la superficie de la cmara, respirando sobre ella. Asegure el cubreobjetos sobre las cmaras de conteo presionando firmemente sobre los pilares. La iridiscencia (anillos de Newton mltiples) entre las dos superficies de vidrio confirma la correcta posicin del cubreobjetos. Ms lneas, mejor es el ajuste; slo una o dos lneas pueden indicar problemas con la variacin de la profundidad de cmara. Usar una micropipeta de desplazamiento positivo, para dispensar el volumen apropiado de fijador dentro de dos viales para diluir.

P g i n a | 43 Mezclar la muestra de semen bien. Aspirar la cantidad de semen apropiado, inmediatamente, despus de mezclar, de manera de no dar tiempo a que los espermatozoides sedimenten. Limpie el semen de la parte exterior de la punta de la pipeta, teniendo cuidado de no tocar la abertura de la punta. Dispensar el semen en el fijador y enjuagar la punta de la pipeta aspirando y expulsando el fijador. Mezclar nuevamente la muestra de semen y preparar un duplicado, siguiendo los pasos descritos arriba. Mezclar la primera dilucin con el vrtex durante 10 s a mxima velocidad. Tomar de inmediato 10 l de la suspensin fijada, para evitar la sedimentacin de los espermatozoides. Toque la punta de la pipeta con cuidado contra el borde inferior de una de las cmaras en el surco en forma de V. Presione el mbolo de la pipeta lentamente, permitiendo que la cmara se llene por capilaridad. El cubreobjetos no debe moverse durante el llenado, y la cmara no debe quedar demasiado llena (se puede ver que el cubreobjetos se mueva) o poco llena (se nota cuando el aire ocupa algunas de las reas de la cmara). Mezclar la segunda dilucin y tome de inmediato una segunda alcuota de 10 l. Cargue la segunda cmara del hemocitmetro siguiendo los pasos anteriores. Guarde el hemocitmetro en posicin horizontal, por lo menos durante 4 min a temperatura ambiente, en una cmara hmeda (por ejemplo papel de filtro impregnado con agua destilada dentro de en una placa de Petri) para evitar que

P g i n a | 44 se sequen. Las clulas inmovilizadas sedimentarn dentro de la cuadrcula de la cmara durante este tiempo.

3.7.9. Evaluacin del nmero de espermatozoides en la cmara de Neubauer El nmero de espermatozoides, se debe evaluar en las dos cmaras del hemocitmetro. Si coinciden los dos valores lo suficiente, las alcuotas tomadas pueden ser consideradas representativa de la muestra. Examinar el hemocitmetro con microscopio de contraste de fase con 200x o 400x de magnificacin. Contar al menos 200 espermatozoides por rplica, a fin de lograr un error de muestreo bajo aceptable. Primero, evaluar el cuadrado grande central (nmero 5 en la figura 4) de la cmara de Neubauer, fila por fila. Contar hasta que por lo menos 200 espermatozoides se hayan observado y se haya examinado una fila completa (de las 5 del cuadrado grande). El contaje se debe hacer por filas completas, no detenerse a la mitad de una fila. Si 200 espermatozoides no se observan en las 5 filas del cuadrado grande central, seguir contando en las filas de los dos cuadrados adyacentes (nmeros 4 y 6 en la figura 4). Anote el nmero de filas evaluadas para llegar a un mnimo de 200 espermatozoides. El mismo nmero de filas se contar en la otra cmara del hemocitmetro. Cuente el nmero de espermatozoides y filas con la ayuda de un contador para laboratorio. Cambie a la segunda cmara del hemocitmetro y realice el contaje por duplicado, contando el mismo nmero de filas (el mismo volumen) como en la primera, incluso si esto se traduce en menos de 200 espermatozoides.

P g i n a | 45 Calcular la suma y la diferencia de los dos nmeros. Determinar la aceptabilidad de la diferencia a partir de la tabla 4. Si la diferencia es aceptable, calcular la concentracin. Si la diferencia es demasiado alta, preparar dos diluciones nuevas y repetir por duplicado las cuentas. Reportar la concentracin de espermatozoides a dos cifras significativas. Calcular el nmero total de espermatozoides por eyaculado.

Nota 1: Si hay menos de 200 espermatozoides en los cuadrados nmeros 4, 5 y 6, no seguir contando en los siguientes cuadrados 1, 2, 3, 7, 8 9, ya que el volumen de cada fila en estos cuadrados difiere del de las filas de los cuadrados nmeros 4, 5 y 6. En este caso, preparar y evaluar dos diluciones ms bajas. Evaluar dos veces la misma cmara o evaluar las dos cmaras llenas a partir de una dilucin simple no es un duplicado real, ya que no permite la deteccin de errores de muestreo, de la mezcla y dilucin.

Tabla 4. Diferencias aceptables entre dos cuentas a partir de los replicados para una suma determinada. Suma 144-156 157-169 170-182 183-196 197-211 212-226 227-242 243-258 259-274 275-292 293-309 310-328 Diferencia aceptable* 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 Suma 329-346 347-366 367-385 386-406 407-426 427-448 449-470 471-492 493-515 516-538 539-562 563-587 Diferencia aceptable* 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47

* Basado en el intervalo de confianza del 95%

P g i n a | 46 3.7.10. Clculo de la concentracin de espermatozoides en el semen

Se recomienda calcular e informar sobre la concentracin de espermatozoides en el semen. Aunque la concentracin no es una medida especfica de la funcin testicular, est relacionada con tasas de fecundacin y embarazo.

La concentracin de espermatozoides en el semen es su nmero ( N) dividido por el volumen en el que se encontraron, es decir, el volumen del nmero total (n) de filas examinadas en los replicados (20 nl para cada fila de los cuadrados grandes nmeros 4, 5 y 6), multiplicado por el factor de dilucin. Es decir:

C = (N/n) x (1/20) x factor de dilucin.

Para una dilucin 1+4 (1:5), usando los cuadrados 4, 5 y 6, la concentracin C = (N/n) x (1/20) x 5 espermatozoides por nl = ( N/n) x (1/4) espermatozoides/nl (o 106 por mililitro de semen).

