PRODUCCIN Y CARACTERIZACIN DE POLIHIDROXIALCANOATOS, SINTETIZADOS POR MICROORGANISMOS NATIVOS A PARTIR DE RESIDUOS GRASOS

Javier Ricardo Gmez Cardozo Tesis de Grado presentada para optar al Ttulo de Magster en Ciencias-Biotecnologa

DIRECTOR Amanda Lucia Mora Martnez Qumica, M.Sc, D.Sc.

ASESORES Mara del Socorro Yepes Prez Qumica, M.Sc.

Guillermo Correa Londoo Ingeniero Forestal, M.Sc, Ph.D

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA SEDE MEDELLN FACULTAD DE CIENCIAS 2013

A mis padres

A mis hermanos

Con gratitud y cario

AGRADECIMIENTOS

A mis padres sencillamente por todo, sin ellos esto no hubiera sido posible.

A la profesora Amanda Lucia Mora Martnez por acogerme en su grupo de investigacin y guiarme en este proceso que enmarca mi inicio en el campo investigativo.

A la profesora Mara del Socorro Yepes Prez por aceptarme en el Laboratorio de Venenos Naturales y, por todas las enseanzas, asesoras y consejos durante el desarrollo del trabajo.

Al profesor Guillermo Correa Londoo por sus asesoras y su orientacin en este trabajo.

A la profesora Blanca Cecilia Salazar lzate por facilitarnos el espacio y los equipos del laboratorio de Anlisis y Procesos Ambientales, para desarrollar este trabajo.

Al profesor Mauricio Alejando Marn por facilitarnos el espacio y los equipos del Laboratorio de Biologa Celular y Molecular, para desarrollar parte de este trabajo.

A la profesora Blanca Fabiola Espejos Benavidez por facilitarnos los equipos de su laboratorio, para desarrollar parte de este trabajo.

A mis compaeros de grupo: Alejo, Jersson, Xiomy, Cata, Cris, Pao, Oscar, Ana Caro y a todos los integrantes del grupo PROBIOM que siempre estuvieron dispuestos a ayudar y a dar la mano.

A mis compaeros de estudio: Rodrigo y Olga quienes siempre estuvieron dispuestos a colaborarme y ayudarme durante el desarrollo de este trabajo.

A todas las personas que de una u otra manera hicieron parte colaborando con este trabajo.

CONTENIDO INDICE DE TABLAS ............................................................................................................ 1 INDICE DE FIGURAS .......................................................................................................... 4 ABREVIATURAS ................................................................................................................. 6 RESUMEN ............................................................................................................................. 9 1. 2. INTRODUCCIN ........................................................................................................ 10 MARCO TERICO ..................................................................................................... 13 2.1 2.1.1 LOS BIOPOLMEROS ........................................................................................ 13 Clasificacin de los biopolmeros .................................................................... 14

2.1.1.1 Biopolmeros producidos directamente por organismos vivos. ................... 14 2.1.1.2 Biopolmeros producidos mediante polimerizacin de monmeros. ........... 14 2.1.1.3 Biopolmeros producidos mediante combinacin de monmeros. .............. 15 2.1.1.4 Biopolmeros obtenidos de mezclas de materiales. ..................................... 15 2.1.2 2.1.3 2.1.4 2.2 2.2.1 2.2.2 2.2.3 2.3 Fuentes naturales de biopolmeros ................................................................... 15 Uso de los biopolmeros ................................................................................... 16 Ventajas y desventajas de los biopolmeros ..................................................... 17 PLSTICOS BIODEGRADABLES O BIOPLSTICOS .................................. 18 Plsticos sintetizados qumicamente. ............................................................... 18 Plsticos semi-biodegradables o plsticos a base de almidn. ......................... 19 Plsticos completamente biodegradables ......................................................... 19 POLIHIDROXIALCANOATOS ......................................................................... 19

2.3.1 Estructura y propiedades de los PHA ................................................................. 21 2.3.2 Clasificacin de PHA ......................................................................................... 23 2.3.3 Aplicaciones de los PHA ..................................................................................... 24 2.3.4 Principales productores de PHA a nivel mundial ............................................... 25 2.4 SNTESIS DE PHA .............................................................................................. 27

2.4.1 Sntesis qumica de PHA .................................................................................... 27

2.4.2 Sntesis biolgica de PHA .................................................................................. 28 2.4.2.1 Rutas metablicas ........................................................................................ 30 2.4.2.2 Sustratos empleados en la produccin bacteriana de PHA......................... 33 2.5 2.5.1 PRODUCCIN DE PHA ..................................................................................... 35 Produccin de PHA in vitro ............................................................................ 35

