Uniwersytet Medyczny im.

Karola Marcinkowskiego w Poznaniu

Wydzia Lekarski II

Pawe Gruszczyski

OCENA ZNACZENIA TESTU DIAGNOSTYCZNEGO QUANTIFERON-TB GOLD IN TUBE W ROZPOZNAWANIU ZAKAE PUCNYCH MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS

Rozprawa doktorska

Promotor Prof. dr hab. med. Halina Batura - Gabryel

Spis treci
Wykaz skrtw .................................................................................................... 4 1. 1.1. 1.2. 1.2.1. 1.2.1.1. 1.2.1.2. 1.2.2. 1.2.3. 1.2.4. 1.2.4.1. 1.2.4.2. 2. 3. 3.1. 3.2. 3.2.1. 3.2.1.1. 3.2.1.2. 3.2.1.3. 3.2.2. 3.2.2.1. 3.2.2.2. 3.2.2.3. 3.2.3. 3.2.4. 3.3. 4. 4.1. 4.2. 4.3. 4.4. 4.5. 4.5.1. 4.5.2. Wstp ........................................................................................... 6 Grulica wany problem epidemiologiczny i spoeczny ...............6 Laboratoryjna diagnostyka grulicy .............................................. 13 Klasyczne metody mikrobiologiczne ............................................ 14 Bakterioskopia ............................................................................. 14 Metody hodowlane ....................................................................... 17 Diagnostyka metodami biologii molekularnej ............................... 20 Diagnostyka histologiczna ............................................................ 22 Immunologiczne metody diagnostyczne w grulicy ...................... 24 Metody oparte na badaniu odpowiedzi humoralnej ...................... 24 Metody oparte na badaniu odpowiedzi komrkowej .................... 25 Cel pracy .................................................................................... 31 Materia i metody ....................................................................... 32 Charakterystyka badanej populacji .............................................. 32 Zakres bada ............................................................................... 33 Badania mikrobiologiczne ............................................................ 33 Opracowanie materiau klinicznego do badania mikrobiologicznego ...................................................................... 35 Ocena preparatu bezporedniego w kierunku prtkw kwasoopornych ............................................................................ 36 Hodowla w kierunku prtkw kwasoopornych .............................. 36 Badania genetyczne..................................................................... 37 Przygotowanie prbek.................................................................. 37 Amplifikacja .................................................................................. 37 Detekcja ....................................................................................... 38 Badanie histologiczne .................................................................. 38 Test QuantiFERON-TB Gold in tube ............................................ 39 Opracowanie statystyczne ........................................................... 41 Wyniki ........................................................................................ 43 Charakterystyka grupy badanej ................................................... 43 Wyniki bada mikrobiologicznych w badanej populacji ................ 44 Wyniki bada mikrobiologicznych w grupie pacjentw z definitywnym rozpoznaniem grulicy ......................................... 45 Wyniki testu QuantiFERON-TB Gold in tube ................................ 46 Analiza statystyczna wynikw testu QFT ..................................... 51 Analiza statystyczna w ujciu jakociowym ................................. 51 Analiza statystyczna w ujciu ilociowym .................................... 52 2

4.6. 4.7.

Prba wyznaczenia optymalnej wartoci cut-off testu QFT .......... 53 Czy mona wykorzysta parametry skadowe testu QFT do rnicowania grupy pacjentw z rozpoznan grulic od pacjentw z innymi rozpoznaniami?........................................ 56 Dyskusja .................................................................................... 60 Wnioski ...................................................................................... 73 Streszczenie w jzyku polskim ................................................ 74 Streszczenie w jzyku angielskim ........................................... 77 Pimiennictwo ........................................................................... 80

5. 6. 7. 8. 9.

Wykaz skrtw
AFB acid fast bacilli bakterie kwasooporne AIDS acquired immune deficiency syndrome - zesp nabytego niedoboru odpornoci A-15 - wg nomenklatury ICD-10: grulica ukadu oddechowego, bakteriologicznie i histologicznie potwierdzona A-16 wg nomenklatury ICD-10: grulica ukadu oddechowego, bakteriologicznie i histologicznie ujemna BCG - Bacillus Calmette-Gurin CFP-10 culture filtrate protein antygen biakowy, produkt regionu RD1 CI confidence interval przedzia ufnoci DNA deoxiribonucleic acid - kwas dezoksyrybonukleinowy ELISA - enzyme-linked immunosorbent assay test immunoenzymatyczny (immunoenzymosorbcyjny) ESAT-6 early secretory antigenic target antygen biakowy, produkt regionu RD1 FN false negative wyniki faszywie ujemne FP false positive wyniki faszywie dodatnie H + E hematoksylina + eozyna technika barwienia histochemicznego HIV human immunodeficiency virus - ludzki wirus niedoboru odpornoci ICD-10 - International Statistical Classification of Diseases and Related Health Problems - Midzynarodowa Klasyfikacja Chorb i Problemw Zdrowotnych IGRA interferon-gamma release assay test uwalniania interferonu-gamma IP inducible protein (rodzaj chemokiny) I.U. international units jednostki midzynarodowe kDA kilodalton nazwa jednostki masy atomowej

LAM lipoarabinomannan L-J podoe Loewenstein-Jensen MDR multidrug resistance oporno wielolekowa MGIT mycobacteria growth indicator tube probwka ze wskanikiem wzrostu mykobakterii n/o nieokrelony (dot. kategorii wyniku testu QFT) PCR polymerase chain reaction polimerazowa reakcja acuchowa QFT QuantiFERON-TB Gold In Tube RD region of difference region rnicowania RLU relative luminescence unit wzgldna jednostka luminescencji RNA ribonucleic acid kwas rybonukleinowy ROC receiver operating characteristic charakterystyka operacyjna odbiornika rRNA ribosomal ribonucleic acid rybosomalny kwas rybonukleinowy SD standard deviation odchylenie standardowe SDA stand displacement amplification nazwa wasna systemu amplifikacji DNA firmy Beckton Dickinson TMA transcription mediated amplification nazwa wasna systemu amplifikacji rRNA firmy Gen-Probe TN true negative wyniki prawdziwie ujemne TP true positive wyniki prawdziwie dodatnie WHO World Health Organization - wiatowa Organizacja Zdrowia XDR extensive drug resistance poszerzona lekooporno

1. Wstp
1.1. Grulica wany problem epidemiologiczny i spoeczny

Grulica to choroba zakana towarzyszca czowiekowi od zarania dziejw. Czynnikiem etiologicznym grulicy s kwasooporne prtki nalece do kompleksu Mycobacterium tuberculosis. W skad kompleksu, o przynalenoci do ktrego decyduj z jednej strony obraz kliniczny wywoywanego schorzenia, a z drugiej budowa genomu, wchodz nastpujce gatunki prtkw: Mycobacterium

tuberculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium africanum, Mycobacterium microti. Do kompleksu naley rwnie atenuowany szczep szczepionkowy Mycobacterium bovis BCG. Nie wywouje on jednak u osb immunokompetentnych objaww grulicy (1). Uwaa si, e prtki, bdce przyczyn grulicy, spowodoway w historii ludzkoci mier wikszej liczby osb, ni jakikolwiek inny drobnoustrj.

Do niedawna za najstarsze przypadki grulicy uwaano te, ktre identyfikowano na podstawie stwierdzenia zmian anatomopatologicznych obserwowanych

w materiaach archeologicznych: wykopaliskach i mumiach. Zmiany grulicze w tych przypadkach dotyczyy ukadu kostnego. Liczba tego rodzaju doniesie cigle ronie, dowodzc powszechnoci zmian o charakterze grulicy u ludzi i hominidw w rnych epokach i rnych miejscach kuli ziemskiej. Za najstarsze w ten sposb zidentyfikowane znalezisko uwaa si szcztki Homo erectus odnalezione w Turcji, a pochodzce ze rodkowego plejstocenu. Zmiany zaobserwowane w kociach czaszki tego hominida zdiagnozowano jako Leptomeningitis tuberculosa (2). Nowych narzdzi dla obserwacji historii tych drobnoustrojw wrd gatunku ludzkiego dostarczya biologia molekularna. Naley podkreli, i to wanie badania nad histori naturaln grulicy w gwnej mierze przyczyniy si do powstania nowej 6

gazi

nauki

jak

jest

paleomikrobiologia

(3).

Kwasy

nukleinowe,

ktre

s przedmiotem identyfikacji przy uyciu metod genetycznych, s strukturami niezwykle labilnymi. W przypadku prtkw mamy jednak do czynienia

ze sprzyjajcymi okolicznociami: prtki posiadaj wyjtkowo odporn na dziaanie czynnikw rodowiskowych, bogat w lipidy cian komrkow, ktra chroni zawarto komrki, a wysoka zawarto guaniny i cytozyny w ich kwasie dezoksyrybonukleinowym wpywa korzystnie na jego stabilno. Poszukiwanie i zidentyfikowanie w materiaach kopalnych sekwencji DNA charakterystycznych dla prtkw grulicy pozwolio w sposb jednoznaczny stwierdzi obecno samych drobnoustrojw, a take przeledzi ich filogenez. Do niedawna za najstarsze w ten sposb datowane znaleziska uwaano egipskie mumie, w ktrych obecno zmian w kocu korelowaa z obecnoci w nich sekwencji DNA charakterystycznych dla M. tuberculosis (4). Ostatnio ukazay si doniesienia o odkryciu w warstwie iw pod powierzchni morza u wybrzey Izraela jeszcze starszego znaleziska liczcych 9.000 lat szkieletw kobiety i dziecka, w ktrych zidentyfikowano DNA prtkw (5). W czasach historycznych, w rdach pisanych grulica jako phtisis (gr. phthisis rozpad) pojawia si bodaj po raz pierwszy u Hipokratesa, ktry pisze w swych Aforyzmach (ok. 400 lat przed Chr.) w rozdziale V, e phthisis wystpuje najczciej pomidzy 18 a 35 rokiem ycia. Arystoteles podejrzewa zakany charakter choroby. Gallen (II w. po Chr.) podaje opis grulicy piszc, e jest to owrzodzenie puc, klatki piersiowej lub garda, ktremu towarzyszy kaszel oraz wyniszczenie organizmu z powodu ropienia. Opisuje te grulic jako chorob niedoywienia (6). Milowym kamieniem na drodze poznania natury choroby oraz czynnika j wywoujcego byy prace niemieckiego lekarza Roberta Kocha (1843-1910), ktry

pracujc m.in. na stanowisku lekarza powiatowego w Wolsztynie dokona w roku 1882 odkrycia prtkw grulicy.

Rys. 1. Robert Koch oraz przyznany mu dyplom Nagrody Nobla (7)

W roku 1905 zosta uhonorowany Nagrod Nobla. Potwierdzi ostatecznie zakany charakter choroby, ktry przed wiekami sugerowa ju Arystoteles. Jego odkrycie umoliwio wykrywanie osb wydalajcych prtki, a wic wykrywanie osb zakaajcych. Koch zdawa sobie jednak spraw, e to tylko pocztek poczyna na drodze walki z chorob. Wskazywa te na sposoby walki z ni: niezbdn pomoc pastwa, konieczno rejestracji chorych oraz stworzenie warunkw do ich izolacji od osb zdrowych (8). Dzi grulica jest cigle istotnym problemem epidemiologicznym, medycznym i spoecznym wspczesnego wiata. Wedug danych wiatowej Organizacji Zdrowia w 2009 roku na caym wiecie na grulic chorowao 14 mln osb, w tym 9,4 mln byy to przypadki po raz pierwszy w tym roku zarejestrowane. Zmaro na t chorob 1,3 mln osb HIV-ujemnych i 380 tys. HIV-dodatnich. Zapadalno na grulic

wynosia w roku 2009 137/100.000 w skali wiata. Dla sytuacji epidemiologicznej w skali globu znaczenie maj rwnie nastpujce dane: 1. liczba chorych, u ktrych stwierdzono prtki w preparacie bezporednim wrd chorych noworejestrowanych (57% noworejestrowanych

przypadkw w roku 2009); 2. liczba pacjentw noworejestrowanych ze wspistniejcym zakaeniem wirusem HIV (12% noworejestrowanych przypadkw w roku 2009); 3. liczba pacjentw, u ktrych stwierdzono grulic wywoan wielolekoopornym szczepem M. tuberculosis (440 tys. dane za rok 2008) (9). Wysoki odsetek chorych prtkujcych przesdza o fakcie istnienia cigle niemoliwego do przerwania acucha epidemicznego. Przyjmuje si bowiem, e jedna osoba prtkujca kaszlc zakaa 10 osb w cigu roku (10). Pacjenci ze wspistniejcym zakaeniem wirusem HIV stanowi szczeglne wyzwanie dla wspczesnej medycyny. Wszyscy oni powinni by bowiem poddani terapii antyretrowirusowej. Grulica jest cigle gwn przyczyn mierci wrd zakaonych HIV oraz chorych na AIDS. Zgodnie z zaoeniami programw profilaktycznych WHO, skoordynowane dziaania powinny doprowadzi z jednej strony do zmniejszenia problemu HIV w populacji chorych na grulic, z drugiej zmniejszenia problemu grulicy w populacji zakaonych wirusem HIV. Wielolekooporne szczepy M. tuberculosis (MDR) stanowi powany problem terapeutyczny. Wystpowanie takiego mechanizmu opornoci ogranicza bowiem i tak krtk list lekw przeciwprtkowych. W skrajnych przypadkach dochodzi do wyselekcjonowania szczepw o poszerzonej lekoopornoci XDR, wobec ktrych czsto nie istnieje adna opcja terapeutyczna. Chorzy zakaeni takimi szczepami stanowi rezerwuar prtkw, ktrymi mog zakaa kolejne osoby ze swojego

otoczenia. Jest to zjawisko niebezpieczne zwaszcza w zamknitych rodowiskach obozach, wizieniach. Doprowadzio to do olbrzymiego rozprzestrzenienia tych szczepw w krajach poradzieckich. Rozprzestrzenienie grulicy na wiecie jest bardzo nierwnomierne. Rzuca si w oczy zaleno liczby zachorowa od poziomu socjoekonomicznego danego regionu. Pi pastw o najwyszej bezwzgldnej liczbie chorych na grulic to w roku 2006 Indie, Chiny, Nigeria, Bangladesz, Indonezja. Zapadalno za najwysza jest w Regionie Afrykaskim (wedug podziau WHO), gdzie wynosi 340/100.000. W Regionie Europejskim WHO zapadalno na grulic wynosi

47,1/100.000 (9). Rwnie w obrbie tego regionu mamy do czynienia z ogromnym zrnicowaniem sytuacji epidemiologicznej, ktra podobnie jak w skali wiata uzaleniona jest od poziomu rozwoju gospodarki. W skad Regionu Europejskiego w ujciu WHO wchodz subregiony, w ktrych zapadalno na grulic wynosi odpowiednio: 1. Unia Europejska (27 pastw) i 7 pastw zachodu (oprcz Monako i San Marino) 17,4/100.000 2. Bakany (7 pastw) 28,1/100.000 3. Wschd (12 pastw) 110,3/100.000 Najwysza zapadalno spord pastw Regionu Europejskiego wystpuje w Kazachstanie (282,1/100.000), najnisza za na Islandii i na Cyprze

(po 4,4/100.000) (11). Zapadalno na grulic w Polsce umiejscawia j wrd pastw o rednim stopniu zapadalnoci. Polska jest przykadem kraju, ktry dziki sprawnym programom prewencyjnym, dobrze zorganizowanej sieci specjalistycznych poradni

10

przeciwgruliczych i oddziaw szpitalnych specjalizujcych si w diagnostyce i leczeniu grulicy oraz sieci dziaajcych na ich potrzeby laboratoriw

mikrobiologicznych, poczyni na przestrzeni kilkudziesiciu lat olbrzymi postp w sytuacji epidemiologicznej w zakresie grulicy. W okresie od roku 1965 do 2005 nastpi 9-krotny spadek zapadalnoci (rys. 2) (12).

Rys. 2. Zapadalno na grulic wszystkich postaci w Polsce w latach 1965-2009. Wspczynniki na 100.000 ludnoci (12).

Dalszy i szybszy spadek zapadalnoci zosta zahamowany niekorzystnymi zmianami majcymi miejsce w ochronie zdrowia (demonta sieci poradni przeciwgruliczych, niedostateczne finansowanie, brak jasnego systemu nadzoru epidemiologicznego). Biorc pod uwag cisy zwizek sytuacji epidemiologicznej w zakresie grulicy z sytuacj ekonomiczn, naley rwnie w jej pogorszeniu w niektrych grupach spoecznych upatrywa spowolnienia korzystnych trendw. Wydaje si, e obecnie sytuacja epidemiologiczna w zakresie grulicy ulega w Polsce niekorzystnej stabilizacji. Nie obserwuje si ju od 5 lat spadku zapadalnoci w skali kraju, a wszelkie zmiany w tym zakresie w cigu tego okresu 11

(zarwno wzrost jak i spadek) maj swoje rdo w niedoskonaoci systemu sprawozdawczoci. wiadczy o tym mog obserwowane w skali wojewdztw zmiany zapadalnoci, ktrych skali nie mona wytumaczy zjawiskami

epidemiologicznymi, a jedynie bdami w rejestracji przypadkw (rys. 3).

Rys. 3. Zapadalno na grulic w wojewdztwie wielkopolskim w latach 2005-2009 ( ilo przypadkw/100.000) (12).

Naley podejmowa nadal wszelkie starania, aby zapadalno na grulic realnie obniy. Dziaania zmierzajce ku temu musz obejmowa zarwno obszar diagnostyki (w tym laboratoryjnej) i leczenia, jak profilaktyki i organizacji (koordynacji) dziaa. O ile celem globalnym w skali wiata zgodnie z zaoeniami programu wiatowej Organizacji Zdrowia STOP TB jest powstrzymanie wzrostu zapadalnoci na grulic do roku 2015, to dla Polski celem takim mogoby by ograniczenie zapadalnoci do wielkoci, ktra umoliwiaby umiejscowienie Polski w gronie pastw o niskiej zapadalnoci, a wic niszej ni 10 przypadkw na 100.000 ludnoci (13). Realna analiza linii trendu spadku zapadalnoci kae jednak ten cel w danej

12

perspektywie czasowej uzna za nierealny. Taka sytuacja kae wnikliwie przyglda si wszelkim nowociom na rynku produktw diagnostycznych, ktre usprawniajc proces wczesnego rozpoznawania osb zakaonych prtkiem grulicy oraz chorych na grulic pozwol na jak najwczeniejsze przerwanie acucha epidemicznego poprzez wdroenie procedur profilaktycznych, izolacyjnych i terapeutycznych.