Para una dilucin 1+19 (1:20), usando los cuadrados 4, 5 y 6, la concentracin C = (N/n) x (1/20) x 20 espermatozoides por nl = ( N/n) espermatozoides/nl (o 106 por mililitro de semen).

Para una dilucin 1:50 (1+49), usando los cuadrados 4, 5 y 6, la concentracin C = (N/n) x (1/20) x 50 espermatozoides por nl = ( N/n) x 2,5spermatozoa/nl (o 106 por mililitro de semen.

3.7.10.1. Ejemplos de trabajo

Ejemplo 1: Con una dilucin 1+19 (1:20), en el replicado 1 se contaron 201 espermatozoides en 7 filas, mientras que en el replicado 2 se contaron 245 espermatozoides en 7 filas. La suma de los contajes (201+245) es de 446 en 14 filas y la diferencia (245-201) es de 44. En la tabla 4, se ve que la diferencia es mayor a la esperada (41), por lo que se deben realizar nuevas diluciones por duplicado.

P g i n a | 47 Ejemplo 2: Con una dilucin 1+19 (1:20), en el replicado 1 se contaron 220 espermatozoides en 4 filas, mientras que en el replicado 2 se contaron 218 espermatozoides en 4 filas. La suma de los contajes (220+218) es de 438 en 8 filas y la diferencia (220-218) es 2. En la tabla 4, se ve que la diferencia es menor que la esperada (41), por lo que los valores son aceptados.

La concentracin de espermatozoides en la muestras para una dilucin 1+19 (1:20) es de C = (N/n) x 1,0 espermatozoides por nl, es decir, (438/8) x 1,0 = 54,75 espermatozoides/nl o 55x106 espermatozoides por ml de semen (con dos cifras significativas).

Nota: Para la dilucin 1+19 (1:20) usando los cuadrados 4, 5 y 6, la concentracin es fcil de calcular. El nmero total de espermatozoides contados, dividido por el nmero total de filas, es igual a evaluar la concentracin de espermatozoides en 10 6/ml. En el ejemplo anterior el clculo es (220+218)/(4+4) = 438/8 = 55x106 espermatozoides/ml de semen.

Ejemplo 3: Con una dilucin 1+19 (1:20), en el replicado 1 se contaron

98

espermatozoides en 15 filas (cuadrados 5, 4 y 6), mientras que en el replicado 2 se contaron 114 espermatozoides en 15 filas (cuadrados 5, 4 y 6). La suma de las cuentas (98+114) es de 212 en 30 filas y la diferencia (114-98) es de 16. En la tabla 4, se ve que es menor que la esperada (29), por lo que los valores son aceptados.

La concentracin de espermatozoides en la muestra a una dilucin 1+19 (1:20) es C = (N/n) x 1,0 espermatozoides por nl o (212/30) x 1,0 = 7,07 espermatozoides nl o 7,1x106 espermatozoides por ml de semen (con dos cifras significativas). Como menos de 400 espermatozoides fueron contados, reportar el error de muestreo de 212 espermatozoides dado en la tabla 2 (aproximadamente 7%).

Ejemplo 4: Con una dilucin 1+4 (1:5), en el replicado 1 se contaron 224 espermatozoides en 4 filas, mientras que en el replicado 2 se contaron 268 espermatozoides en 4 filas. La suma de los valores (224+268) es 492 en 8 filas y la diferencia (268-224) es de 44. En la tabla 4, se ve que la diferencia es mayor a la diferencia esperada (43), por lo que deben realizarse nuevas diluciones por duplicado.

P g i n a | 48 Ejemplo 5: Con una dilucin 1+4 (1:5), el replicado 1 se contaron 224 espermatozoides en 8 filas, mientras que en el replicado 2 se contaron 213 espermatozoides en 8 filas. La suma de los valores (224+213) es de 437 en 16 filas y la diferencia (224-213) es de 11. En la tabla 4, se ve que la diferencia es menor a la esperada (41), por lo que los valores son aceptados.

La concentracin de espermatozoides en la muestra para una dilucin 1+4 (1:5) es C = (N/n) x (1/4) espermatozoides por nl o (437/16)/4 = 6,828 espermatozodes/nl, o 6,8x106 espermatozoides por mililitro de semen (con dos cifras significativas).

Nota: Para una dilucin de 1+4 (1:5), la concentracin tambin es fcil de calcular, pero el nmero total de espermatozoides contados, dividido por el nmero total de filas evaluadas se divide entre 4. En el ejemplo anterior el clculo es ((224 +213)/(8 +8))/4 = (437/16)/4 = 27,3/4 = 6,8x106 espermatozoides/ml de semen.

3.7.10.2. Lmite inferior de referencia El lmite inferior de referencia para la concentracin de espermatozoides es de 15x106 espermatozoides/ml (percentil 5, IC 95%: 12-16x106).

3.7.11.

Clculo del nmero total de espermatozoides en el eyaculado

Se recomienda calcular y reportar el nmero total de espermatozoides por eyaculado, ya que este parmetro proporciona una medida de la capacidad de los testculos para producir espermatozoides y la permeabilidad del tracto masculino. Este resultado se obtiene multiplicando la concentracin de espermatozoides por el volumen del eyaculado.

3.7.11.1. Lmite inferior de referencia El lmite inferior de referencia del nmero total de espermatozoides es de 39x10 6 espermatozoides por eyaculado (percentil 5, IC 95%: 33-46x106).

P g i n a | 49 3.8. MORFOLOGA ESPERMTICA

El anlisis de la morfologa espermtica, comprende los siguientes pasos: Preparacin del frotis. Fijacin y coloracin. Montaje con un cubreobjetos si se van a realizar preparaciones permanentes. Observacin microscpica con magnificacin de 1000x con aceite de inmersin. Contaje de 200 espermatozoides por rplica, para los porcentajes de formas normales o normales y anormales. Comparacin de los valores de los replicados y determinar si son aceptables, si es as proceder con los clculos, si no releer las lminas.