2.5.2 Produccin de PHA mediante fermentacin microbiana .................................. 35 2.3.3 2.6 2.7 Produccin de PHA en plantas transgnicas ................................................... 38 MTODOS DE EXTRACCIN DE PHA. ......................................................... 38 MTODOS DE DETECCIN, CUANTIFICACIN Y CARACTERIZACIN

DE PHA. ........................................................................................................................... 40 3. OBJETIVOS ................................................................................................................. 42 3.1 OBJETIVO GENERAL ............................................................................................. 42 3.2 OBJETIVOS ESPECFICOS ..................................................................................... 42 4. METODOLOGA......................................................................................................... 43 4.1 LUGAR DE EXPERIMENTACIN ....................................................................... 43 4.2 MATERIALES Y REACTIVOS ........................................................................... 43

4.2.1 Reactivos y equipos menores .............................................................................. 43 4.2.2 Sustratos .............................................................................................................. 44 4.3 CEPAS BACTERIANAS .......................................................................................... 47 4.4 MEDIOS DE CULTIVOS ........................................................................................ 48 4.4.1 Medio de cultivo con lactosuero como fuente de Carbono. ............................... 49 4.4.2 Medios de cultivo con aceites (ricino, Jatropha, frituras) como fuentes de Carbono. ....................................................................................................................... 49 4.4.3 Medios de cultivo con glicerol comercial y glicerol residual como fuentes de carbono. ........................................................................................................................ 50 4.5 CONDICIONES DE CRECIMIENTO MICROBIANO........................................... 51

4.5.1 Fermentaciones con lactosuero como fuente de carbono ................................... 51 4.5.2 Fermentaciones con aceites (Jatropha, ricino, frituras) y glicerol (GGR), como fuentes de Carbono. ...................................................................................................... 52 4.5.3 Fermentaciones con glicerol residual (GRSB) como fuente de Carbono........... 53 4.6 MEJORES CONDICIONES OPERACIONALES PARA LA PRODUCCIN DE PHA EN EL SISTEMA BACTERIA: SUSTRATO. ...................................................... 53 4.7 METODOLOGAS DE ANLISIS .......................................................................... 56 5. RESULTADOS Y DISCUSIN .................................................................................. 58 5.1 SELECCIN DEL SISTEMA BACTERIA: SUSTRATO ..................................... 58 5.1.1 EVALUACIN DE LAS FERMENTACIONES CON EL SISTEMA

BACTERIA: LACTOSUERO...................................................................................... 58 5.1.1.1 Sistema Lactococcus lactis: Lactosuero ....................................................... 58 5.1.1.2 Sistema Bacillus sp: Lactosuero .................................................................. 59 5.1.2.3 Sistema B. megaterium : glicerol residual (GRSB) .................................... 68 5.2 MEJORES CONDICIONES OPERACIONALES PARA LA PRODUCCIN DE PHA EN EL SISTEMA BACTERIA: GLICEROL RESIDUAL ................................... 70 5.2.1 Produccin de biomasa seca y de PHA ............................................................... 72 5.2.2 Superficies de respuesta produccin de biomasa ............................................. 75

5.2.3 Superficies de respuesta produccin de PHA ..................................................... 80 5.3.4 Superficies de respuesta rendimiento de sustrato en producto global Yp/s ....... 86 6. CONCLUSIONES ........................................................................................................ 92 BIBLIOGRAFA .............................................................................................................. 94 ANEXOS ............................................................................................................................ 106 ANEXO A. ANLISIS ESTADSTICO ....................................................................... 106 ANEXO B. CALIBRACIN - CARACTERIZACIN DEL PHA POR GC/MS. Error! Marcador no definido.

INDICE DE TABLAS Tabla 1. Principales fuentes naturales de biopolmeros.. 15 Tabla 2. Algunos biopolmeros y sus aplicaciones.. 16 Tabla 3. Ventajas y desventajas del empleo industrial de los biopolmeros 17 Tabla 4. Algunas propiedades fsico-qumicas de los PHA y de otros plsticos sintticos. 23 Tabla 5. Aplicaciones de PHA en distintos campos.. 24 Tabla 6. Principales productores de PHA en el mundo26 Tabla 7. Precios de mercado de biopolmeros y polmeros derivados del petrleo en el ao 2009.. 27 Tabla 8. PHA sintetizados por diferentes bacterias.28 Tabla 9. Produccin bacteriana de PHA a partir de diferentes sustratos puros... 33 Tabla10. Produccin bacteriana de PHA a partir de diferentes desechos

