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Tcnicas de Recombinacin y Desciframiento ADN

Ahora que entendemos en un nivel simplificado como el sistema de informacin trabaja, los bioingeniros estn interesados en cambiar esto y ya que todos los seres vivos usan el mismo cdigo de informacin de protenas, podemos inducir a cualquier clula a producir cualquier producto proveyendo le un cdigo conocido. Tambin hemos discutido por que las clulas procariotas son buenas para este trabajo, son relativamente fciles de mantener en el laboratorio o fabrica y son diseadas para que vivan solas. Su genoma es relativamente simple y es mayoritariamente devoto de codificar protenas. Ahora aprenderemos como hacer que una bacteria produzca una protena de inters. Dos ejemplos claros son la insulina y el factor de crecimiento humano. Dichos productos vienen de animales donde se aplico los mtodos de bioingeniera. Eran caros de producir y no eran humanos asi que tenan un riesgo de inducir aqu la respuesta inmune dependa de la fuente del animal. En este captulo aprenderemos como producir nuestras propias protenas humanas usando bacteria.

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Tcnicas de Recombinacin
Para obtener las protenas que necesitamos de una bacteria debemos: Producir una copia de la secuencia de ADN que codifique la protena de inters De alguna manera introducir esta secuencia de ADN en la bacteria Inducir a esta bacteria a producir la protena codificada mediante la secuencia de ADN Proteger la nueva molcula de ambiente hostil en el interior de la clula bacteriana Purificar la molcula

Este proceso ser explicado con ms detalle en este captulo, usaremos el ejemplo de la insulina para ilustrar como la bacteria puede producir una protena humana.

PRODUCIR UNA COPIA DE LA SECUENCIA DE ADN QUE CODIFIQUE LA PROTENA DE INTERS


Primero necesitamos producir una secuencia de ADN que codifique la protena, la forma ms fcil de realizar esto es obtener un ARN mensajero (ARNm) codificando el gen. Como recuerdas el ARN mensajero es una molcula que transcribe el cdigo de ADN de una protena dada. El ARNm sirve para recoger el cdigo y llevar fuera del ncleo de ribosomas, donde las protenas son producidas. Puedes obtener el mensaje y podremos obtener el cdigo, adems en la clula eucariota cuando el ARNm deja el ncleo estar apropiadamente cortado y este libre de cualquier material gentico superfluo habr transcrito el cdigo necesitado, por un proceso llamado gen de empalme. Si tu comienzas con el ARNm y lugar del ADN evitamos complejidades en la transcripcin del ADN incluyendo variables del gen de enlace. Tambin, teniendo una parte del cdigo de ADN un cianotipo que puede ser utilizado una y otra vez para producir muchas copias de ARNm para un para una protena dada. En una clula que est produciendo cierta protena habr un gran nmero de ARNm para dicha protena en el citoplasma. As que, el uso de ARNm amplifica el gen. Esto es el paso del nmero uno del proceso presentado en la Figura7-8.

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Para obtener el ARNm correcto, tu iras a la clula que sirve de fuente normal para la protena. Considerando que queremos producir insulina, la fuente de insulina humana son las clulas isletas del pncreas, las cuales producen insulina. Molculas del ARNm codifican la insulina y la produce en grandes cantidades en dichas clulas. La mayora del ARNm en el citoplasma debe ser para la insulina. Si separamos un ARNm de las clulas isleta, obtendremos un gran porcentaje de ARNm que codifiquen la insulina. Nosotros podemos aislar un ARNm por que el ARN tiene una nica base qumica, una nica cola compuesta de adenosinas. Los mtodos qumicos existen para encontrar la cola de adenosinas sirviendo de base para el mtodo qumico para el ARNm aislado. Recuerda que el ARNm no es exactamente un cdigo gentico. En efecto es el inverso del cdigo y contiene bases complementarias para las bases orgnicas del ADN. El ARNm es usado para leer invertidamente el cdigo de la cadena complementaria de ADN. Cuando el ARNm es removido, la cadena simple de ADN produce, por la transcripcin reversa con los nucletidos complementarios apropiados, a partir del accin del ADN polimerasa. El resultado es la produccin de una cadena nueva doble enrollada conocida como ADN complementaria (ADNc), como se muestra en la Figura7-1. Este es el paso dos presentado en la Figura7-8

INSERTANDO EL GEN HUMANO EN EL ADN DE LA BACTERIA


Necesitamos insertar el gen de la insulina dentro de una bacteria porque dicha bacteria producir dicha protena en una forma menos probable de ser rechazada por el sistema inmune del paciente que una insulina animal. Tambin el costo de cosechar la protena de tu colonia es mucho menor que el cdigo de mantener un gran nmero de animales para obtener insulina. El reto es insertar un gen humano en el ADN de la bacteria incluyendo lo siguiente: Primero, introducir el ADN de la bacteria es dificultoso necesitaremos un vector que transportara el ADN dentro de la clula.

