MTODOS HISTOLGICOS Los diferentes mtodos histolgicos permiten examinar clulas vivas o muertas, as como componentes celulares, los

histlogos utilizan estos mtodos para resolver problemas histolgicos (Banks, 1996): Los cultivos celulares permiten la observacin directa de clulas vivientes. Se realizan de manera rutinaria gracias a los antibiticos. Los cultivos celulares tambin permiten efectuar observacin continua y manipulacin. Esto facilita el estudio de diferenciacin, transformaciones, citogentica, metabolismo, interacciones, relaciones husped-parsito y otros procesos biolgicos celulares. Los cultivos celulares son indispensables en el diagnstico virolgico, al igual que para el desarrollo y produccin de vacunas. El uso de cmaras transparentes de observacin, as como la exteriorizacin y transiluminacin de rganos y tejidos, complementa la observacin directa. Aunque las tcnicas de exteriorizacin limitan el tiempo de observacin, se ha logrado profundizar con respecto a microcirculacin y respuestas de rganos y tejidos a quimioteraputicos. Las cmaras transparentes de observacin extienden el periodo de sta. Con dichas tcnicas pueden estudiarse neoformacin vascular, diferenciacin y movimiento celular, al igual que otros procesos vitales. La cmara anterior del ojo es una cmara de observacin natural que se ha utilizado para este tipo de enfoque. La fijacin selectiva de colorantes vitales y supravitales ha aportado conocimientos de la funcin y estructura celulares, as como respecto de los materiales de la matriz extracelular. Estos colorantes tienen baja toxicidad; pueden inyectarse en organismos vivos (colorante vital) o usarse en clulas vivas tomadas del organismo (colorante supravital). Examinar clulas y tejidos con el microscopio no es fcil, por que son transparentes y gruesos. El ndice de refraccin de los componentes celulares es similar para todos, lo que dificulta su identificacin y diferenciacin fciles. Los artefactos superpuestos y la absorcin excesiva de luz limitan la utilidad y confiabilidad de la informacin que se obtiene a partir de materiales vivos no procesados. Los problemas sealados se reducen cuando se obtiene cortes delgados que se tien y examinan. Esto requiere manejo y procesado excesivo de los tejidos, pero constituye el tipo de enfoque habitual de los estudios histolgicos. Con objeto de reducir las alteraciones estructurales, por lo comn clulas y tejidos para examen microscpico, se matan incluyndolos en fijadores. En consecuencia el proceso termina incluyendo los tejidos en algn material para simplificar la obtencin de cortes finos.

TCNICA DE INCLUSIN EN PARAFINA La tcnica de inclusin en parafina para preparar muestras es sencilla y confiable. Aunque modifica clulas y tejidos, las muestras procesadas brindan confianza y precisin, y permite inferir datos respecto de las situaciones in vivo. la tcnica de inclusin en parafina constituye el mtodo de ms uso para la preparacin de

especmenes para cursos de histologa, diagnstico histopatolgico e investigacin morfolgica con microscopio de luz (Banks, 1996). Obtencin Obtener muestras es un paso fundamental. La obtencin de muestras implica tener conocimientos de anatoma macroscpica. Una vez que se identifica la muestra deseada, debe obtenerse de modo atraumtico. La mayora de los tejidos vivos son entidades frgiles cuya morfologa puede cambiar si se manipulan en exceso y mediante tcnicas inadecuadas de obtencin. Estar consciente de los tejidos es tan importante para el histlogo como para el cirujano. Un escalpelo o tijeras romos y sucios, as como la presin o traccin excesivas durante el muestreo, alteran los componentes celulares. Muchas clulas y tejidos degeneran cuando se separan de su ambiente ideal. Los tejidos deben extraerse con rapidez y destreza; sobre todo han de colocarse de inmediato en un buen fijador para inactivar las enzimas autolticas. Fijacin La fijacin qumica se usa en especmenes histolgicos: con el fin principal de detener la autolisis postmortem. Los fijadores inactivan, por desnaturalizacin de protenas, las enzimas autolticas que causan los cambios postmortem. Los fijadores que se utilizan con ms frecuencia son formaldehdo, glutaraldehdo, paraformaldehdo, alcohol etlico, cido actico, cido pcrico, dicromato de potasio, cloruro de mercurio, cido crmico y cido smico. Cada uno de ellos tiene propiedades especficas que a su vez les confiere ventajas y desventajas. Algunos agentes qumicos son fijadores coagulantes. Inducen cambios celulares semejantes a los que se producen cuando se aplica calor aun huevo. La conformacin molecular se altera con este tipo de fijadores (Metano y Etanol). Estos fijadores originan cambios estructurales profundos. Otros fijadores se describen como fijadores aditivos, en los que la fijacin ocurre por reaccin qumica con los componentes bioqumicos de las clulas. No inducen cambios morfolgicos tan marcados como los caractersticos de los fijadores coagulantes. Los aldehdos (Formaldehdo, Paraformaldehdo y Glutaraldehdo) son fijadores aditivos tiles para estudios histolgicos. El fijador ms comn es la solucin al 10% de formalina neutralizada con soluciones amortiguadoras. Consiste en 10 volmenes de formalina comercial (Formaldehdo en agua al 40%) y 90 volmenes de agua amortiguada con fosfato. La accin de casi todos los fijadores es mltiple: 1. 2. 3. 4. Previene la autlisis por postmortem por inactivacin de enzimas hidrolticas. Facilitan la obtencin de cortes mediante endurecimiento de los tejidos. Intensifican la tincin al actuar como mordientes. Reducen el arrastre de agua de muchos de los componentes durante el proceso ulterior. 5. Estabilizan los componentes para que se acerquen a su condicin in vivo.

