Agrobiotecnologa

Curso 2011

Fitorremediacin
Alejandro Mentaberry

Departamento de Fisiologa, Biologa Molecular y Celular Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Universidad de Buenos Aires

Sumario
Alternativas actuales para eliminar contaminaciones de metales pesados Fitorremediacin
- Ventajas - Limitaciones - Tipos de plantas ms utilizadas

Tipos de fitorremediacin
- Fitoextraccin - Rizofiltracin - Fitotransformacin - Fitodegradacin de compuestos orgnicos - Fitoestimulacin Agrobiotecnologa
Fitorremediacin

- Fitoestabilizacin

Plantas transgnicas para detectar compuestos inorgnicos txicos en el medio ambiente Referencias

Alternativas actuales para eliminar contaminaciones de metales pesados

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Fitorremediacin

Rangos de concentracin comnmente hallados y lmites permitidos para los contaminantes metlicos y los radionucletidos ms importantes

Elemento Metales
Plomo Cadmio Arsnico Cromo Mercurio Cobre Zinc

Rango de concentracin (g/Kg)a

1.000-6.900.000 100-345.000 100-102.000 5,1-3.950.000 0,1-1.800.000 30-550.000 150-5.000.000

Lmite regulatorio (mg/Kg) b

600 100 20 100 270 600 1.500

Radionucletidos
Uranio Estronio Cesio Plutonio

Unidades
0,2-16.000 c 0,06-18.700 d 0,03-540.000 e 0,02-46.900 e 0,00011-3.500.000 e

pCi . g-1
------250 f -------------------

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Fitorremediacin

Riley et al. b Clean up Standards for contaminated sites. New Jersey, Department of Environmental Protection (1996) c Microgramos por gramo d Picocuries por gramo e Picocuries por kilogramo f Stern et al.

Tomado de: Salt et al., Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 1998.

Alternativas actuales para eliminar contaminaciones de metales pesados

Suelos
- Rellenado de terrenos - Fijacin qumica e impermeabilizacin superficial - Lixiviacin y reposicin del suelo

Aguas
- Precipitacin o floculacin - Intercambio inico - Osmosis inversa - Microfiltracin

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Mercado potencial para la descontaminacin ambiental en Estados Unidos mediante las tecnologas actuales

En los ltimos 10 aos se ha desarrollado un mercado . importante para la biorremediacin, principalmente en . Estados Unidos.
Productos txicos: Metales pesados: Metales pesados y txicos: ~ U$S 400.000 M ~ U$S 7.100 M ~ U$S 35.400 M

El costo estimado para remediar los sitios utilizados . por el Departamento de Energa Atmica por mtodos . convencionales se calcul en U$S 142.000 M En 2005, el mercado norteamericano de remediacin . ambiental era de U$S 6.000 a 8.000 M por ao. El mercado norteamericano de fitorremediacin era de . U$S 100-150 M anuales (0.5% del total de remediacin).

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El mercado comercial de fitorremediacin comprende . 80% de contaminantes orgnicos y 20% de inorgnicos. El mercado de fitorremediacin creci de 3 y 5 veces . entre 1999 y 2005.

La fitorremediacin es econmicamente competitiva respecto de otras alternativas de remediacin

Adaptado de Chappell, US Environmental Protection Agency,1998.

Fitorremediacin

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Fitorremediacin

Fitorremediacin
Conjunto de mtodos para degradar, asimilar, metabolizar o detoxificar metales pesados y compuestos orgnicos por medio de la utilizacin de plantas. Es el empleo de vegetacin para el tratamiento in situ de suelos, sedimentos y aguas contaminadas.

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Se basa en los procesos que ocurren naturalmente por los cuales las plantas y los microorganismos rizosfricos degradan y secuestran contaminantes orgnicos e inorgnicos

La fitorremediacin permite detoxificar distintos sustratos

Sustratos slidos (suelos y sedimentos):
- sitios militares (TNT, metales, orgnicos) - campos agrcolas (herbicidas, pesticidas, metales, selenio) - sitios industriales (orgnicos, metales, arsnico) - minas (metales) - sitios de tratamiento de maderas (hidrocarburos aromticos policclicos; PAHs)

Sustratos lquidos
- aguas residuales (nutrientes, metales) - drenajes de agricultura (nutrientes, fertilizantes, metales, arsnico, selenio, boro, pesticidas orgnicos y herbicidas) - efluentes industriales (metales, selenio) - efluentes de minera (metales) - plumas subterrneas (metales, compuestos orgnicos)

Sustratos gaseosos
- aire libre e interior (xidos de nitrgeno, SO2, ozono, CO2, gases neurotxicos, partculas de holln, e hidrocarburos halogenados voltiles)

Contaminantes orgnicos
Son consecuencia de las actividades humanas:
- industria petroqumica (derrames de combustibles y solventes) - actividades militares (explosivos y armas qumicas) - agricultura (pesticidas, herbicidas) - industria qumica (efluentes) - industria forestal y maderera (efluentes)

Dependiendo de sus propiedades, pueden ser: - degradados en la zona radicular

- incorporados a la planta degradacin secuestro volatilizacin

Ejemplos de descontaminaciones exitosas por fitorremediacin:

Solventes orgnicos, herbicidas, explosivos, hidrocarburos derivados del petrleo, bifenilos policlorinados (PCBs), tricloroetileno (TCE), hidrocarburos aromticos policclicos (PAHs).

