Informacin Tecnolgica Utilizacin de Residuos Forestales Lignocelulsicos para Produccin del Hongo Vol.

21(2), 13-20 (2010)

doi:10.1612/inf.tecnol.4154it.09

Varnero

Utilizacin de Residuos Forestales Lignocelulsicos para Produccin del Hongo Ostra (Pleurotus ostreatus)
Mara T. Varnero1, Madelaine S. Quiroz1 y Cristian H. lvarez2 (1) Universidad de Chile, Facultad de Ciencias Agronmicas, Casilla 1004, Santiago-Chile (e-mail: mvarnero@uchile.cl, madquiroz@gmail.com) (2) Ministerio del Trabajo y Previsin Social, Hurfanos 1273 Santiago-Chile (e-mail: transparencia@mintrab.gob.cl)

Resumen Se estudi el potencial de distintos residuos forestales como sustrato para el cultivo del hongo Pleurotus ostreatus. Para ello, se analiz la composicin qumica de estos residuos, antes y despus de la etapa de cosecha, y se midieron distintas variables fenolgicas y morfolgicas as como el rendimiento y la calidad de los cuerpos fructferos de Pleurotus ostreatus tras la cosecha. Se fijaron cuatro tratamientos: astillas de lamo, astillas de eucalipto, mezcla de paja de trigo y eucalipto, y paja de trigo como testigo. Los resultados obtenidos indicaron que todos los sustratos, principalmente paja de trigo y mezcla paja de trigo ms eucalipto son aptos para el cultivo de Pleurotus ostreatus. El nivel proteico de este hongo fue elevado en todos los sustratos y la relacin carbono/nitrgeno de los mismos disminuy despus de cosecha. Palabras clave: hongo ostra, residuos forestales, residuos lignocelulsicos, sustratos

Use of Lignocellulosic Forest Residues for Oyster Mushroom Production (Pleurotus ostreatus)
Abstract Organic waste resulting from the forest practices, containing lignocellulosic carbon sources, was used in the production of the mushroom specie Pleurotus ostreatus. For this, the chemical composition before and after harvest were analyzed, the phenological and morphological variables were determined and yield and quality of harvested fruit bodies also determined. Four treatments were performed: chips of poplars, chips of eucalyptus, a mixture of wheat straw and eucalyptus, and wheat straw as witness. The results showed that all substrates, especially wheat straw and wheat straw with eucalyptus, are suitable for the production of Pleurotus ostreatus. This species showed a high protein level in all the studied substrates, and the ratio carbon/nitrogen decreased after harvest. Keywords: oyster mushroom, forest residues, lignocellulosic wastes, substrates Informacin Tecnolgica Vol. - 21 N 2 - 2010 13

Utilizacin de Residuos Forestales Lignocelulsicos para Produccin del Hongo INTRODUCCIN

