Universidad Icesi Andrea Escobar Fuertes 08220049 Bioqumica AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE PROTENAS DE UNIN A UNA SECUENCIA ESPECFICA DEL

PROMOTOR DEL GEN CALMODULINA DE PLASMODIUM FALCIPARUM.

En el articulo presentan como objetivo principal, buscar la maquinaria transcripcional de Plasmodium falciparum, utilizando los mtodos de separacin y aislamiento de protenas que se unen a cadenas de DNA. Con lo anterior se esperan encontrar mtodos y formas de tratar una endemia que provoca la muerte de dos millones de personas cada ao. Para llevar a cabo esto, se tomo un modelo del gen de calmodulina, el cual fue el fragmento de DNA PfCAM 149 y un microsistema de afinidad DNA PfCAM 149-biotina-estreptadivina-magnesferas, el cual es una herramienta para separar protenas de unin a DNA. Para escalar este sistema de afinidad se usaron protenas nucleares del parsito. Se realizaron los siguientes pasos para lograr el objetivo: Diagrama de flujo

1. (Cultivo) Cultivo in vitro de Plasmodium falciparum: Utilizar cepa colombiana FCB-2 de P. falciparum para cultivar por mtodo de Trager y Jensen en medio RPMI 1640 (Sigma), con 10% de suero humano. 0.2mM de hipoxantina, 1mg/ml de glutatin reducido, 25mM de HERPES, 50 g/ml de gentamicina y glbulos rojos O positivo, llevados a un hematocrito del 5%. Cultivar a una temperatura de 37C, atmosfera de N2 (90%), CO2 (5%) y O2 (5%). Sincronizar cultivo con 5% de sorbitol para estimular lisis de formas maduras. 2. (Obtencin y cuantificacin) Obtencin de extractos nucleares: Tratar los glbulos rojos con saponina y extraer los ncleos por lisis de la membranas nuclear de los parsitos por choque osmtico en presencia de buffer hipotnico y tratamiento con Noniden-P40. Protenas nucleares se extraen con un buffer de alta fuerza inica (utilizando un stok de inhibidores de proteasas y fosfatasas). Cuantificar protenas en este y en los dems pasos por un mtodo especfico para esto, mtodo de Bradford. 3. (Cromatografa por afinidad)Fraccionamiento del extracto nuclear: Por cromatografa de afinidad, realizar un fraccionamiento del extracto celular. Utilizar DNA heterlogo para la matriz. Al extracto nuclear ajustarlo a una concentracin de 100 mM NaCl para mantener unidas las protenas al DNA de la matriz. Adicionar 0.05% de Brij-35 para no incurrir en la precipitacin al disminuir la concentracin de sal. Agregar el extracto a la columna y recolectar la primera elucin con buffer de baja fuerza inica 0.1M de NaCl (N100), con el fin de obtener primero las protenas que no se unen al DNA. Luego realizar la elucin de las protenas que s se unen al DNA utilizando 0.5M (NH4)2SO4. 4. (Ensayo) Verificacin de la actividad de unin de diferentes fracciones de la cromatografa de afinidad a la secuencia PfCAM 149 mediante ensayos de unin a filtros: El fragmento de DNA PfCAM 149, se extrajo del vector pCR-2.1-149 con enzima Eco RI (del clon de E coli), utilizar como plantilla para amplificar por PCR, usar indicador para anilar en posiciones -667 a -649 de la regin 5UTR del promotor del gen de calmodulina 5CAM2. El indicador reverso con un sitio Eco RI, permite la marcacin radioactiva (32P-dATP). Se marca tambin radiactivamente el plsmido pGEM (Promega) para ser utilizado como marcador de tamao. Se utilizan filtros de nitrato de celulosa, para lograr la retencin de los complejos protena-DNA. Desnaturalizar las protenas unidas al DNA marcado por extraccin fenlica de los filtros, este se lleva a precipitacin, se observa en electroforesis y luego por una autoradiografa.

5. Escalamiento del microsistema de afinidad DNA-PfCAM-biotina-estreptavidinamagnesferas y aislamiento de protenas nucleares de P. falciparum: Obtener fragmento el DNA (PfCAM 149) por medio de una amplificacin por PCR. Utilizar como indicador directo 5`CAM-2 y como indicador reverso una secuencia biotinilada en el fragmento obtenido de para producir un anillamiento en diferentes posiciones (-518 a -539). Esta amplificacin incluye un proceso de denaturacin a 94C por 5 minutos Luego 34 ciclos de anillaje a 39C por 2 minutos, extensin a 72C por 3 minutos y denaturacin a 94C por un minuto, un anillaje final a 39C por 2 minutos y por ultimo una extensin a 72C por 10 minutos. Purificar el producto obtenido y estimar la cantidad de DNA por visualizacin en gel de agarosa. Realizar captura de protenas nucleares del parsito utilizando el sistema PfCAM 149 biotinaestreptavidina magnesferas. Efectuar separacin magntica de las magneferasas sobre un soporte imantado. Las protenas se separan electroforticamente (SDS-PAGE 8%). Visualizar por tincin con plata. 6. Marcacin metablica con 35S-Met de un cultivo in vitro de P. falciparum: Tomar un cultivo entre 18-20 horas de edad en estado de anillo. Adicionar 5% NaHCO 3, 1 mg/ml de glutatin reducido, 10% de suero y 240 Ci de 35S-Met por cada 100 ml de cultivo. De los parsitos extraer luego las protenas nucleares. 7. Deteccin de protenas nucleares de P. falciparum que reconocen secuencias consenso para algunos factores de transcripcin eucariotes: Usar secuencias de consenso, con el fin de detectar protenas del parasito unidas a eucariotes, para factores de transcripcin CREB, GATA, MIG y OCT1. Realizar ensayo de unin a filtros y luego un ensayo de South-Western, que consiste en una electroforesis en SDS-PAGE al 8%, despus una transferencia sobre membrana de PVDF. Renaturar las protenas y aplicar autoradiografa. Condiciones para el aislamiento de protenas con fines de secuenciacin: Utilizar geles de poliacrilamida tris-tricina al 8% polimerizado por 4h a 4C (10mM glutatin reducido). Realizar pre-electroforesis a 8mA por 30 minutos; evitar ebullicin en la preparacin de la muestra. Usar membranas PVDF Immobilon- P (Millipore), para mejores resultados utilizar PVDF ProBlott TM (Applied Biosystem). Teir membrana con azul de Comassie, se obtiene la banda de inters y almacenar a -20C, hasta que se realice el anlisis de la secuencia aminoterminal por la degradacin de Edman.