1.2.

Laboratoryjna diagnostyka grulicy

Specyficzny charakter drobnoustroju wywoujcego grulic kwasoopornych prtkw nalecych do kompleksu Mycobacterium tuberculosis sprawia, e jego diagnostyka ograniczona jest do wskiego krgu wyspecjalizowanych laboratoriw mikrobiologicznych. Ich liczba w Polsce nie przekracza 90. W zalenoci od stopnia referencyjnoci (zakresu wykonywanych bada) laboratoria te dzieli si

na laboratoria I, II i III rzdu. Laboratoria III rzdu oferuj peen zakres bada w zakresie mikrobiologicznej diagnostyki grulicy. Laboratoria I rzdu, wykonujce tylko badania mikroskopowe, charakterystyczne s dla krajw Trzeciego wiata i w Polsce nie wystpuj. Zgodnie z rekomendacjami wiatowej Organizacji Zdrowia jedno laboratorium II rzdu powinno przypada na milion mieszkacw kraju, natomiast jedno laboratorium III rzdu powinno obsugiwa populacj 3 4 milionw mieszkacw. Nadrzdn rol nad sieci laboratoriw peni krajowe referencyjne laboratorium prtka (14). Wynika z powyszego, e sie laboratoriw prtka cigle jest w Polsce nadmiernie rozbudowana. Sie t charakteryzuje rwnie pewna nierwnomierno, gdy obok wojewdztw o prawidowej strukturze sieci

(np. wojewdztwo wielkopolskie) s wojewdztwa o duej liczbie laboratoriw wykonujcych stosunkowo niewielk liczb bada. Tylko w przypadku laboratoriw wykonujcych du liczb bada mona mwi o nabyciu przez nie biegoci 13

zapewniajcej odpowiedni poziom diagnostyki. Naley pamita, e dokadne i szybkie wykrycie prtkw metodami mikrobiologicznymi w materiaach

pochodzcych od chorych stanowi jeden z najwaniejszych elementw programu DOTS w (Directly Observed grulicy na Treatment wiecie, a Short-Course) za cigle obowizujcego grulicy badania

zwalczaniu si

definitywny dodatnim

przypadek wynikiem

uwaa

jedynie

przypadek

potwierdzony

mikrobiologicznego (15). Wspczenie mikrobiolog ma do dyspozycji szeroki wachlarz metod diagnostycznych, z ktrych cz w niemal niezmienionej postaci funkcjonuje od czasw Roberta Kocha. Postp technologiczny sprawia jednak, e do tej grupy metod doczyy nowe metody szybsze, czulsze, zapewniajce wysok specyficzno. S to przede wszystkim metody wykorzystujce technologie biologii molekularnej. Cigle dyskusyjna jest warto i przydatno metod immunologicznych (wykorzystujcych mechanizmy odpowiedzi humoralnej

lub komrkowej) w diagnostyce grulicy.

1.2.1. Klasyczne metody mikrobiologiczne 1.2.1.1. Bakterioskopia

Bakterioskopia jest pierwszym i najwaniejszym badaniem mikrobiologicznym, jakie naley wykona w przypadku podejrzenia grulicy u pacjenta. Jest to badanie proste, tanie i szybkie. Zalet badania jest atwo uzyskania podstawowego w diagnostyce grulicy puc materiau diagnostycznego jakim jest plwocina. Dodatni wynik rozmazu mikroskopowego materiau klinicznego wraz z obecnoci okrelonych objaww klinicznych oraz zmian radiologicznych daje lekarzowi bliskie pewnoci potwierdzenie gruliczej etiologii choroby. Niezwykle istotny jest epidemiologiczny aspekt tego badania, gdy pozwala na szybkie 14

izolowanie pacjenta, a co za tym idzie przerwanie acucha epidemiologicznego. Niestety, badanie rozmazu mikroskopowego obarczone jest rwnie pewnymi ograniczeniami i wadami. Najpowaniejsz wad jest niska czuo badania. Dla zaobserwowania pojedynczych prtkw w rozmazie preparatu bezporedniego wykonanego z materiau klinicznego musi on zawiera 5000 10000 komrek prtkw w 1 mililitrze (16). W rd wszystkich zarejestrowanych w roku 2009 w Polsce przypadkw grulicy potwierdzonej bakteriologicznie dodatni wynik bakterioskopii uzyskano jedynie w 58,7% przypadkw (12). Drugim powanym ograniczeniem tej metody jest brak absolutnej specyficznoci wobec prtkw kompleksu Mycobacterium tuberculosis. Wykorzystywana w barwieniu preparatw prtkw cecha kwasoopornoci jest bowiem cech zarwno prtkw kompleksu Mycobacterium tuberculosis jak i prtkw niegruliczych, a take drobnoustrojw z rodzaju Nocardia (16). Kwasooporno jest fizyczn wasnoci niektrych bakterii, odnoszc si do ich opornoci na odbarwianie kwanymi roztworami alkoholi podczas procedury barwienia. Drobnoustroje kwasooporne trudno scharakteryzowa przy uyciu standardowych technik mikrobiologicznych (np. barwione metod Grama czsto wykazuj wynik wtpliwie dodatni). Kwasooporno jest spowodowana budow ciany komrkowej, ktra jest bardzo bogata w kwasy mykolowe, ktre w poczeniu z barwnikami anilinowymi tworz trwae kompleksy (17). Twrcami stosowanej do dzi techniki barwienia prtkw byli niezalenie Franz Ziehl (1857-1926) oraz Friedrich Neelsen (1854-1894). Niezalenie od siebie opracowali w roku 1882 metod barwienia drobnoustrojw kwasoopornych, ktra do dzi nazywana jest metod Ziehl-Neelsena. Jako barwnik podstawowy

wykorzystywana jest w niej fuksyna karbolowa. Obecnie coraz czciej wykorzystuje

15

si barwniki fluorescencyjne i technik mikroskopii fluorescencyjnej. Najczciej wykorzystywanym barwnikiem jest auramina O, ktra, podobnie jak fuksyna karbolowa, tworzy ze skadnikami ciany komrkowej prtkw nie wypukujce si kwanymi odbarwiaczami trwae kompleksy. Uwaa si, e technika fluorescencyjna ma nieco wysz czuo. Podstawow zalet tej techniki jest jednak krtszy czas potrzebny do obserwacji preparatw mikroskopowych, co jest moliwe dziki stosowaniu w tej technice mniejszych ni w metodzie Ziehl-Neelsena powiksze (typowo 400-krotne). Umoliwia to obserwacj wikszej powierzchni preparatu w pojedynczym polu widzenia mikroskopu (18). Warto nadmieni, e jeszcze w roku 1948 najwybitniejszy polski ftyzjatra tamtych czasw Eugenia Piasecka-Zeyland pisaa o tej powszechnie dzi stosowanej metodzie: Poczwszy od r. 1937 wznowiono prby stosowania promieni pozafiokowych do rozpoznawania mikroskopowego prtkw grulicy potraktowanych

odpowiednimi fluorochromami (siarczanem berberyny) i przede wszystkim auramin. Metoda ta wymaga nie tylko osobnego urzdzenia (aparat fluorescencyjny czyli luminescencyjny), lecz i osobnego pokoju z usuwaniem szkodliwych azotynw. Krytyczny przegld powstaego na ten temat pimiennictwa doprowadza do wniosku, e uzyskane wyniki nie

usprawiedliwiaj kosztw. (19) Nieaktualno tego stwierdzenia pozwala ywi nadziej, e inne metody diagnostyczne, dzi uwaane za zbyt drogie, w przyszoci bd uywane tak powszechnie, jak dzi stosuje si barwienie fluorescencyjne. Inna myl docent Eugenii Piaseckiej-Zeyland zawarta w cytowanej pracy do dnia dzisiejszego nie stracia nic ze swojej aktualnoci:

16

bakterioskopia w bakteriologicznym rozpoznawaniu grulicy jest metod bardzo cenn, ale aby mc naleycie z niej korzysta, trzeba dokadnie zna wszystkie jej ograniczenia. (19)

1.2.1.2.

Metody hodowlane

Prekursorem zastosowania metody hodowli w diagnostyce grulicy by Robert Koch. Pierwsze wyhodowane przez niego prtki grulicy wzrosy na podou, ktre stanowia termicznie koagulowana surowica umieszczona w probwce w formie skosu. Materiaem jakiego uy do posiewu byy gruzeki grulicze pobierane pomiertnie od zmarych na grulic pacjentw berliskich szpitali. W cigu dziesicioleci dopracowano optymaln formu podoa sucego wspczenie do hodowli prtkw w wikszoci laboratoriw na wiecie. Jest to podoe Loewenstein-Jensen. Loewenstein pierwotnie opracowa podoe do hodowli prtkw zawierajce czerwie Kongo i ziele malachitow barwniki czciowo hamujce wzrost innych bakterii (20). Obecna formua, opracowana przez Jensena, charakteryzuje si nieznacznie zmodyfikowan zawartoci cytrynianw i fosforanw oraz zwikszonym steniem zieleni malachitowej i nie zawiera czerwieni Kongo (21). Gwne skadniki tego podoa to jaja kurze, glicerol, L-asparagina oraz sole mineralne. Glicerol jest rdem wgla w podou, zwizki organiczne zawarte w jajach (zwaszcza tkach) stanowi materia do budowy skadnikw lipidowych, L-asparagina jest rdem azotu. Czas oczekiwania na wynik ujemny hodowli zaoonej na tym podou wynosi 10 tygodni. Jeeli materia od chorego jest bogaty w prtki, charakterystyczne kolonie prtkw zaczynaj wzrasta na podou w 4 6 tygodniu hodowli. Dugi okres oczekiwania na wynik hodowli (zarwno dodatni jak i ujemny) jest powodem, dla ktrego coraz powszechniej uywa si 17

tzw. szybkich systemw hodowlanych. Dwa istotne elementy tych systemw, decydujce o ich wysokiej czuoci oraz skrconym w stosunku do konwencjonalnej metody hodowli czasie wykrycia prtkw to: pynne podoe hodowlane (podoe Middlebrookea 7H9), system automatycznej detekcji wzrostu prtkw.

Obecnie w rutynowym uyciu w pracowniach bakteriologicznych caego wiata znajduj si dwa systemy, rnice si sposobem detekcji. Poniej opisano te dwa systemy. MB/BacT Butelka z podoem wzrostowym zawiera wskanik reagujcy na zmian stenia dwutlenku wgla wydzielanego w czasie wzrostu bakterii. Pomiar kolorymetryczny jest dokonywany w sposb cigy, a stwierdzenie przez system wzrostu jest sygnalizowane przez aparat (22). MGIT 960 System wykorzystuje probwki MGIT (Mycobacteria Growth Indicator Tube) ze wskanikiem reagujcym na zmiany stenia tlenu w poywce (zmniejszenie stenia zwizane z tlenowym metabolizmem bakterii). Podobnie jak w poprzednim systemie, pomiar dokonywany jest w sposb cigy, a cz pomiarowa jest integraln czci komory inkubacyjnej. Zasadnicz rnic jest sposb detekcji mierzonego parametru w tym systemie mierzy si zmian fluorescencji (23).

Prekursorem

obu

wymienionych

systemw

by

system

hodowlany

Bactec 460 TB z radiometrycznym pomiarem stenia dwutlenku wgla jako produktu metabolizmu bakterii (24). Ze wzgldu na wykorzystywane w tym systemie podoa zawierajce substraty znakowane izotopem wgla C-14 jest on sukcesywnie

18

wycofywany z uycia i zastpowany bezpieczniejszymi dla rodowiska systemami MB/BacT oraz MGIT. Zastosowanie systemw automatycznych pozwolio na znaczce skrcenie czasu potrzebnego do uzyskania wzrostu prtkw, co potwierdzaj wyniki Sorlozano i wsp. przedstawione w tabeli 1. (25)

Czas wykrycia: rednio dni SD Prtki L-J MB/BacT MGIT 960

Wszystkie

32,4 11,9

20,2 9,0

15,1 6,4

M. tuberculosis complex

32,6 11,8

20,1 8,6 12,0

(tylko 1 izolat)

15,3 6,1

M. chelonae

21,6 5,3

12,6 0,5

M. kansasii

29,8 10,8 49,5 0,7

(tylko 2 izolaty)

19,2 13,0 44,0

(tylko 1 izolat)

12,0 5,6

M. fortuitum

20,3 18,9

M. gordonae

43,0 9,9 19,0

(tylko 1 izolat)

nie wykryto

nie wykryto

M. marinum

nie wykryto

nie wykryto

Tab. 1. redni czas wzrostu prtkw w rnych systemach hodowlanych (L-J - klasyczna hodowla na podou Loewensteina-Jensena) (25).

Rwnie czsto izolacji prtkw w przypadku hodowli w systemach automatycznych jest znaczco wysza ni w przypadku konwencjonalnych hodowli na podoach staych (25, 26). 19

Naley pamita, e kademu zleceniu badania materiau klinicznego metod bakterioskopii powinno towarzyszy zlecenie wykonania hodowli. Metoda hodowli jest znacznie czulsza ni bakterioskopia i umoliwia wykrycie prtkw wystpujcych w materiale klinicznym ju w ilociach 10 100 komrek/ml (16). Poza tym tylko hodowla umoliwia uzyskanie kultury bakteryjnej, ktra pozwoli na identyfikacj gatunkow oraz okrelenie wraliwoci na leki przeciwprtkowe.

1.2.2. Diagnostyka metodami biologii molekularnej Zastosowanie technik amplifikacji kwasw nukleinowych mikobakterii znacznie zwikszyo moliwoci mikrobiologicznej diagnostyki grulicy. Ta najmodsza ga technik stosowanych w mikrobiologii prtka grulicy (pierwsze prace na temat stosowania technik amplifikacji DNA prtka grulicy w materiaach klinicznych pochodz z koca lat 80-tych XX wieku) rozwija si niezwykle dynamicznie (27). Rozwj technik molekularnych doprowadzi do powstania metod umoliwiajcych potwierdzenie, z bardzo du czuoci i swoistoci, obecnoci prtkw w badanym materiale klinicznym ju w cigu 1-2 dni. W zakresie klinicznej diagnostyki grulicy metodami amplifikacji kwasw nukleinowych stosunkowo wczenie zaczo obowizywa ograniczenie naoone przez wiatow Organizacj Zdrowia dotyczce systemw diagnostycznych typu home-made. W roku 1998 organizacja ta rekomendowaa, aby badania molekularne materiaw klinicznych na obecno materiau genetycznego Mycobacterium tuberculosis wykonywa wycznie w zamknitych, komercyjnie dostpnych

systemach genetycznych, wyposaonych w kontrole procesw amplifikacji (28). Obecnie w Polsce najpowszechniej stosowane s dwa tego rodzaju systemy:

20

ProbeTec (Becton Dickinson) W systemie tym wykorzystywany jest proces SDA (Strand Displacement

Amplification). Jest to proces izotermalny, w ktrym amplifikacja odbywa si w poczeniu z jednoczesnym wykrywaniem amplifikowanego materiau. Sekwencj docelow jest sekwencja insercyjna IS 6110 fragment DNA charakterystyczny dla Mycobacterium tuberculosis complex. System posiada wewntrzn kontrol amplifikacji, pozwalajc na wykrywanie inhibitorw tego procesu znajdujcych si w badanym materiale. Enzymy wykorzystywane w reakcji SDA to polimeraza DNA oraz enzym restrykcyjny (29). MTD (Gen Probe) Amerykaska firma Gen Probe opracowaa metod amplifikacji kwasw nukleinowych nazwan TMA (Transcription Mediated Amplification). TMA jest procesem izotermalnym. W tej metodzie amplifikacji ulega sekwencja rybosomalnego kwasu rybonukleinowego. Detekcja amplifikowanego materiau genetycznego odbywa si przy pomocy sond znakowanych estrem akrydynowym. Sondy, ktre ulegy hybrydyzacji z produktem procesu TMA emituj sygna chemiluminescencyjny, ktry jest mierzony przez luminometr. Stosowane w procesie TMA enzymy to: odwrotna transkryptaza oraz polimeraza RNA. Zastosowanie rRNA prtkw jako obiektu docelowego sondy okazao si metod bardzo czu, gdy wystpuje on w komrce bakteryjnej w tysicach kopii (30, 31). Obecnie znaczenie zyskuj systemy wykorzystujce technologi real-time PCR. Zastosowanie takich systemw umoliwia pilociow ocen iloci prtkw w badanym materiale klinicznym. Jednym z najnowszych produktw tego typu jest system GeneXpert. W systemie tym, w przypadku wykrycia materiau genetycznego

21

prtka, rwnoczenie identyfikowane jest wystpowanie mutacji odpowiedzialnej za oporno na rifampicyn podstawowy lek przeciwprtkowy (32). Diagnostyka molekularna wesza na stae do zestawu metod diagnostyki laboratoryjnej grulicy. Zostao to jednoznacznie usankcjonowane zaleceniami wiatowej Organizacji Zdrowia. Zaleca ona, by amplifikacyjnym testem genetycznym potwierdza wszystkie przypadki dodatniej bakterioskopii. Takie postpowanie umoliwia bardzo szybkie potwierdzenie przynalenoci obserwowanych

w preparacie bezporednim form kwasoopornych do kompleksu Mycobacterium tuberculosis, a take w przypadku stosowania zaawansowanych systemw pozwala na okrelenie wraliwoci prtkw na leki przeciwprtkowe poprzez identyfikacj mutacji w genie rpoB odpowiedzialnych za t oporno. O randze jak wiatowa Organizacja Zdrowia nadaje molekularnej diagnostyce grulicy wiadczy

to, e promuje ona systemy praktycznie bezobsugowe i zaleca ich wprowadzanie do laboratoriw o niszych poziomach referencyjnoci (33).

