UNIVERSIDAD DE SALLE FACULTAD DE INGENIERA AMBIENTAL Y SANITARIA, BOGOT, CUNDINAMARCA, COLOMBIA

UTILIZACIN DE PSEUDOMONA PARA LA BIODEGRADACION DE CROMO (VI) DE AGUAS RESIDUALES POR PROCESOS DE CURTIEMBRE Karen Eliana Hosttos Perez1, Mauro Aldair Arteaga Ortiz2, Lisney Zoreth Pez Roa , Mara Paula Gonzlez4.
1. Universidad de Salle, Facultad De Ingeniera Ambiental y Sanitaria. Remediacin Ambiental ,41112139. 2. Universidad de Salle, Facultad De Ingeniera Ambiental y Sanitaria. Remediacin Ambiental, 41112203. 3. Universidad de Salle, Facultad De Ingeniera Ambiental y Sanitaria. Remediacin Ambiental, 41061082. 4. Universidad de Salle, Facultad De Ingeniera Ambiental y Sanitaria. Remediacin Ambiental 41082119.
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OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL Utilizar la bacteria Pseudomona sp para la biodegradacin de cromo hexavalente de aguas residuales por procesos de curtiembre.

OBJETIVOS ESPECIFICOS Determinar la capacidad de la especie de bacteria Pseudomona, para contrarrestar y degradar la accin y presencia de cromo (VI) Cromo contaminante hdrico. Cuantificar la transformacin parcial de Cromo (VI) a valencias o estados de oxidacin ms pequeos como cromo trivalente, por medio de la bacteria Pseudomona sp. Determinar los factores que favorecen la degradacin del Cromo (VI) de aguas residuales por los procesos de curtiembres.

MARCO TEORICO

Se sabe que las aguas residuales son materiales derivados de la actividad industrial y de los residuos domsticos, los cuales por razones de salud pblica no pueden ser vertidos a los cursos de aguas corrientes o lagos, pero a pesar de las recomendaciones y ordenanzas los ambientes naturales han recibido altos aportes de efluentes industriales y domsticos que han llevado al deterioro de muchos cursos de agua hacindolos incompatibles con la vida (1). Los efluentes industriales que contienen Cr (VI) son descargados por industrias qumicas, de construccin de maquinarias e instrumentos, de radio electrnica, curtiembres, efluentes de torres, refrigerantes de estaciones generadoras de energa elctrica, entre otras, donde la concentracin de Cr (VI) puede variar ampliamente ya que la cantidad de aguas contaminadas con cromo que se vierten al ambiente va de docenas a cientos de metros cbicos por hora (2). Las operaciones y procesos de las curtiembres generan lquidos y slidos que se distinguen por su elevada carga orgnica y presencia de agentes qumicos que pueden tener efectos txicos, como es el caso del sulfuro y el cromo. Las variaciones en cuanto al volumen de los residuos y a la concentracin de la carga contaminante se presentan de acuerdo a la materia prima procesada y a la tecnologa empleada (3). El cromo en la etapa de curtido, es uno de los contaminantes, que produce impactos negativos en el crecimiento del pas, ya que compromete la salud humana, daando los procesos ecolgicos que sostiene la produccin de alimentos, y desde el punto de vista econmica la descarga de residuos es un desperdicio de recursos que son escasos (4). Existen referencias sobre el cromo; que indican que es un metal pesado que funciona qumicamente con distintas valencias: bivalente, trivalente y hexavalente, siendo este ltimo de gran importancia por su alto poder txico para todas las formas de vida, siendo mutagnico y carcinognico en el hombre y mutagnico en bacterias, ya que se debe a que al igual que otros metales, produce estrs oxidativo; tambin, el cromo trivalente y el cromo hexavalente en particular es un desnaturalizador de protenas y precipitante de los cidos nucleicos.(5) El Cr (VI) por ser un poderoso oxidante de sustancias orgnicas, es peligroso para los organismos vivos y para la salud humana, por ejemplo el cido crmico y los cromatos son irritantes y destructores para todas las clulas del organismo y pueden producir intoxicaciones accidentales agudas por va digestiva, tambin por envenenamiento agudo por ingestin produce vrtigo, sed intensa, dolor abdominal, vmito, entre otros; as mismo, la inhalacin de vapores de cromo por largos periodos, causa ulceracin indolora, hemorragia y perforacin del tabique nasal, acompaado de secrecin nasal ftida, conjuntivitis, lagrimeo y hepatitis aguda.(6,7) Por otra parte, en contraste con la biorremediacin de compuestos orgnicos, que destruyen las molculas, y dan como productos finales CO2 o CH4 , los iones de Cromo no son destruidos por procesos microbianos, sin embargo, la molcula que contiene el metal puede ser modificada, inmovilizada, o destoxificada conduciendo a una apreciable o en algunos casos completa remediacin del ambiente contaminado. Las principales vas por las cuales se lleva a cabo esta biorremediacin o los mecanismos que utilizan los microorganismos para lograr la inmovilizacin del metal,