Contaminantes inorgnicos

Pueden ser consecuencia de elementos naturales presentes en la corteza . terrestre y/o en la atmsfera, o resultado de actividades humanas:
- minera - industria - transporte - agricultura - actividades militares

No pueden ser degradados, pero pueden fitorremediarse mediante . estabilizacin o secuestro en la parte cosechable de la planta. Ejemplos de descontaminaciones exitosas por fitorremediacin:
Macronutrientes vegetales (nitrato y fosfato), elementos traza (Cr, Cu, Fe, . Mn, Mo, Zn), elementos no esenciales (Cd, Co, F, Hg, Se, Pb, V y W), e . istopos radioactivos (238U, 137Cs y 90Sr), entre otros.

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Ventajas
Las plantas pueden ser utilizadas como bombas extractoras de bajo costo para depurar suelos y aguas contaminadas (costo 7-10 veces menor respecto de los . mtodos tradicionales). - Las plantas emplean energa solar. - El tratamiento es in situ. Algunos procesos degradativos ocurren en forma ms rpida con plantas que con microorganismos. Es un mtodo apropiado para descontaminar superficies grandes o para finalizar la descontaminacin de reas restringidas en plazos largos.

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Es una metodologa con buena aceptacin pblica.

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Se generan menos residuos secundarios.

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Limitaciones
El proceso se limita a la profundidad de penetracin de las races o a aguas poco profundas. La fitotoxicidad es un limitante en reas fuertemente contaminadas. Los tiempos del proceso pueden ser muy prolongados. La biodisponibilidad de los compuestos o metales es un factor limitante de la captacin. Deben considerarse contaminaciones potenciales de la cadena alimentaria y napas de agua.

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Se requiere comprender mejor la naturaleza de los productos de degradacin (fitodegradacin). Falta elaborar el marco regulatorio detallado.

Biologa de la acumulacin de metales en plantas

Captacin por las races:

- Movilizacin de los metales Quelacin mediante fitosiderforos Unin a protenas quelantes (fitoquelatinas) Acidificacin por exudado de H+ - Captacin por la raz Via apoplstica Va simplstica

Transporte:
- Almacenamiento en raz o exportacin al tallo por xilema - Transporte por xilema o redistribucin por floema - Almacenamiento en vacuolas

Mecanismos de evasin o tolerancia:

- Captacin celular limitada (evasin) - Metabolismo tolerante a metales pesados - Detoxificacin por quelacin, compartimentalizacin o precipitacin

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Mecanismos ms probables:
- Compartimentalizacin en vacuolas y quelacin con fitoquelatinas (Cd2+, Zn2+, Cu2+ ) - Precipitacin como fitatos (Zn2+)

Mecanismos involucrados en la quelacin y compartimentalizacin

pared celular citoplasma Contaminante inorgnico secuestro

conjugacin

adsorcin

vacuola
degradacin enzimtica

Contaminante orgnico
modificacin enzimtica

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secuestro
Adaptado de: Pilon-Smits, Annual Review in Plant Biollogy, 2005.

Mecanismos de tolerancia para contaminantes orgnicos e inorgnicos en plantas. La detoxificacin generalmente involucra la conjugacin seguida del secuestro activo en la vacuola y el apoplasto, donde el contaminante hace el menor dao. Los quelantes son: glutatin (GSH), glucosa (Glu), metalotionenas (MT), nicotinamina (NA), cidos orgnicos (OA, fitoquelatinas (PC). Los transportadores se representan por cajas con flechas.

Estrategias de fitorremediacin utilizadas para remediar agua, suelo o aire contaminados.

hidroponia (rizofiltracin)

humedal artificial Plantas usadas como filtros

Plantas usadas como barrera hidrulica para prevenir la contaminacin de napas y la dispersin horizontal de plumas. Agrobiotecnologa
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barrera hidrulica

fitoextraccin y fitoestabilizacion

filtracin de aire

Adaptado de: Pilon-Smits, Annual Review in Plant Biology, 2005.

Diseo de sistemas de fitorremediacin

Seleccin de la especie vegetal

Datos de toxicidad y de degradacin de contaminantes

Tasa de captacin del contaminante y tiempo de limpieza requerido

Esquema y densidad de las plantaciones

Costos de Irrigacin, insumos agronmicos, . mantenimiento y gastos de cosecha.

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Zona de captura de agua y tasa de transpiracin

Anlisis de riesgos contingentes (plagas, sequas, etc.)

Tipos de plantas ms utilizadas

Freatfitas - Plantas de races profundas (lamo, sauce, algodonero). Pasturas - Por su tipo de raz retienen el suelo. Legumimosas - Permiten enriquecer el suelo en N2. Acuticas - Permiten la degradacin de contaminantes en humedales artificiales.

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Algunas especies propuestas para fitorremediacin

Brassica juncea Lotus corniculatus Hibiscus cannabinus

Thlapsi caerulescens

Silene vulgaris

Alyssum lesbiacum

Festuca arundinacea

Ejemplos de pruebas de campo para fitorremediacin de metales

Metal Pb

Planta Brassica juncea

Ubicacin Trenton, N.J.

Mtodoa FE-FEAQ

Comentarios La incorporacin de Pb2+ aplicando EDTA result en la reduccin del 28% en la contaminacin en el rea en una temporada de cosecha. Fitoextraccin de suelos enmendados con barros sedimentarios. La acumulacin de Zn2+ en T. caerulescensfue 10 veces mayor que en otras plantas. Suelos enmendados con sedimentos.

Cd Zn

Thlapsi caerulescens Silene vulgaris

Beltsville, Md.

FE-FEC

Zn Cd Ni Cu Pb Cr Se B

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a:

Brassica oleracea Raphanus sativus Thlapsi caerulescens Alyssum lesbiacum Alyssum murale Arabidopsis thaliana Brassica juncea Festuca arundinacea Hibiscus cannabinus Lotus corniculatus Helianthus annus

Rothamstead , U.K.