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Segundo, una vez dentro de la clula, la bacteria reconocer el ADN humano como extrao, primeramente basndonos en el hecho de que el ADN de la bacteria es circular y el nuestro es lineal, entonces la bacteria destruir nuestro ADN. Necesitaremos insertar el ADN en una forma circular.

La mayora de bacterias tienen un solo cromosoma. Afortunadamente contiene pequeas partes de un ADN secundario en estructuras llamados plsmidos. Los plsmidos como vez en la Figura7-2, son estructuras anillar pequea que existen independientemente de la mayora de los cromosomas de la bacteria cargan el 55 de la informacin de la clula y no contienen informacin esencial para que la clula sobreviva. Los plsmidos llevan pocos genes que pertenecen a ambientes anormales. Todo esto sirve para nuestros propsitos ya que el plsmido puede servir como vector.

Cortaremos el plsmido con enzimas restrictoras. La primera restriccin de enzimas fue aislada de una bacteria por H. O. Smith, K.Wilkocs, y Kelly en 1968. Estas enzimas cortan la molcula de ADN en una base de secuencia especfica. Este es el paso nmero cuatro y se presenta en la Figura7-8. Por qu la bacteria contiene enzimas que cortan el ADN? Poseer estas enzimas es beneficioso para la bacteria por que la protegen de los bacterifagos o virus que afectan la bacteria. Cuando el ADN viral se inyecta dentro de la bacteria el ADN es atacado por la restriccin de enzimas y el ADN viral es destruido. El ADN propio de la bacteria es protegido por grupo de metilos nicos en los pares de bases del ADN bacterial estos grupos metlicos previenen la accin de la restriccin de enzimas, de los cuales 900 han sido identificadas cada enzima tiene una sitio de accin especfica y existen ms 200 secuencias de ADN que son reconocidas por las restricciones de enzima. Las enzimas restrictoras son una secuencia especfica de diez pares de bases en el ADN. En el ejemplo de la Figura7-3, la enzima restrictora corta el ADN entre los pares de bases G-C y T-A.

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Tu puedes llevar tu plsmido donde sea seleccionando la enzima restrictora que corta la secuencia de bases seleccionada. Adems, sabes que si cortas el ADN con enzimas restrictoras, obtendremos finales pedazos en cada extremo del ADN, lo cual se produce ya que la enzima restrictora hace un corte dentado los extremos no son literalmente pegajosos pero tienen pequeos segmentos de una sola cadena de ADN. Estos pequeos segmentos se conectaran con el ADN nuevo que contienen las bases complementarias. En la figura7-3, los extremos pegajosos consisten en segmentos GA-T-T por un lado y C-A-T-T por el otro. Estos extremos se pegaran al otro extremo. Adicionalmente los pares de bases pueden ser aadidos entre los extremos pegajosos. Usted puede aislar el plsmido de la bacteria usando una enzima restrictora para hacer un corte en el plsmido. Luego podr pegar cualquier gen que quiera. Debemos generar extremos pegajosos en el gen, usando una enzima restrictora apropiada. Para seleccionar la enzima restrictora debes seleccionar el nucletido que se pegara en la cadena de ADN cortada. Pero que si el gen que usted necesita no tiene un extremo pegajoso y no puede ser adjuntado al plsmido juntado? La industria biotecnolgica se ha anticipado a la necesidad de pequeas secuencias de ADN, las cuales pueden ser aadidas usando una enzima llamada ADN ligasa este es el paso tres en la Figura 7-8. Tu ahora puedes aadir el gen a tu plsmido y crear una recombinacin del ADN como se muestra en la Figura7-4, recuerda que empezamos con un ARNm de las clulas isleta por que dichas clulas producen grandes cantidades de insulina y tu estas tratando de obtener un gen para producir insulina con el ARNm que tu empezaste, un gran porcentaje de genes crearan el cdigo de insulina que deseamos. Algunos de los plsmidos tomaran el gen de la insulina sin embargo, las clulas isleta producen otros protena adems de la insulina y algunos de estos genes que hemos aislado lo harn para estas protenas. Tu no tienes forma de seleccionar solo gens de insulina asi que en la incubacin de los plsmidos algunos de ellos tomarn un gen diferente. En resumen, algunos plsmidos contienen genes de insulina, otros contienen genes para otras protenas y otros no contienen ningn gen; no podemos

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distinguir estos plsmidos. Ahora aadiremos estos plsmidos, solo algunos de ellos contienen el gen de inters, y lo aadiremos en una poblacin de bacterias. La bacteria es inducida a permitir que los plsmidos entren mediante un truco suministrndoles solucin de cloruro de calcio en un proceso conciso como transformacin. Este es el paso 6 en la Figura7-8.