incluyen biosorcin, bioacumulacin, biomineralizacin, quimiosorcin como muestra la Figura 1. (Vullo, 2003).

biotransformacin

Figura 1. Mecanismos de interaccin entre los metales pesados y microorganismos (Vullo, 2003).

Son muchos los microorganismos que pueden llevar a cabo la reduccin de metales como As, Pb, Cu, Mo, U, Se, Bi, Te, Va, Mn, Fe, Ag, Au, Hg y Cr, mediante la reduccin convierten un alto estado de oxidacin del elemento a un estado de oxidacin menor. Entre los microorganismos capaces de reducir iones metlicos existe una gran variedad de gneros donde las transformaciones las llevan a cabo de acuerdo a su capacidad fisiolgica, algunos lo hacen mediante reacciones enzimticas, mientras que otros lo hacen mediante la excrecin de un compuesto reductor que convierte el in de un alto estado de oxidacin a uno menor. Es conocido que las bacterias en cultivo pueden reducir cromatos y dicromatos, estas bacterias pueden ser aisladas del suelo, sedimentos y aguas contaminadas, por ello se conocen estas especies con capacidad de reducir el Cr (VI): Alcaligenes, Bacillus, Corynebacterium, Enterobacter, Escherichia, Micrococus, Pseudomonas, Vibrio, entre otras, tanto aerobios como anaerobios son activos (8) .Los organismos a elegir deben presentar un alto grado de tolerancia ya que bajo condiciones adecuadas, se ha logrado 99% de reduccin de Cr (VI), pero a concentraciones muy altas del in, el porcentaje de reduccin disminuye (9,10). Estos materiales txicos deben ser tratados para hacerlos inocuos, en condiciones de laboratorio, el tratamiento se efecta en un biorreactor donde se realiza el proceso en forma controlada, es decir, se suministran nutrientes, se inocula con los microorganismos deseados, se dan las condiciones adecuadas de pH y temperatura. Con ello se han llevado a cabo estudios en biorreactores de agitacin continua suplementado molasas como fuente de carbono e inoculado con Pseudomonas mendocina (11), logrando la reduccin del Cr (VI)a la precipitacin de la forma trivalente. Otra manera de lograr la reduccin fue la adicin de sulfato y la provisin de condiciones anaerbicas y una fuente de carbono disponible que permita la reduccin de sulfato generando H2S, el H2S, reacciona abiticamente para reducir Cr (VI).

En nuestro medio, Bogot, una de las industrias que se destacan es la de curtido de cueros, industria que se inicia en forma artesanal, alcanzando actualmente un gran desarrollo en cuanto a tecnologa moderna y prueba de ello es la obtencin de productos de ptima calidad, junto a ello se han presentado nuevos problemas como la contaminacin ambiental. Ya que en Colombia existen 677 curtiembres, de las cuales 350 estn en Bogot en san Benito y san Carlos (12) y aunque se han tomado medidas para las problemticas ambientales generadas por estas, no son suficientes debido a la magnitud que crean ya que la industria de curtiembre es contaminadora y vuelca al ambiente altos contenidos de materia orgnica y concentraciones que alcanzan niveles txicos de sustancias como sulfuros y cromo, si el proceso es mineral. Las dos primeras etapas del proceso de curtido, son importantes por el volumen y la carga contaminante de los efluentes que descargan al ambiente y el tercero por las cantidades de residuos slidos generados en las distintas operaciones del acabado del cuero (13). Figura 2. Diagrama. Segunda etapa. (Vullo, 2003).