6. Protegen al histlogo mediante sus propiedades antispticas. La inmersin de la muestra en fijador debe realizarse tan pronto como sea posible, una vez que se ha obtenido del organismo. A partir del recortado del cubo de tejido en el fijador, debe obtenerse una muestra de pocos milmetros de espesor. De esta manera se permite la penetracin (y fijacin) de la totalidad de la muestra. El ndice ideal es de 30:1 de volumen de fijador por volumen de tejido. El tiempo real requerido para la fijacin completa vara segn las propiedades de difusin y la concentracin del fijador, y de acuerdo con la densidad del tejido. Por lo general, bastan 24 horas para la fijacin con formaldehdo. Deshidratacin y Aclarado Diversas sustancias qumicas se usan como parte del procedimiento. Cuando se infiltra en la muestra parafina o una sustancia similar con objeto de obtener cortes, debe eliminarse el agua. Normalmente, el agua constituye el 75% de casi todos los tejidos. Despus de lavar de manera escrupulosa la muestra para eliminar todo rastro de formalina, se deshidrata el espcimen como preparacin previa a la inclusin. Se usan muchos deshidratante (Etanol, Butanol, Dioxano, Isopropanol) pero el Etanol es el ms utilizado. Las muestras de tejido se sumergen en concentraciones crecientes de etanol, hasta que se obtiene la deshidratacin total en alcohol absoluto. Las muestras se procesan con un aclarante porque los deshidratantes y agentes para inclusin no son miscibles el uno en el otro. El aclarante sustituye al deshidratante. Inclusin Las muestras aclaradas se procesan pasndolas por soluciones de parafina a diferentes concentraciones. Los reactivos para inclusin se mantienen a las temperaturas de su fusin (50 a 68C) durante todo el proceso de infiltracin. No obstante, el calor requerido puede inducir ciertos cambios morfolgicos en los tejidos. En el comercio se obtienen mezclas de parafina purificada y polmeros de plstico que constituyen eficaces materiales para inclusin. Los especmenes infiltrados se colocan en moldes llenos de parafina y se dejan enfriar. Obtencin De Cortes Una vez que la parafina se ha endurecido y ya que se han retirado los moldes, los cubos se recortan para exponer una cara del tejido incluido. Los cubos se montan en el micrtomo y se hacen cortes muy finos (secciones) sobre la superficie. Estas secciones as obtenidas tienden a formar cintas el ltimo borde de la seccin precedente se adhiere al primer borde de la que sigue lo que facilita la recoleccin de secciones de la muestra. Debido a cierta compresin generada por el proceso de corte, las cintas pueden hacerse flotar en agua tibia, estirarse despus y recogerse con portaobjetos. Parte de las cintas se fijan en los portaobjetos, y stos se colocan sobre una platina caliente para reducir los artefactos por compresin. Un micrtomo rotatorio permite obtener secciones hasta de un 1 m de espesor. La mayora de los especmenes requeridos para examen histolgicos se corta con un espesor de entre 5 y 7 m y se montan sobra portaobjetos.

Tincin y Montaje Las secciones de materiales incluidos en parafina, montados sobre portaobjetos de vidrio, simplifican el resto de la operacin de teido y montaje. Muchos colorantes tisulares son solubles en agua o alcohol; la parafina debe eliminarse antes de teir. Se rehidratan las secciones y se tien. Se deshidratan de nuevo, se aclaran y se cubren con un medio de montaje miscible en el medio aclarante. Al aplicar un cubreobjetos se obtiene una preparacin permanente.

(Bacha, 2000)

PRINCIPIOS DE TINCIN Caractersticas Generales En casi todos los exmenes de secciones histolgicas se utiliza el campo claro del microscopio. Las clulas y los componentes tisulares son similares, desde el punto de

vista ptico, y su estudio se dificulta si no se resalta sus cualidades pticas mediante la tincin. Muchos colorantes y combinaciones de stos se usan en el laboratorio de histologa debido a que pueden reaccionar de modo variable con clulas y tejidos. Algunas tinciones son especficas para ciertas clulas o componentes extracelulares o ambos; otras no lo son. Hematoxilina (H) y eosina (E) son tinciones generales que a menudo se usan juntas. Las tinciones son tiles y la informacin que se obtiene con ellas se magnifica si se comprenden bien los principios del teido. Las reacciones qumicas detalladas, de todas las tinciones no se comprenden del todo; sin embargo, se conocen muchos mecanismos de tincin y esto proporciona la ventaja adicional de entender algunas de las particularidades qumicas relacionadas con las clulas y sus componentes (Banks, 1996).

Colorantes Bsicos y cidos Muchos de los colorantes usados en histologa son sales solubles en agua que se califican como colorantes cidos o bsicos. Si el colorante que proporciona color se encuentra entre los radicales cidos, se dice que el colorante es cido. Si en cambio est entre los bsicos, se considera que es un colorante bsico. La tincin cida o bsica depende las cargas aninicas o catinicas de las protenas celulares. La carga neta de estos colorantes proviene del nmero total y de la naturaleza de sus radicales ionizables, as como del pH del entorno. Los componentes celulares bsicos reaccionan con los colorantes cidos mediante un proceso de neutralizacin, lo que origina formacin de una sal coloreada y agua. Los componentes celulares y tisulares cidos reaccionan de manera similar con los colorantes bsicos. Los componentes celulares y tisulares bsicos son acidfilos, es decir reaccionan con tintes cidos. Por otra parte, los componentes cidos son basfilos, esto es, reaccionan con tintes bsicos. Hematoxilina Y Eosina El mecanismo de tincin de la H y E ocurre por neutralizacin. El colorante bsico, la Hematoxilina, se aplica primero. Confiere un color azul a prpura a componentes cidos de las clulas, como la cromatina y algunos productos de secrecin. La Eosina, el colorante cido, se aplica en seguida; confiere color rosa plido a rojo a componentes bsicos de la clula, como el citoplasma y muchos productos extracelulares. Tincin de Romanowsky La tincin de Romanowsky modificada es una combinacin de colorantes de mucha utilidad, entre los que se destacan el azul de metileno y la Eosina. El azul de metileno se oxida y produce colorantes azur. Las combinaciones de stos (azur A, B, y C) con azul de metileno se conocen como azul de metileno policromo y tienen un amplio espectro de tincin para los componentes cidos de la clula. La eosina es el colorante cido de contraste. Esta combinacin de tintes (Romanowsky y eosina) se utiliza a menudo para teir muestras de sangre y mdula sea.

Tincin de cido Perydico de Schiff La tincin de cido perydico de Schiff (PAS) es de mucha utilidad en los estudios histolgicos. El procedimiento requiere de dos etapas sucesivas para obtener la reaccin caracterstica. La primera reaccin consiste en oxidar, por medio de cido perydico, alcoholes alfa-amino o grupos 1,2-glicol, o ambos, a aldehdos. Dichos aldehdos se exponen al reactivo de Schiff. Este ltimo contiene fucsina bsica, originalmente rojo violeta, decolorada con cido sulfuroso. La reaccin subsecuente de los aldehdos con el reactivo, produce un complejo que restituye el color magenta. La tincin de contraste suele ser la hematoxilina. Muchos carbohidratos y complejos Carbohidrato-Protena son positivos a PAS.

TCNICAS SELECTAS DE PREPARACIN La cantidad y el tipo de informacin que puede obtenerse a partir de los estudios histolgicos queda solo limitada por el enfoque elegido. Si nicamente se requiere estudiar las relaciones estructurales, la tcnica de inclusin en parafina es de utilidad suficiente. Sin embargo, muchos inconvenientes son obvios (Banks, 1996): 1. 2. 3. 4. 5. La fijacin utilizada. El calor que se necesita durante el proceso. El uso de solventes que tiene efectos sobre las clulas. La necesidad de secciones gruesas (5-7 m) para facilitar la observacin. El tiempo requerido para completar el procedimiento.