3.8.1. Concepto de espermatozoide normal

El aspecto morfolgico variable de espermatozoides humanos hace difcil su evaluacin, pero observaciones de espermatozoides recuperados del aparato reproductor femenino postcoito en moco endocervical y tambin de la superficie de la zona pelcida han ayudado a definir el aspecto potencial de fertilizacin (morfolgicamente normales) de espermatozoides. Mediante la aplicacin estricta de ciertos criterios de morfologa de los espermatozoides, se han establecido las relaciones entre el porcentaje de formas normales y diversos parmetros de fertilidad como tiempo requerido para el embarazo (TTP), tasas de embarazo in vivo e in vitro, los cuales pueden ser tiles para el pronstico de la fertilidad.

La filosofa subyacente del sistema de clasificacin descrito aqu es limitar que sea identificada como normal a la subpoblacin potencialmente fecundante de

P g i n a | 50 espermatozoides prevalente en el moco endocervical. Usando estas directrices, el intervalo de valores de porcentaje normal para hombres frtiles e infrtiles es probable que sea entre 0-30%, con algunas muestras excediendo el 25% de espermatozoides normales. Este bajo valor producir inevitablemente umbrales bajos y, de hecho se han encontrado lmites de referencia y umbrales de 3-5% de formas normales en los estudios de fertilizacin in vitro, inseminacin intrauterina y fertilizacin in vivo.

La zona pelcida humana tambin selecciona una subpoblacin de espermatozoides morfolgicamente similares, pero en tal "zona preferida" los espermatozoides muestran una gama ms amplia de formas.

3.8.2. Elaboracin del frotis de semen

Para el anlisis morfolgico, se acostumbra a preparar frotis de semen que se secan al aire antes de la fijacin y tincin. Sin embargo, este proceso conduce a formar artefactos morfolgicos, ya que el secado al aire de los frotis de semen se relaciona con: cambios en las dimensiones de los espermatozoides: los espermatozoides secados, fijados y teidos son ms pequeos que los espermatozoides vivos del semen; expansin de la cabeza de los espermatozoides inmaduros, y prdida de la gota citoplasmtica osmticamente sensibles, aunque una gran cantidad de exceso de citoplasma residual es retenido.

Deben realizarse dos o ms frotis, por si hay problema con la coloracin o se rompe la lmina. La evaluacin debe realizarse por duplicado, porque podra ser significativa la variacin entre las lminas. Los portaobjetos deben estar limpios por ambas caras e identificados.

P g i n a | 51 Se mezcla la muestra como se describe en el recuadro 1 y se toma inmediatamente una alcuota de 5 a 10 l, por cada rplica debe siempre mezclarse. El frotis puede realizarse por los dos mtodos descritos a continuacin (figura 6):

Figura 6. Mtodos para realizar el frotis de semen. (a) Mtodo Feathering para el semen sin diluir (muestras de semen normal): se coloca la alcuota en un extremo del portaobjeto, inmediatamente, con otra lmina en un ngulo de 45, permitir que el semen se extienda a lo largo del borde posterior de la lmina y formar el frotis con un movimiento lento (ms de 1 s) hacia adelante. Este mtodo es apropiado para muestras con viscosidad baja, ms no, para semen muy viscoso. (b) Mtodo de la Pipeta para el semen lavado: la gota de la suspensin del semen se extiende sobre el portaobjetos con una pipeta Pasteur en posicin horizontal. Este mtodo se aplica en muestras cargadas de detritos o muy viscosas, cuando el semen hay que lavarlo.

Los frotis se dejan secar al aire y posteriormente se colorean.

La calidad del frotis (superposicin mnima de espermatozoides) depende de: El volumen del semen y concentracin de espermatozoides: a menor nmero de espermatozoides, es menos probable que ellos se superpongan. El ngulo de la lmina de extendido: cuanto menor es el ngulo ms delgado es el frotis. La velocidad para la elaboracin del frotis: mientras ms rpido sea el movimiento ms grueso es el frotis.

P g i n a | 52 3.8.3. Preparacin de frotis

3.8.3.1.

En semen normal

Comience con un volumen de 10 l, con un ngulo de 45 y una velocidad de aproximadamente 1 s. Estos parmetros se pueden variar, si es necesario, para reducir la superposicin de los espermatozoides en la lmina. El mtodo Feathering funciona bien cuando la viscosidad del semen es baja, pero es inadecuada para el semen muy viscoso (figuras 6a y 7).

Figura 7. Preparacin de frotis a partir de semen normal. Para conseguir la sensacin del movimiento, coloque el borde de la lmina de arrastre en un ngulo de 45 y mueva hasta tocar la alcuota de semen (panel izquierdo), permitir que se extienda a lo largo del borde de la lmina (panel central). Con un movimiento lento hacia adelante (ms de 1 s aproximadamente) extienda el semen a lo largo de la lmina (panel derecho).

3.9. MTODOS DE COLORACIN

Los mtodos de coloracin recomendados son Papanicolaou, Shorr y Diff-Quik. La cabeza del espermatozoide se colorea azul plido en la regin del acrosoma, azul oscuro en la regin postacrosmica. La pieza intermedia puede mostrar alguna coloracin roja, la cola es azul o rojiza. El exceso de citoplasma residual, normalmente, se encuentra detrs de la cabeza y alrededor de la pieza intermedia, se tie de color rosa o rojo (Papanicolaou) o naranja-rojizo (Shorr).

Comentario: Los mtodos de coloracin rpida en la que se aade una gota de semen al fijador y se colorean sobre la lmina, estn disponibles comercialmente. Estos no son recomendables, porque sin la distribucin uniforme de los espermatozoides mediante la

P g i n a | 53 tcnica del extendido, no es posible observar los detalles necesarios para la clasificacin morfolgica que se describe en este manual.

3.9.1. Coloracin Papanicolaou modificada

La tcnica de tincin modificada descrita aqu, ha demostrado ser til en el anlisis de la morfologa de los espermatozoides y en el examen de las clulas germinales inmaduras y clulas no espermticas (lminas 1-5). Los procedimientos de rutina han sido modificados, para trabajar sin ter (como fijador) y sin xilol (para el montaje). Las lminas teidas mediante el procedimiento de Papanicolaou pueden ser montadas de manera permanente y se almacenan para uso futuro en programas internos de control de calidad. Si se almacenan en la oscuridad, sern estables durante meses o aos.