1.2.3. Diagnostyka histologiczna Rol badania histologicznego w diagnostyce grulicy potwierdza fakt zrwnania jej znaczenia z badaniem bakteriologicznym poprzez umieszczenie jej w opisie jednostki chorobowej zastosowanym w Midzynarodowej Klasyfikacji Chorb i Problemw Zdrowotnych ICD-10 (34). Klasyfikacja ta opisuje grup A-15 jako grulic ukadu oddechowego, bakteriologicznie i histologicznie potwierdzon. Ten rodzaj diagnostyki posiada pewne ograniczenia: materia do przeprowadzenia badania metodami histologicznymi pobierany jest w sposb inwazyjny (w trakcie zabiegu operacyjnego lub biopsji); 22

badanie nie dostarcza materiau (namnoonego szczepu bakteryjnego) koniecznego do przeprowadzenia identyfikacji gatunkowej szczepu oraz oznaczenia jego lekowraliwoci.

Nie zmienia to jednak faktu, e ta metoda rozpoznawania etiologii zmian w tkance puc posiada wysok, porwnywaln z badaniami mikrobiologicznymi czuo i swoisto (35). Niektrzy autorzy wnioskuj, e dla uzyskania optymalnego wyniku z uzyskanego materiau naley wykona rwnolegle posiew (36, 37). Zakaona prtkiem grulicy tkanka ulega charakterystycznym zmianom.

Mikroskopowy obraz tych zmian pozwala na postawienie rozpoznania grulicy. Histologicznie miejsca aktywnego rozwoju naznaczone s charakterystyczn zapaln reakcj ziarniniakow, w ktrej tworz si zarwno serowaciejce, jak

i nieserowaciejce gruzeki. Pojedyncze gruzeki s mikroskopowej wielkoci; dopiero gdy nastpi zlewanie si licznych gruzekw, staj si one widoczne makroskopowo. Gruzeki otacza zwykle piercie fibroblastw przerywany naciekiem limfocytw. W gruzekach stwierdza si wielojdrowe komrki olbrzymie (38).

Rys. 4. Obraz mikroskopowy wielojdrzastej komrki olbrzymiej i ziarniniaka gruliczego (39).

23

1.2.4. Immunologiczne metody diagnostyczne w grulicy 1.2.4.1. Metody oparte na badaniu odpowiedzi humoralnej

Odpowied immunologiczna w grulicy jest typowym przykadem odpowiedzi komrkowej (40, 41). Z tego wzgldu diagnostyka serologiczna, polegajca na poszukiwaniu we krwi przeciwcia produkowanych przez ukad immunologiczny w odpowiedzi na zakaenie prtkiem, ma marginalne znaczenie w diagnostyce grulicy. Pomimo tego, e badania nad wykorzystaniem reakcji antygen przeciwciao rozpoczto ju pod koniec XIX wieku badaniami Arloinga (42) i trway one przez cay wiek XX, nie doczekano si testu wykazujcego w peni satysfakcjonujce parametry. Stosowany w pracach Arloinga tzw. szczep jednolity dajcy rwnomierne zmtnienie bulionu mia reagowa z przeciwciaami

przeciwprtkowymi, a wynikiem tej reakcji miaa by aglutynacja. Reakcja ta przy wysokiej czuoci charakteryzowaa si bardzo nisk swoistoci. W nastpnych dziesicioleciach prbowano praktycznie uy wielu rnych antygenw. W chwili obecnej pewne znaczenie praktyczne posiadaj antygeny 38 kDa, A-60

i LAM (43, 44). Na bazie tych antygenw produkowane s dostpne komercyjnie testy (zarwno w postaci testw ELISA jak i prostych i szybkich w wykonaniu testw immunochromatograficznych). Czuo tych testw szacowana jest jednake zaledwie na 31-69% w zalenoci od fazy choroby (1). Na chwil obecn wydaje si, e ten rodzaj diagnostyki stanowi lep uliczk w diagnostyce czynnych postaci grulicy. Pewne nadzieje mona natomiast wiza z wykorzystaniem izolowanych antygenw prtkowych w badaniach odpornoci humoralnej stymulowanej

szczepieniami zarwno BCG oraz projektowanych atenuowanych szczepionek przeciw grulicy (45, 46).

24

1.2.4.2.

Metody oparte na badaniu odpowiedzi komrkowej

Tuberkulinowy odczyn skrny W roku 1964 Mackaness (47) wykaza w sposb jednoznaczny, e odporno na zakaenie prtkiem grulicy oraz niektrymi innymi wewntrzkomrkowymi patogenami bakteryjnymi ma charakter odpornoci typu komrkowego. Umoliwio to ostateczne wyjanienie mechanizmu tuberkulinowego odczynu skrnego

stosowanego od pocztku XX wieku. Jakkolwiek podzia mechanizmw obrony przed zakaeniem (na odporno humoraln i komrkow) by znany duo wczeniej, to nie rozumiano istoty zjawiska. Oto jeszcze w roku 1948 w rozdziale publikacji nt. grulicy dotyczcym udziau odpornoci komrkowej w reakcji na zakaenie prtkiem czytamy: Czy jednak udzia komrek krcych we krwi albo tkankowych, ma pewne znaczenie w zwalczaniu prtkw przez ustrj? Ot krtko powiedziawszy, nie znamy takiego odczynu komrkowego, ktry by mona uwaa za wyraz obrony czy odpornoci ustroju. Udzia mikrofagw (sic!) , a wic granulocytw w pochanianiu prtkw jest duy, ale znaczenie jego polega moe raczej na roznoszeniu prtkw w ustroju i powstawaniu w ten sposb przerzutw drog krwi. (19) Tuberkulinowy odczyn skrny zaproponowany zosta w rnych postaciach, niemal rwnoczenie przez trzech badaczy: Clemensa von Pirqueta (1907), Charlesa Mantoux (1908) oraz Ernsta Moro (1908) (19). Technika zaproponowana przez Pirqueta polegaa na skaryfikacji w miejscu podania tuberkuliny. Moro stosowa wcieranie maci zawierajcej tuberkulin. Niewtpliwie najlepszym i do dnia dzisiejszego stosowanym sposobem podania tuberkuliny jest zaproponowane przez Mantoux rdskrne wstrzyknicie tuberkuliny. W przypadku kadego z testw

25

obserwowano wystpienie reakcji zapalnej w miejscu podania tuberkuliny jako odpowiedzi na wczeniejszy kontakt osoby badanej z prtkiem grulicy. Reakcja ta ma charakter nadwraliwoci typu opnionego (48). Przez dziesiciolecia test Mantoux by jedynym dostpnym testem umoliwiajcym ocen stanu zakaenia organizmu prtkiem, speniajc rwnie pomocnicz rol w diagnostyce aktywnych postaci grulicy. Metoda ta nie bya wolna od wad. Podstawow wad jest stosowanie tuberkuliny, bdcej mieszanin niezdefiniowanych dokadnie antygenw reagujcych krzyowo z antygenami szczepu BCG (49). Stosowana dzi tuberkulina referencyjna RT23 (Statens Serum Institut, Kopenhaga) rwnie nie jest wolna od wszystkich wad jakie miay jej stare wersje. Jest to przyczyna, dla ktrej interpretacja wynikw tego testu w populacjach szczepionych szczepionk BCG moe by obarczona duym stopniem odczynu niepewnoci. skrnego Doniesienia w dotyczce tych swoistoci populacjach

tuberkulinowego

s sprzeczne (50, 51, 52, 53). W badaniu przeprowadzonym na polskiej grupie osb szczepionych wielokrotnie Gruszczyski i Ozorowski wykazali, e nie wystpuje statystycznie istotna rnica w rozkadzie wynikw skrnego odczynu

tuberkulinowego pomidzy osobami zdrowymi, bez uprzedniego kontaktu z osobami chorymi na grulic, a osobami chorymi na grulic. Przyjcie wielkoci nacieku, ktra dyskryminowaa obie grupy w sposb statystycznie istotny 19 mm powodowao z kolei, e test wykazywa czuo niespena 24% (54). Testy uwalniania interferonu gamma Opisanych powyej wad pozbawione s testy uwalniania interferonu gamma (IGRA). Testy IGRA s testami in vitro sucymi do oceny zakaenia organizmu drobnoustrojem (w tym przypadku prtkiem grulicy), ktry indukuje odpowied komrkow. Poziom tej odpowiedzi jest mierzony iloci uwalnianego przez limfocyty

26

interferonu gamma. Uzyskanie wysokiej specyficznoci moliwe jest w tej metodzie dziki zastosowaniu do indukcji odpowiedzi antygenw specyficznych dla kompleksu Mycobacterium tuberculosis z wyjtkiem Mycobacterium bovis BCG. Stosowane antygeny nie reaguj rwnie z wikszoci szczepw prtkw niegruliczych (wyjtkiem s: M. kansasii, M. szulgai, M. marinum). Antygeny te zostay zidentyfikowane metodami inynierii genetycznej na pocztku lat 90-tych XX wieku jako produkt regionu RD1 genomu prtka (55). Region ten nie wystpuje za w szczepie BCG oraz w szczepach niegruliczych (z wyjtkiem wyej

wymienionych). Antygeny te to ESAT-6 (Early Secretory Antigenic Target 6) (56) oraz CFP-10 (Culture Protein Filtrate 10) (57). W tecie najnowszej generacji, dla zwikszenia jego specyficznoci uywa si rwnoczenie trzeciego antygenu: TB7.7(p4), ktry jest produktem regionu RD11 (55).

Zasada metody IGRA (58)

Do prbki krwi heparynizowanej dodaje si w warunkach in vitro antygeny: ESAT-6, CFP-10 oraz ewentualnie TB7.7(p4). Dochodzi do kontaktu antygenw oraz komrek prezentujcych antygen (APC).

Antygeny zostaj pochonite i przetworzone przez komrki APC.

27

Nastpuje prezentacja epitopw antygenu limfocytom T.

Aktywowany limfocyt T wydziela cytokiny, wrd nich interferon gamma.

Proces uwalniania interferonu gamma moe by monitorowany w dwojaki sposb: bd poprzez pomiar jego stenia metod ELISA (komercyjna forma testu: QuantiFERON-TB Gold In Tube; Cellestis), bd poprzez okrelenie liczby limfocytw uwalniajcych interferon gamma metod ELISPOT (komercyjna forma testu: T-Spot.TB; Oxford Immunotec) (58). Testy IGRA zostay opracowane gwnie z myl o wykrywaniu latentnego zakaenia prtkiem grulicy, jako czulsza i bardziej swoista alternatywa

tuberkulinowego odczynu skrnego. Znalazo to odbicie w rekomendacjach jakie ukazay si w ostatnich latach (59, 60, 61, 62). Gwne obszary zastosowa testw IGRA to: badanie osb po kontakcie z chorymi na czynn grulic (63 - 67) badanie osb naraonych zawodowo na zakaenie prtkiem grulicy (68 72) badanie kandydatw do terapii biologicznych (73 78) badanie osb z pierwotnymi i wtrnymi niedoborami odpornoci (79 81).

28

Obserwuje si trzy rne sposoby podejcia do stosowania testw IGRA w diagnostyce pacjentw w wyej wymienionych obszarach: rwnoczesne skrnego (62); weryfikowanie dodatnich wynikw tuberkulinowego odczynu skrnego testem IGRA (61); dopuszczenie testw IGRA do stosowania we wszystkich obszarach, w ktrych do tej pory stosowano tuberkulinowy odczyn skrny (59). Jednoczenie od samego niemal pocztku stosowania testw IGRA podejmowano prby uycia ich jako testw sucych diagnostyce aktywnych postaci grulicy (82 89). Stosunek rnych autorw do tego zagadnienia dobrze ilustruje tytu w formie pytania artykuu zamieszczonego w European Respiratory Journal: Interferon- release assays for the diagnosis of active tuberculosis: sensible or silly? (90). Midzy tymi skrajnymi opcjami mieszcz si bowiem odpowiedzi na to pytanie. Zwizane jest to ze znacznym rozrzutem wartoci czuoci uzyskanych w badaniach rnych autorw: od 58% (91) do 100% (92) dla testu wykonywanie testu IGRA i tuberkulinowego odczynu

QuantiFERON-TB Gold In Tube oraz od 50% (93) do 100% (94) dla testu T-Spot. Obliczona w metaanalizie Diela i wsp. (95) rednia czuo testu IGRA w wykrywaniu aktywnych postaci grulicy wynosia 81% (95% CI: 78-83%) dla testu

QuantiFERON-TB Gold In Tube oraz 87,5% (95% CI: 85-90%) dla testu T-Spot. Taka rozbieno nasuwa wniosek o koniecznoci dokonania oceny przydatnoci testu do diagnozowania aktywnych postaci grulicy kadorazowo dla populacji, w ktrej test ma by stosowany (87). Na podstawie teoretycznych rozwaa mona oczekiwa, e znalezienie innych, bardziej specyficznych, cytokin spowoduje zwikszenie czuoci i swoistoci testu opartego na pomiarze uwalniania takich

29

cytokin pod wpywem stymulacji specyficznymi antygenami prtka. By moe uda si wwczas rwnie rnicowa zakaenia pierwotne od przebytych oraz latentne zakaenie prtkiem od czynnej postaci grulicy.

30

2. Cel pracy

Celem pracy jest okrelenie miejsca i znaczenia testu QuantiFERON-TB Gold In Tube w schematach diagnostycznych rozpoznawania zakae prtkiem Mycobacterium tuberculosis w aktywnej postaci grulicy puc.

Cel ten zrealizowano przez:

1. Analiz statystyczn wynikw testu QuantiFERON-TB Gold In Tube w odniesieniu do zotego standardu w diagnozowaniu aktywnych postaci grulicy, jakim jest wynik bada mikrobiologicznych;

2. Okrelenie

optymalnych

dla

badanej

populacji

punktw

odcicia

rnicujcych grup wynikw dodatnich i ujemnych testu;

3. Analiz

przydatnoci

pomiaru

elementw

skadowych

testu

do rnicowania etiologii chorb puc.

31

3. Materia i metody
3.1. Charakterystyka badanej populacji Badaniem objto 979 pacjentw w wieku powyej 18 lat, w tym 381 kobiet i 598 mczyzn, podejrzanych o wystpowanie grulicy i hospitalizowanych w Wielkopolskim Centrum Pulmonologii i Torakochirurgii w okresie od stycznia 2006 roku do maja 2010 roku. Charakterystyk demograficzn badanej populacji przedstawiono w tabeli 2. W toku prowadzonej rutynowo diagnostyki rnicowej wykonano u nich badania mikrobiologiczne oraz test Quantiferon-TB Gold in tube.

pe Kobiety mczyni

n (%) 381 (38,9%) 598 (61,1%)

wiek (min. max.) 18 91 18 - 88

mediana 58,0 55,2

redni wiek (w latach) 56,6 16,6 54,9 15,8

Tabela 2 . Charakterystyka demograficzna badanej populacji.

Ze wzgldu na postawione rozpoznanie na potrzeby badania pacjentw podzielono zgodnie z Midzynarodow Klasyfikacj Chorb i Problemw

Zdrowotnych ICD-10 na nastpujce grupy (34): grupa pacjentw z definitywnym rozpoznaniem grulicy puc rozpoznanie A-15 (przypadki potwierdzone dodatnim wynikiem hodowli prtkw M. tuberculosis i/lub dodatnim wynikiem badania genetycznego i/lub rozpoznaniem histopatologicznym);

32

grupa pacjentw z grulic rozpoznan jedynie na podstawie objaww klinicznych bez potwierdzenia w badaniach laboratoryjnych

rozpoznanie A-16; grupa pacjentw z innymi chorobami puc, u ktrych po przeprowadzeniu bada diagnostycznych grulic wykluczono. W toku dalszej diagnostyki rozpoznano u nich nastpujce jednostki chorobowe: zapalenie puc wywoane drobnoustrojem innym ni M. tuberculosis, nowotwory puc, sarkoidoz. Dla istoty niniejszej pracy analiza czstoci wystpowania tych rozpozna nie jest konieczna. Zgod na przeprowadzenie badania wedug zastosowanego protoku wydaa Komisja Bioetyczna przy Uniwersytecie Medycznym w Poznaniu

(Uchwaa nr 200/08).

3.2.

Zakres bada

3.2.1. Badania mikrobiologiczne Wszyscy pacjenci wczeni do badania mieli wykonywan pen diagnostyk mikrobiologiczn grulicy, prowadzon zgodnie ze zleceniami lekarza prowadzcego. Materiaami do bada mikrobiologicznych byy: plwocina popuczyny oskrzelowe pyn z jam opucnej tkanka puca

Plwocina pobierana bya do badania rano, do jaowych pojemnikw o szerokim wylocie, po wykonaniu zabiegw higienicznych w obrbie jamy ustnej. Pacjent by

33

instruowany o koniecznoci odkrztuszenia plwociny i unikaniu, w miar moliwoci, dodawania liny do pojemnika. Ilo pobranej plwociny 2 do 5 ml. Pojemnik natychmiast szczelnie zamykano i przekazywano do laboratorium

mikrobiologicznego. Popuczyny oskrzelowe pobierano do badania w trakcie zabiegu

bronchofiberoskopii. Pukanie wykonywano przy uyciu 250 ml soli fizjologicznej. Dla celw diagnostyki mikrobiologicznej pobierano z odzyskanego materiau bezporednio do jaowej probwki typu Falcon 50 ml popuczyn.

Probwk natychmiast szczelnie zamykano i przekazywano do laboratorium mikrobiologicznego (96). Pyn z jamy opucnej pobierano w trakcie nakucia odbarczajcego bezporednio do jaowych probwek typu Falcon o pojemnoci 50 ml. Ilo pobranego materiau 20 - 200 ml. Probwk (probwki) natychmiast szczelnie zamykano i przekazywano do laboratorium mikrobiologicznego. Fragmenty tkanki puca do badania mikrobiologicznego pobierano w trakcie zabiegw operacyjnych. Pobran tkank umieszczano w jaowym naczyniu bez dodatku substancji zabezpieczajcych i przekazywano do laboratorium

mikrobiologicznego. Wszystkie materiay do czasu wykonania badania przechowywano

w temperaturze +4oC. Badanie mikrobiologiczne obejmowao we wszystkich przypadkach: opracowanie (homogenizacj) materiau ocen preparatu bezporedniego w kierunku prtkw kwasoopornych hodowl w kierunku prtkw kwasoopornych

34

W wybranych przez lekarza prowadzcego przypadkach wykonywano badanie genetyczne metod amplifikacji rRNA. W przypadku wyhodowania prtkw kwasoopornych badanie obejmowao identyfikacj prtkw.

3.2.1.1.