Diversos enfoques tcnicos proporcionan informacin diferente (Cubillos, 2006): Estudios Citolgicos Los estudios citolgicos constituyen una alternativa til cuando la estructura tisular es de poca importancia. Tcnicas de Congelacin La preocupacin por las alteraciones de morfologa y funcin, debidas a los mtodos de fijacin y al procesamiento subsecuente, han impulsado el desarrollo de tcnicas menos lesivas que las de uso rutinario. Tambin la reduccin del tiempo de procesamiento ha influido en ello. Las tcnicas de congelacin se desarrollaron para satisfacer stas y otras necesidades. Las secciones congeladas, como las biopsias transoperatorias, se procesan con rapidez para examinarse. La tcnica de liofilizacin consiste en congelar a temperatura de nitrgeno lquido (170C) una muestra de tejido fresco obtenida mediante biopsia, en tanto se encuentra al vacio. La sublimacin subsecuente del agua, al elevar paulatinamente la temperatura, evita el uso de fijacin, deshidratacin y aclarado. Las muestras son incluidas, cortadas y teidas. La posibilidad de efectuar estudios qumicos en tales tejidos tiene especial inters. Valiosos datos se han obtenido sobre la localizacin de actividad enzimtica. Los tejidos procesados por este mtodo han mostrado menos

artefactos que los preparados por medio de procedimientos ms convencionales de fijacin qumica. Las muestras preparadas por congelacin tienen tantas ventajas como las que se obtienen con el procedimiento antes descrito; sin embargo, el dao celular se presenta cuando se forman cristales de hielo; asimismo, el grosor de los cortes es una limitante ms. Las muestras de tejidos se congelan con rapidez a -40C y se cortan dentro de un aparato que mantiene constante la temperatura. El utensilio de corte, el criotomo, consiste en un micrtomo rotatorio que se halla en la cmara de entorno fro. Histoqumica Y Citoqumica Estas tcnicas proceden del intento de localizar e identificar sustancias qumicas dentro de clulas y tejidos intactos, que los qumicos puedan reconocer con rapidez en el tubo de ensayo. El procedimiento vara de lo sencillo a lo complejo, pero el principio bsico es simple. Si un componente qumico puede unirse con un colorante para mejorar se visualizacin, entonces es adecuado para el estudio. Lo preciso de la visualizacin y localizacin est en funcin de: 1. La especificidad de la reaccin de tincin. 2. La localizacin y estabilidad del componente en estudio. 3. El grado hasta el cual la sustancia examinada se altera con el mtodo de procesamiento. Muchas clulas y constituyentes celulares pueden ser examinados mediante tcnicas histoqumicas y citoqumicas: minerales, carbohidratos, grasas, protenas y enzimas. En general el trmino histoqumica se aplica a estudios conducidos con microscopio de luz; Citoqumica, en cambio, se utiliza respecto de estudios con microscopio electrnico. Las tcnicas de congelacin con uso de fijadores qumicos moderados o sin utilizacin de stos, se emplean para estudios enzimticos; ello, por que los fijadores qumicos de uso comn tienen sobre ella efecto desnaturalizante. Los estudios con microscopio electrnico de reacciones Citoqumica hacen necesario que el producto final de stas tenga densidad electrnica, para que pueda visualizarse y localizarse. Tcnica de Metacrilato La tcnica de inclusin en parafina es un mtodo rpido, fcil y confiable. Sin embargo, a pesar de sus ventajas tambin tiene sus desventajas. La resolucin de detalles finos no es posible en especmenes cortados que tiene 5 - 7m de grosor. Tambin, el calor y los solventes fuertes que requiere la tcnica de parafina producen cambios por artefactos celulares y tisulares. El microscopio electrnico ofrece la ventaja de una resolucin mejorada en gran medida. Esta resolucin ampliada es la suma de las caractersticas del rayo y de la facilidad para obtener cortes de especmenes en inclusiones plsticas, de aproximadamente de 40 nm o menos. Desafortunadamente, es necesario usar sustancias qumicas dainas durante la tcnica de procesado.

El metacrilato de glicol (GMA) es un medio plstico de inclusin, soluble en agua con el que evita el uso de muchos qumicos enrgicos (deshidratantes y aclarantes) y el calor requerido en las tcnicas de parafina. Asimismo, se reduce la aparicin de artefactos por el procesamiento. La tcnica de GMA puede seccionarse en un intervalo de 0.5 y 4m. Esta fineza de corte aumenta el detalle citolgico que puede observarse mediante el microscopio de luz. La fijacin en GMA es til en las tcnicas histoqumicas y citoqumicas. La determinacin de la actividad enzimtica especfica aumenta cuando se evita el uso de sustancia qumicas lesivas, y por que al eliminar o al menos reducir la exposicin al agua las sustancias hidrosolubles se retienen en clulas y tejidos. Autorradiografa Esta tcnica es til en el estudio histolgico de procesos celulares dinmicos. Las secciones de tejidos se incuban con sustancia radiactivas. Por lo general, los marcadores radiactivos son emisores de radiacin beta corta. Las secciones se cubren con una emulsin fotogrfica que es expuesta por la emisin radiactiva. La imagen latente en la emulsin fotogrfica se revela de modo rutinario. La tincin subsecuente permite visualizar los granos de plata sobre las secciones. Estas secciones pueden visualizarse con microscopio de luz o con electrnico, ello, debido a que los granos de plata son negros y tambin tienen densidad electrnica. Estos mtodos permiten una visin profunda de sntesis, secrecin y mitosis celular. Inmunohistoqumica Este procedimiento se utiliza en estudios de investigacin con microscopio de luz y electrnico para localizar e identificar sustancias potencialmente antignicas. Se prepara un extracto purificado de la sustancia que se busca. Se inyecta como antgeno (Ag) en otro animal, mismo que desarrolla una respuesta inmunitaria y produce anticuerpos (Ac). Los anticuerpos se aslan y purifican. El tratamiento subsecuente lo determina el tipo especfico de tcnicas inmunohistoqumicas que se quiera utilizar. En la tcnica directa de anticuerpos fluorescentes, un colorante fluorescente, por lo comn isotiocianato de fluorescena (FITC), se conjuga con el anticuerpo. El conjugado Ac-FITC reacciona con el espcimen. El lavado elimina el reactivo libre y slo queda el que reaccion formando un complejo Ag-Ac-FITC. El examen mediante luz ultravioleta, permite localizar al antgeno fluorescente. En la tcnica indirecta de anticuerpos fluorescentes, se requiere un paso ms para producir una antiglobulina (An) para el anticuerpo producido originalmente. El colorante fluorescente se liga a la antiglobulina. La muestra se incuba como se describi, pero esta vez la reaccin origina el complejo Ag-Ac-An-FITC. Esta tcnica tiene la ventaja de que ocasiona una reaccin de mayor intensidad y especificidad, al permitir que se formen ms conjugados. Los marcadores que es posible usar con este mtodo no se limitan a los colorantes fluorescentes. La enzima peroxidasa puede conjugarse con Ac y con An. La visualizacin de conjugados se consigue por medios de demostracin histoqumica de actividad de la peroxidasa. Es posible conjugar la ferritina con Ac y An. Esta sustancia contiene 23% de hierro, tiene densidad electrnica y, por ende, permite ser visualizada con microscopio electrnico. Las investigaciones con esta tcnica no se limitan al

