BOTANICA

Acta Cientca Venezolana, 51: 7883, 2000

ESTUDIOS ANATOMICOS Y MORFOLOGICOS DE LA INICIACION DE EMBRIONES SOMATICOS OBTENIDOS A PARTIR DE APICES MERISTEMATICOS DE Musa sp.
Mara del Carmen Vidal, Teresa Edith Vargas y Eva de Garca Centro de Botnica Tropical, Facultad de Ciencias, Universidad Central de Venezuela, Apartado 47114, Los Chaguaramos 10490, Caracas, Venezuela.

Recibido: 13/07/99 ; Revisado: 01/12/99 ; Aceptado: 08/02/00

RESUMEN: El origen de embriones somticos obtenidos de pices meristemticos del clon de Musa (AAA) Gran enano, fue analizado mediante estudios histolgicos y morfolgicos durante las diferentes fases de desarrollo del proceso. La investigacin revel que los embriones somticos se originaron directamente de clulas del parnquima perivascular de las hojas. Secciones histolgicas de los embriones globulares mostraron una disposicin radial de las clulas y la presencia de una epidermis que rodea completamente al embrin. Con la adicin de citocinina (Z o BA), algunos embriones permanecieron en estado globular, con ligeros signos de agrandamiento sin un posterior desarrollo de la invaginacin. Otros lograron alcanzar el estado de embrin globular con invaginacin; otros el estado alargado, con una clara diferenciacin entre el extremo apical y basal y con tejidos fotosintticamente activos, pero no se logr la regeneracin de plantas completas. Tratamientos adicionales, como es el someter a los embriones a un "shock osmtico" o la adicin de GA , fueron tambin probados sin xito. Al presente, no tenemos una explicacin para la no regeneracin de las plantas, por lo tanto sugerimos que se deben realizar experimentos adicionales, como lo son estudios histolgicos y bioqumicos en estados tempranos, intermedios y tardos de la embriognesis somtica, para tratar de entender en que momento y porque, son interrumpidos los procesos siolgicos normales del desarrollo del embrin. Palabras clave: Anatoma, morfologa, histologa, ontogenia, embriognesis somtica, Musa sp., banano.

ANATOMIC AND MORPHOLOGICAL STUDIES ON THE INITIATION OF SOMATIC EMBRYOS OBTAINED FROM MERISTEMATIC APEXES OF Musa sp.
ABSTRACT: The origin of somatic embryos obtained from meristematic apexes of the Musa (AAA) clone "Gran enano" was analyzed through histological and morphological studies during the various development phases of the process. The research point out that somatic embryos developed directly from perivascular parenchyma cells of the leaves. Histological sections of globular embryos showed a radial disposition of cell and the existence of an epidermal layer that surrounds the embryo completely. When citocinine (Z or BA) was added, some embryos remained in globular stage with mild signs of enlargement but with no later development of invagination. Others embryos reached the invagination stage; and some reached the enlargement stage with active photosynthetic tissues. Howevere there were no to generation of complete plant regardless of additional treatment, such as "osmotic shock" or the additions of GA . At present do not have an explanations for this results. Therefore, additional experiment should be in early, intermediate and later stages of somatic embryogenesis, in order to understand the mechanisms underlying the lack of development of plants from somatics embryos. Key Words: Anatomy, morphology, histology, ontogeny, somatic embryogenesis, Musa sp., banana.

INTRODUCCION El creciente inters por la obtencin de embriones somticos en diversos cultivos de plantas, se debe a que el proceso de embriognesis somtica facilita dos aspectos importantes en el mejoramiento gentico de los cultivos: la propagacin clonal a gran escala, va "semilla articial" y la variabilidad gentica, va variacin somaclonal. En un mismo proceso, se puede asegurar la estabilidad gentica de un cultivo (embriognesis directa) o inducir su cambio (embriognesis indirecta), con el objeto de obtener nuevas variedades. En Musa, los mtodos de cultivo de tejidos ofrecen una alternativa a los sistemas de entrecruzamiento clsicos, los cuales han sido, hasta ahora, poco exitosos . No obstante, la regeneracin de plantas completas a partir del cultivo de embriones somticos, ha constituido un paso limitante en la aplicacin de tcnicas biotecnolgicas para el mejoramiento de clones de banano con importancia econmica . Varios autores han realizados esfuerzos para obtener embriones somticos