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En los ltimos aos los principales pases productores de madera han centrado su inters en la bsqueda de alternativas para la gestin y la utilizacin de los residuos derivados de las actividades forestales. Las alternativas de aprovechamiento implementadas hasta el momento se han enfocado fundamentalmente hacia su recuperacin energtica (Cerda, 1998). Sin embargo, considerando su alto contenido en fuentes de carbono lignocelulsicas (Bonatti et al., 2004), resultara interesante explorar las posibilidades de uso de estos residuos como sustrato para el cultivo y produccin de hongos comestibles. La crisis energtica, el deterioro del medio ambiente y el acusado crecimiento demogrfico ponen de manifiesto la importancia de producir alimentos proteicos de calidad, siempre que su produccin no ocasione un riesgo contaminante. Los hongos comestibles constituyen una importante fuente de alimento, y algunos pases en vas de desarrollo como Chile los consideran una alternativa novedosa para la obtencin de alimentos de bajo costo. Pleurotus ostreatus es la tercera seta de mayor comercializacin a nivel internacional y la segunda a nivel nacional, estimndose un mercado en crecimiento para los prximos aos, debido, en parte, a que su cultivo se desarrolla mayoritariamente en paja de trigo, residuo que se encuentra disponible en el centro y sur del pas (Medina y Cisterna, 2002) . Por otra parte, la utilizacin de residuos de origen maderero como sustrato para el cultivo de este hongo tambin ayuda al aprovechamiento de productos del bosque nativo (Orensanz y Navarro, 1979). P. ostreatus es un hongo ligncola saprfito, conocido con el nombre comn de hongo ostra. Pertenece a la clase Basidiomicetes, orden Agaricales, familia Agaricacea (Donoso y Aguirre, 1980; Furci, 2007). En condiciones silvestres crece en tocones y ramas de planifolios muertos o debilitados, en bosques de rivera, parques y jardines (Alpuche y Paredes, 1996). Su desarrollo ocurre durante la estacin otoal e inicio de primavera, aunque en sitios hmedos tambin es posible encontrarlo en otras estaciones del ao. Esta especie presenta gran versatilidad y adaptabilidad, ya que tolera un rango amplio de temperaturas; adems, presenta resistencia a plagas y enfermedades, y se puede cultivar prcticamente sobre cualquier sustrato lignocelulsico como troncos, corteza o aserrn (Garca, 1987; Levin, 1996; Adamovic et al., 1998; Yildiz et al., 2002). En Chile, esta especie se encuentra en los bosques de la zona centro sur, sobre tocones de sauces, lamos y castaos (INFOR y Fundacin Chile, 2008). La composicin qumica de P. ostreatus es muy variable y depende del estado de desarrollo y la cepa utilizada; la variabilidad es ocasionada por diferencias en el contenido de humedad, temperatura y la presencia de nutrientes. Esta especie constituye un alimento altamente proteico, posee un elevado contenido de vitaminas (Tiamina (B1), Riboflavina (B2), Piridoxina (B6) y Cobalamina (B12)); y acta como una fuente importante de calcio y fsforo (Breene, 1990). Adems de su valor nutritivo, P. ostreatus posee enzimas especficas capaces de degradar lignina, fenoles y polifenoles hasta un 60% del contenido original, por lo que es una de las especies ms utilizadas en la investigacin de residuos aptos para su cultivo (Espinoza, 1997). Normalmente, el cultivo de Pleurotus se realiza sobre sustratos preparados con paja de cereales, como trigo, centeno o cebada, cortados en trozos de 2 a 4 cm de longitud. A modo de ejemplo, se ha observado una produccin de 100 a 200 kg por tonelada de paja de trigo (Garca, 1987). Yildiz et al (2002) y Salmones et al. (2005), tambin observaron una elevada produccin de P. ostreatus en residuos derivados de actividades agroindustriales, como pulpa de caf, hojas usadas en la extraccin de aceites esenciales y bagazo de caa de azcar. El objetivo de este estudio fue evaluar el potencial de distintos residuos forestales como sustrato para el cultivo de este hongo. Se analiz la composicin qumica de los residuos antes y despus de la etapa de cosecha, y se determinaron las propiedades fenolgicas, morfolgicas, rendimiento y calidad de los cuerpos fructferos de P. ostreatus tras la cosecha. MATERIALES Y MTODO Preparacin del inculo El hongo P. ostreatus se obtuvo de troncos muertos de lamo (Populus sp.), en la localidad de Santa Cruz, ubicada a 40 Km de la ciudad de San Fernando, Chile. El micelio se propag en placas Petri 14 Informacin Tecnolgica Vol. - 21 N 2 - 2010

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colocando 1 g de micelio en 5 ml de agar papa dextrosa y se inocul en un medio de cultivo elaborado con granos de trigo previamente esterilizados en frascos de vidrio de 250 g. Sustratos empleados para el cultivo de P. ostreatus Se utilizaron los siguientes residuos lignocelulsicos: paja de trigo (Triticum aestivum L.), astillas de eucalipto (Eucalytus globulus); y astillas de lamo (Populus nigra), las cuales presentaron una longitud aproximada de 2 cm. Previo a la inoculacin de Pleurotus ostreatus, estos sustratos se sumergieron en agua a 70C durante 60 minutos. Se establecieron los siguientes tratamientos experimentales con cinco rplicas por cada tratamiento (Tabla 1): Tabla 1: Tratamientos usados para la evaluacin del cultivo de Pleurotus ostreatus Tratamientos
T1 T2 T3 T4 1 kg paja de trigo + 50 g de grano invadido con micelio. 1 kg astillas de eucalipto + 50 g de grano invadido con micelio. 150 g paja de trigo + 850 g astillas de eucalipto + 50 g de grano invadido con micelio. 1 kg astilla de lamo + 50 g de grano invadido con micelio.