En Bogot existen reportes de la concentracin de cromo en los efluentes de las industrias de curtido de cuero, los cuales sobrepasa los valores mximos permisibles Ante esto, en las ltimas dcadas, los estudios en los ambientes acuticos, se han orientado a las pruebas de bioensayos como tcnica y herramienta bsica, para evaluar el agua en relacin con el tipo de tratamiento y disposicin final , utilizando metales pesados; pruebas, con las cuales se ha logrado determinar que los metales pesados cobre, zinc, plomo, hierro, mercurio, arsnico cromo y cadmio, que se encuentran reaccionando en el medio acutico, con frecuencia se acumulan en los tejidos de los organismos y causan efectos de inhibicin enzimtica o en muchos casos muerte de los organismos (14). Teniendo en cuenta, que la mayora de industrias dedicadas al curtido de cuero emiten sus efluentes por encima de los valores mximos permisibles y sin ningn o muy poco tipo de tratamiento a los colectores comunes, los cuales llegan a los ros, de los que se proveen muchas veces las personas, animales y plantas ya sea de forma directa o indirecta, el presente trabajo tiene como propsito, utilizar la bacteria pseudomona sp para la biodegradacin de cromo hexavalente de aguas residuales por procesos de curtiembre.

METODOLOGA De acuerdo a los componentes contaminantes presentes en el agua destinada a la investigacin de este proyecto, cuyo tipo corresponde a una muestra hdrica perteneciente a la curtiembre de San Benito. Se utilizo la bacteria Pseudomona sp para el estudio de la accin de este microorganismo a travs de la medicin de las concentraciones del metal, Cromo VI utilizndose el siguiente procedimiento: Se cultivo la Pseudomona sp en agar Macconkey a una temperatura promedio de 37 C por tres das. A partir del cultivo puro de Pseudomonas sp, se prepar una suspensin en solucin salina fisiolgica estril 0.9% con peptona 1mL (con una concentracin aproximada 3 x 108 clulas/mL), preparndose 2 mL de esta dilucin. En seguida se tomo el primer tubo de ensayo llamado No. 1 se agrego 10 ml de agua destilada, luego para un segundo tubo de ensayo llamado No. 2 se agrego 10 ml de agua de la muestra de la curtiembre, despus en el tubo de ensayo llamado No. 3 se agrego 8 mL de la muestra de curtiembre con 2 mL de la siembra de la Pseudomona. Seguido a esto a cada uno de los tubos de ensayo se le agrego un sobre de Chromium diphenylcarbazide, mediante una continua agitacin durante un periodo de tiempo aproximado de 5 minutos, a continuacin se tomo el tubo de ensayo No. 1 y se introdujo en el espectrofotmetro HACH para tomar la medida de Cromo VI como blanco, 0.0. Por ltimo se introducen los tubos de ensayo No. 2 y No. 3 y se realizo la cuantificacin y el posterior anlisis de los resultados.

CROMO HEXAVALENTE (HACH) MTODO 8023. POWDER PILLOWS (15) Lo primero que se realiza para determinar la concentracin de cromo hexavalente por medio del espectrofotmetro HACH es identificar el mtodo 90 (Chromium Hex). En el men del equipo; despus de realizar esto se procede a agregar 10ml de la muestra en una celda HACH, este ser nuestro blanco. En una segunda celda HACH se agregan 10ml de la muestra y un sobre de ChromaVer y se procede a agitar, si la muestra vira a un color purpura es porque en la muestra existe la presencia de cromo hexavalente. A continuacin se debe iniciar el timer del equipo para 5 minutos, que es el tiempo en que se realiza la reaccin. Cuando se acabe el tiempo de reaccin se debe insertar a celda que contiene el blanco y se pone en ZERO el equipo, la pantalla debe mostrar 0.00 mg/L Cr6+. Despus de esto se realiza la lectura para la muestra a analizar y se leen los resultados en mg/L Cr6+. Si los valores arrojados de concentracin de Cr6+ exceden los rangos de medicin del equipo se tendr que realizar una dilucin de la muestra.

