1

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BASICAS LABORATORIO DE BIOQUMICA 502504 GUA No: 3.2. DETERMINACIN DE PROTEINA BRUTA POR EL MTODO DE KJELDAHL I. EL PROBLEMA Determinar el contenido de protena bruta presente en muestras de harina de pescado, harina de soya y/o harina de trigo comerciales. II. FUNDAMENTO TERICO Como se ha discutido, las protenas constituyen un grupo de biomelculas muy importante, puesto que son las responsables de muchas funciones biolgicas: Como la formacin de tejidos y la actividad enzimtica. Conocer los contenidos de protenas presentes en los tejidos, ha sido objeto de varios estudios y en consecuencia se han desarrollado muchas tcnicas de anlisis. Existen varios mtodos mediante los cuales se puede determinar el contenido de protena bruta, protena real y nitrgeno no proteico en muestras tanto de origen vegetal como de origen animal. MTODOS ESPECTROFOTOMTRICOS Estos mtodos son particularmente tiles en la valoracin del contenido de protena real, puesto que se basan en la formacin de complejos coloreados entre algunos aminocidos proteicos el enlace peptdico, con reactivos especficos. Dentro de los mtodos clsicos estn el que emplea el reactivo del biuret, el cual se fundamenta en la formacin de un complejo coordinado entre los iones cpricos del reactivo y el enlace peptdico de la protena, reaccin que transcurre en medio alcalino. Tambin es de uso frecuente el mtodo que emplea la espectrofotometra con base en la reactivo de Folin. En los dos casos anteriores, se elaboran curvas de calibracin con una protena patrn, normalmente la albmina de huevo o la albmina bovina estabilizada estndar, y en las mismas condiciones de reaccin se hace el desarrollo de la coloracin para la muestra que se est analizando.

MTODOS VOLUMTRICOS Dentro de estos mtodos est el de Kjeldahl, el cual se fundamenta en la conversin del nitrgeno total presente en la muestra a sales de amonio que son posteriormente valoradas por volumetra cido base.

El mtodo de Kjeldahl consta de tres etapas que en su orden son: digestin de la muestra, destilacin con arrastre de vapor del amoniaco producido y valoracin cido base de este amoniaco. En la primera etapa, el hidrgeno y el oxgeno proteico, son oxidados hasta dixido de carbono y agua, mientras que el nitrgeno es convertido en sulfato de amonio, por la accin de un agente oxidante en medio cido y con la ayuda de un catalizador. Se han desarrollado diferentes variantes en las cuales cambia el catalizador el agente oxidante, pero en todos los casos, el objetivo final de la etapa de digestin es el de convertir el nitrgeno proteico en sulfato de amonio. En la etapa siguiente, mediante la accin de una base fuerte, generalmente hidrxido de sodio al 40%, se libera el amonaco de la sal de amonio. Cuando la valoracin se va a efectuar por retroceso, el amoniaco liberado se arrastra con vapor y se recoge sobre un volumen exactamente medido de un cido estndar. Una variante utilizada comnmente, consiste en recibir el amoniaco (hidrxido de amonio) sobre cido brico aproximadamente al 4% de tal manera que se forma borato de amonio, el cual se titula directamente. En la etapa final, se hace la valoracin de acuerdo con el proceso empleado para la recoleccin. As por ejemplo, si el hidrxido de amonio, se recibi sobre un volumen exactamente medido de un cido estndar, la titulacin se hace con una base valorada y en presencia de un indicador adecuado, de tal manera que se determina el cido que no reaccion con el hidrxido de amonio destilado y por diferencia, se calcula el hidrxido de amonio producido. En la variante de Steyemark, el hidrxido de amonio se recoge sobre cido brico no valorado y luego se titula directamente el borato de amonio que se forma, con un cido estndar. Reacciones mtodo Kjeldahl Variante Steyemark Digestin: Protena(s) + H2SO4(c) + Catalizador(s) Liberacin del NH3: Arrastre con vapor: Recoleccin: Titulacin: NH4HSO4(ac) + 2NaOH(ac) NH3(g) + H2O(g) NH4OH(ac) + H3BO4(ac) NH4H2BO4(ac) + HCI(ac) CO2(g) + H2O(g)+ NH4HSO4(ac) NH3(g) + Na2SO4(ac) + H2O(g) NH4OH(ac) NH4H2BO4 + H2O NH4CI(ac) + H3BO4(ac)

III. BUSQUEDA DE INFORMACIN Elabore el preinforme, segn lo pre-establecido desde primer semestre y que contenga los resultados de las siguientes consultas: Composicin promedio en porcentaje de carbohidratos, lpidos y protenas la harina de trigo, harina de pescado y harina de soya. Composicin promedio de las diferentes fracciones proteicas que constituyen cada una de las protenas presentes en cada harina a analizar. Composicin promedio en aminocidos esenciales de cada una de las protenas a analizar

IV. MATERIAL EQUIPOS Y RECTIVOS Material biolgico: Harina de trigo. Harina de soya Harina de pescado 5g 5g 5g

Material y equipo de laboratorio, de uso general Balanza analtica Equipo de digestin y destilacin para Kjeldahl Material por grupo de trabajo Baln para kjeldahl Erlenmeyer de 500 mL Probeta de 100 mL Probeta de 200 mL Vidrio de reloj Esptula 1 1 1 1 1 1