FE-FEC

Los Baos, California

FE-FEC FV

El contenido de B extraible por agua se redujo entre 24% y 52%, y el de Se se redujo entre 13% y 48% por todas las especies. Remocin de U de aguas subterrneas

Asthabula, Ohio

RF

Tomado de: Salt et al., Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1998.

Mtodos de fitorremediacin. FE: fitoextraccin; FV: fitovolatilizacin; RF: rizofiltracin; FEAQ: fitoextraccin asistida por quelantes; FEC: fitoextraccin continua

Caractersticas del contaminante que afectan la captacin por la planta

Contaminantes orgnicos:
No existen generalmente transportadores especficos en la planta. Se mueven por difusin en los tejidos vegetales, segn sus propiedades qumicas. La hidrofobicidad les permite atravesar fcilmente la bicapa lipdica pero se mueven con dificultad por los fluidos celulares.

Contaminantes inorgnicos:
Incorporados por procesos biolgicos mediante transportadores de membrana, preexistentes porque son nutrientes o similares a ellos (arsenato y selenato son incorporados por transportadores de fosfato). Por ello, su captacin es saturable.

Los contaminantes inorgnicos causan en general toxicidad . por daos en la estructura celular (estrs oxidativo por su . actividad redox) y reemplazan a otros nutrientes esenciales. Los contaminantes orgnicos suelen ser menos txicos: no . tienden a acumularse a altos niveles y son menos reactivos.
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En los suelos con mezcla de ambos contaminantes, el . crecimiento vegetal y la posibilidad de fitorremediacin son . ms limitados

Factores fsicos y qumicos que afectan la biodisponibilidad del contaminante

La biodisponibilidad depende de: Las propiedades qumicas del contaminante (hidrofobicidad . y volatilidad):
Las molculas con extrema hidrofobicidad (PCBs, PAHs, hidrocarburos) se unen fuertemente a la materia orgnica y no se disuelven en el agua (contaminantes recalcitrantes). Los contaminantes no voltiles son fitodegradados o secuestrados, mientras que los voltiles pueden liberarse a la atmsfera sin transformaciones.

Las propiedades del suelo:

Los arcillosos (partculas pequeas) retienen ms agua que los arenosos y tienen ms sitios de unin para iones (cationes), al igual que los de mayor concentracin de materia orgnica (humus). stos pueden unir mayor cantidad de contaminantes hidrofbicos. La biodisponibilidad de los contaminantes inicos est afectada por el pH del suelo (pH cido, aumenta la biodisponibilidad de cationes) Agrobiotecnologa

Las condiciones medioambientales:

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La temperatura y la humedad afectan la biodisponibilidad (por ejemplo, aumentando la migracin de contaminantes disueltos en agua)

Factores biolgicos que afectan la biodisponibilidad del contaminante

Interacciones planta-microorganismo:
- La liberacin de fotosintatos por la planta aumenta la poblacin . microbiana capaz de remediar. - La liberacin de metabolitos secundarios de la planta puede activar . la expresin de genes relacionados a la degradacin de . contaminantes en los microorganismos o actuar como co-metabolitos . para la degradacin por los microorganismos.

La biodisponibilidad es modificada por liberacin de:

Biosurfactantes (ramnolpidos) liberados por bacterias que aumentan . disponibilidad de compuestos hidrofbicos Exhudados vegetales con compuestos que pueden promover la sntesis . de biosurfactantes por las bacterias Enzimas (vegetales y bacterianas) que modifican las cadenas laterales de . algunos compuestos orgnicos aumentando su biodisponibilidad. Quelantes por plantas y bacterias (siderforos, cidos orgnicos y . fenlicos) que aumentan disponibilidad de metales. Secrecin de H+ por las plantas que acidifican el suelo. Enzimas que convierten los metales a formas menos txicas o ms . biodisponibles (por ejemplo, Cr VI a Cr III)

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Aspectos que requieren de mayor investigacin

Procesos que requieren aumentar los conocimientos para aumentar la eficiencia de la fitorremediacin: Interacciones planta-microorganismo y otros procesos . rizosfricos Captacin por la planta Mecanismos de traslocacin Mecanismos de tolerancia (compartimentalizacin, . degradacin) Quelantes vegetales involucrados en transporte y . almacenamiento

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Movimiento de los contaminantes en los ecosistemas . va el sistema suelo-agua-planta hacia niveles trficos . superiores

Tipos de fitorremediacin

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Las bases conceptuales de la fitorremediacin se apoyan en los mecanismos presentes en plantas que hiperacumulan metales

Acumulacin o degradacin en el tejido cosechable

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Fitovolatilizacin

Fitoestimulacin Fitodegradacin Microorganismo que degrada toxinas

Toxina

Fitoextraccin Fitoestabilizacin

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Adaptado de: Buchanan et al., Biochemisty and Molecular Biology of Plants, 2000.

Tipos de fitorremediacin

Fitoextraccin
Las plantas se usan para concentrar metales en las partes cosechables (principalmente, la parte area).

Rizofiltracin
Las races de las plantas se usan para adsorber, precipitar y concentrar metales pesados a partir de efluentes lquidos contaminados.

Fitoestimulacin
Se usan los exudados radiculares para promover el desarrollo de microorganismos degradativos (bacterias y hongos).

Fitoestabilizacin
Las plantas tolerantes a metales se usan para reducir la movilidad de los mismos y evitar el pasaje a napas subterrneas o al aire.