estudio de antgenos caractersticos. Cualquier sustancia capaz de suscitar respuesta Ac en otro animal, puede localizarse mediante esta tcnica. Microscopia Electrnica de Transmisin La preparacin de material biolgico para microscopia electrnica, incluye procedimientos similares a los descritos en cuanto al mtodo de inclusin en parafina. La muestra debe obtenerse de modo atraumtico. Cualquier manejo descuidado o proceso de contaminacin, o bien ambos, durante esta etapa del proceso, se evidencia de inmediato por los diferentes aumentos que se utilizan. El procedimiento habitual de fijacin que se efecta a base de paraformaldehdo o glutaraldehdo, con cido smico o sin ste, debe ser excelente; a menudo esto se logra a 4C. La deshidratacin es similar a la de las preparaciones de microscopia de luz. Los aclaradores se usan de la manera descrita, para permitir la inclusin del espcimen en plstico. La inclusin en plstico, la precisin de los instrumentos de corte y el uso de navajas de diamante o vidrio, facilitan la obtencin de especmenes delgados (30-60nm de espesor). Para el libre paso de los rayos de electrones, es esencial que las secciones sean muy delgadas. Si los especmenes son delgados en extremo, la dispersin es insuficiente. Los fragmentos gruesos, en cambio, absorben electrones del rayo. Las tinciones de metales pesados (cido smico, plomo y uranio) se utilizan en el teido de constituyentes celulares y extracelulares. Estos metales pesados, que se dispersan de modo diferencial por toda la extensin de la muestra, determinan la dispersin del rayo electrnico y la formacin de la imagen. Durante el proceso de corte, a menudo se examinan secciones de tejido de 1 a 2m de espesor, con propsitos de orientacin. Estos cortes delgados son tiles para estudio histolgico. Microscopia Electrnica de Barrido Las tcnicas de preparacin para este tipo de microscopia son similares a las descritas antes para la microscopia electrnica de transmisin, solo que no se requiere seccionar ni teir los fragmentos. Los especmenes que se usan en esta tcnica presentan una superficie natural o que se prepara de modo artificial. Se obtienen, se fijan y se deshidratan por medio de secado al punto critico (para reducir distorsiones por tensin superficial) y luego se cubren con u conductor, a menudo oro, que dispersa los electrones secundarios hacia atrs a un colector. Tales fragmentos requieren tratamiento mnimo y, aun as, proporcionan visin detallada de las relaciones tridimensionales. Congelado y Fractura Esta tcnica utiliza la congelacin rpida de muestras con nitrgeno lquido (o fren) y prescinde de fijacin qumica y deshidratacin. Las muestras congeladas se montan en lminas que se colocan en un aparato especial. Las lminas se mueven ligeramente y se fractura el espcimen. Metales vaporizados desde una fuente de calor, cubren las superficies fracturadas y forman rplicas metlicas ultrafinas, mismas que se retiran de la superficie de fractura del tejido y se usan como muestras que se

examinan con microscopio electrnico de transmisin. Esta tcnica proporciona una visin de alta resolucin de la estructura de superficies reales y artificiales plasmalema, citomembranas, otros organitos, componentes de la matriz e inclusiones.

MICROSCOPIA E INTERPRETACIN Para estudiar histologa eficazmente, deben entenderse las tcnicas de preparacin y los muchos modos en que clulas y tejidos pueden examinarse. Ambos imponen o limitan, la informacin que puede obtenerse de las muestras histolgicas. La habilidad para interpretar es tambin componente esencial de la histologa (Banks, 1996). MICROSCOPIA La capacidad que el microscopio tiene para amplificar es importante para la histologa, pero la consideracin mas significativa es que permite mostrar dos puntos, muy cercanos entre si, como dos imgenes independientes. Exhibir dos objetos muy cercanos entre s como imgenes separadas, es el poder de resolucin de un lente o sistema de lentes. La resolucin se define como: R + 0.61 /AN. El poder de resolucin (R) (en angstroms) se determina por la longitud de onda ( )de la fuente de luz y la abertura numrica (AN) del lente objetivo. La abertura numrica de un lente, n seno de alfa, es el ndice de refraccin (n) multiplicado por el seno de la mitad del ngulo formado entre el espcimen y la mxima abertura del lente. Este concepto describe las propiedades de la concentracin de luz del lente. Por lo comn, un microscopio de luz usa longitudes de onda del orden de 5000 , y la abertura numrica de un buen lente de inmersin en aceite es de alrededor de 1.4. El poder de resolucin de un sistema con estos parmetros seria del orden de 2200 . Cualquier componente mas cercano entre si que 2200 no serian vistos como dos objetos separados. La aberracin esfrica, incapacidad de una superficie curva para reunir en un punto focal luz monocromtica, puede disminuir la resolucin. La aberracin cromtica, presencia de focos mltiples a travs de la refraccin diferencial de luz policromtica, tambin puede afectar de modo negativo la calidad de la imagen. En los sistemas pticos de calidad, dichas aberraciones estn corregidas en las lentes.

Microscopio de Campo Claro El microscopio de campo claro que se usa en histologa tiene limites de resolucin del orden de 2200 . Para la mxima eficacia de este tipo de microscopio se requieren secciones teidas, debido a la transparencia de los tejidos vivos. La resolucin del microscopio de campo claro puede aumentar con la adaptacin de una fuente de luz con longitud de onda ms corta. Las longitudes de ondas menores a 4000 no se transmite a travs de las lentes de vidrio. La resolucin ms refinada de estos microscopios, esta en funcin de las caractersticas de las lentes y no de la longitud de onda. Microscopio de Luz Ultravioleta