Opracowanie materiau klinicznego do badania mikrobiologicznego (97)

Materia uzyskany w objtoci mniejszej ni 10 ml poddawano homogenizacji bez wstpnego zagszczania. Materiay o wikszych objtociach poddawano wstpnemu zagszczeniu za pomoc wirowania. Warunki wirowania: przyspieszenie 3000 g, czas wirowania 30 minut, temperatura +4oC. Supernatant zlewano do pynu antyseptycznego. Osad pozostawiony w objtoci 5 10 ml poddawano homogenizacji. Materiay operacyjne homogenizowano wstpnie mechanicznie. W tym celu materia rozdrabniano uywajc skalpela a nastpnie tak rozdrobnione fragmenty miadono w szklanym homogenizatorze mikrobiologicznym. Do homogenizacji uywano mieszaniny uzyskiwanej przez zmieszanie rwnych objtoci 4% jaowego roztworu wodorotlenku sodowego i 2,9% jaowego roztworu cytrynianu sodowego. Do tak sporzdzonej mieszaniny dodawano w sposb aseptyczny N-acetylo-L-cystein w iloci 0,1 g/100 ml. Homogenizacj rwnoobjtociow ilo prowadzono mieszaniny dodajc do badanego materiau cao

homogenizujcej,

pozostawiajc

na 20 minut po dokadnym wymieszaniu na mieszadle typu Vortex. Po tym czasie uzupeniano mieszanin wod destylowan do objtoci cakowitej 50 ml i po wymieszaniu wirowano w warunkach j.w.

35

Supernatant dokadnie zlewano znad osadu, a osad zawieszano w 2 ml buforu fosforanowego o steniu 67 mM i ph 6,8. Tak uzyskany osad uywano do bada mikrobiologicznych.

3.2.1.2.

Ocena preparatu bezporedniego w kierunku prtkw kwasoopornych

Do rutynowej oceny preparatw bezporednich wykorzystywano metod auraminow i obserwacj preparatw w mikroskopie fluorescencyjnym

w powikszeniu 400x. Preparaty dodatnie wzgldnie wtpliwe potwierdzano stosujc klasyczn metod Ziehl-Neelsena i obserwacj w mikroskopie optycznym

w powikszeniu 1000x.

3.2.1.3.

Hodowla w kierunku prtkw kwasoopornych

Wszystkie zhomogenizowane uprzednio materiay posiewano na podoa Loewenstein-Jensen w duplikacie uywajc po 0,2 ml homogenatu na podoe. Podoa inkubowano przez 10 tygodni w temperaturze 37oC. Podoa sprawdzano co tydzie. W przypadku stwierdzenia wzrostu kolonii bakteryjnych na podou wykonywano preparat bezporedni barwiony metod Ziehl-Neelsena. Stwierdzajc wzrost bakterii kwasoopornych wykonywano przesiew bakterii dla uzyskania kultury do przeprowadzenia testu niacynowego. Dodatni wynik testu niacynowego potwierdza przynaleno wyhodowanych prtkw do gatunku M. tuberculosis (98). Homogenaty popuczyn oskrzelowych oraz pynw z jamy opucnej posiewano dodatkowo na podoa pynne BacT/AlerT MP (bioMerieux) i inkubowano w automatycznym systemie hodowlanym MB/BacT. Hodowla sygnalizowana przez system jako dodatnia bya weryfikowana na obecno prtkw kwasoopornych

36

preparatem

barwionym

metod

Ziehl-Neelsena.

Ostateczn

weryfikacj

przeprowadzano wykonujc test niacynowy.

3.2.2. Badania genetyczne (99) Genetyczn diagnostyk grulicy prowadzono wykorzystujc zamknity system diagnostyczny firmy Gen-Probe Inc. W badaniach stosowano zestaw diagnostyczny MTD 2. Zawarte w zestawie odczynniki su do przeprowadzenia detekcji specyficznych dla Mycobacterium tuberculosis complex sekwencji

rybosomalnego kwasu rybonukleinowego metod TMA (Transcription-Mediated Amplification). Badanie w systemie TMA skada si z trzech etapw: przygotowanie prbek, amplifikacja i detekcja.

3.2.2.1.

Przygotowanie prbek

Aby uwolni kwasy nukleinowe do mieszaniny reakcyjnej, konieczne jest rozbicie komrek mikroorganizmw. Dokonuje si tego przy pomocy ultradwikw w sonikatorze. Nastpnie mieszanina reakcyjna ogrzewana jest przez 15 minut w temperaturze 95oC w celu denaturacji kwasw nukleinowych i inaktywacji czynnikw infekcyjnych. Tak przygotowany lizat zawiera kwasy nukleinowe, ktre su jako matryca do replikacji in vitro.

3.2.2.2.

Amplifikacja

System TMA wykorzystuje dwa primery i dwa enzymy: polimeraz RNA i odwrotn transkryptaz. Jeden z primerw zawiera sekwencj promotorow dla

37

polimerazy RNA (starter-promotor). W pierwszym etapie amplifikacji starter-promotor czy si z rRNA w cile okrelonym miejscu. Odwrotna transkryptaza syntetyzuje kopi DNA z rRNA poprzez wyduanie od koca 3 startera-promotora. W rezultacie tworzy si hybryda RNA:DNA, w ktrej RNA jest degradowane dziki aktywnoci RNAzy odwrotnej transkryptazy. Drugi primer przycza si do uwolnionej kopii DNA. Komplementarna ni DNA jest syntetyzowana dziki aktywnoci odwrotnej transkryptazy. Razem tworz podwjn ni DNA. Polimeraza DNA rozpoznaje sekwencj promotorow na matrycy DNA i rozpoczyna transkrypcj. Kada z nowo zsyntetyzowanych czsteczek RNA ponownie podlega procesowi TMA , co prowadzi do wykadniczego wzrostu liczby czsteczek RNA. Proces odbywa si w suchej ani w temperaturze 42oC w cigu 30 60 minut.

3.2.2.3.

Detekcja

Detekcja kopii RNA wyprodukowanych w reakcji TMA odbywa si poprzez dodanie do prb sond DNA znakowanych za pomoc estru akrydynowego. Czsteczki sondy, ktre ulegy hybrydyzacji daj sygna chemiluminescencyjny, natomiast chemiluminescencja czsteczek niezwizanych jest wygaszona. Pomiaru luminescencji dokonywano w luminometrze Leader 50i. Za dodatnie uznawano prby, ktrych luminescencja bya wiksza ni 500.000 RLU.

3.2.3. Badanie histologiczne (100) Badania histologiczne materiaw tkankowych pobieranych rdoperacyjnie wykonywano w Zespole Akademickich Patologw sp. z o.o. Skrawki poddawano barwieniu H + E. Gruliczy charakter zmian w badanych tkankach rozpoznawano na podstawie charakterystycznego obrazu ziarniny gruliczej. 38

3.2.4. Test QuantiFERON-TB Gold in tube (101) Test QFT przeprowadza si w dwch etapach. W etapie pierwszym pobierano pen krew yln w iloci po 1 0,2 ml do kadej z trzech probwek zestawu, tj. do probwki z prb lep (NIL Control), probwki opaszczonej antygenami prtka (TB Antigen) i probwki z mitogenem (Mitogen). Probwki zawierajce krew po intensywnym wytrzniciu poddawano inkubacji w temperaturze 37oC tak szybko, jak to tylko moliwe, przy czym nie pniej ni po 16 godzinach od momentu pobrania krwi. Po okresie inkubacji trwajcym 16 24 godzin zawarto probwek odwirowywano (3000g/10 minut) i oddzielano osocze, ktre do momentu przeprowadzenia pomiarw przechowywano w temperaturze +4oC. W drugim etapie oznaczano przy pomocy techniki ELISA stenie interferonu gamma w kadej z trzech probwek zestawu. W poszczeglnych probwkach oznaczano nastpujce parametry: NIL stenie endogennego interferonu-gamma; TB Antigen stenie interferon-gamma uwalnianego przez limfocyty T po stymulacji antygenami prtka; MITOGEN stenie interferonu-gamma uwalnianego przez limfocyty T po stymulacji mitogenem - fitohemaglutynin (ocena sprawnoci ukadu odpowiedzi komrkowej osoby badanej). Oznaczenie wykonywano uywajc odczynnikw, ktre s czci

komercyjnego zestawu QuantiFERON-TB Gold In tube (Cellestis) postpujc dokadnie wedug instrukcji producenta. Pomiaru dokonywano na czytniku

Humareader (Human), stosujc filtr 450 nm oraz filtr referencyjny 620 nm. 39

Otrzymane

wyniki

gstoci

optycznej

wprowadzano

do

programu

komputerowego, ktry dokonywa kontroli jakoci testu, oblicza wyniki ilociowe wyraone w jednostkach midzynarodowych interferonu gamma w 1 mililitrze surowicy (I.U./ml), oraz interpretowa je jakociowo, przyporzdkowujc do kategorii wynikw dodatnich, ujemnych bd nieokrelonych. Interpretacja odbywaa si zgodnie z algorytmem przedstawionym w tabeli 3.

NIL (I.U./ml)

TB Antigen minus NIL (I.U./ml) <0,35 0.35 i <25% wartoci NIL 0.35 i

Mitogen minus NIL (I.U./ml) 0,5

Wynik testu QuantiFERON-TB Gold

Zakaenie

Interpretacja

0,5

UJEMNY

M. tuberculosis mao prawdopodobne Wysoce

8,0

25% wartoci NIL <0,35 0.35 i <25% wartoci NIL kada warto

kada warto <0,5

DODATNI

prawdopodobne zakaenie M. tuberculosis Wynik nieokrelony ze wzgldu

<0,5 NIEOKRELONY kada warto

na wysoki poziom endogennego interferonu-gamma lub brak odpowiedzi na stymulacj mitogenem

>8,0

Tab. 3. Kryteria interpretacyjne testu QuantiFERON-TB Gold In Tube.

40

3.3.

Opracowanie statystyczne W celu obliczenia parametrw statystycznych testu: czuoci, swoistoci,

dodatniej i ujemnej wartoci predykcyjnej, analizie poddano grupy pacjentw z definitywnym (potwierdzonym laboratoryjnie) rozpoznaniem grulicy oraz grup pacjentw, ktrym postawiono rozpoznanie inne ni grulica. Z analizy wykluczono pacjentw, u ktrych grulic rozpoznano na podstawie objaww klinicznych, nie uzyskujc mikrobiologicznego potwierdzenia grulicy. Postpowanie takie jest uzasadnione wobec faktu, e rozpoznanie mikrobiologiczne jest w niniejszym badaniu uznane za punkt odniesienia dla oceny testu QFT. Parametry testu obliczono dla rnych wariantw analitycznych. Wyniki testu QFT pacjentw podzielono na grupy reprezentujce nastpujce kategorie: prawdziwie dodatnie (TP) dodatni wynik testu QFT u pacjentw z potwierdzon mikrobiologicznie lub histologicznie grulic puc; prawdziwie ujemne (TN) ujemny wynik testu QFT u pacjentw z rozpoznaniem innym ni grulica puc; faszywie dodatnie (FP) dodatni wynik testu QFT u pacjentw z rozpoznaniem innym ni grulica puc; faszywie ujemne (FN) ujemny wynik testu QFT u pacjentw z potwierdzon mikrobiologicznie lub histologicznie grulic puc. W zwizku z istnieniem kategorii nieokrelonego wyniku testu QFT przyjto nastpujc klasyfikacj: Wynik nieokrelony testu QFT traktowany jako ujemny, tylko wynik dodatni testu QuantiFERON-TB Gold In Tube potwierdza rozpoznanie aktywnej postaci grulicy puc. W takim schemacie QFT traktowany jest jako test potwierdzajcy rozpoznanie grulicy puc; Wynik nieokrelony testu QFT traktowany jako dodatni, tylko wynik ujemny testu QuantiFERON-TB Gold In Tube wyklucza rozpoznanie 41

aktywnej postaci grulicy puc. W takim schemacie QFT traktowany jest jako test wykluczajcy rozpoznanie grulicy puc. Utworzono rwnie teoretyczn formu wykorzystujc do celw

diagnostycznych rwnoczenie wynik testu QFT oraz bakterioskopii (AFB). W takim schemacie zastosowano nastpujcy algorytm kwalifikowania wynikw tych testw jako potwierdzajcych lub wykluczajcych rozpoznanie grulicy puc: QFT + AFB jako testy potwierdzajce: grulic puc potwierdza dodatni wynik przynajmniej jednego z dwch nastpujcych bada: testu QFT i/lub preparatu bezporedniego (AFB). Wynik nieokrelony testu QFT traktowany jest jako ujemny; QFT + AFB jako testy wykluczajce: grulic puc wykluczaj jedynie ujemne wyniki obydwu bada: testu QFT oraz preparatu bezporedniego (AFB). Wynik nieokrelony testu QFT traktowany jest jako dodatni; Dla oceny istotnoci rnic parametrw ilociowych testu QFT stosowano test U Manna-Whitneya. Test ten jest nieparametrycznym testem do sprawdzenia czy wartoci prbek pobranych z dwu niezalenych populacji s jednakowo due (102). Do wyznaczenia optymalnej wartoci cut-off w interpretacji wyniku testu QFT oraz w celu sprawdzenia moliwoci diagnostycznego wykorzystania rnych parametrw mierzonych w tecie QFT posuono si analiz krzywych ROC. Krzywe ROC (Receiver Operating Characteristic) s narzdziem sucym do oceny poprawnoci klasyfikatora (pojedynczej zmiennej lub caego modelu), zapewniaj one czny opis jego czuoci i specyficznoci (103). Do oblicze statystycznych wykorzystano program Analyse-It.

42

4. Wyniki
4.1. Charakterystyka grupy badanej W tabeli 4 przedstawiono charakterystyk demograficzn grup pacjentw wydzielonych zgodnie z rozpoznaniem Chorb i klinicznym Problemw (wedug nomenklatury ICD-10)

Midzynarodowej

Klasyfikacji

Zdrowotnych

na podstawie epikryzy.

Rozpoznanie Grulica ukadu oddechowego, bakteriologicznie i histologicznie potwierdzona (A-15) Grulica ukadu oddechowego, nie potwierdzona bakteriologicznie i histologicznie (A-16) rozpoznania inne ni grulica

n (%)

pe (M/K)

wiek (min. max.)

mediana

redni wiek (w latach)

200 (20,4%)

130 / 70 18 - 88 65,0% / 35,0% 49,0 50,2 17,5

52 (5,3%)

34 / 18 23 - 82 65,4% / 34,6% 59,2 57,3 13,6

727 (74,3%)

434/293 18 - 91 59,7% / 40,3% 58,0 56,9 16,0

Tab. 4. Podzia grupy badanej wg rozpoznania.

Nie

stwierdzono

statystycznie

istotnych

rnic

wiekowych

pomidzy

poszczeglnymi grupami (p>0,05).

43

4.2.

Wyniki bada mikrobiologicznych w badanej populacji W trakcie prowadzonej diagnostyki klinicznej grulic puc rozpoznano u 252

pacjentw, co stanowio 25,7% badanej populacji. Badaniami mikrobiologicznymi sensu stricto, genetycznymi i histopatologicznymi grulic potwierdzono u 200 pacjentw (20,4%). U pozostaych 52 pacjentw (5,3%) rozpoznanie postawiono na podstawie obrazu radiologicznego puc i objaww klinicznych. Wyniki wszystkich bada laboratoryjnych wykonanych w celu wykrycia M. tuberculosis u pacjentw z rozpoznaniem A-16 16 oraz w grupach rozpozna innych ni grulica byy ujemne. Oznacza to, e odsetek przypadkw definitywnych (potwierdzonych) wrd ogu przypadkw grulicy wynis 79,4%. W przypadku 727 pacjentw (74,3% badanej populacji) wyniki bada klinicznych, obrazowych i laboratoryjnych wykluczyy rozpoznanie grulicy. Struktur bakteriologiczn 252 przypadkw grulicy wykrytych w trakcie badania przedstawia rys. 5.

20,6% 4,4%

28,6%

46,4%

bakterioskopia (+) hodowla (+) potwierdzone innymi metodami

bakterioskopia (-) ) hodowla (+) przypadki niepotwierdzone

Rys. 5. . Struktura bakteriologiczna przypadkw grulicy puc stwierdzonych w badaniu. 44

4.3.

Wyniki bada mikrobiologicznych w grupie pacjentw z definitywnym rozpoznaniem grulicy Struktur potwierdze przypadkw grulicy zweryfikowanych dodatnimi

wynikami bada laboratoryjnych: bakterioskopii preparatw barwionych metod Ziehl-Nelsena lub auraminow, hodowli na podoach Loewenstein-Jensen lub na podoach pynnych w systemie automatycznym MB/BacT, badania genetycznego testem MTD-2 w systemie Gen-Probe oraz badania histologicznego na obecno ziarniny gruliczej przedstawia tabela 5.

Wynik badania bakterioskopia dodatni oraz hodowla dodatni bakterioskopia ujemny oraz hodowla dodatni bakterioskopia ujemny oraz hodowla ujemny, badanie genetyczne dodatni bakterioskopia ujemny oraz hodowla ujemny, badanie histologiczne dodatni Razem

liczba przypadkw 72

Odsetek

36,0%

117

58,5%

3,0%

2,5%

200

100%

Tab. 5. Struktura potwierdze przypadkw grulicy zweryfikowanych dodatnimi wynikami bada laboratoryjnych.

45

4.4.

Wyniki testu QuantiFERON-TB Gold in tube Wyniki testu i procentowy udzia rnych kategorii wyniku w caoci grupy

badanej przedstawia tabela 6. Kategori wyniku (dodatni, ujemny, nieokrelony) ustalono stosujc kryteria okrelone przez producenta testu.

Rozpoznanie Grulica ukadu oddechowego, bakteriologicznie i histologicznie potwierdzona (A-15) (n = 200) 154 (77,0 %) 36 (18,0 %) 10 (5,0 %) 200 Grulica ukadu oddechowego, nie potwierdzona bakteriologicznie i histologicznie (A-16) (n = 52) 33 (63,5 %) 17 (32,7 %) 2 (3,8 %) 52

Wynik testu QuantiFERON-TB Gold in tube

rozpoznania inne ni grulica (n = 727) 211 (29,0 %) 479 (65,9 %) 37 (5,1 %) 727

Razem

dodatni

398

ujemny

532

nieokrelony

49

razem

979

Tab. 6. Wyniki testu QuantiFERON-TB Gold in tube w badanej grupie.