Fitotransformacin
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- Fitodegradacin: Las plantas acuticas y terrestres captan, almacenan y degradan compuestos orgnicos para dar subproductos no txicos o menos txicos. - Fitovolatilizacin: Las plantas captan y modifican metales pesados o compuestos orgnicos y los liberan a la atmsfera mediante la transpiracin.

Las diferentes estrategias de fitorremediacin son adecuadas para distintos contaminantes

Fitoextraccin: Usada principalmente para remediar metales y otros txicos inorgnicos . (Se, As, radionucletidos). Rizofiltracin: Tcnica relativamente cara de implementar, siendo til para cantidades . pequeas de aguas residuales conteniendo compuestos inorgnicos . peligrosos (radionucletidos). Los humedales artificiales se utilizan para . una amplia gama de contaminantes inorgnicos (metales, percloratos, cianuro, . nitratos y fosfatos) y contaminantes orgnicos (explosivos y herbicidas). Fitoestimulacin: Es usado para remediar contaminantes orgnicos hidrofbicos que no pueden . ser incorporados por la planta pero que pueden ser degradados por los . microorganismos (PCBs, PAHs e hidrocarburos derivados del petrleo). .

Las diferentes estrategias de fitorremediacin son adecuadas para distintos contaminantes

Fitoestabilizacin: Este tcnica es usada cuando se plantan coberturas vegetales en sitios . conteniendo contaminantes orgnicos o inorgnicos; o cuando se usan . rboles como barreras hidrulicas para permitir el filtrado de contaminantes . orgnicos e inorgnicos. Fitodegradacin: Es til para compuestos orgnicos que se movilizan dentro de la planta, . (herbicidas, TNT, MTBE y TCE). Fitovolatilizacin: Puede utilizarse para compuestos orgnicos con formas voltiles (TCE y . MTBE) y para algunos compuestos inorgnicos que pueden existir en forma . voltil (Se y Hg).

Fitoextraccin

Se utiliza para el tratamiento de contaminaciones con metales (Cd2+, Co2+, Cr2+, Ni2+, Hg2+, Pb2+, Se2+, Zn2+). Caractersticas deseables en la planta:
- Debe tolerar y acumular altas concentraciones de metales en las partes cosechables - Debe tener una alta tasa de crecimiento - Debe producir un gran volumen de biomasa

Coeficiente de bioacumulacin DE Tallos Metal Cd2+ (5)1 Cu2+ (1) Cr2+ (0,4) Ni2+ (1) Brassica 175 16 159 32 80 8 587 115 31 49 31 Thlapsi 59 12 623 265 89 15 2.739 383 29 23 770 320 Brassica 20.574 4295 55.809 9221 5.486 393 11.475 125 1.432 1409 1.816 1739 Races Thlapsi 4258 168 60.716 21510 8.545 4220 8.425 4220 7.011 3616 2.990 1424

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1

Pb2+ (5) Zn2+ (3)

Concentracin inicial del metal en solucin (mg/L)

Tomado de: Salt et al., Biotechnology 1995.

Coeficiente de bioacumulacin: relacin entre la acumulacin en el tejido (g/g de peso seco) y concentracin en solucin (mg/L) o en suelo.

Fitoextraccin

Plantas tpicas empleadas en fitoextraccin:

- Girasol (Helianthus annuus) - Mostaza de la India (Brassica juncea) - Nabos (Brassica napus; B. rapa) - Cebada (Hordeum vulgare) - Lpulo (Humulus lupulus) - Ortigas (Urtica dioica; U. urens), - Diente de Len (Taraxacum officinale)

Hiperacumuladores:

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- Thlapsi caerulescens - Brassica juncea - Pelargonium spp. - Allysum lesbiacum

Fitoextraccin

Los metales en el suelo pueden estar en distintas formas:

Como iones o complejos insolubles Adsorbidos a constituyentes inorgnicos del suelo o unidos a sitios de intercambio Unidos a molculas orgnicas Como compuestos o precipitados insolubles (xidos, carbonatos, hidrxidos) Integrados a la estructura de los silicatos

Formas de incrementar la biodisponibilidad:

Agregado de quelantes de metales
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Establecimiento de un pH moderadamente cido Disolucin de surfactantes para contaminantes hidrofbicos Agregado de microorganismos

Esquema de fitoextraccin continua y asistida por quelantes

La lnea slida naranja ( ) representa la concentracin de metal en la biomasa, la lnea discontinua ( ) representa la biomasa de tallo.
Fitoextraccin continua Fitoextraccin asistida por quelantes

Aplicacin del quelante

Fase de captacin de metal Fase de captacin de metal

Fase de crecimiento

Cosecha

Fase de crecimiento

Cosecha

Adaptado de: D. E. Salt et al., Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1998.

Concentracin de Pb2+ en tallos de Brassica juncea en un suelo contaminado con plomo (600 mg/kg de suelo) tratado con EDTA.
Concentracin de Pb2+ en tallos (g/g)

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EDTA aplicado (mmol/kg suelo)

Tomado de: McCutcheon, PBI Bulletin 1998.

Acumulacin de metales y tolerancia a manganeso en plantas de tabaco que expresan el gen cax2 de Arabidopsis

El transporte de metales desde el citosol a la vacuola es un componente importante para la tolerancia a metales en las plantas. El intercambiador de Ca2+ CAX2 (Calcium Exchanger 2) de Arabidopsis es un regulador clave de este proceso. La expresin del gen cax2 en clulas de Saccharomyces cereviciae suprime defectos en el crecimiento debidos a excesos de Ca2+ y Mn2+. Se transformaron plantas de tabaco con el gen cax2 dirigido por el promotor de 35S de CaMV. La secuencia se introdujo tambin en antisentido para usar esta construccin como un control interno.