Este tipo de microscopio utiliza una fuente emisora de rayos ultravioleta con longitud de onda de entre 1000 y 3000 . La resolucin calculada para este sistema varia entre 500 y 1500 . Para permitir el paso de longitudes de onda tan pequeas al sistema ptico, se requieren lentes de cuarzo. Deben usarse tcnicas fotogrficas debido a que la radiacin ultravioleta es invisible, y lesiona la retina y a los organismos vivos. La aplicacin principal de este tipo de microscopio es la microespectrofotometra, auxiliar de los estudios histoqumicos. Microscopio de Fluorescencia Este microscopio de luz visible utiliza una fuente de luz ultravioleta. La radiacin monocromtica excita las molculas, que absorben energa de fotones y la remiten en longitudes de onda dentro el espectro visible. Para evitar que la radiacin ultravioleta que logra pasar el sistema de lentes lesione la retina del observador, se colocan filtros de barrera que impiden el paso de las ondas ms cortas. Este microscopio se usa en las tcnicas de anticuerpos fluorescentes. Microscopio de Campo Oscuro Este instrumento es una modificacin del microscopio de campo claro. El condensador usual es reemplazado por otro que desva la luz para que llegue a la imagen en ngulo oblicuo. No hay iluminacin directa que alcance el lente objetivo. La luz que llega a ste es la que se disemina en las orillas de los componentes, con ndice de refraccin diferente. Las clulas y otras estructuras tisulares se aprecian brillantes sobre fondo oscuro. Los lmites de resolucin son similares a los del microscopio de campo claro. Estos aparatos pticos permiten examinar especmenes vivos sin teir. Microscopios de Contraste de Fase y de Interferencia Se hace una descripcin de ambos debido a que la luz se usa de modo semejante. El Microscopio de contraste de fases es un microscopio de luz modificado que requiere un condensador especial (Condensador de Zernike) y una placa de fases. La alineacin de los componentes pticos se realiza con un telescopio de enfoque. Al ser transiluminados, los especmenes vivos o sin teir permiten que sus varios constituyentes transmitan la luz de fase alterada en funcin de la pequea diferencia de los ndices de refraccin y de su grosor. Esta luz de fase alterada (desviada) en accin reciproca con luz monofsica (no desvada) produce una imagen, que al crearse mediante interferencias constructivas y destructivas, se hace visible a intensidades alteradas. Los microscopios de contraste de fases convierten las diferencias de fase indetectables en diferencias de amplitudes visibles para la retina humana. Este microscopio tiene utilidad en el estudio de especmenes vivos y no teidos. Los mismos principios rigen el Microscopio de interferencia de fases de Normarski. Su nica pero ms importante ventaja es que proporciona imgenes tridimensionales de clulas y tejidos. Microscopio de Luz Polarizada

Muchas sustancias contenidas en las clulas o secretadas por estas, tienen estructura molecular ordenada. Cuando un rayo de luz polarizada pasa a travs de dichas sustancias, la luz trasmitida se divide en dos rayos perpendiculares entre s. Un rayo ordinario sigue las leyes de refraccin; el rayo extraordinario sufre un cambio de velocidad. Este fenmeno, llamado birrefringencia, es la propiedad de tener mas de un ndice de refraccin (anisotropa, A). los ndices dependen del plano en que vibran la luz polarizada en relacin con la orientacin de las molculas. Aquellas sustancias que tienen un solo ndice independiente del plano de vibracin de la luz polarizada, son isotrpicas. Este microscopio es un instrumento de campo claro al que se aaden un polarizador y un analizador, entre los cuales se halla el espcimen.se utiliza para el estudio de bandas A e I del msculo, y para estudiar la naturaleza ordenada del hueso. Microscopio Electrnico de Transmisin (MET) Los principios rectores de los sistemas pticos de luz, son los mismos que se aplican en microscopia electrnica. Los microscopios electrnicos tienen caractersticas nicas relacionadas con la naturaleza de su fuente de iluminacin el electrn. La columna masiva invertida del MET tiene una fuente de electrones, un dispositivo acelerador de stos, lentes electromagnticas para controlar los electrones, un sistema de vacio y un sistema traductor de imgenes. La fuente de iluminacin es un trodo con filamento de tungsteno caliente que es la fuente catdica de electrones. Los electrones se aceleran desde el ctodo por el elevado potencial de la placa del nodo; la rejilla (tapa del can) controla la cantidad del flujo electrnico. La longitud de onda de los electrones. La mayora de los MET modernos alcanza resoluciones valoradas en 3 a 5 , pero la naturaleza de los especmenes limita estas resoluciones a solo 20 en promedio, que representa una mejora de 110 veces con respecto a la que se obtiene con microscopio de campo claro. Las lentes electromagnticas controlan el rayo de electrones, desde las lentes condensadora, del objetivo y proyectora a una pantalla de observacin fosforescente. Los electrones se dispersan y absorben conforme pasan a travs del espcimen. El resto de los electrones del rayo alcanzan la pantalla fluorescente, lo que ocasiona emisin de luz en el espectro visible, mismas que se usa para localizar y enfocar estructuras; sin embargo, el estudio morfolgico se hace con fotografas. La formacin de imgenes en el microscopio electrnico debe producirse al vacio, debido a que el promedio del paso libre de electrones en aire es muy pequeo. El rayo d electrones pasa a travs del espcimen (<0111 ) y el metal pesado que tie los componentes dispersan los electrones. El rayo disminuido en electrones que se proyecta en la pantalla de observacin, puede considerarse la sombra del espcimen. Microscopio Electrnico de Barrido (MEB) El sistema ptico del MEB es ms simple que el del sistema MET y sus principios de operacin son diferentes. El MEB tiene una fuente de electrones (ctodo, rejilla y nodo), y lentes condensadora y del objetivo. El rayo se enfoca sobre la superficie de

un espcimen cubierto, pero aquel no es estacionario. Un generador de barrido mueve el rayo, de manera ordenada, a lo largo de la superficie del espcimen un patrn de rastrillo. El generador de barrido sincroniza el patrn de rastrillo de un tubo de rayos catdicos (TRC) con el patrn del rayo rastrillo. Los electrones se dispersan desde la superficie del espcimen hacia atrs y excitan un colector de electrones. El barrido del rayo rastrillo sincronizado con el del TRC permite un despliegue punto por punto de los electrones dispersados hacia atrs sobre el TRC. La diversidad de ngulos del espcimen determina el nmero de electrones que llega al colector. Esto da lugar a la intensidad variable de la imagen tridimensional exhibida. La ampliacin en este microscopio esta en funcin de la longitud del barrido que efecta el rastrillo de TCR, dividida entre la longitud del barrido de rayo rastrillo. El barrido del TCR es constante, pero la disminucin de longitud de barrido de rayo rastrillo, aumenta la amplificacin. El MEB no sustituye al MET, la mayor ventaja del MEB es su profundidad de campo, lo que permite exhibir imgenes tridimensionales.