agroindustriales. 34 Tabla 11. Valores de pH para diferentes cepas microbianas empleadas en la produccin de PHA.. 37 Tabla 12. Mtodos de extraccin de PHA...39 Tabla 13. Equipos y reactivos utilizados en el desarrollo de la investigacin. 43 Tabla 14. Composicin Qumica de los aceites de Jatropha, Ricino y Palma. .45 Tabla 15. Composicin Qumica de lactosuero . 46 Tabla 16. Composicin caracterstica de Glicerol Grado reactivo (GRR)...46 Tabla 17. Composicin del glicerol en la fase obtenida por decantacin, en la produccin de biodiesel a partir de aceite de palma47 Tabla 18. Diseo factorial para la seleccin del mejor sistema bacteria:sustrato ..52 Tabla 19. Niveles para cada factor evaluado en la produccin de PHA... 54 Tabla 20. Diseo experimental superficies de respuesta..55 Tabla 21. Valores de biomasa seca obtenidos en el sistema de fermentacin L. lactisLactosuero. 58 Tabla 22. Valores de biomasa seca obtenidos en el sistema de fermentacin Bacillus spLactosuero. 60
1

Tabla 23.

Valores

de biomasa seca obtenidos en el sistema de fermentacin

B. megaterium-Lactosuero ... 61 Tabla 24. Concentracin del monmero metileter metilester del cido 3-hidroxibutrico en los extractos de diferentes sistemas bacteria: Lactosuero... 62 Tabla 25. Valores de biomasa seca obtenida con B. megaterium, Bacillus sp., L. lactis en medios enriquecidos con diferentes fuentes de carbono. (aceite de fritura, aceite de ricino, aceite de Jatropha y glicerol) 64 Tabla 26. Extractos polimricos obtenidos para B. megaterium, Bacillus sp., L. lactis en medios enriquecidos con diferentes fuentes de carbono (glicerol (GGR) , aceite de: frituras, ricino, Jatropha)... 65 Tabla 27.Concentracin del monmero metileter metilester del cido 3-hidroxibutrico en los extractos los sistemas B. megaterium: Glicerol; B. megaterium: aceite de frituras 67 Tabla 28. Valores de biomasa seca producida en los sistemas B. megaterium-glicerol RSB y B. megaterium-glucosa.. 68 Tabla 29. Produccin de PHA diferentes cepas bacterianas, empleando glicerol como sustrato. 71

Tabla 30. Biomasa seca y concentracin de PHA obtenidos en el sistema B. megateriumGRSB, Temperatura: 25C....72 Tabla 31. Biomasa seca y concentracin de PHA obtenido en el sistema B. megateriumGRSB, Temperatura: 30C. 73

Tabla 32. Biomasa seca y concentracin de PHA obtenido en el sistema B. megateriumGRSB, Temperatura: 35C74 Tabla 33. Valores ptimos estimados de pH, concentracin para cada una de las

temperaturas evaluadas (25C, 30 C y 35 C), que permiten la mxima produccin de biomasa en el sistema B. megaterium: glicerol residual... 80 Tabla 34. Valores ptimos estimados de pH, concentracin para cada una de las

temperaturas evaluadas (25C, 30 C y 35 C), que permiten la mxima produccin de PHA en el sistema B. megaterium: glicerol residual.85

Tabla 35. Valores ptimos estimados de

pH, concentracin para cada una de

las

temperaturas evaluadas (25C, 30 C y 35 C), que permiten el mximo rendimiento Yp/s en el sistema B. megaterium: glicerol residual. 91

INDICE DE FIGURAS

Figura 1. Ciclo de vida de los PHA. ................................................................................... 21 Figura 2. Estructura qumica de PHA producidos en bacterias. .......................................... 22 Figura 3. Reaccin de biosntesis de PHB........................................................................... 29 Figura 4. Micrografa de trasmisin electrnica (TEM) de secciones delgadas de clulas de C. nector PHB24 recombinadas que contienen grandes cantidades (90% peso seco de las clulas) de PHB-co-5% mol de HHx.. ................................................................... 30 Figura 5. Biosntesis de PHA.. ............................................................................................ 31 Figura 6. Biosntesis para homopolmeros y copolmeros de PHA a partir de diferentes fuentes de carbono (glucosa, glicerol y cidos grasos) ................................................ 32 Figura 7. Morfologa macro y microscpica de las colonias de cepas ............................... 48 Figura 8. Aceites empleados en las diferentes fermentaciones ........................................... 50 Figura 9. Crecimiento de L. lactis en Lactosuero ................................................................ 59 Figura 10. Crecimiento de Bacillus sp., en Lactosuero ...................................................... 60 Figura 11. Crecimiento de B. megaterium en Lactosuero .................................................. 61 Figura 12. Biomasa seca obtenida en los diferentes sistemas (microorganismo-sustrato). 64 Figura 13. Espectros de masas (GC/MS) de los metilester derivados de (a) cido 3hidroxibutrico (PHB) comercial;(b) extracto polimrico obtenido de la fermentacin con el sistema B megaterium- glicerol y (c) extracto polimrico obtenido de la