El siguiente mtodo se utiliz para preparar las fotomicrografas de este manual, a partir de frotis que se montaron con un medio de montaje insoluble en etanol.

3.9.1.1. Reactivos

1. Colorante Papanicolaou: comercialmente disponible o ver apndice 3.

2. Etanol cido: aadir 1 ml de cido clorhdrico concentrado a 200 ml de etanol al 70% (v/v).

3. Xilol/etanol: mezclar partes iguales (1:2) de etanol al 100% y xilol.

Se pueden montar o no las lminas, para el montaje se puede utilizar medio de montaje soluble en etanol o montaje insoluble en etanol, en este caso, la lmina debe pasarse primero por una solucin de xilol/etanol (1:2) por 1 min, luego por xilol al 100% por 1 min.

Nota 1: El xilol es peligroso para la salud y debe ser manejado en una campana de extraccin.

P g i n a | 54 Nota 2: Los frotis deben secarse al aire durante al menos 4 h, se pueden almacenar por un mximo de 1 semana, antes de la fijacin y tincin.

3.9.1.2. Fijacin de los frotis secados al aire

Sumergir las lminas en etanol al 95% por 15 min.

3.9.1.3. Coloracin de los frotis fijados

Sumergir secuencialmente las lminas en:

1. Etanol 80% (v/v) 2. Etanol 50% (v/v) 3. Agua destilada 4. Hematoxilina de Harris 5. Agua destilada 6. Etanol cido 7. Agua de grifo 8. Etanol 50% (v/v) 9. Etanol 80% (v/v) 10. Etanol 95% (v/v) 11. Naranja O6 12. Etanol 95% (v/v) 13. Etanol 95% (v/v) 14. Etanol 95% (v/v) 15. Verde EA-50 16. Etanol 95% (v/v) 17. Etanol 95% (v/v) 18. Etanol 100% (v/v) 19. Etanol 100% (v/v)

30 s 30 s 30 s 4 min 30 s 4-8 inmersiones de 1 s cada una. 5 min (dejarla correr) 30 s 30 s 15 min 1 min 30 s 30 s 30 s 1 min 30 s 30 s 15 s 15 s

Nota 1: La fijacin con etanol provoca la deshidratacin de las clulas. Por lo tanto, los frotis tomados directamente de la fase de fijacin en etanol al 95%, en la coloracin pueden necesitar slo 10 s en el etanol a 80%, mientras que los frotis que se han secado al aire despus de la fijacin deben permanecer ms tiempo (2-3 min) en etanol al 50%.

Nota 2: En el paso 6, comience con 4 baos, contine hasta que los resultados sean satisfactorios. Este es un paso crtico, ya que la duracin de la decoloracin altera dramticamente la intensidad final de la tincin. Si se omite este paso, los

P g i n a | 55 espermatozoides y el fondo sern oscuros. Aumentar el nmero de inmersiones produce que los espermatozoides y el fondo sean apenas visibles.

Nota 3: Las lminas se pueden observar montadas o no.

3.9.2. Clasificacin de la morfologa espermtica

La evaluacin de la morfologa de los espermatozoides est relacionada con una serie de dificultades asociadas a la falta de objetividad, la variacin en la interpretacin o mal desempeo en evaluaciones externas de control de calidad. El mtodo que aqu se recomienda es una simple clasificacin como normal/anormal, con opcin al recuento de los tipos de anormalidades en los espermatozoides. Los siguientes criterios deben aplicarse cuando se evala la morfologa normal del espermatozoide. El lmite de referencia dado (4% de formas normales) es vlido slo cuando se usa la siguiente tcnica descrita.

El espermatozoide consiste de la cabeza, cuello, pieza intermedia, pieza principal y pieza terminal. Como la pieza terminal es difcil de observar con el microscopio de luz, se puede considerar que la clula est constituida por una cabeza (cabeza y cuello) y la cola (pieza intermedia y pieza principal). Para que un espermatozoide se considere normal, tanto la cabeza como la cola deben ser normales. Todos los espermatozoides con morfologa en el borderline, son anormales. La cabeza del espermatozoide debe ser lisa, regularmente contorneada y generalmente de forma ovalada. Debe haber una regin acrosmica muy bien definida que ocupe entre el 40 y 70% del rea de la cabeza. La regin acrosmica no debe contener vacuolas grandes, y no ms de dos vacuolas pequeas, que no deberan ocupar ms del 20% de la cabeza del espermatozoide. La regin postacrosmica no debe contener vacuolas. La pieza media debe ser delgada, regular y aproximadamente de la misma longitud que la cabeza del espermatozoide. El eje longitudinal de la pieza intermedia debe estar alineado con el eje longitudinal de la cabeza del

P g i n a | 56 espermatozoide. El citoplasma residual se considera una anomala slo cuando est en exceso, es decir, cuando supera un tercio del tamao de la cabeza del espermatozoide. La pieza principal debe tener un calibre uniforme a lo largo de su longitud, ser ms delgada que la pieza intermedia y tener una longitud aproximadamente de 45 m (unas 10 veces la longitud de la cabeza). Puede estar enrollada sobre s misma, siempre que la forma no demuestre ruptura del flagelo.

Comentario 1: Con esta tcnica la forma de la cabeza del espermatozoide es ms importante que sus dimensiones, a menos que stas sean extremadamente anormales.

Comentario 2: Puede ser til un micrmetro ocular para distinguir entre el tamao normal y anormal de la cabeza del espermatozoide.

Comentario 3: Las dimensiones de la cabeza de 77 espermatozoides coloreados con Papanicolaou y clasificados como normales por los criterios dados aqu, medidos por un sistema computarizado (coeficiente de variacin para mediciones repetidas 2-7%) tenan las siguientes dimensiones: media de la longitud: 4,1 m, IC 95%: 3,7-4,7; media del ancho: 2,8 micras, IC 95%: 2,5-3,2; media de la proporcin longitud-ancho: 1,5, IC 95%: 1.3-1.8.