Vector Control CAX2 Control Vector cnb CAX2 cnb

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Tomado de: Hirschi et al., Plant Physiol. 2000. Control: cepa salvaje de S. cereviciae cnb: cepa de S. cereviciae mutada en el gen de calcineurina (suceptibilidad a Mn2+) Vector: cepas transformadas con el vector vaco CAX2: cepas transformadas con el gen cax2

Ensayo de tolerancia a Mn2+ en cepas de Saccharomyces cereviciae que expresan el intercambiador CAX2.

Transporte de iones (nmoles/mg de protena)

Control C-21 C-14

Tomado de: Hirschi et al., Plant Physiol., 2000. Tiempo (min)

Transporte de iones (nmoles/mg de protena)

Acumulacin de metales y tolerancia a manganeso en plantas de tabaco que expresan el gen cax2 de Arabidopsis

Las plantas de tabaco que expresan CAX2 acumularon ms Ca2+, Cd2+ y Mn2+ y fueron ms tolerantes a niveles elevados de Mn2+.
Vector g/g peso seco CAX2 g/g peso seco g/g peso seco g/g peso seco
Tomado de: Hirschi et al., Plant Physiol., 2000.

Tomado de: Hirschi et al., Plant Physiol., 2000.

Concentracin de iones en las races (izquierda) y en los tallos (derecha) de plantas transgnicas. Vector: controles transformados con el vector vaco. C-14: lnea transformada con el gen cax2. Los ensayos se realizaron complementando el medio con 10 mM Cl2Ca, 0,1 M Cl2Cd 0,1 mM Cl2Mn.

Tomado de: Hirschi et al., Plant Physiol., 2000.

Tiempo (min)

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Transporte de iones (nmoles/mg de protena)

Tomado de: Hirschi et al., Plant Physiol., 2000.

Tiempo (min)

Captacin de iones en vacuola de clulas de races de plantas que expresan el gen cax2. A: transporte de Cd2+; 10 M total Cd2+. B: transporte de Mn2+; 100 M total Mn2+. C: transporte de Ca2+; 10 M total Ca2+.

Remocin de metales utilizando algas y plantas acuticas

Las plantas acuticas emplean dos mecanismos para separar metales y otros contaminantes (incluyendo radioistopos) de aguas polucionadas:
- Reaccin superficial rpida independiente del metabolismo: proceso de difusin que finaliza cuando los iones metlicos solubles se unen o adsorben a la pared celular. Puede remover cantidades significativas en minutos. - Reaccin de incorporacin intracelular lenta dependiente del metabolismo: proceso de transferencia desde la pared celular al interior de la clula. Demanda horas o das.

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Lemna minor

Microspora

Concentracin de Ni 2+ (mg/L)

Remocin de metales utilizando Lemna minor

Modelo 0,0 mg/L Pb 2+

Concentracin inicial de Ni2+ : 5 mg/L

5,0 mg/L Pb 2+ 10,0 mg/L Pb 2+

Tiempo (h)

Modelo

Concentracin Pb2+ (mg/L)

Concentracin inicial de Pb2+ : 10 mg/L

0,0 mg/L Ni2+ 2,5 mg/L Ni2+ 5,0 mg/L Ni2+

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Tiempo (h)
Tomado de: Axtell et al., Bioresource Technology, 2003.

Rizofiltracin
Se emplea en el tratamiento de contaminaciones por:
- Metales (Pb2+, Cd2+, Zn2+, Ni2+, Cu2+) - Radioistopos (137Cd, 90Sr, U) - Compuestos orgnicos hidroflicos

Caractersticas deseables en la planta:

- Debe tener races de crecimiento rpido y ramificacin abundante. - Debe poder remover metales txicos por perodos prolongados. - No debe ser un translocador eficiente al tallo.

La remocin tiene distintos componentes:

- Componente rpido: combinacin de procesos fsicos y qumicos (quelacin, intercambio inico, adsorcin); puede ocurrir en races muertas. Agrobiotecnologa
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- Componentes intermedios: Incluyen captura intracelular, deposicin en la vacuola y translocacin a los tallos. - Componente lento: precipitacin mediada por la raz; involucra exudados de la raz.

Rizofiltracin

Las plantas -acuticas son buenos candidatos para encarar procesos de rizofiltracin
Plantas acuticas sumergentes:
- Algas - Chara vulgaris - Myriophyllum aquaticum - Myriophyllum spicatum - Hydrilla verticillata

Plantas acuticas emergentes:

- Scirpus validus - Typha latifolia - Ceratophyllum demersum - Potamogeton pectinatus - Maranta arundinaceae - Lemna spp

Flujo vertical

Scirpus validus

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Capas de arena y grava

Eflujo

Esquema de rizofiltracin basado en Scirpus validus

Rizofiltracin de uranio usando cultivos de races de Brassica juncea y Chenopodium amaranticolor

Agrobacterium rhizogenes es capaz de transformar races y provocar el sobrecrecimiento de las mismas.

Tejido radicular de Brassica juncea y de Chenopodium amaranticolor.

B. juncea C. amaranticolor

Se utilizaron races transformadas de ambas especies para remover U de soluciones con baja concentracin.
B. juncea C. amaranticolor

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Tasa de acumulacin de U en races de Brassica juncea y de Chenopodium amaranticolor. Los valores se expresan como g U/g tejido seco.

g U/g tejido seco

Concentracin de U (M)

g U/g tejido seco

Concentracin de U (M)
Tomado de: Eapen et al., Environmental Research, 2003.