INTERPRETACIN La capacidad de interpretacin implica tener conocimientos sobre las limitaciones y ventajas de las tcnicas y del microscopio que se usa. Debido a que la informacin que se obtiene con un tipo de microscopio es limitada, se puede facilitar la solucin de problemas mediante la utilizacin de varios tipos de microscopios. La comprensin de la estructura capacita para traducir disecciones bidimensionales estticas a relaciones dinmicas tridimensionales que son caractersticas de los rganos vivos (Bacha, 2000). Examen de Especmenes Muchos estudios histolgicos empiezan cuando se obtiene la muestra. El histlogo conoci el rgano de origen y probablemente aprecio su estructura macroscpica (normal o anormal). El estudio histolgico sin orientacin anatmica macroscpica ocasiona una situacin didctica artificial, en especial si el examen requiere apoyarse solo en las caractersticas microscpicas para identificar clulas, tejidos y rganos. Todos los rganos de origen conocido o desconocido deben examinarse primero sin uso de instrumentos pticos. Muchas caractersticas microscpicas se evidencian con este primer paso superficial pero eficaz. La distribucin de las propiedades de tincin (basofilia, acidofilia), la presencia o ausencia de espacios vacos (luces) y la estructura caracterstica, pueden orientar la atencin a ciertas regiones del corte. Adems, si este examen se lleva a cabo con cuidado, se limita el nmero de interpretaciones posibles. El deseo de querer observar ms pasando de inmediato a amplificaciones mayores, solo produce desorientacin. Cada paso a mayores amplificaciones disminuye el campo visual. Es preferible pasar a cada etapa de amplificacin, anotando las caractersticas especficas de cada campo. Se obtiene mayor informacin sobre una menor porcin de tejido a cada incremento de la amplificacin. Un examen puede finalizar con la lente de inmersin. A menudo, la informacin deseada sobre tejidos se obtiene sin usar dicho lente.

Color y Morfologa Si se aprende y se comprende la morfologa, el color pierde importancia. El color ayuda al aprendizaje y al estudio. Las microfotografas electrnicas, elemento importante en el estudio de la histologa, aparece en blanco y negro. Entre mas pronto se pueda encontrar apoyo en la morfologa, independientemente de las propiedades de tincin, ms pronto se entiende la histologa. Cortado y Morfologa Tres desafos se enfrentan al preparar secciones histolgicas: 1. Comprender que las porciones fijadas, procesadas, teidas y seccionadas, representan excelentes muestras de los constituyentes del cuerpo. Las relaciones estructurales y funcionales visibles en el portaobjetos, son un momento capturado de la vida de un organismo o de una parte de ste. Si la muestra es representativa. Pueden hacerse importantes inferencias sobre el organismo, sus partes constituyentes o ambos. 2. Comprobar la confiabilidad en una seccin de tejido. En realidad un corte de tejido de cualquier rgano representa todo el rgano? La respuesta es afirmativa si la muestra se obtuvo con cuidado. Deben aceptarse las muestras como representativas y entonces hay que proceder a convertirlas mentalmente en una imagen tridimensional y dinmica. 3. Convertir las secciones de dos planos en un tubo tridimensional. Los cientficos tienen buenas razones para trabajar con secciones. Estas representan un modo expedito de obtener visualizaciones importantes de las partes constituyentes y del organismo, sin examinar cada miligramo de este. La habilidad para convertir esas secciones de dos planos en un todo tridimensional es una parte importante de la histologa.

Los objetos de la vida diaria son conceptuados con facilidad. Sin embargo, en histologa a menudo es necesario poner en tercera dimensin un plano simple de una seccin, relacionado con un objeto no familiar. Un corte realizado a lo largo del eje longitudinal de una clula aplanada, proporciona informacin engaosa sobre la forma celular. En ambos se debe considerar la tercera dimensin. Resulta muy til relacionar estructuras tridimensionales con imgenes en dos dimensiones de objetos familiares. La primera rebanada perpendicular al eje longitudinal de un huevo duro, difcilmente causa sorpresa si no tiene yema. Los cortes sucesivos en un momento dado mostrarn y dejarn de mostrar la yema. La relacin tridimensional de la yema y la clara determinan la estructura de las secciones. En los cortes de tejido se encuentran situaciones similares. Aunque todas las clulas tiene ncleo, no todos los ncleos se hallan en una determinada seccin (plano) determinado tejido. Se puede tener tanta confianza en encontrar un ncleo como se tiene en encontrar yema. Es posible que se den interpretaciones equivocadas respecto de la estructura y los componentes, al seccionar un huevo. Las mismas interpretaciones errneas pueden esperarse en histologa. Las siguientes

consideraciones ayudan a disminuir tales errores de interpretacin: se debe estar familiarizado con lo que se corta, hay que aumentar el nmero de secciones y ha de tenerse confianza en el conocimiento acumulado de la histologa, en relacin con la estructura tridimensional. Los componentes tisulares de muchos rganos se disponen en diseos con rasgos variados; al cortar un limn se demuestra la apariencia de cierta rebanada de esta fruta. Las secciones de rganos tambin se ven diferentes en funcin de l plano de corte. Se debe estar consciente de las diferentes representaciones, cuando se examina una seccin. Es posible cortar algunos rganos cilndricos slidos de modo longitudinal, transversal o en sentido oblicuo. Su representacin puede compararse con la apariencia de diferentes planos de un cable coaxial. La apariencia alterada del cable, en especial en el borde oblicuo, puede dar la engaosa impresin de falta de continuidad entre los componentes. Algunas estructuras alargadas, huecas o cilndricas, pueden adoptar formas variadas al seccionarlas. Si las formas no se examinan e interpretan con cuidado, es posible obtener impresiones falsas sobre la verdadera naturaleza de dichas entidades estructurales.

(Bacha, 2000)

Artefactos Histolgicos Al procesar muestras histolgicas, se inducen cambios en clulas y tejidos. Se debe aprender a distinguir los cambios predecibles y constantes de aquellas alteraciones originadas por manejo inadecuado, por procesamiento de los especmenes (artefactos) o bien por ambas causas. El exceso de retraccin o aumento de volumen, o ambos pueden alterar los tejidos. Si la inclusin se efecta de modo incompleto, con frecuencia se produce prdida de una regin del tejido durante la obtencin de secciones. La deficiente eliminacin de colorante puede originar precipitados abundantes. Si el ngulo de la navaja es inapropiado durante la obtencin de secciones, es posible que proporcione apariencia ondulada al corte. Las partes gruesas aparecen ms densas debido a la sobreposicin de artefactos. Las navajas mal afiladas raspan los cubos de parafina al cortar las secciones; si stas no se extienden en el portaobjetos., aparecen dobleces o arrugas. La extensin excesiva de las secciones de parafina tambin puede causar distorsin de las relaciones espaciales.