Comentario 4: Las piezas intermedias de 74 espermatozoides coloreados con Papanicolaou, clasificados como normales por los criterios dados aqu y medidos con el mismo sistema computarizado tenan las siguiente dimensiones: media de la longitud: 4,0 m, IC 95%: 3,3-5,2; media del ancho: 0,6 m, IC 95%: 0,5-0,7.

Comentario 5: Las colas en espiral (>360, figura 8m) puede indicar disfuncin del epiddimo.

Esta evaluacin de la morfologa normal del espermatozoide puede mejor ser aplicada para aprender a reconocer las variaciones sutiles en la forma del espermatozoide completo (cabezas y colas de espermatozoides normales/borderline, ver lminas 1-5 y sus comentar

P g i n a | 57 3.9.3. Clasificacin de la morfologa espermtica anormal Las muestras de semen humano contienen espermatozoides con diferentes tipos de malformaciones. Defectos en la espermatognesis y algunas afecciones del epiddimo se asocian comnmente con un elevado porcentaje de espermatozoides con formas anormales. Los defectos morfolgicos suelen ser mixtos. Los espermatozoides anormales, por lo general, tienen un bajo potencial de fecundacin, en funcin a los tipos de anomalas, y pueden tambin tener ADN anormal. Los defectos morfolgicos han sido asociados con aumento de la fragmentacin del ADN, una incrementada incidencia de aberraciones estructurales cromosmicas, cromatina inmadura y aneploida. Se hace nfasis en la forma de la cabeza, aunque la cola (pieza media y pieza principal) del espermatozoide tambin es considerada.

Las categoras de defectos de los espermatozoides son las siguientes (figura 8): Defectos de la cabeza: grande, pequea, en cua, piriforme, redonda, amorfa, vacuolada (ms de 2 vacuolas o >20% del rea de la cabeza es ocupada por vacuolas), vacuolas en la regin postacrosmica, rea acrosmica pequea o grande (<40% o >70% del rea de la cabeza), doble cabeza o cualquier combinacin de estos. Defectos del cuello y pieza intermedia: insercin asimtrica de la pieza intermedia en la cabeza, gruesa o irregular, doblada, anormalmente delgada o cualquier combinacin de estos. Defectos de la pieza principal: corta, mltiple, rota, horquillada, forma de asa, de anchura irregular, enrollada o cualquier combinacin de estos. Exceso de citoplasma residual (ECR): Esto est asociado con la produccin de espermatozoides anormales por un proceso de espermatognesis defectuoso. Los espermatozoides caracterizados por cantidades grandes de citoplasma irregular coloreado, de un tercio o ms del tamao de la cabeza del espermatozoide, a menudo asociados con defectos de las piezas intermedias, son anormales. Este exceso de citoplasma anormal no debe ser llamado gota citoplasmtica.

P g i n a | 58 Comentario 1: Las gotas citoplasmticas (vesculas de membrana en la pieza intermedia en la unin cabeza-cuello) son componentes normales de espermatozoides humanos fisiolgicamente funcionales. Comentario 2: Las gotas citoplasmticas son osmticamente sensibles y no se conservan bien por los procedimientos de rutina de secado al aire. Ellas no son evidentes en las preparaciones teidas, donde pueden aparecer como pequeas distensiones de la pieza intermedia. Las gotas citoplasmticas, son menos de un tercio del tamao de la cabeza del espermatozoide en preparaciones fijadas y teidas y no se consideran anormales.

A. Defectos de cabeza

B. Defectos de cuello y pieza intermedia

C. Defectos de cola

D. Exceso de citoplasma residual

Adaptado por Kruger et al., 1993 y reproducido con permiso de MQ Mdicos.

Figura 8. Dibujo esquemtico de algunas formas anormales de espermatozoides humanos.

P g i n a | 59 3.9.4. Morfologa de las lminas

El anlisis de la morfologa de los espermatozoides es subjetivo y difcil, sobre todo para estandarizar, puesto que se intenta trazar un punto de corte artificial entre clulas normales y anormales, sobre la base de una multitud de caractersticas de la cabeza del espermatozoide y la cola. Las ilustraciones que siguen fueron evaluadas por un slo experto, el Dr. Thinus Kruger. Las evaluaciones se han complementado con comentarios adicionales para asegurar la consistencia de las anotaciones de todas las anormalidades. Frente a cada lmina en color est una tabla que describe la evaluacin de la morfologa de cada espermatozoide en la foto. La tabla indica si la forma de la cabeza es normal o anormal, proporciona detalles sobre anomalas de la cabeza que no sea la forma e indica si la forma de la pieza intermedia o pieza principal es normal, y si el espermatozoide puede ser considerado normal en general. Otras observaciones pertinentes estn incluidas en "comentarios". Los comentarios que se explican en la tabla 6.

P g i n a | 60 Tabla 6. Explicaciones usadas en los comentarios de las lminas de morfologa.

<40% acr >70% acr >un tercio <un tercio anormal amorfa bacilo doblada enrollada GC citoplasma leucocito degenerado espermtide degenerada defectuosa doble clula epitelial ECR base foco s PP bien inserc irreg en asa macrfago monocito espermtide no acro normal no evaluado superposicin vac PA cabeza de alfiler polimorfo piriforme redonda vista lateral pequea espermatocito cua gruesa larga vac >2 vac menos del 40% de la cabeza del espermatozoide es ocupada por el acrosoma ms del 70% de la cabeza del espermatozoide es ocupada por el acrosoma citoplasma anormal (mayor a un tercio del tamao de la cabeza) (ECR) citoplasma normal (menor a un tercio del tamao de la cabeza) (GC) se explica por s mismo forma de la cabeza bacteria forma no natural de angulacin se explica por s mismo gota citoplasmtica cualquier exceso de citoplasma residual o gota citoplasmtica, depende del tamao se explica por s mismo se explica por s mismo se explica por s mismo se explica por s mismo del sistema de ductos masculino exceso de citoplasma residual base de la cabeza del espermatozoide no oval fuera de foco no se observaron todas las piezas principales en la fotomicrografa (pero si eran normales, los espermatozoides deberan considerarse normales) el sitio de insercin de la cola, est a un lado del eje longitudinal de la cabeza contorno irregular cola doblada sobre s misma leucocito fagoctico leucocito agranulocito clula germinal inmadura acrosoma ausente parecidos a los hallados en moco endocervical por superposicin o pobre enfoque cabezas oscurecidas por cola vacuola en regin postacrosmica no es un espermatozoide: no presenta cromatina leucocito polimorfonuclear forma de la cabeza forma de la cabeza espermatozoide observado sobre el borde tamao de la cabeza clula germinal inmadura forma de la cabeza se explica por s mismo se explica por s mismo vacuola ms de dos vacuolas

P g i n a | 61
10 micras

Lmina 1

Fotomicrografa cortesa de C Brazil.