fermentacin con el sistema B megaterium- A. de frituras ......................................... 67 Figura 14. Curvas de crecimiento de B. megaterium en glicerol residual y B. megaterium en glucosa ..................................................................................................................... 69 Figura 15. Biomasa obtenida en el sistema B. megaterium: glicerol residual 25 C... ...... 76 Figura 16. Biomasa obtenida en el sistema B. megaterium: glicerol residual 30C.. ......... 77 Figura 17. Biomasa obtenida en el sistema B. megaterium: glicerol residual 35C.. ........ 78 Figura 18. Efectos principales de cada una de las condiciones operacionales evaluadas sobre la produccin de biomasa................................................................................... 79 Figura 19. Produccin de PHA en el sistema B. megaterium: glicerol residual a 25 C... 82 Figura 20. Produccin de PHA en el sistema B. megaterium: glicerol residual a 30 C... . 83

Figura 21. Produccin de PHA en el sistema B. megaterium: glicerol residual a 35 C... 84 Figura 22. Efectos principales sobre concentracin de PHA , de cada una de las condiciones operacionales evaluadas ........................................................................... 85 Figura 23. Rendimiento de PHA por unidad de sustrato en el sistema B. megaterium: glicerol a 25 C..............................................................................................................87 Figura 24. Rendimiento de PHA por unidad de sustrato en el sistema B megaterium: glicerol a 30 C..88 Figura 25. Rendimiento de PHA por unidad de sustrato en el sistema B megaterium: glicerol a 35 C.. .......................................................................................................... 89 Figura 26. Efectos principales sobre el rendimiento de producto por unidad de sustrato Yp/s, de cada una de las condiciones operacionales evaluadas. ................................... 90

ABREVIATURAS

CMC: carboximetilcelulosa

FTIR: espectroscopia infrarroja con transformada de Fourier ( por su abreviatura en ingles, Fourier Transform Infrared Spectroscopy)

GC: cromatografa de gases (Por su abreviatura en ingles, Gas Chromatography)

GC-MSD: cromatografa de gases con detector selectivo de masa (Por su abreviatura en ingles Gas Chromatography/Mass Selective Detector)

HA:

cidos hidroxialcanocos (por su abreviatura en ingls, Hidroxialkanoic Acid)

HHx: hidroxihexanoato

mBar: milibares

MMS: medio mnimo de sales

PBTA: polibutileno tereftalato adipato

PBTS: polibutileno tereftalato succinato

PBTG: polibutileno tereftalato glutarato

PCL: policaprolactonas

PEA: polisteramidas

PEBDL: polietileno lineal de baja densidad a base de bioetanol

PDO: propanodiol (Por su abreviatura en ingles, Propane-1,3-diol)

PGA: cido poligliclico (por su abreviatura en ingls, Polyglycolic Acid)

PHA: polihidroxialcanoatos

PLA: cido polilctico (por su abreviatura en ingls, Polylactic Acid)

PHASCL: polihidroxialcanoatos de longitud de cadena corta PHAMCL: polihidroxialcanoatos de longitud de cadena media PHALCL: polihidroxialcanoatos de longitud de cadena larga PHB: poli (3-hidroxibutirato)

PHV: polihidroxivalerato

PHBH: poli (3-hidroxibutiraro-4-hidroxibutiraro)

PVA: alcohol polivinlico (por su abreviatura en ingls, Polyvinyl Alcohol)

PP: polipropileno.

PS: Poliestireno.

PEBD: polietileno de baja densidad.

RMN- 13C: resonancia magntica nuclear de Carbono-13. RMN- 1H: resonancia magntica nuclear de Hidrogeno-1.

SDS: dodecilsulfato sdico.

SET: solucin de elementos traza.

SAS: Statistical Analisys System.

TEM: micrografa de trasmisin electrnica (Por su abreviatura en ingles, Transmission Electron Microscopy).

YP/S : rendimiento de producto por unidad de sustrato.