TOMA Y ENVIO DE MUESTRAS PARA EL ESTUDIO PATOLGICO En todos los casos, la toma de muestras depender directamente del tipo de patologa de la que se sospecha. Es decir, para cada enfermedad sera conveniente tener un protocolo especfico de toma de muestras, ya no slo para histopatologa, sino para cada tipo de test o prueba que se precise realizar. En primer lugar es necesario considerar que estas muestras se deben fijar en formol previamente a todo procesado que se pretenda realizar. Lo ideal es fijar la muestra tan pronto como sea posible (Segals, 2003): Fijacin de las muestras Debera utilizarse formol tamponado al 10%. A nivel prctico, no obstante, es suficiente la utilizacin del formol comercial que se vende en las drogueras diluido 1:10. Lo que no se debe hacer en ningn caso con una muestra en la cual se pretenda realizar un estudio histopatolgico es congelarla (dado que se forma una cantidad muy importante de artefactos asociados a la congelacin, que tienden a enmascarar la posible existencia de lesiones). Se recomienda en todos los casos utilizar contenedores de plstico con cierre hermtico (los botes de cristal se rompen con gran facilidad durante el transporte), llenados hasta las 4/5 partes de su capacidad con formol. Es muy importante, especialmente para evitar la autolisis incluso dentro del bote de formol, que la proporcin entre el volumen de tejido fijado y el volumen de formol sea aproximadamente de 1:5 a 1:10.

Correcta fijacin de tejidos para su posterior evaluacin microscpica (izquierda) en comparacin con una fijacin deficiente (derecha).

(Segals, 2003)

Caractersticas de las muestras a tomar Depender de la enfermedad de la que se sospecha, pero en general se pueden marcar las siguientes pautas: Cerebro: Se extrae y se fija entero. Si se pretende realizar aislamiento microbiolgico, es adecuado sacar primero un hisopo de meninges o del tercer ventrculo. Si se quiere realizar un aislamiento vrico, entonces se fija slo la mitad del cerebro y la otra mitad se utiliza para el estudio virolgico. Pulmn: Se suelen recoger 3-4 muestras de diferentes partes del pulmn, tanto de la zona supuestamente lesionada como de la zona aparentemente no lesionada. Se cortan rodajas de unos 0,5 cm de ancho, y especialmente de los lbulos apicales y medios (son los lbulos donde generalmente las lesiones microscpicas son ms evidentes). Las muestras deben ser pequeas para facilitar la penetracin del formol. Corazn: Se toma una porcin de la pared ventricular derecha, izquierda y del tabique interventricular. En todos los casos, la rodaja no debe medir ms de 0,5 cm de ancho. Ndulos Linfticos: Se pueden recoger enteros, pero abiertos mediante un corte sagital para facilitar su fijacin. Estmago/Intestino: Estas son probablemente las muestras ms delicadas de tomar adecuadamente. Dado la normal presencia de una flora bacteriana en estas localizaciones (especialmente intestino), el proceso de autolisis (putrefaccin) comienza inmediatamente despus de la muerte del animal. De hecho, se considera que despus de 3 o 4 horas post-mortem, la mucosa intestinal ya se encuentra autoltica. Por tanto la muestra ideal es aqulla que procede de un animal muerto recientemente o al que el propio veterinario le ha practicado la eutanasia. Las

muestras que conviene tomar suelen ser 2 o 3 porciones de unos 4-5 cm de longitud de yeyuno, una de leon, una de ciego y 1 o 2 de colon. En todos los casos es necesaria la apertura longitudinal de la seccin intestinal recogida para poder lograr una fijacin eficiente. La no realizacin de la apertura del tracto intestinal recolectado puede suponer que igualmente se produzca la autolisis de la mucosa, aunque la muestra corresponda a un animal recientemente muerto o al que se le ha practicado la eutanasia. Otros rganos: Habitualmente se suelen tomar secciones de rganos parenquimatosos de un grosor igual o menor a 0,5 cm. En muchos casos es adecuado recoger varias porciones de un mismo rgano. En caso de rganos pequeos (casos de glndulas adrenales, ganglio trigmino, etc.) se toma el rgano entero. Envo de las muestras al laboratorio Es indispensable una correcta rotulacin del contenedor de la muestra tomada, con identificacin de granja, nmero del animal, y tipo de muestra o muestras que contiene. Adems de este tipo de informacin, tambin debe incluirse un resumen de la historia clnica, listado de las muestras remitidas, la sospecha de la problemtica y los datos de contacto del veterinario o granjero (telfono y direccin). Las muestras correctamente etiquetadas y referenciadas en botes de plstico de cierre hermtico no necesitan refrigeracin. Lgicamente, se debe incluir una referencia adecuada en el exterior del paquete. Para facilitar un diagnstico histopatolgico lo ms rpido posible, se recomienda el transporte urgente de la muestra al laboratorio de diagnstico.

Diagnstico histopatolgico Cabe recordar que el procesado de las muestras para histopatologa requiere unas 1824 horas de fijacin (tiempo que generalmente ya se consigue desde que la muestra es fijada hasta que llega al laboratorio), y aproximadamente unas 24 horas ms para la realizacin de los procesos de corte de la muestra, inclusin en parafina, corte del bloque de parafina en secciones de 4 m, y tincin con hematoxilina y eosina. Una vez realizados estos procesos, la muestra se encuentra a punto para ser examinada por el patlogo. En caso de peticin de tcnicas especiales, inmunohistoqumicas o de hibridacin in situ (para la deteccin de agentes infecciosos, generalmente), se precisa al menos entre 24 y 48 horas ms de tiempo para su consecucin. Desde un punto de vista prctico, la histopatologa es una herramienta diagnstica excelente para orientar

problemas patolgicos de difcil caracterizacin clnica y problemas de origen neurolgico. Lgicamente, tambin permite la correlacin entre la deteccin de agentes infecciosos y la existencia de lesiones asociadas. Este ltimo punto es muy importante, y cada vez ms, dado que la deteccin de un agente infeccioso no supone necesariamente que ste sea la causa de la problemtica clnica o de las lesiones macroscpicas observadas.

TOMA DE MUESTRAS PARA OTROS ANALISIS La realizacin de la necropsia incluye, en muchos casos, la toma de muestras para anlisis complementarios. Es muy importante que sta se lleve a cabo de forma correcta. Normalmente, siempre existe una toma de muestras para histopatologa que determinar las posibles lesiones histolgicas y adems, en numerosas ocasiones, ser necesario llegar a un diagnstico etiolgico para lo cual necesitaremos realizar pruebas complementarias como aislamiento microbiolgico o identificacin de virus e incluso deteccin de posibles sustancias txicas. Por tanto, la toma de muestras se efecta para poder llevar a cabo (Fernndez, 2002): Estudio histopatolgico. Estudio microbiolgico. Estudio toxicolgico. En todo caso, las muestras remitidas deben identificarse claramente y adjuntar la mayor cantidad de informacin posible de los antecedentes clnicos y hallazgos de necropsia. Estudio Histopatolgico Las muestras que se tomarn para este anlisis sern pequeas piezas de 0,5-1 cm de grosor, aproximadamente y se incluirn en formol al 10% (100 cc de formalina comercial, que se considera pura, en 900 cc de agua). Las muestras deben ser representativas de la lesin, a ser posible incluyendo zona afectada y sana, nunca de los rganos de hipstasis o de zonas de necrosis. Es muy importante que las muestras sean pequeas (2-3 cm mximo) para que el formol penetre lo ms rpidamente posible y as evitar las reacciones de autolisis. Las piezas se introducirn en un bote de boca ancha y de tamao adecuado al nmero de muestras enviadas, ya que con la fijacin en formol los tejidos aumentan de volumen. Se recomienda que el cerebro se remita entero, o en su defecto la mitad en un bote separado, con 10 veces ms cantidad de formol que su tamao. Es conveniente que el cerebro se envuelva en papel de celulosa para que se fije la zona del cerebro que contacta con las paredes del bote. Los botes debern ir adecuadamente etiquetados e identificados.