de Musa, ya sea a partir de tejido vegetativo como son: la base de las hojas , la parte superior de las yemas en proliferacin , segmentos de cormos , y de tejido reproductivo: ores masculinas ; embriones cigticos inmaduros , y semillas inmaduras . En varios de estos trabajos, se ha logrado la regeneracin de plantas completas va embriognesis somtica, siguiendo un patrn que muestra una gran similitud con la embriognesis cigtica. Sin embargo, la obtencin de embriones somticos a partir de embriones cigticos y semillas inmaduras presenta una limitacin en los esquemas de mejoramiento, ya que solo se puede aplicar a especies silvestres de Musa y no a los cultivares econmicamente importantes, los cuales, por su condicin partenocrpica, carecen de semillas. Adicionalmente, en los clones de Musa sp. que se ha logrado regenerar plantas a partir de embriones somticos, la frecuencia de conversin (proceso de obtencin de plantas a partir de embriones) es baja y depende del genotipo. Hasta ahora, no se ha reportado una descripcin del ori-

Anatoma y morfologa de la embriognesis somtica en Musa sp. Tabla 1. Composicin de medios usados para la regeneracin de plantas va embriognesis somtica directa del clon de Musa (AAA) Gran enano.
Composicin Sacarosa Mioinositol 2,4-D BA Z GA Gelrite del medio de: (gl ) (mgl ) ( M) ( M) ( M) (mgl ) (gl ) Iniciacin Maduracin Germinacin: G1 G2 G3 G4 G5 G6 30 30 40 40 40 40 40 80 5 100 100 100 100 100 100 100 1 1 10 1 0.1 1 2 2 2 2 2 2 1

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(2,4-D) y 1 M zeatina (Z). El pH de los medios fue ajustado a 5.8. Los cultivos se mantuvieron bajo agitacin constante a 100 r.p.m., una temperatura de 27 C y luz continua, con una intensidad de 50 Em seg . Cada 2 3 semanas, se decantaba el medio viejo y se agregaba el medio fresco, hasta la obtencin de los embriones somticos. Para la maduracin de los embriones somticos, estos fueron transferidos a un medio lquido igual al medio de induccin, pero con la sustitucin de 2,4-D por citocinina. Las citocinina usada fue 6-bencilaminopurina (BA) a una concentracin de 1 M. La sacarosa se us a una concentracin de 30 g/l. El pH de los medios fue ajustado a 5.8. Para la germinacin de los embriones, estos fueron transferidos a un medio slido (2 g/l gelrite) igual en composicin al medio de maduracin, pero vari el tipo (citocinina o giberelina) y concentracin de los reguladores de crecimiento usados. Las citocininas utilizadas fueron BA (1 M 10 M) y zeatina (1 M). La giberelina usada fue el cido giberlico (GA ) a una concentracin de 0.1 mg/l. La sacarosa fue usada a una concentracin de 40 y 80 g/l. El pH de los medios se ajust a 5.8. La composicin de los medios utilizados y los seis tratamientos para la induccin de la germinacin de los embriones somticos (G1, G2, G3, G4, G5, y G6) se indican en la Tabla 1. Se realizaron 3 rplicas por tratamiento, usando 20 embriones globulares en cada rplica. A estos embriones se les hizo un seguimiento durante la fase conversin de embriones en estado globular hasta alcanzar la fase de embrin alargado.

Abreviaturas: 2,4-D (2,4 Diclorofenoxiactico), BA (6-Belcilaminopurina), Z (Zeatina), GA (Acido giberlico)