Wyniki bada uzyskane jako potwierdzenie rozpoznania u pacjentw z definitywn postaci grulicy puc w grupach w zalenoci od wyniku testu QFT przedstawiaj rysunki 6, 7, 8 i 9.

46

Rys 6. Wynik testu QFT w grupach pacjentw w zalenoci od rozpoznania. rozpoznania

47

Rys. 7. Wyniki bada laboratoryjnych w grupie pacjentw z definitywn postaci grulicy puc oraz dodatnim wynikiem testu QuantiFERON-TB Gold In Tube.

48

Rys. 8. Wyniki bada laboratoryjnych w grupie pacjentw z definitywn postaci grulicy puc oraz ujemnym wynikiem testu QuantiFERON-TB Gold In Tube.

49

Rys. 9. Wyniki bada laboratoryjnych w grupie pacjentw z definitywn postaci grulicy puc oraz nieokrelonym wynikiem testu QuantiFERON-TB Gold In Tube.

50

4.5.

Analiza statystyczna wynikw testu QFT

4.5.1. Analiza statystyczna w ujciu jakociowym Dla dokonania analizy jakociowej brano pod uwag tylko kategori uzyskanych wynikw testu QFT: wyniki dodatnie, ujemne i nieokrelone. Uzyskane wyniki testu podzielono na grupy wynikw prawdziwie dodatnich (TP), prawdziwie ujemnych (TN), faszywie dodatnich (FP) i faszywie ujemnych (FN) zgodnie z algorytmem opisanym w rozdziale 3.3. W zalenoci od zaoenia wykorzystania testu/testw QFT/QFT+AFB jako potwierdzajcego/potwierdzajcych bd

wykluczajcego/wykluczajcych uzyskano grupy o liczebnoci przedstawionej w tabeli 7.

TP

FN

TN

FP

TEST POTWIERDZAJCY QFT QFT + AFB 154 181 46 19 516 516 211 211

TEST WYKLUCZAJCY QFT QFT + AFB 164 184 36 16 479 479 248 248

Tab. 7. Liczebno grup w badaniu dla rnych wariantw analizy wynikw przy zastosowaniu wartoci cut-off wyznaczonej przez producenta testu (0,35 I.U./ml).

Dla dobranych w ten sposb grup obliczono czuo, specyficzno, dodatni oraz ujemn warto predykcyjn testu (tabela 8).

51

czuo (95% CI)

specyficzno (95% CI)

PPV (95% CI)

NPV (95% CI)

TEST POTWIERDZAJCY 77,0% (70,5 82,6) 90,5% (85,6 94,2) 71,0% 67,5 74,3) 71,0% (67,5 74,3) 42,2% (37,1 47,4) 46,2% (41,2 51,3) 91,8% (89,2 94,0) 96,5% (94,5 97,9)

QFT

QFT + AFB

TEST WYKLUCZAJCY 82,0% (76,0 87,1) 92,0% (87,3 95,4) 65,9% (62,3 69,3) 65,9% (62,3 69,3) 39,8% (35,1 44,7) 42,6% (37,9 47,4) 93,0% (90,5 95,1) 96,8% (94,5 98,1)

QFT

QFT + AFB

Tab. 8. Parametry statystyczne testu/testw QFT/QFT+AFB dla wartoci cut-off wyznaczonej przez producenta testu (0,35 I.U./ml).

4.5.2. Analiza statystyczna w ujciu ilociowym Dla przeprowadzenia analizy statystycznej w ujciu ilociowym brano pod uwag ilociowy wynik testu wyraony steniem wydzielanego interferonu-gamma. W tym celu przeprowadzono analiz metod krzywej ROC. Krzyw ROC wyznaczono, zgodnie z przyjtym zaoeniem, dla wszystkich wynikw testu QFT otrzymanych dla grupy z definitywnie potwierdzon grulic (A-15) oraz dla grupy z rozpoznaniami innymi ni grulica. rysunek 10. Obliczone pole Tak wyznaczon pod krzyw krzyw ROC przedstawia wynosi 0,77

powierzchni

(95% CI: 0,73 0,80).

52

Rys. 10. Krzywa ROC dla wynikw testu QFT w grupach pacjentw z potwierdzon laboratoryjnie grulic puc oraz z rozpoznaniami innymi ni grulica.

4.6.

Prba wyznaczenia optymalnej wartoci cut-off testu QFT Wykorzystujc dane otrzymane z analizy krzywej ROC ustalono czuo

i specyficzno testu w caym zakresie otrzymanych wynikw, a nastpnie dane te wykorzystano do ustalenia optymalnej wartoci cut-off testu. Jako punkt optymalnej wartoci cut-off przyjto punkt, w ktrym suma parametrw czuoci i specyficznoci uzyskuje maksymaln warto (rys. 11). Zgodnie z tak przyjtym zaoeniem optymalne parametry statystyczne test przyjmuje dla wartoci cut-off rwnej 0,20 I.U./ml. Dla wyznaczonej w ten sposb wartoci cut-off dokonano przeliczenia liczebnoci wynikw dodatnich i ujemnych, a nastpnie obliczono parametry

53

statystyczne analogicznie do oblicze dokonanych dla wartoci ustalonej przez producenta testu (tabele 9 i 10).

Rys.

11. Graficzna interpretacja metody wyznaczenia optymalnej wartoci cut-off testu QFT (strzak oznaczona warto cut-off okrelona przez producenta testu) 54

TP

FN

TN

FP

TEST POTWIERDZAJCY QFT QFT + AFB 169 185 31 15 483 483 244 244

TEST WYKLUCZAJCY QFT QFT + AFB 179 188 21 12 447 447 280 280

Tab. 9. Liczebno grup w badaniu dla rnych wariantw analizy wynikw przy zastosowaniu wyznaczonej empirycznie optymalnej wartoci cut-off (0,20 I.U./ml).

czuo (95% CI)

specyficzno (95% CI)

PPV (95% CI)

NPV (95% CI)

TEST POTWIERDZAJCY 84,5% (78,7 89,2) 92,5% (87,9 95,7) 66,4% (62,9 69,9) 66,4% (62,9 69,9) 40,9% (36,1 45,8) 43,1% (38,4 48,0) 94,0% (91,6 95,9) 97,0% (95,1 98,3)

QFT

QFT + AFB

TEST WYKLUCZAJCY 89,5% (84,4 93,4) 94,0% (89,8 96,9) 61,5% (62,3 69,3) 61,5% (62,3 69,3) 39,0% (34,5 43,6) 40,2% (35,7 44,8) 95,5% (93,2 97,2) 97,4% (95,5 98,6)

QFT

QFT + AFB

Tab. 10. Parametry statystyczne testu/testw QFT/QFT+AFB dla wyznaczonej empirycznie optymalnej wartoci cut-off (0,20 I.U./ml).

55

4.7.

Czy mona wykorzysta parametry skadowe testu QFT do rnicowania grupy pacjentw z rozpoznan grulic od pacjentw z nnymi rozpoznaniami? Wykorzystujc test U Manna-Whitneya dokonano porwnania parametrw

sucych do interpretacji wyniku testu QFT: stenia endogennego interferferonu-gamma w prbie (NIL) stenia interferonu uwalnianego po stymulacji mitogenem (MITOGEN) wyniki uzyskane w grupie pacjentw z potwierdzon

Porwnano

bakteriologicznie grulic z wynikami dla grupy pacjentw z chorobami puc innymi ni grulica. Parametry porwnywano oddzielnie dla grupy wynikw dodatnich i ujemnych testu QFT. Charakterystyk tak dobranych grup oraz porwnawcz analiz statystyczn przedstawia tabela 11, a graficzn interpretacj dla grup wynikw rnicych si w sposb statystycznie istotny rysunki 12 14.

analizowany parametr

liczebno grupy wg rozpoznania A-15 inne

rnica mediany dla grup (95% CI) p

wynik testu QFT dodatni NIL 154 MITOGEN 211 0,02 (0,01 0,04) -3,38 (-4,84 - -1,97) wynik testu QFT ujemny NIL 36 MITOGEN 479 0,03 (0,01 0,05) -0,86 (-3,53 1,32) 0,0084 0,004

<0,0001

0,4386

Tab. 11. Porwnanie rozkadu wartoci wynikw skadowych parametrw testu QFT dla grup pacjentw z grulic puc oraz innymi ni grulica rozpoznaniami.

56

Rys. 12. Rozkad wartoci wyniku NIL (wyraone w I.U. interferonu-gamma/ml) u pacjentw z dodatnim wynikiem testu QFT. Porwnanie grup pacjentw z potwierdzon grulic puc (A-15) oraz z innymi ni grulica rozpoznaniami.

Rys. 13. Rozkad wartoci wyniku MITOGEN (wyraone w I.U. interferonugamma/ml) u pacjentw z dodatnim wynikiem testu QFT. Porwnanie grup pacjentw z potwierdzon grulic puc (A-15) oraz z innymi ni grulica rozpoznaniami.

57

Rys. 14. Rozkad wartoci wyniku NIL (wyraone w I.U. interferonu-gamma/ml) u pacjentw z ujemnym wynikiem testu QFT. Porwnanie grup pacjentw z potwierdzon grulic puc (A-15) oraz z innymi ni grulica rozpoznaniami.

Analiza statystyczna potwierdzia istotne statystycznie rnice parametrw NIL i MITOGEN dodatnich wynikw testu QFT pomidzy grup pacjentw chorych na grulic oraz grup chorych na inne choroby puc, oraz parametru NIL w grupie ujemnych wynikw testu QFT. W przypadku parametru MITOGEN ujemnych wynikw testu QFT nie stwierdzono istotnej statystycznie rnicy pomidzy pacjentami z grulic i z chorobami innymi ni grulica. Wartoci stenia endogennego interferonu-gamma (NIL) byy wysze w grupie pacjentw z grulic, ni u pacjentw z innymi chorobami puc niezalenie od uzyskanej kategorii wyniku testu QFT (dodatni lub ujemny). Stenia interferonu-gamma uwolnionego po stymulacji mitogenem (MITOGEN) byy wysze w grupie pacjentw z dodatnim wynikiem testu QFT, u ktrych czynnej grulicy nie stwierdzono.

58

Sprawdzono parametrw jako

moliwo testu

diagnostycznego

wykorzystania choroby.

pomiaru W tym

tych celu

rnicujcego

rozpoznanie

przeprowadzono analiz krzywych ROC, a warto dyskryminacyjn testu okrelono na podstawie oceny pola powierzchni pod krzyw ROC. Otrzymane wyniki (tabela 12) nie daj podstawy do wykorzystania pomiaru parametrw NIL i MITOGEN do rnicowania rozpoznania grulicy od innych chorb puc w obrbie grup wynikw dodatnich i ujemnych testu QFT.

liczebno grupy badany parametr wynik testu QFT wg rozpoznania A-15 inne

pole powierzchni pod krzyw ROC 0,59 0,65 0,63 0,53 0,72 0,59 0,70 0,54 0,72 95% CI

NIL MITOGEN NIL

dodatni ujemny

154 36

211 479

Tab. 12. Wartoci pola powierzchni pod krzyw ROC dla wybranych wariantw analizy wartoci dyskryminacyjnej parametrw skadowych testu QFT.

59

5. Dyskusja
Diagnostyka grulicy jest jednym z trudniejszych zada stojcych przed klinicyst i diagnost laboratoryjnym. Specyficzny charakter drobnoustroju

wywoujcego t chorob Mycobacterium tuberculosis complex sprawia, e jego diagnostyka rodzi wiele problemw praktycznych. Mwic o specyficznych cechach prtka grulicy utrudniajcych diagnostyk naley wymieni: a) b) c) wysokie wymagania odywcze (104) bardzo dugi czas podziaw komrkowych (105) indukowanie odpowiedzi humoralnej na niskim poziomie (40, 41).

Wymienione w punktach a) i b) trudnoci udao si w ostatnich dekadach XX wieku omin wprowadzajc do diagnostyki automatyczne systemy hodowlane, w ktrych zastosowano pynne podoa hodowlane oraz systemy detekcji o czuoci wyszej od oferowanej przez wczeniej stosowane metody konwencjonalne (hodowle na podoach jajowych Loewenstein-Jensen) (25). Szerokie stosowanie metod automatycznych w niniejszym badaniu moe tumaczy wysoki odsetek potwierdze grulicy badaniami mikrobiologicznymi wynoszcy 75%, podczas gdy rednia dla caego kraju wynosi 63,4% (12). Podstawow zalet systemw automatycznych jest skrcenie czasu niezbdnego do potwierdzenia wzrostu prtkw grulicy. Nawet stosowanie takich systemw wymaga jednak czasu liczonego czsto w tygodniach dla uzyskania dodatniego wyniku hodowli. Oczekiwanie na wynik hodowli bardzo opnia definitywne potwierdzenie grulicy w przypadku

materiaw z ujemnym wynikiem bakterioskopii. Oparcie za rozpoznania tylko na objawach klinicznych moe prowadzi do bdnego postawienia diagnozy. Przykadem takiej sytuacji mog by przypadki pacjentw, u ktrych szybkim badaniem cytologicznym lub histopatologicznym potwierdzano chorob

60

nowotworow,

pniej

za

otrzymywano

wynik

hodowli

potwierdzajcy

wspistniejc grulic puc (106). Sytuacja taka w sposb radykalny zmieniaa sposb prowadzenia procesu terapeutycznego. W kontekcie czasu uzyskania wyniku dodatniego przewag nad metodami hodowlanymi cay czas posiada metoda bakterioskopii, ktra pozwala stwierdzi obecno form kwasoopornych ju w dniu otrzymania materiau klinicznego do badania. Metoda ta, istniejca w niemal niezmienionej postaci od czasw Roberta Kocha, pomimo swych wad cigle jest stosowana przez laboratoria prtka na caym wiecie. Jedn z tych wad jest brak bezwzgldnej specyficznoci wobec Mycobacterium tuberculosis, gdy prtki grulicy oraz prtki niegrulicze

s praktycznie nieodrnialne w obrazie mikroskopowym (16). W grupie badanej nie stwierdzono ani jednego takiego przypadku, tzn. zaobserwowania form

kwasoopornych w preparacie bezporednim, ktre okazayby si w trakcie hodowli bakteriami innymi ni prtki grulicy. Druga wada tej metody to stosunkowo niska czuo. Ocenia si bowiem, e dodatni wynik preparatu bezporedniego mona stwierdzi dopiero wwczas, gdy liczba prtkw wynosi nie mniej ni 5000 komrek w mililitrze badanego materiau (16). Wedug danych Instytutu Grulicy i Chorb Puc w roku 2009 dodatni wynik preparatu bezporedniego uzyskano tylko w 37,2% wszystkich przypadkw grulicy w Polsce (potwierdzonej i niepotwierdzonej w badaniach laboratoryjnych), za w grupie chorych z grulic potwierdzon dodatni wynik bakterioskopii uzyskano w 58,7% przypadkw (12). Oznacza to, e u 41,3% tych chorych definitywne potwierdzenie uzyskano z opnieniem wynikajcym z koniecznoci oczekiwania na wynik hodowli. Jak wynika z cytowanego

opracowania odsetek ten rni si pomidzy wojewdztwami dosy znacznie a rnice te wynikaj z poziomu wyposaenia laboratoriw w nowoczesne systemy

61

diagnostyczne, organizacji sieci laboratoriw, wsppracy lekarzy z laboratoriami. W grupie poddanej obserwacji w niniejszym badaniu potwierdzenie grulicy dodatnim wynikiem bakterioskopii uzyskano w 28,6% (rednia dla Polski 37,2%) wszystkich przypadkw grulicy puc, za w grupie 200 chorych z definitywnym,

tzn. potwierdzonym badaniami mikrobiologicznymi, rozpoznaniem grulicy dodatni wynik bakterioskopii uzyskano jedynie w 36% przypadkw (rednia dla Polski 58,7%). Tak struktur potwierdze moe tumaczy wysoka czuo stosowanych w laboratorium bada hodowlanych, ktre pozwalaj uzyska dodatni wynik hodowli z materiaw uzyskanych od pacjentw skpo prtkujcych. Oznacza to rwnie, e w 64% przypadkw uzyskano opnione potwierdzenie grulicy. Zastosowanie bada genetycznych i histologicznych, z zaoenia szybkich, czuych i specyficznych cigle jeszcze jest ograniczone. W przypadku bada genetycznych czynnik ograniczajcy ma charakter pozamerytoryczny s to badania stosunkowo drogie i z tego powodu rzadko zlecane przez lekarzy. Badanie histologiczne jest za ograniczone do wskiej grupy pacjentw, u ktrych stwierdzono wskazania do wykonania zabiegu chirurgicznego, w trakcie ktrego pobierano tkank do bada laboratoryjnych. Jeli chodzi o typow diagnostyk serologiczn, tzn. wykrywanie przeciwcia skierowanych przeciw antygenom prtka, to metody te zasadniczo nie weszy do panelu metod rutynowo stosowanych w rozpoznawaniu grulicy. Dzieje si tak ze wzgldu na marginalny udzia odpowiedzi humoralnej jako reakcji na zakaenie prtkiem (40, 41). Oprcz wyej wymienionych metod laboratoryjnej diagnostyki grulicy pomocnicze znaczenie w rozpoznawaniu tej choroby ma badanie skrnego odczynu tuberkulinowego. Metoda ta, zaproponowana niemal jednoczenie na przeomie

62

XIX i XX wieku w rnych postaciach przez kilku badaczy, utrzymywaa swoj pozycj, jako testu pomocniczego w diagnostyce, przez prawie cay XX wiek. Liczne badania wykonane wspczenie wykazuj jednak ograniczon specyficzno wynikw otrzymanych przy zastosowaniu tych metod, zwaszcza w krajach, w ktrych stosowano schemat wielokrotnego szczepienia szczepionk BCG (50 - 53). Ograniczenia dotyczce wszelkich do tej pory stosowanych metod, zwaszcza te, ktre dotycz niskiej czuoci bada laboratoryjnych (jak w przypadku bakterioskopii) i dugiego czasu oczekiwania na wynik (jak w przypadku metod hodowlanych) nakazuj cigle poszukiwa nowych rozwiza diagnostycznych. Due nadzieje wizano z innowacyjnymi testami testami uwalniania interferonu-gamma (IGRA), ktre weszy do rutynowej diagnostyki pod koniec XX wieku. Pozbawione wad skrnych odczynw tuberkulinowych stay si wanym narzdziem diagnostycznym, sucym identyfikacji osb zakaonych prtkiem grulicy. Takie umiejscowienie tych testw w schematach diagnostycznych znalazo potwierdzenie w wytycznych towarzystw naukowych i organizacji nadzoru

epidemiologicznego jako testu umoliwiajcego wykrycie zakaenia prtkiem grulicy (59-62). Od momentu wprowadzenia testw IGRA prbowano take ustali ich znaczenie w diagnostyce aktywnych postaci grulicy. W licznych badaniach prbuje si ustali, czy ilociowe wyniki testu pozwalaj rozrni latentne zakaenie prtkiem od aktywnej postaci grulicy (82-94). W niniejszym badaniu podjto prb okrelenia znaczenia tych testw w grupie pacjentw dorosych, u ktrych obraz kliniczny choroby wymaga wdroenia diagnostyki rnicowej z uwzgldnieniem grulicy puc. W tym celu, oprcz bada rutynowo zlecanych w takich przypadkach, dodatkowo wykonywano test

63

QuantiFERON-TB Gold In Tube. Krew do testu QFT pobierano pacjentom rwnoczasowo z pobraniem materiaw do bada mikrobiologicznych, zawsze przed ewentualnie wczon terapi przeciwprtkow. Wykonywany do tej pory, jako test pomocniczy, tuberkulinowy odczyn skrny nie wnosi do tej diagnostyki istotnych informacji, co wykazano w innym badaniu przeprowadzonym na podobnej grupie chorych (54). Diagnostyk kadego z 979 wczonych do niniejszego opracowania pacjentw, na potrzeby tego opracowania, uwaano za zakoczon w momencie definitywnego zakoczenia diagnostyki mikrobiologicznej, tzn. wyhodowania prtkw i ich identyfikacji do poziomu gatunku, ewentualnie wykonania badania genetycznego lub histologicznego, bd uzyskania ujemnych wynikw wszystkich wymienionych bada. Uzyskane wyniki konfrontowano z rozpoznaniami klinicznymi. Na tej podstawie stwierdzono, e w badanej grupie znalazo si 200 osb z rozpoznan i potwierdzon badaniami grulic puc oraz 727 osb, u ktrych wyniki bada mikrobiologicznych oraz ewentualnie genetycznych i histologicznych byy ujemne i pokryway si z rozpoznaniem klinicznym, ktre byo inne ni grulica.