P g i n a | 62 Evaluacin morfolgica de los espermatozoides de la lmina 1

Espermatozoide Forma de la cabeza Otros comentarios de la cabeza Comentarios de pieza media Comentarios de pieza principal Clasificacin general del espermatozoide Comentarios

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

normal normal normal normal normal normal normal normal normal normal normal normal normal normal normal normal normal normal normal normal

normal normal normal normal normal normal normal normal normal normal normal normal normal normal normal normal normal normal normal normal

normal normal normal normal normal normal normal normal normal normal normal normal normal normal normal normal normal normal normal normal

s PP bien s PP bien s PP bien s PP bien s PP bien s PP bien s PP bien s PP bien s PP bien s PP bien s PP bien s PP bien s PP bien s PP bien s PP bien s PP bien s PP bien s PP bien s PP bien s PP bien

P g i n a | 63
10 micras

Lmina 2

Fotomicrografa cortesa de C Brazil.

P g i n a | 64 Evaluacin morfolgica de los espermatozoides de la lmina 2

Espermatozoide

Forma de la cabeza

Otros comentarios de la cabeza

Comentarios de pieza media

Comentarios de pieza principal

Clasificacin general del espermatozoide

Comentarios

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36

anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal normal anormal anormal anormal anormal anormal anormal normal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal

piriforme

gruesa irreg doblada, irreg, ECR

doble

anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal

vista lateral >un tercio

piriforme

gruesa inserc

piriforme >2 vac, vac PA piriforme piriforme vac PA gruesa gruesa, ECR ECR gruesa, inserc anormal gruesa gruesa

doblada

>un tercio >un tercio

>2 vac

>70% acr

piriforme pequea pequea

gruesa gruesa, doblada gruesa gruesa gruesa gruesa gruesa gruesa gruesa gruesa ECR gruesa gruesa

>un tercio

P g i n a | 65
10 micras

Lmina 3

Fotomicrografa cortesa de C Brazil

P g i n a | 66 Evaluacin morfolgica de los espermatozoides de la lmina 3

Espermatozoide

Forma de la cabeza

Otros comentarios de la cabeza

Comentarios de pieza media

Comentarios de pieza principal

Clasificacin general del espermatozoide

Comentarios

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36

anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal normal

cua

gruesa irreg

redonda redonda cua cua amorfa redonda cua >2 vac, vac PA vac PA

gruesa gruesa irreg, gruesa

anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal

vista lateral >un tercio

dos clulas

cabeza de alfiler anormal anormal normal anormal anormal normal anormal anormal anormal anormal anormal anormal normal anormal anormal anormal normal normal anormal anormal pequea larga gruesa gruesa inserc anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal cabeza de alfiler

>2 vac >70% acr >70% acr <40% acr, pequea <40% acr, pequea <40% acr, pequea >70% acr <40% acr, >2 vac >2 vac cua cua cua

irreg

<40% acr

gruesa gruesa gruesa gruesa, doblada

P g i n a | 67
10 micras

Lmina 4

Fotomicrografa cortesa de C Brazil

P g i n a | 68 Evaluacin morfolgica de los espermatozoides de la lmina 4

Espermatozoide

Forma de la cabeza

Otros comentarios de la cabeza

Comentarios de pieza media

Comentarios de pieza principal

Clasificacin general del espermatozoide

Comentarios

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

anormal normal normal normal normal normal anormal normal normal normal anormal anormal anormal normal normal normal normal normal normal normal

base

gruesa gruesa, doblada gruesa gruesa, doblada gruesa gruesa gruesa inserc, doblada gruesa, doblada

anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal anormal

irreg

vac PA gruesa irreg inserc gruesa inserc, gruesa gruesa, larga inserc irreg

<40% acr, >2 vac,

<40% acr <40% acr

P g i n a | 69
10 micras

Lmina 5

Fotomicrografa cortesa de C Brazil

P g i n a | 70 3.10. ANLISIS DE LA MORFOLOGA ESPERMTICA EN FROTIS

3.10.1. Evaluacin de la morfologa espermtica normal

Puede ser suficiente determinar la proporcin de espermatozoides normales. Con este paradigma de la evaluacin de la morfologa, se consideran las regiones funcionales del espermatozoide. No es necesario distinguir todas las variaciones en el tamao y la forma de la cabeza o los distintos defectos de las piezas intermedia y principal.

La evaluacin morfolgica se debe realizar en cada espermatozoide, en varias reas de la lmina seleccionadas sistemticamente, para evitar la seleccin sesgada de espermatozoides en particular. Examinar con microscopio de campo brillante, magnificacin de 1000x y aceite de inmersin. Evaluar todos los espermatozoides en cada campo, pasando de un campo microscpico a otro. Evaluar al menos 200 espermatozoides en cada rplica, a fin de lograr un error de muestreo bajo aceptable. Cuente el nmero de espermatozoides normales y anormales con la ayuda de un contador de laboratorio. Repetir la evaluacin de al menos 200 espermatozoides, preferiblemente, en la segunda lmina, pero, alternativamente, en la misma lmina. Comparar los porcentajes de formas morfolgicamente normales entre las dos evaluaciones independientes. Calcular la media y diferencia de los porcentajes de formas normales obtenidos en las dos evaluaciones.