Rizofiltracin de uranio usando cultivos de races de Brassica juncea y Chenopodium amaranticolor

Se utilizaron races transformadas de ambas especies para remover U de soluciones con alta concentracin. Para todas las concentraciones utilizadas, el 90% del U fue absorbido por las races dentro de las 10 h de tratamiento.
B. juncea C. amaranticolor

g U/g D.w.t. ( X10 3)

Tasa de acumulacin de U en races de Brassica juncea y de Chenopodium amaranticolor. Los valores se expresan como g U/g tejido seco.

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Concentracin de U (M)
Tomado de: Eapen et al., Environmental Research, 2003.

Las races transformadas de ambas especies podran usarse como bioabsorbentes de uranio, para lo cual podran producirse a gran escala en biorreactores.

Fitotransformacin

La fitotransformacin comprende los procesos de fitodegradacin y fitovolatilizacin

Empleada en tratamientos de contaminacin por:
Herbicidas (atrazina, alaclor) Aromticos (BTEX: benceno, tolueno, etilbenceno y xilenos) Alifticos clorinados (TCE: tricloroetileno; tetracloroetileno) Deshechos de nutrientes (NO3-, NH4+, PO43-) Deshechos explosivos (TNT; RDX: hexahidrotrinitrotriazina)

Depende de:
Concentracin del compuesto disuelto en el suelo Eficiencia de captura, que depende de: - las propiedades fsico-qumicas del compuesto - especie qumica - propiedades de la especie vegetal Agrobiotecnologa
Fitorremediacin

Tasa de transpiracin, que depende de: - el tipo de planta - rea foliar - nutrientes - humedad del suelo - temperatura - viento - humedad relativa

Fitotransformacin

Una vez translocado, el compuesto puede tener los siguientes destinos:

- Almacenamiento del producto (o de sus productos de .degradacin) va conjugacin o lignificacin - Metabolizacin a distintos productos de degradacin - Volatilizacin por la transpiracin - Mineralizacin (CO2 + H2O)

Plantas tpicas empleadas en fitotransformacin:

- Arboles freatfitos (lamo, sauce, lamo americano) - Pasturas (centeno, sorgo, festuca) - Leguminosas (trbol, alfalfa, caup)

Agrobiotecnologa
Fitorremediacin

Fitodegradacin de compuestos orgnicos

Las plantas pueden desarrollar una serie de reacciones para metabolizar o mineralizar compuestos orgnicos
Enzimas Nitroreductasas Rol natural Su funcin es la reduccin de nitrato para obtener nitrgeno destinado al crecimiento celular Estn vinculadas a la degradacin de subproductos de etileno durante la senescencia Detoxifican compuestos aromticos cianamidados naturales Su rol es el procesamiento de fosfato durante el desarrollo Intervienen en la lignificacin y delignificacin por adicin de oxgeno Aplicaciones en fitorremediacin Reducen grupos nitrato en explosivos y otros compuestos nitroaromticos y remueven el nitrgeno del anillo aromtico Deshalogenan solventes clorinados

Deshalogenasas

Nitrilasas

Procesan grupos cianidados de los anillos aromticos en herbicidas y otros compuestos cianidados Procesan grupos fosfato de pesticidas organofosfatados y de compuestos que afectan el sistema nervioso Completan la degradacin del TNT. Aparentemente involucradas en la incorporacin de fragmentos de anillos aromticos en la biomasa vegetal Empleadas en el tratamiento de aguas residuales para degradar fenoles
Tomado de: McCutcheon, PBI Bulletin, 1998.

Fosfatasas

Lacasas

Peroxidasas

Degradan en forma no especfica compuestos fenlicos, lignina, y otros

Contaminacin con explosivos

Las tcnicas tradicionales se basan en la . incineracin o en utilizacin de microorganismos . e implican remocin del suelo La alternativa frente a las tcnicas tradicionales fue . usar sistemas de fitorremediacin:
- Cultivos celulares de remolacha que degradan nitroglicerina (GNT) - Plantas acuticas y cultivos de races que biotransforman trinitroglicerina (TNT)

El xito fue limitado, ya que la GNT slo pudo ser . denitrificado a di- y mononitroglicerol; la remocin . completa de grupos nitratos no se logr nunca. Adems, la degradacin de TNT produjo la . acumulacin de otra toxina: aminodinitrotolueno. Otra desventaja es que las plantas captan y . metabolizan los compuestos nitrogenados 10 veces . ms lentamente que los microorganismos.

Agrobiotecnologa
Fitorremediacin

Rutas de degradacin del TNT mediante nitroreductasas y lacasas vegetales

Tomado de: McCutcheon, PBI Bulletin 1998.

Agrobiotecnologa
Fitorremediacin

ADNT: aminodinitrotolueno; DANT: diaminonitrotolueno; TAT: triaminotolueno; TNT: trinitrotolueno

Detoxificacin de TNT por plantas de tabaco transformadas con el gen de nitroreductasa de Enterobacter cloacae

Crecimiento brotes de tabaco no transformado y transgnico (NR 3-2) en medio lquido.

Sin TNT TNT 0,25 mM

NT

NR 3-2

NT

NR 3-2

Crecimiento de plantas de tabaco no transformado y transgnicas (NR 3-2) luego de la germinacin en medio conteniendo explosivos.
Sin TNT TNT 0,05 mM TNT 0,1 mM

Agrobiotecnologa
Fitorremediacin
NT NT NR NR 3-2 3-2 NT NT NR NR 3-2 3-2 NT NT NR NR 3-2 3-2

Tomado de: Hannik et al., Nature Biotechnology, 2001.