W 52 przypadkach stwierdzono rozbieno pomidzy wynikami tych bada a rozpoznaniem klinicznym, gdy pomimo ujemnych wynikw bada na podstawie symptomw klinicznych i/lub obrazu radiologicznego i/lub odpowiedzi na wczone leczenie przeciwprtkowe postawiono rozpoznanie grulicy. T grup pacjentw wyczono z dalszej analizy, gdy w myl definicji wiatowej Organizacji Zdrowia nie mona w jej przypadku rozpoznania grulicy traktowa w sposb definitywny. Dodatni wynik testu QFT uzyskano u 77% pacjentw z rozpoznan grulic i u 29% pacjentw z innymi rozpoznaniami, natomiast ujemne wyniki testu odpowiednio u 18% i 65,9% pacjentw. Wynik nalecy do kategorii nieokrelony w obydwch grupach wystpi u 5% pacjentw. Z powyszych danych wida,

64

e czuo testu jest daleka od absolutnej. W zalenoci od tego, czy test wykorzystamy jako potwierdzajcy chorob (to znaczy, e tylko wyniki dodatnie testu QFT uznamy za potwierdzajce chorob, za wyniki nieokrelone wczymy do grupy wynikw ujemnych), czy te jako wykluczajcy (wwczas tylko wyniki ujemne uznamy za wykluczajce chorob, nieokrelone wczymy do grupy wynikw dodatnich) uzyskamy czuo testu odpowiednio 77% bd 82%. Czuo testu jest zdecydowanie lepsza w przypadku stosowania go jako testu

wykluczajcego grulic. Warto tego parametru testu obniaj przypadki pacjentw z potwierdzon grulic i ujemnym wynikiem testu QFT. Przyczyn takiej sytuacji moe by fakt, e test wykonywany jest przy uyciu krwi obwodowej. Limfocyty krce we krwi obwodowej stanowi za jedynie okoo 2% caej populacji limfocytw w organizmie czowieka (107). Dodatkowo, w przypadku czynnej grulicy limfocyty T specyficzne wobec antygenw Mycobacterium tuberculosis s aktywnie rekrutowane do miejsca toczcej si infekcji, co powoduje dalsz redukcj ich liczby we krwi obwodowej (108). Proces ten moe doprowadzi w efekcie do sytuacji, w ktrej liczba uczulonych limfocytw T w tym kompartmencie bdzie zbyt maa do tego, aby da wymiern odpowied na zakaenie mierzon testem QFT. Zwraca uwag zgodno otrzymanej w badaniu czuoci testu z wynikami przedstawionymi w metaanalizie Diela (95). Wyliczona przez niego rednia czuo testu wynosia 81%, co jest wartoci bardzo zblion do otrzymanej w niniejszym badaniu (82%). Co ciekawe, na podstawie tej metaanalizy obliczono, e rednia czuo testw przeprowadzonych w krajach rozwijajcych si wynosia tylko 74,3%, podczas gdy ten sam parametr w krajach rozwinitych gospodarczo wynosi 84,5%. Specyficzno testu obliczona dla caej badanej grupy (927 osb)

na podstawie otrzymanych wynikw wynosi 71,0% jako testu potwierdzajcego

65

grulic i 65,9% jako testu wykluczajcego. Na tak nisk specyficzno testu wpywa stosunkowo dua liczba przypadkw pacjentw z wynikiem dodatnim testu QFT wrd chorych z rozpoznaniem innym ni grulica (29%). Przyczyny takiego stanu rzeczy mona upatrywa w nastpujcych przyczynach: rozkadu wieku pacjentw w badanej grupie specyfiki badanej grupy.

Mwic o rozkadzie wieku w badanej grupie naley zwrci uwag na to, e wrd pacjentw z rozpoznaniem innym ni grulica dominoway osoby starsze. Mediana wieku dla tej grupy wynosia 58 lat, ale I kwartyl to a 48 lat. Porwnujc grupy z wynikiem dodatnim i ujemnym testu QFT wrd pacjentw z rozpoznaniem innym ni grulica mona zauway, e w skad grupy pacjentw z wynikiem dodatnim wchodzi wiksza liczba osb starszych, ni w przypadku grupy z wynikiem ujemnym (I kwartyl 52,0 vs. 43,8 lat, mediana 61,0 vs. 57,0 lat). Mona ten fakt uzna za populacyjny lad przebytego zakaenia. Dziecistwo osb majcych dzisiaj ponad 50 lat przypadao na lata, gdy zapadalno na grulic wynosia w Polsce w caej populacji 290/100.000, za wrd dzieci do 14 roku ycia ponad 180/100.000 (12). Odsetek zakaonych dzieci w roku 1953 szacowano na 83,3% wrd dziewczt i 87,7% wrd chopcw (10). Zakaenie prtkiem grulicy mierzone wynikiem testu QFT rzadko za ulega negatywizacji . Nawet w przypadku aktywnych postaci grulicy leczonych z sukcesem klinicznym, w wikszoci badanych przypadkw po zakoczonym leczeniu utrzymywa si wynik dodatni (109, 110). Mona sdzi, e odsetek zakaonych bdzie zmniejsza si z upywem czasu, co potwierdzaj badania amerykaskie (111). Mwic o specyfice badanej grupy naley zwrci uwag na to, e wielu pacjentw objtych badaniem, ze wzgldu na charakter schorze jest wielokrotnie hospitalizowanych na oddziaach

66

pulmonologicznych, a przez to dodatkowo naraonych na zakaenie poprzez kontakt z osobami chorymi na grulic hospitalizowanymi jednoczasowo. W trakcie analizy statystycznej uzyskanych wynikw zwrcono uwag na wysok ujemn warto predykcyjn testu 91,8% (95% CI: 89,2 94,0) w przypadku traktowania testu jako potwierdzajcego grulic i a 93,0% (95 CI: 90,5 95,1%) w przypadku traktowania go jako testu wykluczajcego. Niska, zaledwie 40 procentowa dodatnia warto predykcyjna testu wskazuje na niewielk przydatno testu w potwierdzaniu choroby. Nasuwa to jednoznaczny wniosek, e miejscem stosowania testu QFT w diagnostyce rnicowej aktywnych postaci grulicy jest uycie go jako testu sucego wykluczaniu rozpoznania tej choroby. Takie podejcie - wykorzystania testu w diagnostyce aktywnej grulicy jako testu wykluczajcego t chorob zgodne jest z podejciem innych autorw (85). W przypadku aktywnej grulicy, wskutek zjawisk opisanych wczeniej, mona mie do czynienia z faszywie ujemnym wynikiem testu QFT. Co wicej, otrzymane wyniki wskazuj, e zaawansowanie choroby mierzone dodatnim wynikiem

bakterioskopii rzutuje na odsetek wynikw faszywie ujemnych. W grupie pacjentw z takim wynikiem odsetek pacjentw z dodatnim wynikiem bakterioskopii

(20/36 = 55,6%) jest znacznie wyszy ni w grupie z poprawnie oznaczonym, dodatnim wynikiem testu QFT (45/154 = 29,2%). Spostrzeenie to byo

przyczynkiem do podjcia prby obliczenia parametrw czuoci i specyficznoci dla cznie traktowanych testw: QFT oraz bakterioskopii. Takie opracowanie

wynikw zaowocowao znaczn popraw parametrw, zwaszcza czuoci (wzrost do 92,0%, 95% CI: 87,3 95,4%), oraz ujemnej wartoci predykcyjnej (wzrost do 96,8%, 95% CI: 94,5 98,1%). Tego rodzaju podejcie przedstawili rwnie Ravn i wsp. (82) uzyskujc wyniki zbiene z otrzymanymi w niniejszym badaniu.

67

Inni autorzy podejmowali prby cznego wykorzystania wynikw testu QFT oraz rnych testw/bada dla poprawienia wartoci diagnostycznej tak stosowanych testw. Stosowano na przykad w tym celu czne badanie testem QFT oraz tuberkulinowym odczynem skrnym (83), Wydaje si, e wobec wczeniej przedstawionych zastrzee co do wartoci diagnostycznej tuberkulinowego testu skrnego w polskiej populacji wielokrotnie szczepionej szczepionk BCG, badanie tego wariantu jest pozbawione sensu. Jeli chodzi o prby testw stricte laboratoryjnych to na uwag zasuguje praca Kabeera i wsp. (88), w ktrej badano przydatno cznie traktowanych: testu QFT i pomiaru biaka IP. W badanej grupie stwierdzono stosunkowo wysoki odsetek wynikw nieokrelonych, wynoszcy 5% w grupie chorych na grulic i 5,1% w grupie chorych z innymi rozpoznaniami. Z tej grupy (47 pacjentw) tylko u 8 osb wynik nieokrelony by rezultatem podwyszonego stenia endogennego interferonu gamma, u pozostaych 39 pacjentw za by rezultatem braku reaktywnoci na stymulacj mitogenem, a wic byy to osoby z pierwotnym lub wtrnym niedoborem w zakresie odpornoci komrkowej. Biorc pod uwag bardzo dobrze kontrolowany przebieg caej procedury analitycznej, od etapu pobrania krwi do oznaczenia stenia interferonu, naley przyj, e jest to realny odsetek takich osb w badanej grupie. W innych badaniach odsetek ten waha si w granicach od 0 (112) do 34% (113). Rozbieno tych danych potwierdza tez, e analizujc wyniki testu QFT zawsze naley bra pod uwag rodzaj populacji, w jakiej badanie si przeprowadza. Pierwsze z cytowanych bada dotyczy bowiem osb modych i zdrowych, drugie za osb zakaonych wirusem HIV. W kadej z tych populacji warto predykcyjna testu bdzie zupenie odmienna.

68

Nastpnym krokiem zmierzajcym w kierunku optymalnego wykorzystania testu bya prba okrelenia wartoci cut-off stosowanej dla rnicowania wynikw dodatnich i ujemnych. Tego rodzaju podejcie stosowali rwnie inni badacze sugerujc obnienie ustalonej przez producenta testu wartoci wynoszcej 0,35 I.U. IFN-gamma/ml surowicy (73, 114). Bardzo interesujcy pogld przedstawili Costa i wsp.: zaproponowali oni okrelenie wartoci w zakresie 0,2 0,7 I.U. interferonugamma jako szarej strefy wynikw o niepewnym statusie (70). Aby okreli optymaln warto cut-off przeprowadzono analiz

z wykorzystaniem krzywych ROC. Optymalne parametry statystyczne otrzymano dla wartoci cut-off wynoszcej 0,20 I.U./ml. Zmiana wartoci cut-off spowodowaa reklasyfikacj 48 przypadkw z grupy wynikw ujemnych do grupy wynikw dodatnich. W wyniku tego czuo testu wzrosa z 82% do 89,5% (o 7,5%) przy jednoczesnym obnieniu specyficznoci z 65,9% do 61,5% (o 4,4%). Rwnoczenie ujemna warto predykcyjna testu wzrosa z 93,0% do 95,5%. Podane liczby dotycz wykorzystania testu jako testu wykluczajcego. W wariancie analizy wykorzystujcym cznie badanie QFT i bakterioskopi uzyskano wzrost czuoci testu do 94%, a wzrost ujemnej wartoci predykcyjnej do 97,4%. Oznacza to wzrost czuoci w takim wariancie o 2%, a wzrost ujemnej wartoci predykcyjnej o 0,6%.

Otrzymane wyniki wskazuj jednoznacznie, e: test QFT dla uzyskania maksymalnej korzyci w procesie diagnostyki rnicowej czynnych postaci grulicy puc powinien by stosowany jako test wykluczajcy t chorob; wynik nieokrelony testu powinien by traktowany jako wynik

nieprawidowy (nie ujemny);

69

rwnolegle

badaniem

QFT

musi

by

prowadzona

diagnostyka

mikrobiologiczna (bakterioskopia i hodowla); zasadne wydaje si obnienie wartoci cut-off testu do 0,2 I.U./ml.

Stwierdzona przy takim wykorzystaniu testu ujemna warto predykcyjna 97,4% (95% CI: 95,5% - 98,6%) oznacza, e spord kadych stu przebadanych pacjentw, u ktrych stwierdzono ujemny wynik testu QFT oraz ujemny wynik bakterioskopii, tylko u trzech inne badania mikrobiologiczne potwierdz grulic. Podjto rwnie prb wykorzystania skadowych parametrw testu QFT (stenia endogennego interferonu-gamma i stenia interferonu wydzielanego po stymulacji mitogenem) do rnicowania wynikw potwierdzajcych/

wykluczajcych grulic w obrbie grupy wynikw dodatnich i ujemnych tego testu. Wyniki wstpnej analizy byy obiecujce, gdy stwierdzono, e rozkad wynikw oznaczenia endogennego interferonu-gamma rni si w sposb istotny

statystycznie pomidzy pacjentami z rozpoznaniem grulicy puc i pacjentami z rozpoznaniami innymi ni grulica zarwno w grupie wynikw ujemnych (p = 0,0084) jak i dodatnich (p = 0,004). Podobne porwnanie wynikw oznaczenia stenia interferonu-gamma uwalnianego po stymulacji mitogenem wykazao istotn statystycznie rnic tylko w przypadku wynikw dodatnich (p < 0,0001). Mediana wartoci stenia endogennego interferonu-gamma bya wysza w grupie pacjentw z rozpoznaniem grulicy puc ni w grupie pacjentw z rozpoznaniami innymi ni grulica niezalenie od tego, czy porwnania dokonano dla wynikw dodatnich czy ujemnych testu QFT. wiadczy to o uruchomieniu mechanizmw obrony nieswoistej. Warto liczbowa tej rnicy mieszczca si w zakresie wielkoci bdu analitycznego metody (0,02 0,03 I.U./ml) nasuwa jednake wtpliwo

co do moliwoci wykorzystania tego parametru dla rnicowania rozpozna grulicy.

70

Odwrotnie sytuacja ksztatowaa si w przypadku rnicy ste interferonu wydzielanego po stymulacji mitogenem. W tym przypadku mediana wartoci stenia interferonu bya wysza w grupie pacjentw z rozpoznaniem chorb innych ni grulica. Taki wynik mona tumaczy opisanym wczeniej zjawiskiem rekrutacji efektorowych limfocytw do ognisk zakaenia. Rnica mediany w tym przypadku wynosia a 3,38 I.U./ml, co pozwalao sdzi, e ten parametr bdzie mg zosta wykorzystany analitycznie do rnicowania chorych na grulic od chorych z innymi chorobami puc w obrbie grupy pacjentw z dodatnim wynikiem testu QFT. Aby okreli warto dyskryminacyjn opisanych parametrw dla rnicowania rozpozna przeprowadzono analiz krzywych ROC, oceniajc pole powierzchni pod krzyw ROC. Otrzymane we wszystkich trzech analizowanych przypadkach wartoci wykluczyy jednak moliwo wykorzystania tych parametrw w zaoonym celu. W kadym bowiem badanym wariancie dolna granica 95% przedziau ufnoci nie przekraczaa wartoci 0,6, zatem pomimo zauwaalnej (i statystycznie istotnej) w badanych populacjach rnicy ma ona rozkad bliski losowemu (103). Wykonane badania oraz analiza ich wynikw pokazuj aktualne miejsce stosowania testu QFT w schemacie diagnostycznym grulicy puc u pacjentw dorosych. Naley podkreli, e jest to analiza aktualna dla okrelonego miejsca i czasu. Jak podkrelaj inni autorzy czuo i specyficzno testu cile zale od populacji, w ktrej test jest stosowany (87). Kontrowersyjnie brzmi ich pogld, e w populacjach niskiego ryzyka test QFT jest przydatny w diagnostyce zarwno latentnych jak i aktywnych postaci grulicy, bez potrzeby wykonywania dalszych bada. W peni natomiast mona si zgodzi z ich opini, e w innych populacjach test QFT powinien by stosowany do diagnostyki aktywnych postaci grulicy tylko jako test uzupeniajcy i wspomagajcy diagnostyk mikrobiologiczn.