P g i n a | 71 Determinar la aceptabilidad de las diferencias a partir de la tabla 1. Si la diferencia entre los porcentajes es aceptable, reportar la media de la morfologa normal. Por lo contrario, si la diferencia es alta, repetir la evaluacin en las mismas lminas. Reporte la media de los porcentajes de formas normales al nmero entero ms cercano.

Nota1: Debe contarse espermatozoides intactos, es decir, que tengan cabeza y cola, dado a que slo los espermatozoides intactos son contados en la determinacin de la concentracin espermtica. No contar clulas inmaduras germinales (redondas).

Nota 2: No evaluar los espermatozoides que se superponen y los que se encuentran con la cabeza en el borde de la lmina, los cuales no pueden ser analizados adecuadamente. No deben estar presentes en un buen frotis, sin embargo, puede ocurrir cuando los detritos y una gran cantidad de material particulado estn. Estas muestras deben ser lavadas y examinarse los frotis antes de la tincin.

3.10.1.1. Ejemplos de trabajo

Ejemplo 1: Los porcentajes de espermatozoides con morfologa normal en los recuentos de 200 espermatozoides por duplicado son 18 y 9. La media redondeada es del 14% y la diferencia es del 9%. En la tabla 1, se observa que para una media del 14%, se espera una diferencia de hasta un 7%. Como la diferencia es mayor a sta, los resultados se descartan y las lminas se reevalan.

Ejemplo 2: Los porcentajes de espermatozoides con morfologa normal en los recuentos de 200 espermatozoides por duplicado son 10 y 14. La media redondeada es del 12% y la diferencia es del 4%. En la tabla 1, se observa que para una media del 12%, se espera una diferencia de hasta un 7%. Como la diferencia es menor a sta, los resultados se aceptan y se reporta la media, es decir, 12% de formas normales.

P g i n a | 72 3.10.1.2. Lmite inferior de referencia El lmite de referencia inferior de formas normales es del 4% (percentil 5, IC 95% 3,04,0). Comentario: El nmero total de espermatozoides morfolgicamente normales en el eyaculado es de importancia biolgica. Este resultado se obtiene multiplicando el nmero total de espermatozoides en el eyaculado por el porcentaje de formas normales.

3.10.2. Evaluacin de defectos especficos en el espermatozoide En ocasiones, muchos espermatozoides tienen un defecto estructural especfico. Por ejemplo, el acrosoma puede no desarrollarse, dando lugar al defecto "cabeza redonda y pequea" o "globozoospermia". Si la lmina basal deja de insertarse en el polo opuesto del ncleo en el acrosoma en la espermiacin, las cabezas son absorbidas y slo las colas son encontradas en el semen (el defecto cabeza de alfiler).

Nota 1: Las cabezas de alfiler (colas libres) no se cuentan como defectos de la cabeza, ya que no poseen cromatina o la estructura anterior de la cabeza a la placa basal. Nota 2: Las colas libres (cabezas de alfiler) y cabezas libres no se cuentan como espermatozoides (definido como tener una cabeza y la cola), debido a que ellas no se consideran anormalidades del espermatozoide.

Aquellos hombres donde el total de espermatozoides exhiban uno de estos defectos son generalmente estriles. Tales casos son raros, pero es fundamental que se identifiquen e informen correctamente. As pues, reportar la presencia de defectos especficos en los espermatozoides, por ejemplo, cabezas de espermatozoides libres, cabezas de alfiler (colas libres), cabezas carentes de acrosomas. Si hay muchos de tales defectos especficos, su prevalencia relativa puede determinarse. Si N es el nmero de clulas con defectos contados en el mismo nmero de campos de 400 espermatozoides, y S es la concentracin de espermatozoides (106 por ml), entonces la concentracin (C) de los defectos (106 por ml) puede calcularse a partir de la frmula: C = S (N/400).

P g i n a | 73 BIBLIOGRAFA

WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen. 2010. Fith edition. p 271.

P g i n a | 74

APNDICE

P g i n a | 75 APNDICE 1 FORMULARIO DE INFORME

Nombre: N: Fecha ( / / )

Recoleccin (1, en el laboratorio; 2, en la casa) Tiempo de recoleccin de la muestra (hora: minutos) Muestra entregada (hora: minutos) Inicio del anlisis de la muestra (hora: minutos) Paciente Tiempo de abstinencia (das) Medicamentos Dificultades en la recoleccin Semen Tratamiento (p. ejm. bromelina) Muestra completa? (1, completa; 2, incompleta) Apariencia (1, normal; 2, anormal) Viscosidad (1, normal; 2, anormal) Licuefaccin (1, normal; 2, anormal (minutos)) Aglutinacin (14, AE) pH [7,2] Volumen (ml) [1,5] Espermatozoides 6 Nmero total (10 por eyaculado) [39] Concentracin (106 por ml) [15] Error (%) si hay menos de 400 clulas contadas Vitalidad (% vivo) [58] Motilidad total PR+NP (%) [40] Progresivos PR (%) [32] No progresivos NP (%) Inmviles IM (%) Formas normales (%) [ 4] Cabezas anormales (%) Piezas medias anormales (%) Piezas principales anormales(%) Exceso de citoplasma residual (%) MAR-test IgG directo (%) (3 10 minutos) [<50] MAR-test IgA directo (%) (3 10 minutos) [<50] IB-test IgG directo (% con beads) [<50] IB-test IgA directo (% con beads) [<50] Clulas no espermticas Clulas peroxidasa positivo, concentracin(10 por ml) [<1,0] Funcin de glndulas accesorias Zinc (mol por eyaculado) [2,4] Fructosa (mol por eyaculado) [13] a-Glucosidasa (neutral) (mU/eyaculado) [20] Lic:
6

P g i n a | 76 APNDICE 2 BUFFER FOSFATO SALINO DE DULBECCO 1. PBS-glucosa de Dulbecco: a 750 ml de agua destilada aadir 0,2 g de cloruro de potasio (KCl), 0,2 g de fosfato potsico dihidrgeno (KH 2PO4), 0,1 g de cloruro de magnesio hexahidratado (MgCl2.6H2O), 8,0 g de cloruro de sodio (NaCl), 2,16 g de fosfato de hidrgeno disdico heptahidratado (Na 2HPO4.7H2O) y 1 g de D-glucosa. 2. Disolver 0,132 g de cloruro de calcio dihidratado (CaCl2.2H2O) en 10 ml de agua destilada y aadir poco a poco con agitacin a la solucin anterior. 3. Ajustar el pH a 7,4 con hidrxido sdico (NaOH) 1 mol/l. 4. Completar hasta 1000 ml con agua destilada.