Siembra e incubacin Los sustratos se inocularon con 5% de micelio del hongo crecido en granos de trigo previamente hidratados y esterilizados. La siembra se hizo en bolsas plsticas, las cuales se perforaron para promover una condicin de semi-anaerobiosis requerida en la fase inicial de invasin del micelio, y los tratamientos se incubaron a 25C con baja luminosidad (inferior a 100 lux). Una vez producida la invasin total del micelio en los sustratos (25 a 30 das), las bolsas se dejaron a temperatura ambiente (15C aproximadamente) y luminosidad normal (200 lux) durante 12 das; de este modo se consigui estimular la brotacin del hongo exponiendo los sustratos a un golpe de fro. Dado que esta fase es aerbica, se retiraron las bolsas plsticas, lo que permiti mantener la forma inicial del recipiente conformando una torre. Los sustratos se regaron peridicamente para mantener una humedad cercana al 70%. Etapa de cosecha La cosecha de los cuerpos fructferos se realiz cuando los sombreros alcanzaron 3 cm de dimetro en los ejemplares menores y antes que los ejemplares mayores cambiaran su forma convexa a cncava. Los racimos se arrancaron por completo para evitar infecciones. El perodo de cosecha concluy despus de 30 das, una vez realizada la cosecha del ltimo racimo, sin la aparicin de nuevos primordios. Anlisis Se midieron variables qumicas de los sustratos al inicio y trmino del ensayo (TMECC, 2002): contenido de humedad, pH, materia orgnica, nitrgeno (N), fsforo (P) y potasio (K) total y relacin carbono/nitrgeno (C/N). Se determinaron variables fenolgicas y morfolgicas de Pleurotus ostreatus, as como rendimiento y calidad de los hongos. Se determin la eficiencia biolgica (EB), como porcentaje de produccin de hongos peso fresco con relacin a peso seco de sustrato (Mandeel et al., 2005). El contenido proteico se determin desde el contenido de nitrgeno total medido en los hongos, usando el factor 4,38 (Breene, 1990). Anlisis estadstico El diseo experimental correspondi a bloques completos al azar con cinco rplicas por tratamiento. La unidad experimental correspondi a una torre, forma que adquiere el sustrato contenido en la bolsa de plstico. Los datos se analizaron mediante un anlisis de varianza o ANDEVA (P=0,05), y Informacin Tecnolgica Vol. - 21 N 2 - 2010 15

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las diferencias entre tratamientos se determinaron utilizando el test de comparaciones mltiples de Duncan (P=0,05). RESULTADOS Y DISCUSIN Composicin qumica de los sustratos utilizados para el cultivo de P. ostreatus En la etapa de precosecha, se observaron diferencias significativas entre tratamientos con respecto al contenido de NT, PT, KT (Tabla 2, ANDEVA P = 0,05). Los resultados del test de Duncan indican que el contenido de estos nutrientes fue significativamente mayor en el tratamiento de paja de trigo, evidencindose tambin, su aporte nitrogenado a la mezcla paja-eucalipto. Por otra parte, los valores nutricionales ms bajos se registraron en los tratamientos de eucalipto y lamo, los cuales contienen altos niveles de fracciones lignocellusicas, lo que podra explicar los menores valores promedios de NT presentados (0,6 g y 0,46 g respectivamente). En la etapa de post cosecha, el tratamiento paja de trigo tambin present los valores ms altos (Tabla 3). Al comparar ambas etapas, se observ un aumento en el contenido de NT de todos los sustratos y una reduccin en la concentracin de KT. Tabla 2: Variables qumicas de los sustratos en pre cosecha utilizados en el ensayo (valores promedios en base masa seca). Letras minsculas diferentes indican diferencias estadsticamente significativas entre tratamientos con un P=0,05. * indica diferencias estadsticamente significativas entre precosecha y post cosecha con un P=0,05. Sustratos Precosecha Paja de Trigo Eucalipto Paja - Eucalipto lamo NT PT KT MO C/N pH g/kg g/kg g/kg g/kg 3,64 a* 0,11 a 1,82 a* 920 d* 147 d* 4,4 b 0,60 c* 0,02 c* 0,15 d* 994 a 1009 b* 3,7 c* 1,06 b* 0,03 b 0,40 b* 983 bc 545 c* 3,8 c 0,46 c* 0,01 d 0,29 c* 986 b 1277 a* 5,5 a*