Los cultivos tenan de 36 a 40 horas de edad que es cuando se presenta ms actividad en cuanto a la sntesis de mRNA del gen calmodulina, con lo que se aumentara la posibilidad de encontrar protenas que controlaran la expresin del gen. Con las extracciones realizadas en el paso dos, se lograron obtener buenas cantidades de extractos nucleares y protenas de buen tamao, lo cual favoreci ms adelante el paso 5 y en total a todo el experimento. Por medio de la cromatografa de afinidad, donde la matriz fue celulosa-DNA timo de terna, se lograron separar las protenas nucleares del parasito que presentaban unin al DNA heterlogo y por lo tanto una actividad de unin al fragmento DNA PfCAM 149. Durante el proceso de purificacin, se obtuvo en el experimento un porcentaje de 76% de protena eluida por la columna, lo cual es bueno porque el resto del porcentaje corresponde a prdida de protenas. Esto indica que los mtodos utilizados durante el experimento han sido buenos, ya que se ha logrado optimizar la cantidad de protena a utilizar, y el porcentaje de prdida, corresponde a un porcentaje normal en los procesos de purificacin. Con mtodos de electroforesis confirmaron que el porcentaje de protenas que presentan unin al DNA es baja, indicando que son ms las protenas que se unen al gen promotor de calmodulina del parsito. En la cromatografa, las fracciones recolectadas de las protenas con alta fuerza inica (E500) son las que se unen al DNA PfCAM 149 y estas se utilizaron en el siguiente paso para escalar (por optimizar protenas obtenidas) el microsistema de afinidad.

Para el paso en el que se utilizo el microsistema de afinidad DNA PfCAM-biotina-estreptadivinamagnesferas, se realizaron en el procedimiento unas amplificaciones del fragmento PfCAM 149 por PCR, ya que no se dispona de suficiente DNA. De este procedimiento, con la matriz ensamblada, se obtuvieron las protenas nucleares del parsito, por medio de la reaccin de esta matriz con protenas de la fraccin E500. Se eliminaron las protenas que no se unieron a la matriz con 3 pasos de purificacin. Despus de que se dieron estas rondas de purificacin, se observo que unas protenas, especialmente las de peso molecular de 54 y 40 kDa, se quedaron unidas al sistema con mayor afinidad. Partiendo de esto se realizo el siguiente paso de determinar la unin de protenas de P. falciparum a secuencias de consenso para factores de transcripcin en eucariotes. Se obtuvo que a CREB se unan las protenas de la fraccin E500. Se escogieron por medio de otros procesos dos candidatos para la secuenciacin por la unin al DNA PfCAM, las protenas de 39 y 54 kDa. Para comprobar esto se realizo una secuenciacin de las protenas de P. falciparum, pero no se pudo obtener la secuenciacin para la de 53 kDa, ya que presento un bloqueo no por causas experimentales, sino porque se comprob que dentro del parsito est protegida. Despus de todo este procedimiento, se defini que el factor de transcripcin CREB y otros relacionados, hacen parte de la maquinaria transcripcional del parsito. Y con esto trabajo se servirn las dems investigaciones, sobre aquellos agentes que regulan la expresin gnica en malaria, y as encontrar la forma de combatir con esta enfermedad que perjudica a una gran poblacin en el mundo, provocando muertes anuales de nios y adultos.

Bibliografa Revista cientfica: http://redalyc.uaemex.mx/ Visitado el 12 Febrero 2011. Artculo cientfico: http://redalyc.uaemex.mx/pdf/776/77650110.pdf , Visitado el 12 de febrero de 2011 http://www.sigmaaldrich.com/life-science/cell-culture/classical-media-salts/rpmi-media.html, visitado el 14 de Febrero de 2011. Jorde, Lynn B. 2005. Gentica Mdica. Madrid espaa : Elsevier Espaa S.A., 2005. Wikipedia: La Enciclopedia Libre. http://es.wikipedia.org/wiki/ Visitado el 14 de Febrero de 2011