71

Wykonane przez autora niniejszej pracy obliczenia statystyczne miayby inny wynik w przypadku analizowania przypadkw grulicy w szpitalu niespecjalistycznym, gdzie naleaoby spodziewa si mniejszej liczby pacjentw zakaonych bez objaww czynnej grulicy, ktra to sytuacja wpynaby na wzrost specyficznoci badania. Rwnie w przyszoci, w miar wchodzenia w wiek dorosy pacjentw urodzonych w warunkach znacznie lepszej sytuacji epidemiologicznej w zakresie grulicy, a co za tym idzie analizowania populacji o niszym odsetku zakaonych, zarwno specyficzno jak i dodatnia warto predykcyjna testu ulegn zwikszeniu. Zapewne zmieni si wwczas rwnie miejsce testu QFT w schematach diagnostycznych grulicy.

72

6. Wnioski

Sam dodatni wynik testu nie moe stanowi definitywnego potwierdzenia aktywnej postaci grulicy puc u pacjentw dorosych;

Diagnostyka

aktywnych

postaci

grulicy

puc

bezwzgldnie

wymaga

prowadzenia klasycznej diagnostyki mikrobiologicznej;

Ujemne wyniki rwnoczenie wykonanego testu QuantiFERON oraz badania bakterioskopowego z bardzo duym prawdopodobiestwem wykluczaj

aktywn posta grulicy puc;

W badanej populacji wskazane byoby obnienie wartoci cut-off;

Nie stwierdzono moliwoci diagnostycznego wykorzystania parametrw skadowych testu;

Test QuantiFERON-TB Gold In Tube jest dobrym narzdziem diagnostycznym wspomagajcym diagnostyk rnicow chorb puc.

73

7. Streszczenie w jzyku polskim

Wstp Prtek Mycobacterium tuberculosis zakaa 1/3 ludnoci globu ziemskiego. Wywoana prtkiem grulica bya przyczyn mierci przeszo 1,5 miliona ludzi na wiecie w roku 2009. W Polsce, chocia skala problemu jest duo mniejsza (8236 przypadkw grulicy zarejestrowanych w roku 2009), to ze wzgldu na zakany charakter grulicy cigle nie wolno jej lekceway. Diagnostyka laboratoryjna grulicy jest trudna i czasochonna. Dlatego naley wykorzystywa wszelkie nowe moliwoci i metody diagnostyczne. W ostatnich latach do panelu tych metod weszy testy uwalniania interferonu gamma (testy IGRA). Przedstawicielem tej grupy testw jest QuantiFERON-TB Gold In Tube (QFT). Test ten przeznaczony jest do diagnostyki latentnych zakae prtkiem grulicy. Jednoczenie od samego pocztku jego stosowania podejmowano prby jego uycia w diagnostyce aktywnych postaci grulicy. Ze wzgldu na supresyjny wpyw grulicy na mechanizmy odpornoci organizmu uzyskiwane wyniki nie s jednoznaczne. W tej sytuacji wydaje si niezbdne podjcie kontrolowanego badania na populacji miejscowej. Cel pracy Celem pracy jest okrelenie miejsca i znaczenia testu QuantiFERON-TB Gold In Tube w schematach diagnostycznych rozpoznawania zakae prtkiem Mycobacterium tuberculosis w aktywnej postaci grulicy puc. Cel ten

zrealizowano przez: 1. Analiz statystyczn wynikw testu QuantiFERON-TB Gold

In Tube w odniesieniu do zotego standardu w diagnozowaniu aktywnych postaci grulicy, jakim jest wynik bada mikrobiologicznych;

74

2.

Okrelenie optymalnych dla badanej populacji punktw odcicia rnicujcych grup wynikw dodatnich i ujemnych testu;

3.

Analiz

przydatnoci

pomiaru

elementw

skadowych

testu

do rnicowania etiologii chorb puc. Materia i metody W badaniu uczestniczyo 979 pacjentw (381 kobiet w wieku 56,6 16,6 lat i 598 mczyzn w wieku 54,9 15,8 lat) hospitalizowanych w Wielkopolskim Centrum Chorb Puc i Grulicy. Materia do badania stanowiy: krew obwodowa, materiay z drg oddechowych (plwocina, popuczyny oskrzelowe, BAL), pyny z jamy opucnej, tkanka puca. Pobrana krew suya do wykonania testu QFT. Pozostae materiay poddano diagnostyce mikrobiologicznej w kierunku wykrycia prtkw grulicy: we wszystkich przypadkach wykonano bakterioskopi i hodowl, dla czci materiaw badanie genetyczne testem amplifikacyjnym MTD (Gen-Probe). Pobrane rdoperacyjnie fragmenty tkanek byy rwnie poddane diagnostyce technikami histologicznymi. W analizie statystycznej wykorzystano test U Manna-Whitneya oraz analiz krzywych ROC. Obliczenia wykonano przy pomocy programu Analyse-It. Wyniki W badanej populacji stwierdzono 200 osb z grulic potwierdzon badaniami mikrobiologicznymi lub histologicznymi, 52 osoby z rozpoznaniem grulicy opartym na rozpoznaniu klinicznym bez potwierdzenia laboratoryjnego, oraz 727 osb z rozpoznaniem innym ni grulica puc. Najwysz warto czuoci i ujemnej wartoci predykcyjnej (NPV) testu QFT uzyskano wczajc grup wynikw nieokrelonych do grupy wynikw dodatnich testu. Czuo testu wynosia wwczas 82%, NPV 93%. Rwnoczesna analiza wynikw testu QFT oraz bakterioskopii podwyszya te parametry do nastpujcych wartoci: czuo 92%, NPV 96,8%.

75

W obydwch wariantach analizy test wykazywa stosunkowo niskie wartoci specyficznoci i dodatniej wartoci predykcyjnej. Analiza krzywej ROC wykazaa, e optymalne parametry statystyczne dla badanej populacji test QFT przyjmuje przy wartoci cut-off 0,20 I.U./ml (wobec wartoci 0,35 I.U./ml wyznaczonej przez producenta testu). Przeprowadzona analiza krzywych ROC dla skadowych parametrw testu QFT (stenia endogennego interferonu gamma oraz stenia interferonu uwalnianego po stymulacji mitogenem) wykazaa wartoci pola powierzchni pod krzyw w zakresie 0,59 do 0,65, co wyklucza moliwo praktycznego stosowania tych parametrw dla rnicowania chorych z grulic od chorych z rozpoznaniami innymi ni grulica. Wnioski 1. Sam dodatni wynik testu nie moe stanowi definitywnego

potwierdzenia aktywnej postaci grulicy puc u pacjentw dorosych; 2. Diagnostyka aktywnych postaci grulicy puc bezwzgldnie wymaga prowadzenia klasycznej diagnostyki mikrobiologicznej; 3. Ujemne wyniki rwnoczenie wykonanego testu QuantiFERON oraz badania bakterioskopowego z bardzo duym prawdopodobiestwem wykluczaj aktywn posta grulicy puc; 4. 5. W badanej populacji wskazane byoby obnienie wartoci cut-off ; Nie stwierdzono moliwoci diagnostycznego wykorzystania

parametrw skadowych testu; 6. Test QuantiFERON-TB Gold In Tube jest dobrym narzdziem diagnostycznym wspomagajcym diagnostyk rnicow chorb puc.

76

8. Streszczenie w jzyku angielskim

Introduction An estimated 1/3 of the world population is infected with Mycobacterium tuberculosis. In 2009 tuberculosis was the cause of death of close to 1.5 million people worldwide. Although the scale of the problem is much smaller in Poland (8,236 cases of active tuberculosis (TB) in 2009), it should not be neglected due to the fact that TB is an infectious disease. Laboratory diagnosis of TB is difficult and time consuming, thus it is crucial to use all available modern diagnostic technologies in the process of identifying the disease. In recent years the spectrum of diagnostic tools was broadened with the appearance of the Interferon Gamma Release Assay tests (IGRA tests) such as QuantiFERON TB Gold in Tube (QFT). These tests are particularly designed to diagnose latent infection with M. tuberculosis, nevertheless they have also been used as an aid in diagnosing TB. However, due to the immunesuppressive effect of TB on the human immune system the results are sometimes ambiguous. In this situation it seems valuable to conduct a controlled study on the population of local patients. Aim of the Study The aim of the study is to define the place and significance of QFT in the diagnostic schemes of identifying infections of Mycobacterium tuberculosis in TB. The aim of this study was achieved by: 1. Statistical analysis of the results of QFT compared to the gold standard in active TB diagnosis which is the microbiological investigation. 2. Defining an optimal cut-off values differentiating negative and positive results for the studied population.

77

3.

Analysis of the usefulness of the results of partial components of the test to differentiate the etiology of different lung diseases.

Materials and Methods 979 patients (381 women aged 56.6 16 years and 598 men aged 54.9 15.8 years) hospitalized in Wielkopolska Center of Pulmonology and Thoracosurgery, Pozna, Poland, were studied. The materials taken for study were peripheral blood, materials from the respiratory tracts (sputum, bronchial lavage, BAL), pleural fluid and lung tissue. The blood was analyzed with QFT. The other materials were analyzed in a microbiological laboratory to detect M. tuberculosis. All specimens were analyzed with microscopy and cultured. Some of the specimens were analyzed with amplification MTD tests (Gen-Probe). Tissue samples were parallel diagnosed by an experienced histo-pathologist. Mann-Whitneys U test and ROC curves analyses were employed to statistically analyze the obtained data. All calculations were performed using Analyse-It software. Results In the investigated population 200 patients were diagnosed with active TB confirmed by microbiological or histological means, 52 patients with active TB diagnosis based on clinical symptoms only (not confirmed by microbiological laboratory), and 727 patients diagnosed with disease other than TB. The highest sensitivity and negative predictive value (NPV) was achieved when the indeterminate results were treated as positive results. In this case the sensitivity was 82% and NPV 93%. Concurrent analysis of QFT result and microscopic diagnosis increased the sensitivity to 92% and NPV to 96.8%. Both scenarios were characterized by low specificity and positive predictive value (PPV) of the QFT test. ROC curve analysis shows that the optimal cut-off point for the studied population was 0.20 I.U./ml

78

(compared to 0.35 suggested by the manufacturer of the QFT test). Results of ROC curve analysis (values of the area under the curve were in the range from 0.59 to 0.65) for the partial components of the test (the amount of the endogenic interferon gamma and the amount of the interferon gamma released after stimulation with mitogen), excludes their practical application in differentiating active TB from other lung diseases. Conclusions 1. Positive QFT result on its own cannot be used to confirm active TB in adults. 2. 3. Diagnosing active TB requires the use of microbiological analysis. Negative results of both QFT test and microscopy with high degree of probability exclude active TB. 4. It seems feasible to reduce the cut-off value in the studied population of patients. 5. There is no application for the analysis of the results partial components of the QFT test in diagnosing active TB. 6. QuantiFERON-TB Gold In Tubes is useful diagnostic tool which helps with differential diagnosis of TB and other lung diseases.

79

9. Pimiennictwo
1. Boru M, Pawowska I, Zwolska Z, Jaworski A. Wspczesne metody diagnozowania grulicy. Post Mikrobiol. 2000; 39: 17-36. 2. Kappelman J, Alcicek MC, Kazanc N, Schultz M, Ozkul M, Sen S. First Homo erectus from Turkey and implications for migrations into temperate Eurasia. Am J Phys Anthropol. 2008; 135: 110-116. 3. Spigelman M, Lemma E. The use of polymerase chain reaction (PCR) to detect Mycobacterium tuberculosis in ancient skeletons. Int J Osteoarcheol. 1993; 3: 137-143. 4. Zink AR, Haas CJ, Reischl U, Szeimies U, Nerlich AG. Molecular analysis of skeletal tuberculosis in an ancient Egyptian population. J Med Microbiol. 2001; 50: 355-366. 5. Hershkovitz I, Donoghue HD, Minnikin DE, Besra GS, Lee OY-C, et al. 2008 Detection and Molecular Characterization of 9000-Year-Old Mycobacterium tuberculosis from a Neolithic Settlement in the Eastern Mediterranean. PLoS ONE 3(10): e3426. doi:10.1371/journal.pone.0003426 6. Seyda B. Dzieje medycyny w zarysie. Wyd. 2. Warszawa: Pastwowy Zakad Wydawnictw Lekarskich; 1973: 42-43. 7. Zwolska Z. Robert Koch twrca bakteriologii chorb zakanych. Gdask: Via Medica; 2006. 8. Koch R. Nobel Lecture. Dostpny na URL: http://nobelprize.org/nobel_prizes/ medicine/laureates/1905/koch-lecture.html 9. World Health Organization. Global tuberculosis control 2010. Dostpny na URL: http://whqlibdoc.who.int/publications/2010/9789241564069_eng.pdf

80

10.

Szczuka I. Epidemiologia grulicy. W: Rowiska-Zakrzewska E, red. Grulica w praktyce lekarskiej. Wyd. 1. Warszawa: Wydawnictwo Lekarskie PZWL; 2000: 32-48.

11.

EuroTB and the national coordinators for tuberculosis surveillance in the WHO European Region. Surveillance notified of in tuberculosis 2006. in Europe. na Report URL:

on tuberculosis

cases

Dostpny

http://www.eurotb.org/ rapports/2006/full_report.pdf 12. Korzeniewska-Kosea M, red. Grulica i choroby ukadu oddechowego w Polsce w 2009 roku. Warszawa: Instytut Grulicy i Chorb Puc; 2010. 13. World Health Organization. The global plan to stop TB. Dostpny na URL: http://www.stoptb.org/global/plan/ 14. Jakubowiak W, Korzeniewska-Kosea M, Ku J, Michaowska-Mitczuk D, Wesoowski S, Ziegman M, Zwolska Z. Podrcznik grulicy zalecenia NPZG. Wyd. 1. Warszawa: Instytut Grulicy i Chorb Puc; 2001: 7-44. 15. World Health Organization. Pursue high-quality DOTS expansion and enhancement. Dostpny na URL: http://www.who.int/tb/dots/en/ 16. American Thoracic Society. Diagnostic Standards and Classification

of tuberculosis in adults and children. Am J Respir Crit Care Med. 2000; 161: 1376-1395. 17. Madison BM. Application of stains in clinical microbiology. Biochem Histochem. 2001; 76: 119-125. 18. Steigart KR, Henry M, Ng V, Hopewell AR, Cunningham J, Urbanczik R, et al. Fluorescence versus conventional sputum smear microscopy for tuberculosis: a systematic review. Lancet Infect Dis. 2006; 6: 570-581.

81

19.

Piasecka-Zeyland E. Prtek grulicy. W: awrynowicz A, Legeyski S, Przesmycki F, red. Mikrobiologia lekarska. Zeszyt III. Warszawa: Lekarski Instytut Naukowo-Wydawniczy; 1948.

20.

Loewenstein E. Culture of tubercle bacilli from blood. (transl. from: Zentralbl Bakteriol Parasitenkd Infektionskr Hyg Abt I Orig. 1931; 120: 127129). Int J Tuberc Lung Dis. 2008; 12: 1380-1381.

21.

Becton-Dickinson.

BBL

Lowenstein-Jensen

Medium.

Product

insert.

Dostpny na URL: http://www.bd.com/ds/productCenter/220908.asp 22. Piersimoni C, Scarparo C, Callegaro A, Tosi CP, Nista D, Bornigia S, et al. Comparison of MB/Bact Alert 3D system with radiometric BACTEC system and Loewenstein-Jensen recovery and identification of mycobacteria from clinical specimens: a multicenter study. J Clin Microbiol. 2001; 39: 651-657. 23. Willians-Bouyer N, Yorke R, Lee HI, Woods GL. Comparison of the BACTEC MGIT 960 and ESP culture system II for growth and detection

of mycobacteria. J Clin Microbiol. 2000; 38: 4167-4170. 24. Aggarwal P, Singal A, Bhattacharya SN, Mishra N. Comparison of the radiometric BACTEC 460 TB culture system and Loewenstein-Jensen medium for the isolation of mycobacteria in cutaneous tuberculosis and their drug susceptibility pattern. Int J Dermatol. 2008; 47: 681-687. 25. Sorlozano A, Soria I, Roman J, Huertas P, Soto MJ, et al. Comparative evaluation of three culture methods for the isolation of mycobacteria from clinical samples. J Microbiol Biotechnol. 2009; 19: 1259-1264. 26. Gruszczyski P. Mikrobiologiczne metody wykrywania grulicy. 2006; Przewodnik lekarza. Supl. 1: 16-20.

82

27.

Brisson-Noel A, Lecossier D, Nassif X, Gicquel B, Levy-Frebault V, Hance AJ. Rapid diagnosis of tuberculosis by amplification of mycobacterial DNA in clinical samples. Lancet. 1989; 334: 1069-1071.

28.

Augustynowicz-Kope E, Zwolska Z. Postpy w diagnostyce i epidemiologii molekularnej Mycobacterium tuberculosis. Post Mikrobiol. 2010; 49: 151-156.

29.

Walker GT, Little MC, Nadeau JG, Shank DD. Isothermal in vitro amplification of DNA by restriction enzyme/DNA polymerase system. Proc Natl Acad Sci. 1992; 89: 392-396.

30.

American Thoracic Society. Rapid diagnostic tests for tuberculosis. What is the appropriate use? Am J Respir Crit Care Med. 1997; 155: 1804-1814.

31.

Coll P, Garrigo M, Moreno C, Marti N. Routine use of Gen-Probe Amplified Mycobacterium Tuberculosis Direct (MTD) Test for detection

of Mycobacterium tuberculosis with smear-positive and smear-negative specimens. Int J Tuberc Lung Dis. 2003; 7: 886-891. 32. Boehme CC, Nabeta P, Hillemann D, Nicol MP, Shenai S, et al. Rapid molecular detection of tuberculosis and rifampin resistance. N Engl J Med. 2010; 363: 1005-1015. 33. World Health Organization. Roadmap for rolling out Xpert MTB/Rif for rapid diagnosis of TB and MDR-TB. Dostpny na URL: http://www.who.int/tb/ laboratory/roadmap_xpert_mtb_rif_rev23dec2010.pdf 34. World Health Organization. International statistical classification of diseases and related health problems. 10th edition. Dostepny na URL:

http://apps.who.int/classification/apps/icd/icd10online/

83

35.