Tabla 3: Variables qumicas de los sustratos en post cosecha utilizados en el ensayo (valores promedios en base masa seca). Letras minsculas diferentes indican diferencias estadsticamente significativas entre tratamientos con un P=0,05. * indica diferencias estadsticamente significativas entre precosecha y post cosecha con un P=0,05. Sustratos Postcosecha Paja de Trigo Eucalipto Paja - Eucalipto lamo NT g/kg 6,86a* 0,84c* 1,68b* 0,84c* PT g/kg 0,13 a 0,01 c* 0,03 b 0,02 c KT g/kg 0,96 a* 0,03 c* 0,06 bc* 0,07 b* MO g/kg 893 c* 991 a 922abc 985 ab C/N 77*d 692ab* 325 c* 751 a* pH 5,3a 3,5 d* 4,0 bc 5,1ab*

En precosecha, respecto al contenido de materia orgnica, el sustrato de eucalipto present el mayor valor, presentando diferencias significativas con los sustratos de lamo y paja de trigo; por el contrario, este ltimo present el menor valor de contenido de MO y se observaron diferencias estadsticas significativas con el sustrato paja de trigo-eucalipto (Tabla 2). En post cosecha estas diferencias no fueron concluyentes, observndose diferencias estadsticas significativas slo en los sustratos eucalipto y paja de trigo (Tabla 3). Al comparar los valores entre tratamientos en pre y post cosecha se observ que todos los sustratos presentaron una disminucin del contenido de MO al final del ensayo, pero slo present diferencias estadsticamente significativas el sustrato con paja de trigo. En cuanto a la relacin C/N, en precosecha, se apreciaron diferencias estadsticas significativas entre todos los tratamientos (Tabla 2), presentando el valor ms alto el sustrato compuesto por lamo, lo cual puede atribuirse al mayor contenido de fracciones lignocelulsicas de este residuo, siendo el sustrato con paja de trigo el que present el menor valor de relacin C/N. Igual tendencia se observ 16 Informacin Tecnolgica Vol. - 21 N 2 - 2010

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en post cosecha (Tabla 3). Al comparar ambas etapas, se observ una disminucin de la relacin C/N en todos los tratamientos existiendo diferencias estadsticas significativas para cada tratamiento en pre y post cosecha. Este resultado se explicara por el incremento relativo de NT en los distintos sustratos, como consecuencia de la disminucin del contenido de carbono en forma de desprendimiento de dixido de carbono (CO2). Esto ltimo, estara asociado a la actividad microbiolgica desarrollada en el interior de los sustratos y, principalmente, por el uso de fuentes de carbono presentes en stos para el desarrollo y produccin de hongos. Los valores de pH observados en precosecha (Tabla 2), fluctuaron en el rango de pH cido observndose diferencias significativas entre sustratos, presentando el sustrato eucalipto el menor valor. Similar tendencia se observ en la etapa de post cosecha. (Tabla 3). Al comparar los pares de sustratos en ambas etapas, slo se observaron diferencias estadsticas significativas con lamo y eucalipto. Descripcin de las variables fenolgicas y morfolgicas de P. ostreatus Las variables fenolgicas de P. ostreatus, medidas en los diferentes sustratos (Tabla 4), sealan que en el perodo de Siembra-Primordio, el sustrato paja de trigo requiri el mayor nmero de das para desarrollar primordios, presentando diferencias estadsticas significativas respecto de los dems tratamientos, en cambio los sustrato eucalipto y lamo presentaron el menor tiempo en el desarrollo de primordios, lo cual podra explicarse por la forma de propagacin del micelio. En el caso del sustrato con lamo la invasin del micelio fue parcial, concentrndose en la base de la torre y en eucalipto present mayor desarrollo en la parte media y superior de esta. En cambio, en el sustrato paja de trigo y mezcla paja de trigo-eucalipto, la invasin fue prcticamente total, de este modo el tiempo de propagacin fue mayor producindose un retraso en la emergencia de primordios. En el perodo de Primordio-Cosecha (Tabla 4), el sustrato eucalipto present mayor tiempo de inicio de cosecha existiendo diferencias estadsticas significativas con los otros tratamientos, en cambio el sustrato lamo present menor tiempo para el inicio de cosecha. Posiblemente estos resultados estaran relacionados con las caractersticas bioqumicas de los distintos sustratos, que podran hacer variar el perodo Primordio-Cosecha, permitiendo una disminucin en este perodo en algunos casos. Tabla 4: Variables fenolgicas de P. ostreatus. Letras minsculas diferentes indican diferencias estadsticamente significativas entre tratamientos en cada perodo, P = 0,05. Tratamientos Paja de trigo Eucalipto Paja-Eucalipto lamo Valores promedios para cada perodo fenolgico (das) Siembra Primordio Perodo de Siembra Final de Primordio Cosecha cosecha Cosecha 69,0 a 10,4 c 25,2 a 104,6 a 41,4 c 14,8 a 15,0 c 71,2 c 51,4 b 13,6 b 20,6 b 85,6 b 39,2 c 7,0 d 8,6 d 54, 8 d