RESUMEN

Los Polihidroxialcanoatos (PHA) son plsticos biocompatibles y biodegradables sintetizados por una amplia variedad de microorganismo (hongos y bacterias) as como de algunos organismos como las plantas, que comparten caractersticas con los plsticos de origen petroqumico. Los estudios ms recientes se centran en la bsqueda de sustratos econmicos y en estrategias de extraccin que permitan la reduccin de los costos del producto y, de esta forma, puedan incursionar en un mercado ampliamente difundido cual es el de los plsticos derivados del petrleo. En este trabajo, la produccin de polihidroxialcanoatos (PHB) fue evaluada empleando las cepas nativas: Bacillus megaterium, Bacillus sp. y Lactococcus lactis, y como sustratos: glicerol grado reactivo (GGR), glicerol residual (GRSB) subproducto de la produccin de biodiesel a partir de aceite de palma, aceite de Jatropha, aceite de ricino y aceites de fritura y lactosuero. Se evaluaron a escala de laboratorio los diferentes sistemas bacteria-sustrato a diferentes condiciones de temperatura, pH y concentracin de sustrato, en un proceso fermentativo por lotes utilizando matraces de 250 mL, con un volumen de trabajo de 50 mL, todos los sistemas se evaluaron por triplicado. El crecimiento bacteriano se dio en todos los sistemas evaluados sin embargo, el sistema B. megaterium-GGR fue el que gener la mayor

acumulacin de PHA. Con base a esto, se propuso realizar el diseo estadstico de optimizacin con el GRSB. Para este sistema se encontr un ptimo de produccin de PHB (2.80 g/L) bajo las siguientes condiciones operacionales: GRSB, 15 g/L, pH 7.0 y temperatura 25C. Sin embargo el ptimo de biomasa (5.42 g/L) se da a un pH 9.0 y una concentracin de sustrato de 22 g/L, con una temperatura de 25C. Palabras claves: biopolmero, polihidroxialcanoatos, glicerol, glicerol residual (GRSB), aceites, lactosuero, Bacillus megaterium, fermentacin.

1. INTRODUCCIN

Los Biopolmeros, son sustancias producidas a partir de fuentes renovables, que dan lugar a plsticos biodegradables y por tanto, pueden ser una alternativa a los problemas ambientales y sociales que son generados por la industria de los plsticos de origen petroqumico. Los plsticos derivados del petrleo, son muy resistentes a la temperatura, la presin, los solventes qumicos, la luz UV, entre otros factores, por lo que son muy utilizados en todos los campos de la industria, as por ejemplo, mientras en 1950 se produjeron 1.5 millones de toneladas (mTon) de plsticos, para el 2010 se reportaron 250 mTon y se prev que llegar a 330 mTon para el 2015 (Castro, 2011). La produccin de plsticos a gran escala (con un incremento anual alrededor del 6.5 % para los prximos 5 aos) resulta, finalmente, en una acumulacin exponencial de desechos plsticos en el medio ambiente (Chanprateep, 2010) y en la contaminacin de cuerpos de aguas y suelos, lo que tiene un impacto negativo en la salud humana y la de los seres vivos, convirtindolos en un problema social de alto inters (Cavalheiro et al., 2009). Debido a esto, en las ltimas dcadas, investigadores de todo el mundo, se han enfocado en la produccin de polmeros biodegradables, empleando diferentes mtodos y