SELECCIONANDO LA BACTERIA ALTERADA


Ahora usted tendr una poblacin de bacterias, algunas en plsmidos con el gen de insulina, otras en plsmidos con otros genes, algunas mas en plsmidos con ningn material gentico nuevo y otras que aun no estn en un plsmido. Necesitaras la subpoblacin de bacterias que estn en el plsmido correcto con el gen correcto insertado. Usted puede eliminar la bacteria que no tiene ningn plsmido cultivndola en un ambiente en el que no pueda sobrevivir. Recuerde que el plsmido tiende a albergar genes que permiten sobrevivir en ambientes anormales. Genes tpicos encontrados en plsmidos son genes para la resistencia de antibiticos o metales. Puede elegir usar una bacteria con resistencia a la ampicilina. Si su cultivo despus de la transformacin en presencia de la ampicilina, solo las bacterias que han tomado un plsmido sobrevivirn. Adems eliminar bacterias que han tomado un plsmido, como se muestra en la Figura 7-5. Este es el paso 7 en Figuraa7-8.

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Ahora tendr que eliminar todas las bacterias que no han tomado un plsmido. El siguiente paso es eliminar las bacterias que han incorporado plsmidos con ningn material gentico nuevo. Su reto es encontrar la bacteria que no ha tomado un plsmido con el gen correcto. Recuerde que usted puede seleccionar el sitio en el plsmido donde el gen est localizado por que conoce la secuencia del gen y por tanto seleccionar la enzima restrictiva correcta para cortar al plsmido en un punto especfico. Puede elegir como interrumpir un cdigo para un gen que no se ha podido detectar en un cultivo. Un sistema es comnmente usado es beta-galactosido. Esta enzima puede generara un color azul, si se le agrega un sustancia conocida como X-gal (5-bromo-4-cloroindolgalactosido). Si tu diseas el sistema como que el plsmido con el gen insertado en la mitad del gen beta-galactosido, tu tendrs un gen funcional de beta-galactosido. Puedes observar la bacteria que ha tomado el gen insertado porque esta bacteria no generara un color azul en el X-gal medio. El gen beta-galactosido es llamado un gen reportador porque reporta la condicin plsmido de ADN. Tu cultivo en un agar contiene X-gal. Colonias con el gen beta-galactosido se tornaran azules; si se quiere los otros, como muestra la Figura 7-6. Este es el paso 8 en Figura 7-8.

Tu tendrs reducidas cantidades de poblacin de bacterias conteniendo el plsmido con el muevo material gentico. Tu reto original ser obtener una poblacin de bacterias

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que produciran la insulina humana. Ahora necesitas encontrar la bacteria que contienen el gen de la insulina. No todos los cdigos nuevos de material gentico para insulina. Recuerda que t recolectaras ARNm de las clulas del pncreas. Muchos de los ARNm codificaran la produccin de insulina, pero otros llamaran a otras protenas. Necesitaras ser capaz de visualizar la insulina que sea producida. T puedes marcar la produccin de insulina usando un anticuerpo monoclonal. Los anticuerpos monoclonales que son descritos en el captulo 5. Para nuestros propsitos, anticuerpos monoclonales son anticuerpos que son especficos para una parte de una protena dada. La habilidad de producir anticuerpos monoclonales fue un gran avance en las herramientas del diagnostico para investigaciones biomdicas como anticuerpos son especficos y por qu pueden atacar anticuerpos con etiqueta, niveles que no pueden interferir con la habilidad de enlazar un antgeno. T puedes producir anticuerpos contra la insulina y puedes etiquetar estos anticuerpos de diferentes maneras. Tintes fluorescentes pueden ser atacados por anticuerpos y ser hechos al fluorescente cuando el enlace de la clula tiene insulina. Otra etiqueta posible es molculas radiactivas tomadas por el anticuerpo. Un ejemplo es hidrogeno radiactivo, conocido como tritio. Las molculas de tritio son tomadas por anticuerpos y remplazadas por hidrogeno no radiactivo en la estructura molecular. La presencia del tritio puede ser vista colocando un foto-film alrededor del material en cuestin. Las emisiones radiactivas del tritio expuestas al film, solo como una lnea. El anticuerpo monoclonal en contra de la insulina necesitar acceso al interior de la clula en orden del enlace con la insulina. Puede causar que la clula se queme (conocida como lisis de la clula), de este modo la liberacin de su contenido. La razn para hacer lisis de la clula es que los anticuerpos no pueden pasar a travs de la membrana celular para ingresar al interior de la clula. Por supuesto no queremos matar a toda la bacteria que ha tomado tanto problema producir, para transferir algo de esta colonia al nuevo agar. La forma de hacer esto es tomar una porcin del manto de la colonia de la bacteria. El manto tomara algunos miembros de cada colonia orientada exactamente como las colonias estaban en la placa. Si tu presionas este manto contra un nuevo agar en una placa, el agar tomara algunas de las bacterias del manto y una nueva colonia crecer como una rplica exacta de la anterior. Podrs hacer lisis de las clulas sin interrumpir la orientacin en la placa usando anticuerpos monoclonales para ver cual colonia produce insulina. Encontraras el anticuerpo que ha atacado para identificarlas observando la coloracin fluorescente o por la identificacin radiactiva. Una vez que has aislado la colonia de bacterias que estn enlazadas con el anticuerpo y adems contienen la protena deseada, podrs cultivar esta colonia en particular para la produccin de la protena, como muestra Figura 7-7. Este es el paso 9 en Figura 7-8.