El sustrato paja de trigo present el mayor periodo de cosecha (Tabla 4), y el menor periodo lo present el sustrato lamo. Estos resultados podran explicarse debido a la forma de invasin del micelio, as en sustratos con mayor propagacin del hongo, se favorecera la obtencin de cosechas prolongadas, lo cual estara asociado al rendimiento final del cultivo. Orensanz y Navarro (1979), sealan que aquellas maderas con mayor densidad presentan mayores perodos de cosecha que maderas con menor densidad. En este caso, al comparar el perodo de cosecha de los sustratos de eucalipto y lamo, se observ esta situacin, ya que la madera de eucalipto presenta mayor densidad que la madera de lamo. Los sustratos en base a cereales, han sido habitualmente utilizados por sus altos rendimientos y segn lo reportado por Garca, 1987, aquel sustrato elaborado en base a paja de trigo presentara los mayores rendimientos para el hongo, lo cual coincide con los resultados obtenidos en este trabajo. Por otra parte, se observa que el perodo de cosecha de la mezcla paja de trigo-eucalipto presenta Informacin Tecnolgica Vol. - 21 N 2 - 2010 17

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mayor duracin que el sustrato eucalipto, lo cual podra atribuirse a la proporcin incorporada de paja de trigo, la que aumentara el periodo de cosecha en la mezcla paja de trigo-eucalipto. Esta situacin se verifica cuando se analiza el perodo de Siembra-Final de Cosecha (Tabla 4), donde se apreciaron diferencias estadsticamente significativas entre todos los sustratos. El perodo de mayor duracin lo present el sustrato paja de trigo, seguido de la mezcla paja de trigo-eucalipto, eucalipto y, finalmente lamo. Por lo que se ha establecido una relacin entre la duracin del perodo Siembra-Final de Cosecha y el rendimiento. La forma y color de los hongos resultaron similares para todos los sustratos. Sin embargo, la consistencia fue superior en los sustratos con mayor rendimiento. Los sustratos paja de trigo y mezcla paja de trigo-eucalipto produjeron el mayor nmero de hongos (Tabla 5) y el menor nmero se observ en el sustrato lamo. Una situacin similar ocurri con el nmero de racimos, lo cual se podra atribuir a la forma de invasin del micelio en la torre, como se mencion anteriormente. As, una mayor cantidad de racimos se podra atribuir al mayor desarrollo o propagacin del micelio en los sustratos. Finalmente, respecto al nmero de hongos por racimo el sustrato paja de trigo present un equilibrio entre la cantidad de hongos y sus correspondientes racimos, existiendo diferencias estadsticas significativas con los dems tratamientos. Tabla 5: Variables morfolgicas de P. ostreatus. Letras minsculas diferentes indican diferencias estadsticamente significativas entre tratamientos P = 0,05. Tratamientos Paja de Trigo Eucalipto Paja/Eucalipto lamo Nmero de hongos 18,2 a 10,2 bc 15,2 ab 3,4 d Nmero de racimos 5,2 ab 4,6 bc 6,8 a 2,8 d Nmero de hongos/racimo 3,4 a 2,2 b 2,3 b 1,2 c