MTODO COLORIMTRICO CON DIFENILCARBACIDA (16) En solucin ligeramente acida, el cromo hexavalente reacciona cuantitativamente con la difenicarbacida, desarrollndose una coloracin rojo violeta. para la determinacin de cromo total, se oxida el cromo trivalente con permanganato potsico antes de efectuar la colorimetra. si al muestra ha sido filtrada y acidificada, se introducen 50ml en un matraz de Erlenmeyer de 100ml; se le agregan 2,5ml de reactivo difenilcarbacida, se deja en reposo 10min y se lee el aparato de medida a 540nm. (16)

METODO DE CONTEO NPM (NUMERO MAS PROBABLE)

Tambin llamada tcnica de dilucin en tubo, proporciona una estimacin estadstica de la densidad microbiana presente con base a que la probabilidad de obtener tubos con crecimiento positivo disminuye conforme es menor el volumen de muestra inoculado.

Figura 3. Determinacin NPM. (17).

MATERIALES

Para la realizacin de este proyecto de investigacin, se ideo el siguiente conjunto de materiales: Agar Macconkey con cepa pura de Pseudomona especie Putida. Tres tubos de ensayo 25 mL. Solucin salina 0.9%. Peptona 1 mL. 10 ml de agua destilada. 3 Pipetas estriles de 10 mL. Espectrofotmetro. Tres sobres de Chromium diphenylcarbazide. Agitador. Reactivos: Sobre de Chromaver 3. 9 tubos de ensayo con Caldo lauril sulfato con campana de Durham invertida.

BIBLIOGRAFIA 1. Alvaro J. ldrovo, L. E. (2001). Niveles de mercurio y percepcin del riesgo en una poblacin . Biomedica , 134-141. 2. UNEPy CIP, 1998 3. Armas, C. ;C. Armas. 2002. Tecnologa Ambiental en Nuestro Hogar la Nave Sideral Tierra. Edit. APLIGRAF S.R.L. Trujillo-Per

4. Garcia, M. 1993. Gua Tcnica para Minimizacin de Residuos en curtiembres. Resumen Ejecutivo, Centro Panamericano de Ingeniera Sanitaria y Ciencias del Medio Ambiente CEPIS. Lima-Per. 5. Gutirrez F. y C. Cervantes; Interacciones microbianas con el cromo: mecanismos y potencial biotecnolgico; Ide@s CONCYTEG; Ao 3, Nm. 37; 21-36. 6. Dreisbach, R.; W. Roberton. 1988. Toxicologa clnica , edit. El manual moderno S.A. Mxico. 7. Buzzo, A.; M. Soria. 1960. Toxicologa. 5ta. Edic. Edit. Lpez Libreros- Buenos Aires Argentina. 8. Romanenko, V.; v. Kerenkov. Mikrobiologiya. 46, 414 417 (1977). 9. Bride, J.; P. Dhakephalkar; K. Paknikar. Biotechnol. Lett. 18, 667 672. (1996). 10. Cooke, V.; M. Hughes, R. Poole. J. Ind. MicroBiol. 14, 323 328 (1995). 11. Alexander, M. 1999. Biodegradation and Biorremediation. 2 ed. Edit. Academic Press. New Cork. U.S.A. Diagnstico Ambiental del sector curtiembre en Colombia, centro nacional de produccin ms limpia y tecnologas ambientales, Febrero de 2004. http://www.tecnologiaslimpias.org/curtiembres/diagnosticonacional.pdf CEPIS, 1993. Gua Tcnica para la minimizacin de Residuos en curtiembres. Lima-Per. Gallardo, V. 1984. Revisin actualizada a 1983 de la contaminacin marina proveniente de fuentes terrestres en la regin del Pacfico Sudoeste (Colombia, Chile, Ecuador, Panam y Per). Rev. Com. Perm. Pacfico Sur. 14:19-173. Protocolo HACH. Chromium, Hexavalent. USEPA1 1,5-Diphenylcarbohydrazide. Method 8023. Norma espaola. Calidad de agua. Determinacin de cromo. Mtodo colorimtrico con difenilcarbacida. Mayo de 2002. de:

12.

13.

14.

15.

16.

17. Imagen tomada http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/U4b_MedicionCrecimiento_19837.pdf