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Puede preguntarse como tu bacteria anfitriona est motivada para producir insulina. Despus de todo, cada clula humana en el cuerpo humano est equipada para producir insulina, pero solo las clulas del bazo de Langertehan leen o transcriben, el gen y hacen la protena. Solo porque la bacteria contiene el gen de la insulina no significa que producir insulina. Un vez ms, puedes tomar ventaja del hecho que puedes colocar tu gen en cualquier lugar en el plsmido por la seleccin de tu enzima restrictiva, asumiendo que sabes la secuencia del gen en el plsmido. Recuerda del captulo 4 que los genes son transcritos por una enzima llamada ARN polimerasa. El ARN polimerasa reconoce un sitio del enlace donde el ADN dice, empezar. Puedes colocar el gen en el sitio donde comience la transcripcin, el sitio para empezar, sin embargo naturalmente este sitio sirve para muchas otras protenas. Recuerda que el ARN polimerasa, despus de enlazar en el sitio, parte en trozos hasta que tenga una seal de stop-absolutamente indiferente a la secuencia de protena esto es creado. El ARNm va haciendo tu protena. Entonces, si tu rebanas tu gen entre el sitio de comienzo y la seal de stop, la clula del ARN polimerasa obligara a crear ARN polimerasa. Plsmidos diseados de esta forma son llamados vectores de expresin porque ellos aseguran que la protena sea producida, y que el gen ser expresado.

SELECCIONANDO EL HUESPED CORRECTO


Necesitamos seleccionar un husped que no ataque ni destruya la insulina en la clula antes de que pueda ser secretada. Para encontrar la clula husped que tolerara la protena extraa, podemos desarrollar subpoblaciones de clulas cultivndolas bajo diferentes condiciones. Podemos seleccionar clulas que son deficientes en enzimas proteolticas necesarias para degradar la protena, y necesitaremos desarrollar cepas especiales de bacterias. Para algunas protenas, ser necesario usar una clula eucariota, por ejemplo, si la protena es toxica para la bacteria. La meta es investigar la expresin del gen, luego la clula eucariota es de lejos la mejor opcin. La clula eucariota ms popular para investigacin de ADN es la levadura (sacharomices cerviciae). Las clulas eucariotas son ms difciles de mantener en cultivo y requieren un tipo diferente de vector.

VECTORES
Por definicin, los vectores son trasportadores del ADN recombinado en una clula intacta. Para insertar pequeas cantidades de ADN en la clula procariota, los plsmidos son usados en insercin mediante una solucin de cloruro de calcio, como se describi antes. El sistema trabaja muy bien para pequeas cantidades de material gentico. Sin embargo para grandes cantidades de genes otros vectores deben ser considerados.

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Los virus son una opcin atractiva, los virus no fueron incluidos del tipo de clula por que los virus no son clulas. Son pequeas cantidades de ADN encerrados en un capsula, su nica funcin es replicarse as mismos, ellos no producen protenas o ni realizan cualquier funcin tpica de una clula real. Se reproducen mediante la replicacin del ADN, inyectan su ADN en la clula. Usualmente, el ADN viral invade el ADN del husped, y cuando el ADN del husped se divide, el ADN del virus tambin. Otros tipos de virus son los retrovirus, compuestos de ARN y que producen ADN cuando invaden una clula. Desafortunadamente, las partculas de virus, una vez replicadas, buscan una forma de salir fuera del husped, usualmente destruyen la clula. Si pudiramos introducir nuestro ADN dentro de un virus, el virus har lo que siempre hace invadir el husped, el ADN de la clula husped leer la protena. Sin embargo, para prevenir que el virus que contiene el ADN no lo destruya. Los virus que depredan bacterias son llamados bacterifagos. Los bacterifagos son usados como vectores si el gen de inters ser transportado dentro de una bacteria y es demasiado grande para ser llevado en un plsmido. Tienen una desventaja que al insertar el material gentico pueden insertar el suyo propio en la clula bacteriana. Recuerda que con un plsmido, el ingeniero determina donde el nuevo gen ser ubicado y tambin manipularemos el ambiente celular para que el virus no induzca la destruccin de la clula. Los vectores virales tambin son usados en terapia gentica experimental en humanos, virus humanos, como los bacterifagos, insertan su ADN nuevo en el cromosoma humano y pueden introducir un gen en una protena nueva dentro de una clula por este mtodo. La ubicacin del material gentico es de gran importancia cuando el experimento es conducido un paciente humano. Se dice que la insercin de material gentico nuevo en determinadas regiones del ADN puede llevar al cncer, las victimas de sndrome de inmune deficiencia combinada severa (SCIDS) fueron tratadas por un vector de un retrovirus. Este virus s insertara en el ADN humano eficazmente. El vector es usado en tratamientos experimentales de victimas de hemofilia y fibrosis cstica. Este virus tiene menor probabilidad que se inserte as mismo en el ADN husped y puede ser tan efectivo como un plsmido. Estudios recientes demuestran que este vector tambin puede ser insertado en el ADN husped y por razones desconocidas es ms probable que se inserte as mismo en genes que no tienen porciones del cdigo de ADN. Los investigadores estn buscando vectores que se inserten en lugares especficos y no se inserten en el ADN existente. Opciones actuales incluyen el uso de endonucleasas para llevar la insercin dentro del ADN husped o el cromosoma artificial que es distinto al DN husped.