Material necesario para la toma de muestra de histopatologa

(Fernndez, 2002)

Estudio Microbiolgico Cuando existe o se establece la sospecha de una enfermedad infecciosa o parasitaria, las muestras deben tomarse en primer lugar siguiendo un orden y sistemticamente por cavidades. Los tejidos deben remitirse por separado en contenedores estriles. Esto ltimo es fundamental si hay que realizar un diagnstico microbiolgico o micolgico. No es tan importante si el proceso es de etiologa vrica, siempre y cuando no se vaya a intentar un aislamiento vrico, en cuyo caso las condiciones para la toma de muestras sern muy rigurosas en trminos de esterilidad y rapidez de obtencin una vez abierto el cadver. Otro de los puntos fundamentales para el diagnstico de enfermedades infecciosas y parasitarias son las horas transcurridas tras la muerte y el proceso de conservacin del cadver. Es una prctica habitual la congelacin del cadver en congeladores domsticos que no superan la temperatura de 20C, en el mejor de los casos. En general, en trminos microbiolgicos y virolgicos es preferible congelar, incluso en estas condiciones, siempre y cuando se realice de forma inmediata despus de la muerte del animal. Con las bacterias hay que evitar una diseminacin postmortem que disfrace el alcance y extensin de la infeccin. En el caso de las infecciones por virus, la correcta conservacin del tejido soporte hospedador evitar el envejecimiento, autolisis y la contaminacin bacteriana, lo que permitir y mejorar el uso de tcnicas de diagnstico directas como Inmunofluorescencia o PCR (polimerase chain reaction).

Placa de siembra para el diagnostico microbiolgico

(Fernndez, 2002)

Para el diagnstico laboratorial de las enfermedades parasitarias, es preferible obtener las muestras en fresco, tanto para parasitosis intestinales, como para sistmicas como por ejemplo: sistema nervioso central en neospora o citologas en leishmaniosis. Por ltimo, en las enfermedades sistmicas siempre deberemos demostrar la presencia del agente infeccioso o parasitario en diversas localizaciones orgnicas, tejidos o clulas diana. Ello deber realizarse a fin de demostrar su distribucin y poder de este modo atribuir la causa de la muerte al agente o agentes en cuestin. Si no existe orientacin sobre qu rganos son los ms implicados en la enfermedad, se puede realizar una toma de muestras bsica que incluye: trozos grandes de rganos parenquimatosos (bazo, hgado, pulmn, etc.) a fin de poder sembrar en profundidad en el caso de bacteriologa, as como un asa de intestino delgado y otra de intestino grueso ligadas por ambos extremos. Siempre se deben tomar lo ms rpidamente posible durante el transcurso de la necropsia en envases estriles individualizados (cada rgano en un envase): stos deben ir a una cmara de refrigeracin, hasta su remisin al laboratorio de referencia (con un tiempo mximo de 12 horas). Adems de la toma de muestras sealada anteriormente, tambin se pueden tomar muestras mediante hisopos estriles preferiblemente con medio de transporte para el cultivo microbiolgico de exudados nasales, conjuntivales o auditivos, orales, sangre, heces, orina, lquido articular, etc.

Material bsico para la toma de muestra de microbiologa

(Fernndez, 2002)

Estudio Toxicolgico Si el cuadro clnico o el estudio anatomopatolgico sugieren un posible caso de intoxicacin poco especfico, es aconsejable tomar muestras de contenido gastrointestinal (200 g) e hgado (100 g en formol), orina (50 ml), sangre (10 ml), humor acuoso (en su defecto un ojo entero), grasa corporal (100 g), lquido cefalorraqudeo y cerebro (la mitad fresco y la otra mitad en formol) durante la necropsia. Las muestras se remitirn acompaadas del historial, sintomatologa y lesiones observadas en la necropsia; como siempre, se proporcionar la mxima cantidad de informacin posible. Es importante considerar tres hechos a la hora de tomar muestras para toxicologa: Seleccionar las muestras adecuadas.

 Tomar las cantidades necesarias. Preservar las muestras correctamente. Para optimizar los resultados es conveniente que el envo de muestras se realice siguiendo una serie de pautas: Las muestras enviadas deben estar libres de contaminacin qumica o detritus (por ejemplo, pelos, vmitos, tierra, etc., que pueden contaminar las muestras y producir errores en los resultados). Es recomendable enviar los cadveres o muestras en fresco o en refrigeracin. Sin embargo, si fuera necesario congelar el animal o las muestras, stas deben llegar congeladas. No congelar sangre entera. El suero debe estar separado de fraccin coagulada y no hemolizado para poderse congelar. Siempre separar las muestras de distintos rganos y fluidos. Etiquetar cada muestra de forma clara. Nunca aadir sustancias para preservar las muestras salvo que exista una razn justificada. En ese caso se recomienda que se enve una muestra de dicha sustancia conservante. Remitir las muestras para anlisis qumicos de contaminantes orgnicos de baja concentracin, tales como residuos de pesticidas o PCB en contenedores de cristal, nunca en envases de plstico. En algunos casos de intoxicaciones qumicas necesitaremos muestras especficas dependiendo del compuesto qumico que sospechemos como principio activo. As, en caso de sospecha de intoxicacin por: Metales (plomo, fsforo, cobre, etc.): Orina (10 ml), rin (50 g), hgado (100 g), sangre completa (10 ml), alimento y suero (5 ml, no para el plomo). Nitratos y nitritos: Contenido gastrointestinal + cloroformo o formol (llenar el bote) y sangre (10ml). Antibiticos: Hgado (100 g), rin (completo), contenido del estmago (100 g), alimento (50 g), orina (200 g). Rodenticidas anticoagulantes (warfarina, dicumarol, etc.): Sangre completa (5 cc), alimento (100 g), hgado (100 g), contenido estmago (100 g). Cianuro: Sangre completa (10 ml), hgado (50 g), msculos esquelticos (100 g), alimento (100 g) o contenido del estmago (100 g). Etilenglicol: Suero (10 ml), contenido estmago (100 g), rin en formol y orina (10 ml). Organofosforados o insecticidas carbamatos: Alimento (100 g), contenido del estmago (50 g), sangre completa (10 ml), la mitad del cerebro. Estricnina: Hgado (100 g), rin (50 g), contenido del estmago (100 g), orina (10 ml), alimento (100 ml).