CONSERVACIN Y CONTROL DE CEPAS MICROBIANAS LIOFILIZACION

LA PRESERVACIN Y MANTENIMIENTO DE CEPAS DE RESERVA

!! Es muy importante un buen mtodo de conservacin de

modo de mantener los microorganismos vivos, puros y la cepa microbiana autntica!! Para lo cual se debe tener en cuenta los conocimientos bsicos de Microbiologa. Proveer condiciones adecuadas para cada tipo de microorganismo. Con cada subcultivo, hay Riesgo de cambio de la cepa.
Evito el crecimiento.

Normas generales para la conservacin de cepas microbianas

Los tres objetivos para una correcta conservacin: 1.-Mantenimiento en Cultivo puro.(PUREZA) 2.-Que este viva.(VIABILIDAD) 3.-La cepa debe guardarse genticamente estable(ESTABILIDAD)

RECORDAR: a) Un cultivo inicial de una especie es una poblacin b) Un subcultivo es una poblacin derivada de este cultivo inicial. c) Una cepa es una sucecin de subcultivos del cultivo inicial

MTODOS PARA LA PRESERVACIN Y MANTENIMIENTO DE CEPAS DE RESERVA a largo plazo:

A)LIOFILIZACIN.

B) CONGELACIN A BAJAS TEMPERATURAS.

Uso de agentes Crioprotectores

FUNDAMENTOS TERICOS DE LA CONSERVACIN DE MICROORGANISMOS POR LIOFILIZACIN

Liofilizacin
Es un mtodo de conservacin a largo plazo. Se basa en la paralizacin del metabolismo celular por falta de agua: congelacin y sublimacin

 Liofilizacin Es una Operacin de conservacin basada en la eliminacin del agua de un material.

Llamada tambien criodesecacin, es una operacin consistente en secar un material manteniendo su temperatura lo suficientemente baja como para que la mayor parte del agua est congelada.

El nombre de liofilizacin se usa debido a una de las propiedades ms caractersticas de los productos secados por esta tcnica, que es la facilidad con la que vuelven a tomar el agua (o disolvente) eliminada. (lio=disolvente; fili=amigo)

 Liofilizacin

Para llevarla a cabo se emplean tecnicas de congelacin y vaco. La idea bsica consiste en la sublimacin del hielo. Es decir la eliminacin del agua del producto sin que sta se encuentre en ningun momento en estado lquido.

PROCESO Congelar el agua libre de las clulas

Eliminacin del agua Agua congelada Vapor de agua

Sublimacin

1 Fase de la Desecacin

2 Fase de la Desecacin

PROCESO
P R O T E C T O R

Congelacin Rpida
T ambiente,4C,-196C

Tubos marcados

BOMBA
BOMBA

condensador

Sellado al vacio

Ampolla

PROCESO (etapas)
Acondicionamiento Previo

OPERACIONES PREVIAS
Congelacin

SECADO PROPIAMENTE DICHO

Sublimacin

Desorcin

OPERACIONES DE ACONDICIONAMIENTO POSTERIOR

Envasado y Almacenamiento

Reconstitucin

Tipos de Liofilizadores
Liofilizador con centrifugacin
Se utilizan ampollas de vidrio taponadas La suspensin se centrifuga durante la 1 fase de la desecacin Se estrechan las ampollas y,despus de conectarlas a una bomba de vaco,se sellan.
Ventajas:Se utiliza la centrifugacin para que el proceso de congelacin sea suave y de forma homognea

Liofilizador con estantes

La suspensin se prepara en viales y,es precongelada a T muy bajas antes de aplicar el vaco. La segunda etapa de la desecacin se realiza tambin en el liofilizador.

Ventajas:La Desecacin es de manera progresiva y continuada

Tipos de Liofilizadores

Tipos de Liofilizadores

Cundo aplicar la Liofilizacin?

Es un mtodo ampliamente utilizado para conservar distintos Microorganismos. SI NO -Dificultad de un crecimiento -Bacterias,Levaduras, Adecuado. Hongos,Algunos virus,Algas -Microorganismos delicados que no resisten el paso de Ejemplos:Rhodospirillum, congelacin. ,Azospirillum,vibrio y dems -A tamaos de clulas mayores, bacterias marinas. menos efectivo es el proceso -Levaduras miceladas con difiProtozoos,Clulas animales, cultad en la esporulacin. Clulas vegetales,Arqueobac-Hongos con grandes conidios o terias y bacterias delicadas con dificultad en la esporulacin.

FACTORES IMPLICADOS EN LA CONSERVACIN POR EL PROCESO DE LIOFILIZACIN

Condiciones de Cultivo
El medio de cultivo Depender del tipo de microorganismo y sus requerimientos nutricionales. Fase de crecimiento del cultivo. F.exponencial. Suspensiones celulares de 108-109 Clulas/ml en bacterias, algo inferiores en hongos y levaduras.

Condiciones de incubacin. T,aerobiosis, anaerobiosis, etc.

FACTORES IMPLICADOS EN LA CONSERVACIN POR EL PROCESO DE LIOFILIZACIN

Preparacin de las clulas para su conservacin - Composicin del medio de la suspensin y adecuada densidad ptica El medio de la suspensin deber proteger la viabilidad de las clulas. Usar el crioprotector adecuado en cada caso. Glucosa 7,5% para Anaerobios Glucosa 15% para Levaduras. Glutmico 0,67M para Bacterias Lcticas. Inositol 5% para Bacterias. Leche descremada para Levaduras, Hongos y Actinomicetos. Leche descremada de calidad microbiolgica ( esterilizacin por vapor fluente) al 10% o 20% P/V.

PRODUCTO: se puede conservar en refrigeracin o a temperatura ambiente por aos.

FACTORES IMPLICADOS EN LA CONSERVACIN POR EL PROCESO DE LIOFILIZACIN

Tipos de ampollas,tubos y viales para la liofilizacin. Dependern del equipo del que se disponga o del tipo de muestra a liofilizar. Se aconseja que no sean de cristal de pyrex o borosilicato, porque por su elevada resistencia ofrecern muchas dificultad en su apertura.
-Temperatura durante la sublimacin. Debe ser lo ms baja posible, sin subir por encima de 50C.

FACTORES IMPLICADOS EN LA CONSERVACIN POR EL PROCESO DE LIOFILIZACIN

-Grado de deshidratacin alcanzado. Lo ms alto posible.

-Atmsfera de oxgeno en el tubo. Las clulas liofilizadas se guardan en tubos al vaco para evitar Rehidratacin o presencia de gases (como el oxgeno) que pueden daar las clulas. -Condiciones de almacenamiento. La temperatura debe ser constante a 18C y sin bajar de los 0C y, en oscuridad

LIOFILIZACIN
VENTAJAS
-Reduccin de la variabilidad del microorganismo. -Largo tiempo de conservacin. -Aplicabilidad para la produccin y distribucin de los lotes

DESVENTAJAS -El alto coste inicial del equipo. -La preparacin de forma incorrecta de los distintos lotes puede desembocar en un estancamiento de la viabilidad y/o en prdidas en la estabilidad de los caracteres de los microorganismos