CROMOSOMAS ARTIFICIALES
Los plsmidos son demasiado pequeos para llevar gran cantidad de material gentico, y los vectores virales son difciles de controlar. El problema con los vectores puede ser

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resuelto si construimos nuestros propios cromosomas con cualquier material gentico que deseemos. Estos cromosomas coexistirn con el material gentico natural casi igual que el ADN mitocondrial. Los cientficos han descubierto la doble cadena del ADN est provista de telomeros en los extremos, un centrmero, un sitio de replicacin para la ADN polimerasa. Este descubrimiento ha contribuido con el desarrollo de los cromosomas artificiales. Como recordaras, el telomero consiste en una seccin densa de ADN y protenas y esta localizado al final del cromosoma para protegerlo. El centrmero son regiones especializadas del ADN, esenciales para el control de la distribucin de cromosomas durante la divisin celular. El centrmero y el ADN polimerasa permiten al cromosoma artificial duplicarse durante la divisin celular, a lo largo del ADN husped. El cromosoma artificial ms usado es el cromosoma artificial bacteriano (BACs), desarrollado en el ao 92. Est basado en estructura bacterial natural provista de telomeros y centrmeros, la base popular para las estructura natural que necesitamos en una BACs es un plsmido llamado F(frtil), el plsmido del organismo echara coli. El BACs permite un mayor segmento de ADN sea insertado en la clula. Ms de 300 mil pares de bases pueden ser insertado en una sola BACs. La BACs puede ser transferida en una clula mediante electroporacion, donde una serie de pulsos elctricos causan poros para formar la membrana celular. Las BACs son muy estables dentro del genoma bacteriano, esta estabilidad explica por qu la BACs es tan til en la secuenciacin del material gentico. As como la bacteria crece y se divide, la BACs se replica, y el resultado es una colonia de clulas idnticas, cada una conteniendo una copia del ADN objetivo. El ADN objetivo puede ser amplificado y subsecuentemente aislado del ADN dentro de la clula. El cromosoma artificial de levadura (YAC) fue desarrollado por David Burke. La YAC contiene telomero, centrmero y una replicacin original. La ventaja de YAC sobre BAC es la forma en que pueden llevar grandes cantidades de ADN ms de un millos de pares de nucletidos. Tambin la levadura es mucho mejor tolerando grandes cantidades de secuencias repetidas. La desventaja del YAC es que no son tan estables que las BAC, y recolectar el DN clonado es mucho mas difcil pero las YAC son mucho mas tiles en las primeras etapas de la investigacin del genoma.

Descifrando el ADN
Hemos discutido como insertar material gentico dentro de un genoma y sobre la recombinacin del ADN, pero no hemos discutido como el genoma es descifrado. Se realiza segn los pasos siguientes.

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REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA:


Muchas aplicaciones en ingeniera gentica dependen de nuestra habilidad en efecto la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) es la llave tecnolgica que ha permitido la revolucin tecnolgica. Una pequea muestra de ADN puede ser ampliada para su anlisis. Existen tres pasos en la PCR como se muestra en la figura7-9. Primero, el material gentico objetivo es calentado a una temperatura de 90 a 95 C esto desnaturaliza el material causando que se divida. Las cadenas individuales son procesadas individualmente. En el segundo paso, pequeos segmentos de bases complementarias llamados cebadores, se adjuntan al extremo de la nueva cadena singular de ADN. En el tercer paso, la polimerasa, lee y encaja las bases complementarias de nucletidos rpidamente, la polimerasa creara dos nuevas cadenas dobles de la original. Con esta tecnologa, un pequeo segmento de ADN puede ser usado para generar innumerables copias. Un mayor componente en la complementacin exitosa del ADN es la polimerasa es tolerante a grandes temperaturas y es fundamental en el cambio trmico del ambiente del proceso automtico del proceso de PCR. Esta polimerasa es llamada Taq, abreviacin de termfila acutica.