Nota 1: Para evitar la precipitacin, agregue el CaCl2 por separado, lentamente y con agitacin. Nota 2: Si es necesario, aadir 0,3 g de albmina de suero bovino (ASB) (libre de cidos grasos esenciales) por cada 100 ml antes de su uso.

P g i n a | 77 APNDICE 3 COLORACIN PAPANICOLAOU

EA-36 (equivalente a EA-50) Constituyentes 1. Eosina Y (ndice de color 45380) 2. Marrn de Bismarck Y (ndice de color 21000) 3. Verde brillante SF, amarillento (ndice de color 42095) 4. Agua destilada 5. Etanol 95% (v/v) 6. cido fosfotngstico 7. Carbonato de litio acuoso saturado (>1,3 g/100 ml) Soluciones madre Preparar por separado cada una de las soluciones al 10% (100 g/l), sealadas a continuacin: 1. Disolver 10 g de eosina Y en 100 ml de agua destilada. 2. Disolver 10 g de marrn de Bismarck Y en 100 ml de agua destilada. 3. Disolver 10 g de verde brillante SF en 100 ml de agua destilada. Preparacin 1. Preparar 2 l de colorante, mezclar 50 ml de la solucin madre de eosina con 10 ml de la solucin madre de marrn de Bismarck Y, y aadir 12,5 ml de la solucin madre de verde brillante SF. 2. Completar con 2000 ml de etanol 95%. 3. Aadir 4 g de cido fosfotngstico. 4. Aadir 0,5 ml de carbonato de litio acuoso saturado. 5. Mezclar bien y conservar a temperatura ambiente en una botella marrn oscuro. Nota 1: la solucin es estable por 2-3 meses. 10 g 10 g 10 g 300 ml 2000 ml 4g 0,5 ml

P g i n a | 78 Nota 2: Pasar por un filtro de 0,45 micras antes de su uso.

Naranja G6 Constituyentes 1. Cristales de naranja G (ndice de color 16230) 2. Agua destilada 3. Etanol 95% (v/v) 4. cido fosfotngstico Solucin madre nmero 1 (solucin de naranja G6 10%, 100 g /l) 1. Disolver 10 g de cristales de naranja G6 en 100 ml de agua destilada. 2. Agite bien. Dejar reposar en una botella de color marrn oscuro o forrada con papel de aluminio a temperatura ambiente durante 1 semana antes de usar. Solucin madre nmero 2 (solucin de naranja G6 0,5%) 1. A 50 ml de la solucin madre nmero 1 aadir 950 ml de etanol 95% (v/v). 2. Aadir 0,15 g de cido fosfotngstico. 3. Agite bien. Dejar reposar en una botella de color marrn oscuro o forrada con papel de aluminio a temperatura ambiente. Nota 1: Filtre antes de usar. Nota 2: la solucin es estable por 2-3 meses. 10 g 10 ml 1000 ml 0,15 g

Hematoxilina de Harris sin cido actico Constituyentes 1. Hematoxilina (cristales oscuros, ndice de color 75290). 2. Etanol 95% (v/v). 3. Sulfato de amonio y aluminio dodecahidrato (AlNH4(SO4)2.12H2O). 4. xido de mercurio (HgO).

P g i n a | 79 Preparacin 1. Disolver 160 g de sulfato de amonio y aluminio dodecahidrato en 1600 ml de agua destilada por calentamiento. 2. Disolver 8 g de cristales de hematoxilina en 80 ml de etanol 95% (v/v). 3. Aadir la solucin de hematoxilina a la solucin de sulfato de amonio y aluminio. 4. Calentar la mezcla a 95 C. 5. Retire la mezcla del fuego y agregue lentamente 6 g de xido de mercurio mientras se agita. Nota: La solucin ser de color prpura oscuro. 6. Inmediatamente sumergir el recipiente en un bao de agua fra. 7. Cuando la solucin est fra, filtrar. 8. Guarde en frasco de color marrn oscuro o cubierto con papel de aluminio a temperatura ambiente. 9. Dejar en reposo durante 48 horas antes de usar. 10. Diluir la cantidad requerida con una cantidad igual de agua destilada. 11. Filtrar otra vez.

Solucin Scott sustituto del agua de grifo Nota: La solucin de Scott se utiliza slo cuando el agua del grifo es insuficiente para devolver el color azul a los ncleos, debindose cambiar frecuentemente, por ejemplo, despus de lavar 20-25 lminas. Constituyentes 1. Bicarbonato de sodio (NaHCO3) 2. Sulfato de magnesio heptahidratado (MgSO4.7H2O) 3. Varios cristales de timol (si es requerido como conservante). 4. Agua destilada 1000 ml 3,5 g 20,0 g

P g i n a | 80 Solucin cida de etanol Constituyentes 1. Etanol 99,5% (v/v) 2. cido clorhdrico concentrado (HCl) 3. Agua destilada 300 ml 2,0 ml 100 ml

P g i n a | 81

IV JORNADAS CIENTFICAS XXII ANIVERSARIO DEL DEPARTAMENTO DE BIOANLISIS

Comit Organizador Dra. Yasmina Araque (Jefa del Departamento de Bioanlisis) Comisin de Cultura y Extensin MSc. Leonor Mora (Coord. General) MSc. Evis Parra MSc. Haide Guarache Esp. Josefa Daz Dra. Mara Zulay Sulbarn

Curso elaborado para las IV Jornadas Cientficas del Departamento de Bioanlisis de la Universidad de Oriente, Ncleo de Sucre. Cuman, 26 y 27 de octubre de 2010. Venezuela.