gen y desarrollo de embriones somticos de Musa sp. a partir del cultivo de pices meristemticos en medio lquido. Un estudio ontognico de la embriognesis somtica, en el que se determine cuales tejidos en particular se derivan en meristemas embriognicos o en que estados posteriores de desarrollo se detiene el proceso, podra suministrar informacin adicional para aumentar o manipular la respuesta embriognica. El objetivo del presente trabajo fue investigar la ontogenia y estados de desarrollo de embriones somticos de un clon de Musa (AAA) Gran enano, obtenidos a partir del cultivo de pices meristemticos en medio lquido. MATERIALES Y METODOS Material vegetal Para establecer el proceso de embriognesis somtica directa en Musa sp., se utilizaron vitroplantas del clon Gran enano, un clon triploide (AAA) del sub-grupo Cavendish. Las vitroplantas fueron seleccionadas del banco de germoplasma del Laboratorio de Biotecnologa Vegetal de la Facultad de Ciencias, U.C.V. Induccin de la Embriognesis somtica En la iniciacin del proceso de embriognesis somtica del clon Gran enano, se seleccion el mtodo de Dheda y col. , con las siguientes modicaciones: la induccin de embriones somticos se inici a partir de pices meristemticos de aproximadamente 1 cm , con 3 a 4 primordios foliares y un peso promedio de 0.43 g. Los pices fueron seccionados por la mitad antes de sembrarlos en el medio de cultivo. Los pices meristemticos (dos pices por ola) fueron colocados en una ola de 250 ml que contenan 50 ml de medio Murashige & Skoog (MS) lquido con las siguientes modicaciones: macroelementos y hierro reducidos a la mitad, con la adicin de 0.4 mg/l tiamina, 50 mg/l cido ascrbico, 30 g/l sacarosa, 5 M 2,4 diclorofenoxiactico

Estudios anatmicos Para evaluar los eventos histolgicos del proceso de embriognesis somtica en el clon de banano Gran enano, se emplearon pices meristemticos jados a diferentes tiempos de cultivo (0, 15, 30 y 45 das). La jacin se realiz en FAA (37% formaldehdo: 100% cido actico: 70% etanol, en una proporcin 5:5:90). El material preservado en FAA se deshidrat en una serie alcohlica ascendente, con las siguientes proporciones de agua destilada, etanol y alcohol butlico terciario (ABT): 50% (50:40:10), 70% (30:50:20), 85% (15:50:35), 95% (0:45:55), 100% (0:25:75), ABT (0:0:100). Posteriormente, el material se inltr en paraplast fundido y ABT, mantenindolo en la estufa a 60 C por dos o tres das hasta que no quedaran restos de ABT. Luego se hicieron cortes seriados a un grosor de 10-12m utilizando un microtomo de rotacin, y nalmente se realiz una coloracin con safranina al 0.5% y fast-green al 0.1%, diferenciando la coloracin con una solucin de cido pcrico (en etanol al 95%). Las secciones de los distintos tejidos fueron registradas microfotogrcamente con una cmara Nikon FDX-35.

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Figura 1. Corte longitudinal de secciones de primordios foliares del clon de Musa (AAA) Gran enano, luego de cultivarlos en medio de induccin de la embriognesis somtica directa. a) Clulas meristemticas (CM) y proembriones esfricos (PE) en la regin del parnquima adyacente a los haces vasculares (HV). b) Proembriones esfricos con una disposicin radial de las clulas internas y rodeados por una epidermis continua.

Anlisis estadstico Los resultados obtenidos en este estudio fueron analizados estadsticamente, mediante la prueba paramtrica ANOVAR, con el n de determinar el grado de signicancia entre los tratamientos aplicados. Los datos porcentuales fueron analizados luego de hacer una conversin angular [arcosen (%/100)] ya que con los datos originales no se cumple el supuesto de homogeniedad de varianza. Dichas pruebas estn incluidas en el paquete estadstico "Statistica for Window", versin 5.0. RESULTADOS Y DISCUSION Anatoma y morfologa de la iniciacin de la embriognesis somtica Luego de una semana de iniciado el cultivo de pices meristemticos del clon de banano Gran enano en medio lquido, los explantes presentaron cambios morfolgicos perdiendo su organizacin como pices. Los primordios foliares se engrosaron marcadamente, y luego de 5 a 6 semanas de cultivo, aparecieron embriones globulares de color blanquecino sobre la supercie de la hoja. El anlisis de alcuotas del medio lquido a los 15 das de cultivo, evidenci la presencia de clulas grandes y alargadas con caractersticas tpicas de clulas no embriognicas, as como clulas pequeas, redondeadas, con citoplasma denso, las cuales son caractersticas de clulas embriognicas. Tambin se observaron clulas en diviFigura 2. Embrin es estado alargado del clon de Musa (AAA) Gran enano, con una clara diferenciacin entre el extremo apical y basal.