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PRUEBAS DE HIBRIDACION Y HIBRIDACION SOUTHERN DEL ADN


Un instrumento fundamental en revelar la secuencia de bases de una cadena existente de ADN es llamado la prueba de ADN nuclear. El fenmeno detrs del ADN o nuclear, prueba la inclinacin de un cadena de ADN simple combinada a cadenas de ADN que contienen secuencias de base que son complementarias a la secuencia de bases de la cadena original. Se estas buscando la secuencia de bases A-T-C-G-G tu necesitaras la secuencia T-A-G-C-C. la cadena doble resultante es llamada hibrida por que es una combinacin de ADN natural y tu prueba artificial. La hibridacin consiste en simplemente mezclar las pruebas de cadenas singulares con el ADN objetivo (molculas combinadas). El ADN necesita ser desnaturalizado primero lo cual se obtiene calentando el ADN, el cual se separara en dos cadenas y permitir el acceso de una cadena singular de prueba hacia la cadena complementaria singular objetivo. El uso de la prueba nuclear va acompaado usualmente de una tcnica de deteccin conocida como hibridacin southern. Esta tcnica tiene su nombre por su descubridor Edward Soutehrn y es usada para analizar fragmentos de ADN. Ahora tenemos una hibridacin Northern que se aplica al ARN. Hibridacin Wetsthern es dedicada para las protenas. Para aplicar la tcnica de hibridacin southern primero debers digerir un segmento de ADN de inters en partes pequeas. Usaremos una de nuestras enzimas de restriccin estables para complementar el corte o digestin. Seremos capaces de determinar si la secuencia de ADN ocurri donde se hizo el corte luego llevaremos los fragmentos de ADN resultante a una electroforesis. Electroforesis de gel es una tcnica analtica que separa molculas basndose en el tamao y carga elctrica. Los componentes de inters son inducidos para migrar dentro del gel tal como agarosa aplicando cargas elctricas dentro del gel. La velocidad con se mueven depende del tamao y de la carga elctrica, por que respondern al campo elctrico a cuan fuertemente este cargado. La velocidad tambin depende del tamao por que el gel es actualmente es una matriz de fibras interconectadas. Los componentes pequeos navegan ms fcilmente que los componentes grandes. Varios fragmentos se ubican en un extremo del gel, cada fragmento puede atravesarlo cuando la carga elctrica es aplicada vea la Figura7-10.

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No puedes ver nada? Tienes que visualizar el fragmento de ADN, remojar el gel en bromato de etidio, el cual enlazara el ADN y es fluorescente cuando expongamos el ADN a la luz ultravioleta veremos los fragmentos de ADN como se muestra en la Figura7-11.

Pero que sucedi con tu prueba el bromato muestra todos los fragmentos pero no hay forma de saber cual fragmento se uni a tu prueba. Afortunadamente esta prueba est provista de algn tipo de signo que le permite ser visto el cual puede ser radiactivo o fluorescente. Una forma de detectar molculas objetivo es con un sistema de parejas de anticuerpos y fluorocromos por un mtodo llamado fluorescencia dentro de la hibridacin (FISH). Las pruebas pueden ser sintetizadas como molculas fluorescentes incorporadas o las molculas pueden reconocerse mediante anticuerpos fluorescentes para que la visualizacin de la prueba sea posible. En cada caso secaremos el gel mediante un sistema de filtros provisto de una matriz solida para el anlisis. Si tu has titulado tu fragmento de ADN con un tomo radiactivo como el tritio necesitaremos un material foto sensitivo dentro de la matriz y el material radiactivo se expondr tal como la luz lo hace. Si hemos titulado nuestro fragmento de ADN con un fluorescente, lo expondremos a una matriz de rayos ultravioletas de una apropiada longitud de onda. Obviamente, necesitaremos una longitud de onda diferente a la del bromato. En cualquier caso veremos algo como la figura 7-12.

De este anlisis hemos aprendido la ubicacin de la secuencia especfica de ADN para una enzima de restriccin y la localizacin de base complementaria para una prueba dentro del fragmento de ADN.

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LA TECNICA DE SANGER
La tcnica de Sanger ha sido usada desde el ao de descubrimiento 1977 para el secuenciamiento de ADN. Es llamada tambin mtodo de la cadena terminal por que es una forma muy clara de determinar la locacin de una base especfica en un fragmento de ADN, se basa en que la sntesis de una cadena nueva se detiene. La metodologa depende en el hecho de que (a) la sntesis de una cadena doble de ADN de una cadena simple de ADN, el proceso se iniciara en presencia del ADN polimerasa y (b) la sntesis del ADN se detendr si incorporamos una base en la forma de dixido nucletido en lugar de oxido nucletido. La forma dioxidada no tiene un grupo hidroxilo en un punto crtico vase la Figura7-13.

La tcnica de Sanger usa el dixido nucletido para un total de cuatro nucletidos requeridos, hay cuatro lotes de re-agentes cada uno para cada nucletido, la misma cadena de ADN se incuba en cada lote con un nucletido provisto de la forma dioxi y tambin de la forma normal oxi. Mantendremos los lotes separados y usaremos la electroforesis de gel en los cuatro lotes. Ya que la duracin de la migracin en el campo de la electroforesis depende de los tamaos de la molcula los fragmentos de ADN se distribuirn en forma lineal de acuerdo a su tamao. Algunos de estos fragmentos son pequeos cuando la adenosina aparece en la cadena algunos sern ms largos, cuando la adenosina aparece mucho despus de la secuencia de ADN. Ahora podemos saber la localizacin de las enzimas mediante el largo de una serie de varios

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fragmentos. Vea la Figura7-14. Para Entender como, cuando comparamos las cuatro fases de la electroforesis podemos decir en qu base se ha incorporado el fragmento de ADN.