Detoxificacin de TNT por plantas de tabaco que expresan el gen de nitroreductasa de Enterobacter cloacae

Crecimiento de races para brotes de plantas no transformadas (NT) y transgnicas (NR 3-2) luego de 21 das de exposicin a TNT
NT
TNT (mM) 0 0,05 0,1 Longitud de las races (cm e.s.) 8,1 0,1 5,5 0,6 0,2 Indice de tolerancia de las races (%) 100 68 3

NR 3-2
Longitud de las races (cm e.s.) 8,1 0,1 6,2 0,9 5,5 0,9 Indice de tolerancia de las races (%) 100 77 68

Tomado de: Hannik et al., Nature Biotechnology, 2001.

e.s.= Error estndar Indice de tolerancia = longitud de las races de brotes tratados con TNT/longitud de las races de brotes control x 100

Detoxificacin de TNT por plantas de tabaco que expresan el gen de nitroreductasa de Enterobacter cloacae
Estudios de toxicidad de TNT en plantas no transformadas (NT) y transgnicas (NR 3-2)
NT
Peso antes del TNT (g) 11,37 0,17 11,2 0,14 11,59 0,01 Peso despus del TNT (g) 16,9 0,28 11,3 0,02 7,59 0,19 Ganancia / prdida de peso (g) +5,52 0,45 +0,13 0,15 -4,00 0,21 Peso antes del TNT (g) 11,08 0,05 11,4 0,95 11,93 0,18

NR 3-2
Peso despus del TNT (g) 16,88 0,18 14,65 0,07 13,95 1,20 Ganancia / prdida de peso (g) +5,79 0,23 +3,24 0,88 -2,02 1,01

TNT (mM) 0 0,1 0,25

Tomado de: Hannik et al., Nature Biotechnology, 2001.

Detoxificacin de RDX por plantas de Arabidopsis que expresan el gen XlpA de Rhodococcus rhodocochrous
El explosivo hexahidro 1,3,5-trinitro-1,3,5-triazina (RDX) es txico para todo tipo . de organismos y un posible carcingeno. Su degradacin ambiental es muy lenta . y su presencia en suelos y napas de agua constituye un problema grave. El RDX es txico para las plantas. El hongo Phanerochaete chrysosporium y las . bacterias del gnero Rhodococcus son capaces de degradar RDX, pero no . desarrollan suficiente biomasa para ser utilizados en procesos de biodegradacin. La molcula responsable de la degradacin es un citocromo P450. Como prueba . de concepto, se aisl el gen de citocromo P450 XplA de Rhodococcus . rhodocochrous y se lo expres en plantas de Arabidopsis thaliana. Las plantas . . fueron utilizadas en ensayos de detoxificacin de suelos contaminados con RDX.
Tomado de: Rylott et al., Nature Biotechnology, 2006.

4-nitro-2,4-diazabutanal

Ruta de degradacin de RDX por el citocromo P450 codificado por el gen XplA de R. rhodocochrous y ensayos de actividad realizados con protena expresada en E. coli. Los controles fueron realizados con protena sometida a 100oC.

Detoxificacin de RDX por plantas de Arabidopsis que expresan el gen XlpA de Rhodococcus rhodocochrous
Caracterizacin de plantas transgnicas que expresan el gen XplA

Tomado de: Rylott et al., Nature Biotechnology, 2006.

a) Anlisis de Northern y Western blot de lneas de A. thaliana que expresan el gen XplA en forma constitutiva. b) Captacin de RDX de medio acuoso por plntulas de A. thaliana. Los resultados son el promedio de repeticiones de cinco experimentos.

Detoxificacin de RDX por plantas de Arabidopsis que expresan el gen XlpA de Rhodococcus rhodocochrous
Tomado de: Rylott et al., Nature Biotechnology, 2006.

Estudios en suelos contaminados con RDX empleando plantas wild type y transformadas con 35S::XPLA. Se cultivaron plantas de A. thaliana de 8 semanas de edad en suelo conteniendo 50, 250, 500 y 2000 mg de RDX/Kg de suelo. Se muestran las mediciones de biomasa (tallos y races) obtenidos en las diferentes condiciones experimentales (promedio de cinco ensayos).

El ciclo biogeoqumico del mercurio y de la biomagnificacin de metilmercurio

Principales interconversiones del mercurio en el medio ambiente

Agrobiotecnologa
Fitorremediacin
Hg(0): mercurio elemental Hg(II): mercurio inico libre RSHg: mercurio unido a azufre MeHg: metilmercurio

Expresin de los genes merA y mer B de Desulfovibrio desulfuricans en plantas transgnicas de Arabidopsis thaliana

No se conocen plantas capaces de detoxificar Hg. En cambio, existen microorganismos presentes en los sitios contaminados que poseen dos enzimas (organomercrico liasa, gen merB, y mercrico reductasa, gen merA) que permiten convertir metilmercurio en Hg elemental, detoxificado este metal. Se transformaron plantas de Arabidopsis thaliana con los dos genes mencionados aislados de Desulfovibrio desulfuricans.

R-CH2-Hg+ + H+ Hg(II) + NADPH

Agrobiotecnologa
Fitorremediacin

MerB MerA

R-CH3 + Hg(II) Hg(0) + NAD+ + H+

MerB: organomercrico liasa MerA: mercrico reductasa

Expresin de los genes merA y mer B de Desulfovibrio desulfuricans en plantas transgnicas de Arabidopsis thaliana

merB merA/B-1 merA NT

merB merA/B-1 merA NT

merB merA/B-1 merA NT

merB merA/B-1 merA NT

0 M

1 M

5 M

10 M

Plantas NT y transgnicas creciendo en medios con mercurio orgnico.