procedimientos, principalmente en los de la familia de los polihidroxialcanoatos (PHA) y sus derivados (polilcticos, polisteres alifticos, polisacridos) (Corre et al., 2012). Los PHA son biopolisteres completamente biodegradables, sintetizados y catabolizados por una amplia gama de microorganismos (bacterias y hongos) y por algunas plantas (Suriyamongkol et al., 2007, Laycock et. al., 2012). Los PHA de origen bacteriano son sintetizados intracelularmente como inclusiones citoplasmtica hidrofbicas, generalmente en presencia de una fuente de carbono en exceso, cuando hay deficiencia de algn otro nutriente esencial como O, N, P, S Mg (Wong et al., 2012), en periodos de tiempo cortos, por lo que llama la atencin de empresarios. Sin embargo, los costos de produccin, relativamente altos con respecto a la produccin petroqumica de sus anlogos, han limitado la produccin industrial de PHA. En el 2010, por ejemplo, el costo de produccin
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de PHB (uno de los tipos de PHA ms estudiado), fue estimado entre USD 2.13 6.25/kg, de los cuales el 30-40% corresponde a la fuente de carbono; estos valores superaban los precios de los polmeros similares obtenidos del petrolero, para los que se estim un costo de USD 1.45/kg (Chanprateep, 2010, Posada et al., 2011). Se ha evidenciado que la produccin rentable, a escala industrial, depende de varios factores: habilidad del microorganismo para emplear una fuente de carbono econmica (recientemente se han enfocado en desechos agrcolas y subproductos industriales), costo del medio de cultivo, velocidad de crecimiento, velocidad de sntesis del polmero, calidad y cantidad del PHA y, el costo de los procesos subsiguientes para la produccin del plstico, temas en los que centran sus estudios los investigadores, a nivel mundial (Chanprateep, 2010 ; Agnew y Pfleger, 2013 ). Adems, de la bsqueda de materias primas renovables y econmicas (Alonso et al., 2010), la evaluacin de microorganismos genticamente modificados (Hfer et al., 2011), el uso de consorcios microbianos (Liu et al., 2011), mejoras en los proceso de extraccin y purificacin (Posada et al., 2011) y el desarrollo de tecnologas en plantas transgnicas (Rebeille et al., 2006), . Adems de la variacin en las estrategias del proceso fermentativo (en lotes, lotes alimentados y continuo). (Naranjo et., la, 2010). En Colombia existen empresas alimenticias y energticas, que generan subproductos que pueden ser aprovechados como potenciales fuentes de carbono en la produccin de PHAs. Esta investigacin, en particular, se centr en la evaluacin del potencial de cepas nativas para la produccin de PHA a partir de sustratos econmicos, desechos o subproductos de diferentes industrias (aceites de Jatropha, ricino, frituras, lactosuero, glicerol residual), teniendo presente que existen microorganismos capaces de sintetizar PHA a partir de cidos grasos y/o azcares (Tian et al., 2000; Ko-Sin et al., 2010; Nath et al., 2008). En particular, el glicerol residual es una fuente de carbono econmica para el proceso de produccin de PHA debido a que es un subproducto de la transesterificacin de aceites empleados en el proceso de fabricacin de biodiesel (Shrivastav et al., 2010). En Colombia existen 6 plantas de produccin de biodiesel las cuales tienen una capacidad de producir en

11

promedio 84 mil Ton/ao, aproximadamente el 10% de esa produccin se convierte en glicerol de desecho (Fedebiocombustibles: Boletn N 62, 2012). En nuestro pas, se han estudiado varios residuos agroindustriales como potenciales materias primas para la produccin de PHA, entre los que figuran: glicerol (Naranjo, 2010), jugo de fique (Snchez, 2007), melaza y pulpa de fruta (Salazar, 2011), y otros enfocados en el aislamiento y caracterizacin molecular de cepas productoras de PHA (Revelo et al., 2006, Snchez, 2007). No obstante, reportes en cuanto a la evaluacin de parmetros operacionales que afectan la produccin de PHA, son mnimos: Salazar (2011) centrndose en el uso de sustratos azucarados y valores ptimos de operacin, logr mejorar el rendimientos hasta unas 4.3 veces. En este trabajo se estableci un proceso fermentativo para la produccin de PHB a partir de GRSB, utilizando el sistema B. megaterium: GRSB a 25 C, pH 7.0, velocidad de agitacin 200 rpm. Con este sistema se logr un rendimiento en productos Yp/s de 204.1 mg de PHB /g . El B. megaterium se ha reportado en muchas ocasiones empleando sustratos azucarados, con resultados satisfactorios en cuanto a la acumulacin de biopolmeros (Gouda et al., 2001; Reddy et al., 2003, Salazar, 2011); sin embargo, los reportes sobre produccin de PHB empleando B. megaterium en presencia de glicerol son mnimos. Esta investigacin constituye un aporte en ese sentido.

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2. MARCO TERICO

Sin duda alguna los polmeros sintticos ofrecen una amplia aplicacin en el mundo actual a diferencia de los polmeros naturales, a tal punto que su uso se ha excedido y con ello, han crecido los problemas ambientales, pues su acumulacin en ros y suelos afecta la salud de las especies y las condiciones de vida humana.

Los polmeros que mayor impacto tienen en el ecosistema, son los derivados del petrleo crudo. Los plsticos tienen el ms amplio campo de aplicacin; esto muestra lo dependiente que es la industria de los plsticos del petrleo y las consecuencias que causa en el precio de este recurso. Por lo que es conveniente pensar en la utilizacin de nuevas materias primas para la fabricacin de estos compuestos (Siracusa et al., 2008).