MICRO-ARREGLO TECNOLOGICO
Existen grandes matrices de genes llamados micro arreglos genticos para numerosos objetivos. Comercialmente podemos comprarlos ya que son creados de material gentico de todos los tipos de organismos y tambin de clulas humanas. Estos micro arreglos son fundamentales en la investigacin de determinados genes, son muy importantes en la diferenciacin de funciones normales y funcin anormales de la clula. Para describir como los micro arreglos son usados considere que existe una diferencia entre la funcin celular de clulas pancreticas de individuos normales y clulas de individuos con diabetes. El paciente producir ARNm de dos tipos de clula. El ARNm le indica al investigador que los genes son expresados, en otras palabras, cual gen se necesita para la produccin de protenas. El investigador usara el ARNm para recrear el ADN el cual vino de la transcripcin reversa.

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Recuerda que este ADN nuevo es llamado cADN. El cual viene de una clula normal identificada mediante una titulacin fluorescente. El cADN de una clula anormal se identificara mediante una titulacin fluorescente diferente, la ubicacin e identidad de cada fragmento es conocida. El investigador obtendr un chip de ADN con fragmentos de ADN desnaturalizados de los genomas de las clulas pancreticas. Los fragmentos de ADN son colocados en un arreglo. La locacin el investigador sabr, por ejemplo, que un fragmento de gen con la secuencia A-TC-GC-C est presente. El micro arreglo es incubado con el cADN de ambas clulas normal y anormal. El cADN se unir a la matriz mediante enlaces con el ADN fragmentado mediante los pares de bases. El microarreglo es como un cuadro de conmutadores; el operador puede decirnos de un vistazo que circuitos estn prendidos. Considere el ejemplo de la Figura7-15 de una bacteria mutante que puede ser digerida por policlorofenoles vs una bacteria norma.

TECNOLOGIA DEL GEN REPORTANTE


Los genes reportados son usados en la investigacin de genes y tienen dificultad para determinar si el gen esta siendo expresado. Los genes reporteros son activos cuando el gen bajo estudio es activo; los sistemas que estn bajo estudio incluyen el ADN viral y los genes mutantes. Algunos genes reporteros fabrican una enzima que es fcil de detectar, tal como el gen que codifica la beta-galactosidasa. La beta-galactosidasa causa que el color del cultivo cambie. Otro gen reportero popular es el gen que codifica la protena verde fluorescente. Por ejemplo, para efectos de la hormona de crecimiento el

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reportero puede ser usado como un HGF-promotor sensitivo e iluminara cuando el HGF sea influenciado por la funcin celular. Los resultados son espectaculares la clula literalmente se vuelve en una clula verdosa.

Otro uso de los genes reporteros es rastrear el movimiento de las protenas. En un estudio realmente hermoso de metabolismos anormales y normales de secrecin de la hormona gonadotropina receptora, los investigadores fusionaron un gen de una protena fluorescente verde con un gen receptor. Ellos fueron capaces de ver a la protena dentro de la clula ya que esta era verde fluorescente. En este gran estudio, la protena no fue doblada apropiadamente, y se acumul lumen en el retculo endoplasmatico. Las protenas dobladas apropiadamente son observadas al insertar en la membrana celular y aparecen en la superficie celular. Para la maravilla del mundo el gen de la protena fluorescente verde pude causar que organismos enteros brillen. Podras ver esto en ratones que brillan verdosamente; un ejemplo tpico de reportador es la luciferasa hecha de ADN de lucirnaga.

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SINTETIZADORES DE ADN
La tcnica que has aprendido te har capaz de producir y usar protenas bioactivas, si los organismos no son un sistema complejo. Sin embargo la mayora de molculas bioactivas son modificadas despus de la produccin de mARN. La modificacin requiere de otras protenas producidas de acuerdo a signos ambientales y que actan de la misma forma que una hormona. Por ejemplo, nuestra ya familiar insulina es producida por la proinsulina, y es guardada como proinsulina y secretada como insulina. La insulina es producida en su forma final por un proceso celular bioqumico despus que el gen es transcrito. As que si usted produce una protena de gen de insulina, estar produciendo proinsulina. Las modificaciones requerirn de protenas que son responsables de producir en su forma final. Muchos mtodos se han desarrollado para trabajar en la estructura del aminocido y desarrollar un gen que codifique la protena, aunque este gen no haya existido en la naturaleza. Podemos sintetizar el ADN fuera de una clula por que las fuerzas qumicas que enlazan el ADN son operativas dentro y fuera de la clula. Para iniciar la sntesis de una nueva cadena de ADN, necesitaremos una matriz que sostenga las molculas y no les permita que interacten. Los sintetizadores de ADN usan una matriz de slice en una columna pequea que enlaza el primer nucletido en la secuencia presente. El segundo nucletido enjuagado a travs de la columna y enlazado con le primer nucletido mediante un enlace de azcar-fosfato que forma la columna vertebral del ADN. Las molculas del segundo nucletido tienen que ser bloqueadas qumicamente para que se unan solo al primer nucletido y no a ningn otro. El exceso del segundo nucletido es desechado de la columna y el bloqueo qumico removido del nucletido que se ha unido a la matriz. Luego el tercer nucletido es aadido y as continuaremos subsecuentemente. Este proceso ahora se hace por un sistema de computadoras una vez provista de la secuencia de ADN deseada se producir la cadena de ADN. Este sistema es llamado SINTESIS de ADN. La cantidad de material producido depende de la secuencia de ADN, pero este sistema es lo suficientemente apropiado para la mayora de protenas de inters medico.