Cutler RR, Baithun SI, Doran HM, Wilson P. Association between the histological diagnosis of tuberculosis and microbiological findings. Tuber Lung Dis. 1994; 75: 75-79.

36.

Yew WW, Kwan SY, Wong PC, Fu KH. Percutaneus transthoracic needle biopsies in the rapid diagnosis of pulmonary tuberculosis. Lung. 1991; 169: 285-289.

37.

Palenque E, Amor E, Bernaldo de Quiros JC. Comparison of bronchial washing, brushing and biopsy for diagnosis of pulmonary tuberculosis. Eur J Clin Microbiol. 1987; 6:191-192.

38.

Kumar V, Cotran RS, Robbins SL, red. Patologia. Wydanie I polskie, Olszewski WT, red. Wrocaw: Wydawnictwo Medyczne Urban & Partner; 2005: 554-560.

39.

The histology of tuberculosis. Dostpny na URL: http://www0.sun.ac.za/ortho/ webct-ortho/tb/tb-histology.html

40.

Teixeira HC, Abramo C, Munk ME. Immunological diagnosis of tuberculosis: problems and strategies for success. J Bras Pneumol. 2007; 33: 323-334.

41. 42.

Raja A. Immunology of tuberculosis. Indian J Med Res. 2004; 120: 213-232. Arloing S, Courmont P. Serum diagnosis of tuberculosis. Boston Med Surg J. 1904; 151: 617-623.

43.

Jackett PS, Bothamley GH, Batra HV, Mistry A, Young DB, Ivanyi J. Specificity of antibodies to immunodominant mycobacterial antigens in pulmonary tuberculosis. J Clin Microbiol. 1988; 26: 2313-2318.

44.

Mukhopadhyay A, Guan M, Chen HY, Lu Y, Lim TK. Prospective study of a new serological test (ASSURE TB Rapid Test) for the diagnosis of pulmonary tuberculosis. Int J Tuberc Lung Dis. 2006; 10: 620-624.

84

45.

Gennaro ML. Immunologic diagnosis of tuberculosis. Clin Infect Dis. 2000; 30 (suppl. 3): S243-S246.

46.

Brown RM, Cruz O, Brennan M, Gennaro ML, Sclesinger L, Skeiky YAW, Hoft DF. Lipoarabinomannan-reactive human secretory immunoglobulin A

responses induced by mucosal Bacilli Calmette-Guerin vaccination. J Infect Dis. 2003; 187: 513-517. 47. Mackaness GB. The immunological basis of acquired cellular resistance. J Exp Med. 1964; 120: 105-120. 48. Huebner RE, Schein MF, Bass JB Jr, The tuberculin skin test. Clin Infect Dis. 1993; 17: 968-975. 49. Curley C. New guidelines: what to do about an unexpected positive tuberculin skin test. Clev Clin J Med. 2003; 70: 49-55. 50. Sleiman R, Al-Tanir M, Dakdouki G, Ziade F, Assi NA, Rajab M. Interpretation of the tuberculin skin test in Bacilli Calmette-Guerin vaccinated and nonvaccinated school children. 2007; 26: 134-138. 51. Wang L, Turner MO, Elwood RK, Schulzer M, FitzGerald JM. A meta-analysis of the effect of Bacilli Calmette-Guerin vaccination on tuberculin skin test measurement. Thorax. 2002; 57: 804-809. 52. Diel R, Ernst M, Doscher G, Visuri-Karbe L, Greinert U, et al. Avoiding the effect of BCG vaccination in detecting Mycobacterium tuberculosis infection with a blood test. 2006; 28: 16-23. 53. Farhat M, Greenaway C, Pai M, Menzies D. False-positive tuberculin skin test: what is the absolute effect of BCG and non-tuberculous mycobacteria? Int J Tuberc Lung Dis. 2006; 10: 1192-1204.

85

54.

Gruszczyski P, Ozorowski T. Znaczenie diagnostyczne prby tuberkulinowej w populacji szczepionej BCG. Pol Merk Lek. 2010; 29: 162-164.

55.

Brosch R, Gordon SV, Pym A, Eiglmeier K, Garnier T, Cole ST. Comparative genomics of the mycobacteria. Int J Med Microb. 2000; 290: 143-152.

56.

Sorensen AL, Nagai S, Houen G, Andersen P, Andersen AB. Purification and characterization of a low-molecular-mas T-cell antigen secreted

by Mycobacterium tuberculosis. Infect Immun. 1995; 63: 1710-1717. 57. Dillon DC, Alderson MR, Day CH, Bement T, Campos-Neto A, Skeiky YA, et al. Molecular and immunological characterization of Mycobacterium tuberculosis CFP-10, an immunodiagnosticanigen missing in Mycobacterium bovis (BCG). J Clin Microbiol. 2000; 38:3285-3290. 58. Lalvani A, Thillai M. Diagnosis of tuberculosis: principles and practice of using interferon- release assays (IGRAs). Breathe. 2009; 5: 303-309. 59. Mazurek M, Jereb J, Vernon A, LoBue P, Goldberg S, Castro K. Updated guidelines for using Interferon Gamma Release Assays to detect

Mycobacterium tuberculosis infection - United States, 2010. MMWR Recomm Rep. 2010 Jun 25;59(RR-5): 1-25. 60. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Guidelines for the investigation of contacts of persons with infectious tuberculosis.

Recommendations from the National Tuberculosis Controllers Association and CDC. MMWR Recomm Rep. 2005 Dec 16;54(RR-15):1-47. 61. The National Institute for Health and Clinical Excellence. Clinical diagnosis and management of tuberculosis, and measures for its prevention and control. Dostpny 51951.pdf na URL: http://www.nice.org.uk/nicemedia/live/12193/51951/

86

62.

Canadian Tuberculosis Committee. Updated recommendations on interferon gamma release assays for latent tuberculosis infection. Can Commun Dis Rep 2008; 34 (ACS-6): 1-13.

63.

Huang Y-W, Shen G-H, Lee J-J, Yang W-T. Latent tuberculosis infection among close contacts of multidrug-resistant tuberculosis patients in central Taiwan. Int J Tuberc Lung Dis. 2010; 14: 1430-1435.

64.

Higuchi K, Harada n, Mori T, Sekiya Y. Use of QuantiFERON-TB Gold to investigate tuberculosis contacts in a high school. Respirology. 2007; 12:88-92.

65.

Connell TG, Curtis N, Ranganathan SC, Buttery JP. Performance of whole blood interferon gamma assay for detecting latent infection with

Mycobacterium tuberculosis in children. Thorax. 2006; 61: 616-620. 66. Yoshiyama T, Harada N, Higuchi K, Sekiya Y, Uchimura K. Use of QuantiFERON-TB Gold test for screening tuberculosis contacts and predicting active disease. Int J Tuberc Lung Dis. 2010; 14: 819-827. 67. Lienhardt C, Fielding K, Hane AA, Niang A, Ndao CT, et al. (2010) Evaluation of the prognostic value of IFN- release assay and tuberculin skin test in household contacts of infectious tuberculosis cases in Senegal. PLoS ONE 5(5): e10508. doi:10.1371/journal.pone.0010508 68. Schablon A, Harling M, Diel R, Nienhaus A. Risk of latent TB infection in individuals employed in the healthcare sector in Germany: a multicentre prevelance study. BMC Infect Dis. 2010; 10: 107. 69. Escombe AR, Huaroto L, Ticona E, Burgos M, Sanchez I, et al. Tuberculosis transmission risk and infection control in a hospital emergency department in Lima, Peru. Int J Tuberc Lung Dis. 2010; 14: 1120-1126.

87

70.

Costa JT, Silva R, Sa R, Cardoso MJ, Nienhaus A. Serial testing with the interferon- release assay in Portuguese healthcare workers. Int Arch Occup Environ Health. 2010; doi: 10.1007/s00420-010-0571-x

71.

Demkow U, Broniarek-Samson B, Filewska M, Lewandowska A, Maciejewski J, et al. Prevelance of latent tuberculosis infection in health care workers in Poland assessed by interferon-gamma whole blood and tuberculin skin tests. J Physiol Pharmacol. 2008; 59 (suppl. 6): 209-217.

72.

Pai M, Gokhale K, Joshi R, Dogra S, Kalantri S, et al. Mycobacterium tuberculosis infection in health care workers in rural India. JAMA. 2005; 293: 2746-2755.

73.

Maeda T, Banno S, Maeda S, Naniwa T, Hayami Y, et al. Usefulness and limitations of QuantiFERON-TB Gold in Japanese rheumatoid arthritis patients: proposal to decrease the lower cutoff level for assessing latent tuberculosis infection. Mod Rheumato. 2010; 20: 18-23.

74.

Inanc N, Zehraaydin S, Karakurt S, Atagunduz P, Yavuz S, et al. Agreement between Qunatiferon-TB Gold test and tuberkulin skin test in the identification of latent tuberculosis infection in patients with rheumatoid arthritis and ankylosing spondylitis. J Rheumatol. 2009; 36:12; doi:10.3899/jrheum.090268

75.

Beglinger C, Dudler J, Mottet C, Nicod L, Seibold F, et al. Screening for tuberculosis infection before initiation of anti-TNF- therapy. Swiss Med Wkly. 2007; 137: 621-622.

76.

Furst DE, Breedveld FC, Kalden JR, Smolen JS, Burmester GR, et al. Updated consensus statement on biological agents for the treatment of rheumatic diseases, 2006. Ann Rheum Dis. 2006; 65 (suppl. III): iii2-iii15.

88

77.

Korzeniewska-Kosea

M.

Zapobieganie

grulicy

chorych

leczonych

antagonistami czynnika martwicy nowotworw. Reumatologia. 2010; 48: 4-13. 78. Kucharz EJ, Korzeniewska-Kosea M, Kotulska A. Zalecenia postpowania w zapobieganiu i leczeniu grulicy u chorych leczonych antagonistami TNF-. Reumatologia. 2008; 46: 51-54. 79. Talati NJ, Seybold U, Humphrey B, Aina A, Tapia J, et al. Poor concordance between interferon- release assays and tuberculin skin test in diagnosis of latent tuberculosis infection among HIV-infected individuals. BMC Infect Dis. 2009, 9: 15. doi:10.1186/1471-2334-9-15 80. Mutsvangwa J, Millington KA, Chaka K, Mavhudzi T, Cheung Y-B, et al. Identifying recent Mycobacterium tuberculosis transmission in the setting of high HIV and TB burden. Thorax. 2010; 65: 315-320. 81. Davies M-A, Connell S, Johannisen C, Wood K, Pienaar S, et al. Detection of tuberculosis in HIV-infected children using an enzyme-linked immunospot assay. AIDS. 2009; 23: 961-969. 82. Ravn P, Munk ME, Andersen AB, Lundgren B, Lundgren JB, et al. Prospective evaluation of a whole blood test using Mycobacterium tuberculosis- specific antigens ESAT-6 and CFP-10 for diagnosis of active tuberculosis. Clin Diagn Lab Immunol. 2005; 12: 491-496. 83. Britton WJ, Gilbert GL, Wheatley J, Leslie D, Rothel JS, et al. Sensitivity of human gamma interferon assay and tuberculin skin testing for detecting infection with Mycobacterium tuberculosis in patients with culture positive tuberculosis. Tuberculosis. 2005; 85: 137-145.

89

84.

Dewan PK, Grinsdale J, Kawamura LM. Low sensitivity of a whole-blood interferon-gamma release assayfor detection of active tuberculosis. Clin Infect Dis. 2007; 44: 69-73.

85.

Kang YA, Lee HW, Hwang SS, Um S-W, Han SK, et al. Usefulness of wholeblood interferon- enzyme-linked immunospot assay in the diagnosis of active pulmonary tuberculosis. Chest. 2007; 132: 959-965.

86.

Rutheford M, Alisjahbana B, Maharani W, Sampurno H, van Crevel R, Hill PC. (2010) Sensitivity of the Quantiferon-gold in tube assay in sputum smearpositive cases in Indonesia. PLoS ONE 5(8): e12020.

doi:10.1371/journal.pone.0012020 87. Tahereh K, Alireza N, Massoud S, Amina K. A validity of the QuantiFERONTB Gold (QFT-TB) method for the diagnosis of pulmonary tuberculosis in a high risk population. Swiss Med Wkly. 2010; 140: 95-96. 88. Kabeer BSA, Raman B, Thomas A, Perumal V, Raja A. (2010) Role of QuantiFERON-TB Gold, interferon gamma inducible protein-10 and tuberculin skin test in active tuberculosis diagnosis. Plos ONE 5(2):e9051. doi:10.1371/journal.pone.0009051 89. Goletti D, Raja A, Ahamed Kabeer BS, Rodrigues C, Sodha A, et al. IFN, but not ip10, mcp2 or il2 response to rd1 selected peptides associates to active tuberculosis. J Infect. 2010; doi: 10.1016/j.jinf.2010.05.002 90. Lange C, Pai M, Drobniewski F, Migliori GB. Interferon- release assays for the diagnosis of active tuberculosis: sensible or silly? Eur Respir J. 2009; 33: 1250-1253.

90

91.

Baba K, Sornes S, Hoosen AA, Lekabe J, Mpe J, et al. Evaluation of Immune Responses in HIV-infected Patients with Pleural Tuberculosis by the QuantiFERON TB-Gold Interferon-gamma assay. BMC Infect Dis. 2008; 8: 35.

92.

Sauzullo I, Mengoni F, Lichtner M, Massetti AP, Rossi R, et al. (2009) In Vivo and In Vitro Effects of Antituberculosis Treatment on Mycobacterial Interferon- T Cell Response. PLoS ONE 4(4): e5187.

doi:10.1371/journal.pone.0005187 93. Nicol MP, Davies M-A, Wood K, Hatherill M, Workman L, et al. Comparison of T-Spot.TB assay and tuberculin skin test for the evaluation of young children at high risk for tuberculosis in community setting. Pediatrics. 2009; 123: 38-43. 94. Kim S-H, Choi S-J, Kim H-B, Kim N-J, Oh M-d, Choe K-W. Diagnostic usefulness of a T-cell-based assay for extrapulmonary tuberculosis. Arch Intern Med. 2007; 167: 2255-2259. 95. Diel R, Loddenkemper R, Nienhaus A. Evidence based comparison of commercial interferon-gamma release assays for detecting active

tuberculosis a meta-analysis. Chest. 2010; 137: 952-968. 96. Piroyski M. Bronchofiberoskopia. Wyd. 1. Bielsko-Biaa: -medica press; 1999: 118-125. 97. Vandepitte J, Verhaegen J, Engbaek K, Rohner P, Piot P, Heuck CC. Podstawowe procedury laboratoryjne w bakteriologii klinicznej. Wyd. 1. Warszawa: Wydawnictwo Lekarskie PZWL; 2005: 85-87. 98. Gadre DV, Mahajan M, Singh NR, Agarwal DS., Talwar V. NIacin test for mycobacteria: a comparative study of two methods. Ind J Tub. 1995; 42: 225-226.

91

99.

Hill CS. Gen-Probe transcription mediated amplification: system principles. Dostpny na URL: http://www.gen-probe.com/pdfs/tma_whiteppr.pdf

100. Zawistowski S. Technika histologiczna. Wyd. V. Warszawa: Pastwowy Zakad Wydawnictw Lekarskich; 1986: 540-541. 101. Cellestis. QuantiFERON-TB Gold (metoda probwkowa). Podrcznik

diagnostyczny do testw w warunkach in vitro. . Dostpny na URL: http://www.cellestis.com/IRM/Company/ShowPage.aspx?CPID=1338 102. Stanisz A. Podstawy statystyki dla prowadzcych badania naukowe. Odcinek 11: Testy nieparametryczne cz. I. Medycyna Praktyczna. 1999 (9): 175-178. 103. Jaeschke R, Cook D, Guyatt G. Evidence based medicine (EBM), czyli praktyka medyczna oparta na wiarygodnych i aktualnych publikacjach (POWAB). Odcinek 5: Ocena artykuw na temat testw diagnostycznych. Cz. II metody okrelania przydatnoci testu. Medycyna Praktyczna. 1998 (11): 184-191. 104. Niederweis M. Nutrient acquisition by mycobacteria. Microbiology. 2008; 154: 679-692. 105. Zwolska Z. Mikrobiologiczne metody diagnozowania grulicy. W: CegielskaTomaszewska K, red. Grulica u dzieci. Wyd. I. Warszawa: Wydawnictwo Lekarskie PZWL, 1996: 30. 106. Browne M, Healy TM. Coexisting carcinoma and active tuberculosis of the lung: 24 patients. Ir J Med Sci. 1982; 151: 75-78. 107. Westermann J, Pabst R. Distribution of lymphocyte subsets and natural killer cells in the human body. Clin Investig. 1992; 70: 539-544. 108. Jafari C, Lange C. Suttons law: local immunodiagnosis of tuberculosis. Infection. 2008; 36: 510-514.

92

109. Pai M, Joshi R, Dogra S, Mendiratta DK, Narang P, et al. Persistently elevated T cell interferon- responses after treatment for latent tuberculosis infection among health care workers in India: a preliminary report. J Occup Med Toxicol. 2006; doi: 10.1186/1745-6673-1-7. 110. Markova R, Drenska R, Todorova Y, Terzieva V, Stefanova D. Monitoring of efficacy of anti-TB therapy by using the QuantiFERON-TB Gold In Tube test. Eur Respir Rev. 2008; 17: 74-75. 111. Winston C, Navin T. Birth cohort effect on latent tuberculosis infection prevelance, United States. BMC Infect Dis. 2010; 10:206. 112. Franken WP, Timmermans JF, Prins C, Slootman E-JHJ, Dreverman J, et al. Comparison of Mantoux and QuantiFERON TB Gold tests for diagnosis of latent tuberculosis infection in army personel. Clin Vaccine Immunol. 2007; 14: 477-480. 113. Baba K, Sornes S, Hoosen AA, Lekabe JM, Mpe MJ, et al. Evaluation of immune responses in HIV infected patients with pleural tuberculosis by the QuantiFERON TB-Gold interferon-gamma assay. BMC Infect Dis. 2008; 8: 35. 114. Soysal A, Torun T, Efe S., Gencer H, Tahaoglu K, Bakir M. Evaluation of cutoff values of interferon-gamma-based assays in the diagnosis of

M. tuberculosis infection. Int J Tuberc Lung Dis. 2008; 12: 50-56.

93