Los polmeros biodegradables (biopolmeros), obtenidos de desechos agroindustriales, son una de las posibles soluciones tanto al problema del consumo del recurso no renovable (petrleo) como al problema ambiental que los plsticos sintticos, puesto totalmente degradables por microorganismos. que son

2.1

LOS BIOPOLMEROS

El beneficio que los recursos naturales ofrece, en cuanto a conservacin y reciclaje se convierte en una excelente opcin e innovacin en el desarrollo de nuevos productos biodegradables. Los biopolmeros representan los componentes orgnicos ms abundantes en la naturaleza. Ellos son importantes para la vida cotidiana y exhiben propiedades fascinaste con variedad de aplicaciones. Su total biodegradacin en productos como CO2 y H2O y, posteriormente, en abonos orgnicos, constituye una gran ventaja frente a los polmeros sintticos.

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Los biopolmeros se encuentran en cualquier organismo y poseen un amplio rango de funciones esenciales y/o benficas para los organismos, por ejemplo: conservacin y expresin de la informacin gentica; catlisis de reacciones; reserva de Carbono, Nitrgeno, Fsforo y otros nutrientes. Adems, actan como reserva de energa, proteccin contra los ataques de otras clulas y de factores ambientales peligrosos o intrnsecos, sensores de factores de bioticidad o abioticidad, comunicadores con el medio ambiente y con otros organismos, y mediadores de adhesin a superficies u otros organismos.

Conjuntamente muchos de estos compuestos son componentes estructurales de clulas, tejidos y microorganismos (Vandamme et al., 2005).

Hasta la presente, se han logrado reemplazar polmeros sintticos por otros de origen natural, en aplicaciones especficas, relacionadas con propiedades de barrera, mecnicas y trmicas, en empaques tipo pelculas, protectores, espumas, envolturas, platos, tasas, cucharas, bolsas, etc (Villada et al., 2007).

2.1.1

Clasificacin de los biopolmeros

Los biopolmeros clasifican en cuatro grupos de acuerdo a su fuente, tal como se presenta a continuacin:

2.1.1.1 Biopolmeros producidos directamente por organismos vivos. Dentro de este grupo se encentran: la lana, la seda, el algodn, y otras fibras naturales como la celulosa, el almidn, la goma xantan, la lignina, las protenas del aceite, la cutina, el caucho natural, los polihidroxialcanoatos (PHA) y copolmeros como el 3-

mercaptopropionato (3MP), el 3-mercaptobutirato (3MB) o el 3-mercaptovalerato (3MV). (Ltke-Eversloh et al., 2001) 2.1.1.2 Biopolmeros producidos mediante polimerizacin de monmeros. En este grupo estn los polmeros constituidos por monmeros que existen en la naturaleza o son derivados de materiales existentes en la naturaleza, por ejemplo: el cido polilctico

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(PLA), el politrimetileno glicol, y los polioles a base de soya y sus derivados (Vandamme et al., 2005).

2.1.1.3 Biopolmeros producidos mediante combinacin de monmeros. Dentro de este grupo figuran los polmeros que mezclan monmeros de fuentes naturales con monmeros de origen petroqumico, por ejemplo: el isosorbato-policarbonato y los poliuretanos a base de soya (Villada et al., 2007)

2.1.1.4 Biopolmeros obtenidos de mezclas de materiales. Este grupo incluye los polmeros producidos por mezclas de materiales de origen petrolero con materiales de fuentes renovables tales como, mezclas de almidn con PVA (Chanprateep, 2010).

2.1.2

Fuentes naturales de biopolmeros

Los biopolmeros naturales provienen fundamentalmente de cuatro grandes fuentes (Vase Tabla 1).
Tabla 1. Principales fuentes naturales de biopolmeros Origen Animal Biopolmero Colgeno, gelatina Lpidos y grasas, e hidrocoloides (protenas, polisacridos) Quitina, Quitosan

Agrcola

Marino

Microbiano Fuente: Villada et al., 2007.

PLA y PHA

15

2.1.3

Uso de los biopolmeros

Los polmeros sintticos estn siendo gradualmente reemplazados por materiales biodegradables, especficamente por los obtenidos de fuentes naturales, en algunas aplicaciones a nivel agrcola e industrial (Villada et al., 2007). El desarrollo de estos

materiales se enfoca a campos del mercado bien definidos (Vase Tabla 2), pero se pueden ampliar a otros, en la medida en que las investigaciones permitan solucionar los problemas asociados con su obtencin, elaboracin y fabricacin.