ANTISENTIDO
Muchas enfermedades humanas resultan por que una protena defectuosa es producida. La enfermedad puede ser tratada si podemos prevenir que el gen de dicha protena no la transcriba. Tambin, podremos prevenir infecciones virales previniendo que el gen viral sea transcrito. Molculas anti sentido son secuencias de molculas de bases orgnicas que enlazan una cadena simple de mARN. La unin de molculas anti sentido dar como resultado que el gen no se exprese. Las cadenas de bases orgnicas

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son llamadas anti sentido, no porque no tengan sentido si no porque contrarrestaran el sentido de la funcin del gen. Una molcula sin sentido es una molcula simple de acido nucleico que tiene una bases orgnica idntica a la codificada en la cadena del gen. El mARN solo funciona con cadenas simples, cuando una cadena anti sentido se une a la cadena del mARN y crea una doble cadena el mARN no pude producir la protena. En adicin una aplicacin potencial es la prevencin de enfermedades virales y la transcripcin de protenas dainas, la tecnologa anti sentido ha sido usada para investigar la funcin de varios genes y tiene gran potencial clnico como una forma de prevenir la expresin de genes que causan patologas, como el cncer causado por oncogenes.

BIBLIOTECA DE GENES
No estamos bromeando, viviendo en la era de la informacin los descubrimientos cientficos son compartidos rpidamente en la comunidad cientfica usando la red internacional. Un nmero de institutos cientficos mantiene una base de datos que rastrea y tiene clasificada la informacin gentica. Esto incluye el instituto en lnea mendeliano de herencia, otro instituto es el John Hopkins esta base de datos se han creado para genes humanos, tratamientos genticos, y desordenes. Existen varias bases de datos de secuencias de ADN y para secuencias de protenas. Esta y otras muchas herramientas tratan de reunir toda la informacin que se genera de diversos experimentos y ayudara en el futuro de la gentica humana.

Resumen
El aspecto ms fundamental de la tecnologa es la habilidad de copiar el gen de un organismo y ponerlo dentro de otro. Vale remarcar esto se puede hacer de diferentes genes, especies, familias, filiums pero como obtenemos estos genes una metodologa es leer el mARN y reconstruirlo en ADN usando una enzima llamada transcriptasa reversa. El mARN es la molcula dedicada ha llevar el cdigo del ADN a la fabrica de protenas. Y puede ser colectada de clulas que esperamos tangan la expresin de gen que queremos. Una vez que tienes el gen, puedes descifrar la secuencia de bases orgnicas usando un gran numero de secuencias analticas. Las cuales son pruebas de ADN con fluorescencia o radiacin, la digestin con enzimas de restriccin y el uso de gel electroforesis para separarlas de acuerdo al tamao una vez que sabes la secuencia, puedes construir el gen con ayuda de sintetizadores de ADN. Una vez que tengas una pequea parte del ADN que quieres puedes producir mas usando la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) Para insertar un gen dentro de otro organismo necesitamos un vector. Este vector puede ser un plsmido, un virus o un cromosoma artificial. Un cromosoma artificial se

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construye a partir de una estructura bases en un centrmero en el centro y telomeros en cada extremo. Las especies que proveen la estructura del centrmero y telomero dan ha las especies la identidad del cromosoma. As es como tenemos cromosomas artificiales de bacterias, ratones, y humanos. Si tenemos que insertar el gen dentro de un vector existente usaremos enzimas de restriccin las enzimas de restriccin realizan un corte dentado en el ADN creando unas bases complementarias que buscaran a sus complementos, llamados extremos pegajosos. Usualmente, necesitaremos incluir un gen que reporte la cantidad admitida de genes. En bacterias, podemos seleccionar el organismo que lleva el gen para la resistencia a la ampicilina y tambin el que llevara el gen reportero popular, la beta-galactosidasa. La bacteria que contenga la betagalactosidasa causara que el cultivo crezca y cambie de color. Anticuerpo monoclonales pueden ser usado para confirmar que la protena deseada esta siendo producida.

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