NT A/B-1 A/B-2 A/B-3 NT A/B-1 A/B-2 A/B-3

Fenotipos de resistencia a mercurio orgnico de plantas control y de 3 lneas transgnicas para merA/merB 0 M PMA
A/B-4 A/B-5 A/B-6

5 M PMA
A/B-4 A/B-5 A/B-6

pg Hg(0).min-1/mg de tejido

Agrobiotecnologa
Fitorremediacin

Tasas de volatilizacin de Hg(0) en plantas control y en 6 lneas transgnicas de A. thaliana

Lneas de plantas

Tomado de: Bizily et al., Nature Biotechnology, 2000.

Fitorremediacin de organomercuriales va transformacin de cloroplastos (genes merA y mer B de Desulfovibrio desulfuricans)

Se transformaron cloroplastos de tabaco con dos versiones de esta construccin con y sin regin 3 no traductible (3 UTR) portando el opern MerAB
16S trnI P trnA 3UTR

aadA

merB

merA

Efecto de la concentracin de acetato de fenilmercurio en el crecimiento de plantas de tabaco controles (NT) y transgnicas (5A y 9)
NT 5A 9

Concentracin de PMA

Agrobiotecnologa
Fitorremediacin

Tomado de: Ruiz et al., Plant Physiol., 2003.

Aumento de la acumulacin y tolerancia a selenio en plantas transgnicas de Arabidopsis que expresan la enzima selenocistena liasa I de ratn

La toxicidad del selenio (Se) se debe a la . incorporacin inespecfica de selenocistena . (Se-Cys) a las protenas.

Estrategia:
Expresar el gen de la selonocistena liasa de ratn en citoplasma y cloroplastos de Arabidopsis thaliana

Agrobiotecnologa
Fitorremediacin

Se-Cys

Se-Cys liasa

Se elemental + alanina

Aumento de la acumulacin y tolerancia a selenio en plantas transgnicas de Arabidopsis thaliana

g Se g protein -

Incorporacin de Se a protenas en brotes de Arabidopsis thaliana no transgnicas (NT) y transgnicas (citoslicas y plastdicas) Control

NT

cit SL

cp SL

Control
50 M Se-Cys

Tolerancia a Se-Cys selenato y selenito de brotes de Arabidopsis no transgnicos y transgnicos.

50 M Se-Cys

Largo de races (mm)

25 M SeO2-3

Agrobiotecnologa
Fitorremediacin

25 M SeO2-3 50 M SeO2-4

50 M SeO2-4

Tomado de: Pilon et al., Plant Physiol., 2003.

NT

cyt SL cp SL

Fitoestimulacin
Las plantas proveen el hbitat para el incremento en el tamao y actividad de poblaciones microbianas. Los exudados vegetales estimulan las transformaciones efectuadas por las bacterias (induccin enzimtica). La sntesis de carbn orgnico aumenta la tasa de mineralizacin microbiana (enriquecimiento de sustrato). El oxgeno que difunde con las races asegura un medio adecuado para las transformaciones . aerbicas.
Agrobiotecnologa
Fitorremediacin

Los hongos micorrticos asociados a las races vegetales metabolizan contaminantes orgnicos.

Fitoestimulacin
Empleado en el tratamiento de contaminacin orgnica causada por pesticidas (atrazina), compuestos . aromticos, e hidrocarburos aromticos policclicos . (PAHs) Se basa en la liberacin por la planta de exudados entre los que se incluyen: - cidos orgnicos de cadena corta - compuestos fenlicos - bajas concentraciones de enzimas y pptidos Plantas tpicas empleadas en fitoestimulacin: - Liberadoras de compuestos fenlicos (mora, manzano, Maclura pomfera) - Pastos con races fibrosas (centeno, festuca) para contaminantes hasta 1 metro de profundidad - Arboles freatfitos para contaminantes hasta 3 metros de profundidad - Plantas acuticas para sedimentos

Agrobiotecnologa
Fitorremediacin

Fitoestabilizacin

Empleada en el tratamiento de contaminacin por: - Metales (Pb2+, Cd2+, Zn2+, As2+, Cu2+, Se2+, U) - Compuestos orgnicos hidrofbicos: hidrocarbonos aromticos policiclcos (PAHs), bifenilos policlorados (PCBs), dioxinas, furanos, pentaclorofenol, DDT, dieldrina Caractersticas deseables en la planta: - Debe tolerar altos niveles de metales txicos - Debe inmovilizar los metales va captura y posterior precipitacin y reduccin - Debe acumular bajas concentraciones en las races Plantas tpicas empleadas en fitoestabilizacin:

Agrobiotecnologa
Fitorremediacin

- Arboles freatrfitos que transpiren grandes volmenes de H2O - Pastos con races fibrosas que estabilicen la erosin del suelo - Plantas con sistemas radiculares robustos capaces de absorber/unir contaminantes

Referencias

1. 2.

Pilon-Smits. Phytorremediation. Annual Review of Plant Biology, 56:15-39. 2005. Eapen and DSouza. Prospects of genetic engineering of plants for phytoremediation of toxic metals. Advances in Biotechnology, 23:97-114, 2005. Mejre, M. and Bulow, L. Metal binding proteins and peptides in bioremediation and phytoremediation of heavy metals. Trends in Biotechnology, 19:67-73, 2001. Kovalchuk, O., Titov, V. Hohn, B. and Kovalchuk, I. A sensitive trangenic plant system to detect toxic inorganic compounds in the environment. Nature Biotechnology, 19:568-572, 2001. Salt, D. E., Smith, R.D., and Raskin I. Phytoremediation. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, 49:643-668, 1998. http://www.hawaii.edu/abrp/Technologies http://www.envirotools.org/factsheets/phytoremediation.shtml

3.

4.

5.

Agrobiotecnologa

6.
Fitorremediacin

7.