sin y estructuras proembrinicas (resultados no mostrados). Estos hallazgos podran reforzar el origen unicelular de los embriones somticos en el clon de banano Gran enano. El estudio histolgico de secciones de primordios foliares del clon de banano Gran enano a los 30 das de cultivo, muestran proembriones esfricos y clulas meristemticas en la regin del parnquima adyacente a los haces vasculares del explante (Figura 1a). Estas clulas meristemticas se originaron directamente, sin la formacin de callo, a partir de clulas del parnquima perivascular de

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las hojas. Las clulas meristemticas se caracterizan por ser pequeas, redondeadas y con contenido citoplasmtico denso. Estas clulas son competentes para la embriognesis, y por tanto, slo requieren de reguladores de crecimiento o de condiciones favorables para ser determinadas como clulas embriognicas . Resultados similares han sido obtenidos por otros autores, tanto en banano como en otras especies, donde sealan que las clulas embriognicas se derivan directamente de clulas de la regin perivascular del explante , mientras que en la embriognesis somtica indirecta, donde est involucrado el parnquima perivascular, son las clulas del callo las que se originan a partir de este tejido . Las subsecuentes divisiones de stas clulas meristemticas del parnquima adyacente al tejido vascular, conduce a la formacin de embriones globulares. Algunos reportes hacen referencia de la activacin preferencial inducida por las auxinas de las clulas perivasculares. Este evento ha sido relacionado, con la presencia de altos niveles de reguladores de crecimiento y nutrientes en las clulas de este tejido . Otra posible explicacin de la iniciacin de la actividad meristemtica de las clulas del parnquima perivascular, an en especies monocotiledneas, es su relativamente bajo grado de especializacin siolgica y morfolgica . Tambin se ha sealado, que las clulas del parnquima perivascular de la hoja poseen alta actividad mittica, la cual puede favorecer la produccin de embriones somticos, ya que las clulas en divisin continua, poseen una mayor capacidad para dediferenciarse y redeterminarse en clulas embriognicas . Son pocas las publicaciones que han descrito el proceso de embriognesis somtica en Musa sp. basado sobre el anlisis histolgico . La comparacin morfolgica e histolgica de los embriones somticos obtenidos en esta investigacin, revelan similitudes con los obtenidos previamente en Musa accuminata, M. balbisiana, y los clones Bluggoe y Grand Nain . El anlisis histolgico de los eventos del proceso de embriognesis somtica directa en el clon de banano Gran enano muestra la presencia de una epidermis que rodea completamente al embrin, lo cual ha sido considerado un paso importante en la embriognesis somtica . Secciones histolgicas de los embriones globulares revelaron una disposicin radial de las clulas, lo cual ha sido anteriormente reportado por Swennen en Musa sp. (Figura 1b). Induccin de la germinacin de embriones somticos La regeneracin de plantas funcionales a partir del cultivo de clulas o tejidos, es el principal paso limitante en la aplicacin de mtodos biotecnolgicos para el mejoramiento de los cultivos . En nuestra investigacin, los tratamientos con citocininas (medios G3 y G4) fueron los que permitieron promover el desarrollo de mayor nmero de embriones somticos en estado globular, hasta alcanzar el estado alargado (Tabla 2). En estos embriones, se pudo observar una clara diferenciacin entre el extremo apical y basal (Figura 2) y la presencia de tejidos fo-

Tabla 2. Efecto de la composicin del medio de germinacin (G) sobre el desarrollo de embriones somticos en estado globular del clon de Musa (AAA) Gran enano. % de embriones somticos en los diferentes estados de desarrollo a las 4 semanas de cultivo Tratamiento Globular Globular con Alargado invaginacin G1 (control) G2 G3 G4 G5 G6 90.83 46.22 11.45 5.04 86.41 78.23 5.77 37.22 26.42 2.4 8.15 15.35 3.40 a 16.56 a 62.13 b 92.56 c 5.44 a 6.42 a

Valores de Porcentajes seguidos por diferentes letras dieren signicativamente (P 0,05) de acuerdo con la prueba de Rango Mltiple de Duncan. Se utilizaron 20 embriones globulares por tratamiento aplicado.