Reactivos H2SO4 R. A NaOH 40% H3BO4 4% HCI 0.1 N Catalizador en pastillas (de 1 g), que contienen la siguiente mezcla catalizadora: Mezcla catalizadora: K2SO4 97 % CuSO 5H2O 1.5 % Selenio 1.5 % cido Brico al 4% con indicador de Tashiro: Preparacin. A un litro de cido brico al 4% agregar 5 mL de indicador de Tashiro, (que se prepara segn se describe a continuacin) y ajustar el pH a 4.2 Indicador de Tashiro: Disolver 0.5 g de rojo de metilo y 1 g de verde de bromocresol, en 100 mL de etanol del 96%. V. PROCEDIMIENTO Revisin del equipo VERIFICAR EL BUEN FUNCIONAMIENTO DE TODO EL EQUIPO KJELDAHL, DIGESTOR, EXTRACTOR Y DESTILADOR. LAVAR CON AGUA DESTILADA LOS REFRIGERANTES Y LOS EXTREMOS DE RECOLECCIN DEL DESTILADO

4
Digestin Pesar con precisin de centsima de gramo, la cantidad de muestra segn la siguiente tabla: MUESTRA HARINA DE PESCADO HARINA DE SOYA HARINA DE TRIGO SACAROSA (BLANCO DE REACTIVOS) CANTIDAD EN GRAMOS 0.30 0.40 0.50 0.40

Transferir cada una de las muestras pesadas a sendos balones Kjeldahl previamente marcados. Agregar a cada baln que contiene la correspondiente muestra, 20 mL de H2SO4 R. A Agregar a cada baln2 pastillas de catalizador Colocar los balones que contienen la mezcla de la muestra, el cido sulfrico y el catalizador sobre las resistencias del digestor Kjeldahl. Encender las resistencias de calentamiento y el extractor del equipo Kjeldahl ractor. Permitir que transcurra la digestin, vigilando que no haya escape de gases y rotando el baln espordicamente para facilitar la digestin del material que salta a las paredes, hasta que la mezcla sea transparente. (se toma entre 45 minutos y una hora) Una vez la mezcla este transparente, apagar las resistencias, SIN APAGAR EL EXTRACTOR, y dejar enfriar por 15 minutos en el equipo. Retirar los balones del digestor, y terminar de enfriar cuidadosamente por enfriamiento exterior del baln al chorro de agua. Destilacin Una vez fro el contenido del baln, AGREGAR, CUIDADOSAMENTE UTILIZANDO GAFAS Y GUANTES, 200 mL, medidos con probeta, de agua destilada, a cada uno de los balones. Dejar enfriar el baln a temperatura ambiente por 15 minutos. Mientras transcurre este tiempo de enfriamiento, colocar en el extremo de cada destilador, un erlenmeyer de 500 mL de capacidad, al que se le han agregado 100 mL de cido brico que contiene el indicador de Tashiro (solucin de color rojo vino) Encender las resistencias del destilador Kjeldahl y el sistema de refrigeracin Terminar el enfriamiento del baln exteriormente al chorro de agua. Agregar a cada baln, de 10 a 15 perlas para controlar la ebullicin Una vez fro el contenido del baln, AGREGAR, CUIDADOSAMENTE UTILIZANDO GAFAS Y GUANTES, 80 mL, medidos con probeta, de solucin de NaOH al 40 % Instalar cada baln en una hornilla del destilador, ajustar y agitar. Dejar que transcurra la destilacin hasta recoger aproximadamente entre 150 y 200 mL de destilado en erlenmeyer de recoleccin, cuyo contenido cambia de color a azl verdoso a medida que se recoge el amoniaco. (se toma aproximadamente de 10 a 15 minutos) Recogido el volumen de destilado mencionado anteriormente, retirar los erlenmeyers colectores. Apagar las resistencias de calentamiento, SIN APAGAR EL SISTEMA DE REFRIGERACINEXTRACTOR. Titulacin. Colocar en un erlenemeyer aproximadamente 150 mL de cido brico con indicador, que se utilizar como referencia para el color del punto final de la titulacin. Titular el contenido de cada destilado con HCl 0.1 N, hasta que el color azul verdoso cambie nuevamente a rojo vino igual al del el erlenmeyer de referencia. Leer y anotar el volumen de HCl gastado en cada titulacin.

VI. TABLAS DE DATOS El estudiante debe elaborar la(s) tabla(s) de datos con base en el (los) procedimiento(s) e incluirla(s) en el preinforme correspondiente. VII. PARA EL ANLISIS DE LA PRCTICA. Calcular el contenido de protena, de cada muestra segn la siguiente ecuacin: % Proteina = VHCl mL x NHClm.e.q x 14 mg de N x 6.25 100 . mL x 1 m.e.q x (Peso muestra en mg) Consultar de donde sale el valor 6.25, de la ecuacin, que es un factor de conversin de porcentaje de nitrgeno a protena Consultar otros factores de conversin, de donde salen y cuando se aplican Analizar los resultados obtenidos, por comparacin con los niveles promedio de protena consultados para el preinforme. y evaluar, desde el punto de vista de contenido de protenas, la calidad nutricional de las muestras analizadas, complementar el anlisis con la consulta hecha en el preinforme sobre composicin en aminocidos esenciales Consultar por qu, el valor de protena, determinado por este mtodo, es de protena bruta y no de protena real. Complementar segn las instrucciones adicionales del docente. VII. BIBLIOGRAFA. Bernal de Ramrez,I. 1993. Anlisis de alimentos, Academia Colombiana de ciencias exactas, fsicas y naturales Coleccin Julio Carrizosa Valenzuela, No 2. Bogot.