Rendimiento de la produccin de P. ostreatus Se encontr que en la variable Peso Fresco Unitario de hongo en el cultivo (Tabla 6), no existieron diferencias estadsticamente significativas entre tratamientos, a pesar que en el sustrato paja de trigo se produjeron los hongos con mayor peso unitario. Lo anterior podra atribuirse a un factor gentico de P. ostreatus, donde independientemente del sustrato utilizado para su cultivo, una vez que el hongo se desarrolla, su peso fresco no presentara mayores variaciones. Similar situacin se observ en el Peso Fresco Racimo, lo cual se explicara por el mayor nmero de hongos que se obtiene en cada racimo, ms que por el peso unitario de los hongos. Al considerar el rendimiento del cultivo en trminos de %EB (Tabla 6), el mayor rendimiento se obtuvo en el sustrato paja de trigo existiendo diferencias significativas con los dems tratamientos. En cuanto al contenido de nitrgeno total y el nivel proteico de los hongos, obtenido en los diferentes sustratos, se aprecian valores similares y sin diferencias estadsticas significativas. Sin embargo, estos valores son superiores a los reportados por Bonatti et al., (2004) para P. ostreatus cultivados en sustratos de paja de arroz y de pltanos. Tabla 6:. Variables de rendimiento de P. ostreatus. Letras minsculas diferentes indican diferencias estadsticamente significativas entre tratamientos con un P = 0,05. Tratamientos Peso fresco/unitario (g) 18,1 a 4,2 a 9,8 a 8,7 a Peso fresco/racimo (g) 55,1 a 8,6 bc 22 b 15,3 bc EB (%) NT (peso seco) (%) 5,85a 5,80a 5,57a 5,22a Protena total (peso seco) (%) 25,6a 25,4a 24,4a 22,9a

Paja de trigo Eucalipto Paja/Eucalipto lamo 18

32,94a 4,23c 14,93b 2,97c

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Utilizacin de Residuos Forestales Lignocelulsicos para Produccin del Hongo CONCLUSIONES

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La produccin o cultivo de P. ostreatus, sobre residuos lignocelulsicos es factible, constituyendo un proceso de bioconversin eficiente, el que se ve reflejado en el alto nivel proteico de las setas obtenidas en todos los tratamientos, y adems, en la calidad de todos los sustratos utilizados para el cultivo, los cuales presentaron una disminucin de la relacin C/N una vez concluido el ensayo. Estos materiales orgnicos podran utilizarse como sustrato en producciones posteriores de P. ostreatus, incorporarse al suelo como acondicionador y/o mejorador de las propiedades fsicas, o bien, constituir parte de mezclas elaboradas en la produccin de sustratos para viveros. REFERENCIAS Adamovic, M., G. y otros seis autores. The biodegradation of wheat straw by Pleurotus ostreatus mushrooms and its use in cattle feeding. Animal Feed Science and Technology: 3-4 (71), 357-362 (1998) Alpuche, G. y O. Paredes; Potencial en la biotecnologa para la produccin de hongos comestibles empleando desperdicios agrcolas. Acta Universitaria: Mxico, 1(4), 1-15 (1996.) Bonatti, M., P. Karnopp, H.M. Soares y S.A. Furlan; Evaluation of Pleurotus ostreatus and Pleurotus sajor-caju nutricional characteristic when cultivated in different lignocelululosic wastes. Food Chemistry: 88, 425-428 (2004). Breene, W.M.; Nutritional and medicinal value of specialty mushrooms. Journal of Food Protection: 10(53), 883-894 (1990). Cerda I.; Trayectoria del sector forestal chileno: Sus logros y desafos. Instituto Forestal. Santiago, Chile, 3-91 (1998). Donoso, J. y J. Aguirre; Cultivo de hongos comestibles lignvoros. Corporacin de Fomento. Gerencia de Desarrollo, 4-70 (1980). Espinoza, R.M.; Podra utilizarse la celulosa de paales desechables para el cultivo de hongos comestibles. Vida Universitaria: Azcapotzalco, Mxico: 12, 1-2 (1997) Furci G.; Fungi Austral: Gua de campo de los hongos ms vistosos de Chile. Ed. Corporacin Chilena de la Madera. Concepcin, Chile, 1-200 (2007). Garca M.; Cultivo de setas y trufas. Editorial Mundi. Madrid, Espaa, 2-255 (1987) INFOR y Fundacin Chile. Productos forestales no madereros (2008). http://www.gestionforestal.cl:81/pfnm/index.htm. Acceso: 3 de marzo 2008. Disponible en:

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