tosintticamente activos. En esta investigacin tambin encontramos que algunos embriones permanecieron en estado globular por un perodo de 4 semanas, con ligeros signos de agrandamiento, mientras que otros lograron desarrollarse hasta el estado de embrin globular con invaginacin. Los resultados muestran que ninguno de los tratamientos probados fueron efectivos para lograr que los embriones somticos en estado alargado se desarrollaran hacia plantas completas. Tratamientos adicionales, como es el someter a los embriones a un "shock osmtico" (con la adicin de 80 g/l de sacarosa), el uso de GA o de BA (1 M) fueron tambin probados sin xito. No tenemos una explicacin para los resultados obtenidos, pero se podra especular que estos tratamientos, adems de no tener una composicin y concentracin de las sustancias utilizadas adecuadas para la germinacin de los embriones de Musa sp., puede que no hayan sido aplicados en el estado apropiado de desarrollo del embrin somtico para que pudieran ser efectivos. La obtencin de estructuras similares que nunca se desarrollaron hacia plantas completas ha sido previamente reportado tanto en Musa como en otras especies . En Ipomea batatas, Che y Cantlife encontraron una diversidad de estados embrionarios, de los cuales solo algunos de ellos fueron capaces de desarrollarse hacia plantas completas; los embriones incompletos tenan forma redondeada y se caracterizaron por tener el extremo apical cerrado, sin la presencia de una hendidura o invaginacin que indique la iniciacin cotiledonar; estos autores plantean que estos embriones posiblemente crezcan mediante alargamiento del estado globular reteniendo un estado primitivo de desarrollo, posiblemente como resultado de un establecimiento retardado de la polaridad. Otra posible causa de la falla en la conversin de embriones somticos a plantas, puede ser la inhibicin del desarrollo de un meristemo funcional en el vstago . El fracaso en lograr la germinacin de embriones som-

82 ticos con el uso de reguladores de crecimiento convencionales, sugiere que el bloqueo del proceso puede tener su origen en etapas tempranas del desarrollo . El balance hormonal en cada estado del proceso, es un factor importante que controla el crecimiento, la diferenciacin y el desarrollo del embrin . Por ejemplo, el papel de las auxinas en la induccin de la embriognesis somtica y el posterior desarrollo de los embriones globulares, no est completamente establecido, pero se ha demostrado que el uso de inhibidores del transporte de auxinas son capaces de bloquear la capacidad de los embriones somticos de sufrir la transicin morfogentica hacia los subsecuentes estados de desarrollo: por ejemplo, los embriones globulares sufren una expansin esfrica persistente sin elongacin del eje, mientras que en los embriones en estado intermedio se produce una continua elongacin del eje, sin iniciacin del desarrollo cotiledonar . Por otro lado, se ha evidenciado que la presencia de macromolculas extracelulares en el medio de cultivo de embriones somticos, estn involucradas en el bloqueo de los embriones en el estado de corazn en Vitis sp. . Por lo expuesto anteriormente, sugerimos que se deben realizar experimentos adicionales, como lo son estudios histolgicos y bioqumicos en estados tempranos, intermedios y tardos de la embriognesis somtica de Musa sp., para

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tratar de entender en que momento y porque, son interrumpidos los procesos siolgicos normales del desarrollo del embrin. La embriognesis somtica directa es considerada como un sistema conveniente para la propagacin de plantas elites, debido a que es un proceso que no involucra una fase de callo, y por ende, se evita una fuente importante de variacin gentica. Por tal motivo, el cultivo de embriones somticos de Musa en medio lquido, obtenidos por la va directa a partir de primordios foliares, puede ser considerado como un sistema opcional para el cultivo de plantas con caractersticas agronmicas sobresalientes. An cuando, con la metodologa empleada en esta investigacin, slo se logr la obtencin de embriones en sus diferentes etapas de desarrollo, estos hallazgos abren el camino para futuras investigaciones relacionadas con el mejoramiento del proceso de embriognesis somtica directa en Musa sp. AGRADECIMIENTOS Al Programa Nuevas Tecnologas, BID-CONICIT quien subvencion esta investigacin a travs del proyecto BTA03. Al Lic. Luis Hermoso por su colaboracin en el procesamiento de las muestras para el estudio histolgico.

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