Tabla 2. Algunos biopolmeros y sus aplicaciones. Biopolmero Fibras naturales Aplicacin En la industria automotriz, son usualmente empleados en partes interiores formadas. Fueron desarrollados para servicios mdicos tales como tornillos reabsorbibles, suturas, y alfileres Pueden ser empleados en la fabricacin de bolsas de basura, Almidn, PHAs cubiertos desechables y platos, envasado de alimentos, y materiales de embalaje. El almidn tambin se usa en la modificacin de las texturas de las comidas. Se Polister, alcohol polivinlico, pectina disean para la extrusin,

PLA

moldeo por inyeccin y moldeo por soplado. Tambin se fabrican bolsas de lavandera, elementos

desechables de servicio de alimentos, productos agrcolas, y bolsas de catter. Mejoran las propiedades de barrera en las pelculas elaboradas,

Celulosa, (CMC)

la CMC es una pelcula capaz de absorber el aceite de los alimentos sometidos a procesos de frituras. Ayudan a prevenir la disminucin de la humedad de frutas y

Ceras naturales

verduras, ellas tambin son usadas como agentes de microencapsulacin, especficamente para sustancias con olores y sabores a condimento.

16

Colgeno

Usado tradicionalmente en la preparacin de envolturas comestibles. Es un antifngico y antimicrobiano, las pelculas a partir de quitosn prolongan la vida de los alimentos en las estanteras.

Quitosn Fuente: Kolybaba et al., 2003

2.1.4

Ventajas y desventajas de los biopolmeros

El uso de los biopolmeros abre un gran potencial benfico para el medio ambiente en todos los sectores de la agroindustria, dada la similitud de estos materiales naturales con los sintticos por sus excelentes propiedades mecnicas, de barrera y transmisin de luz, podran reemplazar materiales de origen petroqumico, evitndose contaminaciones por acumulacin de materiales recalcitrantes (Vase Tabla 3) (Villada et al., 2007).

Tabla 3. Ventajas y desventajas del empleo industrial de los biopolmeros. Biopolmeros Desventajas Ventajas

El costo es un obstculo para los Al ser productos obtenidos de fuentes renovables de

materiales plsticos biodegradables de origen natural cuando estn directamente frente a sus convencionales homlogos. energa, su costo de produccin se puede reducir significativamente, convirtindolos en una opcin industrial sintticos. apropiada frente a los polmeros

Los plsticos sintticos se producen Son amigables al medio ambiente, ventaja

a gran escala, mientras que la mayor parte los biopolmeros a pequea escala. comparativa con respecto a los polmeros sintticos derivados del petrleo, que se producen

masivamente.

No es posible esperar que la renovacin La completa sustitucin de los plsticos a base de

completa de polmeros convencionales por sus homlogos biodegradables sea a petrleo por los basados en recursos renovables como materia prima, llevara a un nivel de CO2 equilibrado en la atmsfera.

17

corto plazo.

Aparentemente hay un nmero ilimitado de las

reas, donde los polmeros biodegradables pueden encontrar aplicacin.

Fuente: Kolybaba et al., 2003

2.2

PLSTICOS BIODEGRADABLES O BIOPLSTICOS

Los plsticos biodegradables son compuestos de especial inters, ya que comparten algunas propiedades mecnicas con los plsticos derivados del petrleo. Estos polmeros se dividen en tres categoras: 2.2.1 Plsticos sintetizados qumicamente. Estos materiales se constituyen por compuestos de origen biolgico y son susceptibles a ataques enzimticos y microbianos. Puesto que no comparten todas las propiedades de los plsticos, no son comercialmente viables como sustitutos de los mismos. Por ejemplo: el cido poligliclico (PGA), las policaprolactonas (PCL), el alcohol polivinlico (PVA), el poli (oxi-etileno), las polisteramidas (PEA), el 1,3 propanodiol (PDO), los cuales se obtienen a partir de azcar de maz y el polietileno lineal de baja densidad, a base de bioetanol (PEBDL). No se consideran totalmente biodegradables porque necesitan de tratamientos con luz de alta frecuencia (ejemplo: luz ultravioleta) para su degradacin parcial y durante el proceso se generan residuos txicos (Reddy et al., 2003).

18

2.2.2 Plsticos semi-biodegradables o plsticos a base de almidn. En estos materiales el almidn es adicionado como relleno al agente reticulante1 para producir una mezcla de almidn y de plstico, por ejemplo: el polmero a base de almidnpolietileno. Este tipo de bioplsticos son parcialmente biodegradables, dado que los microorganismos presentes en el suelo, degradan el almidn pero no son capaces de romper la matriz del polmero, persistiendo la problemtica ambiental con los fragmentos recalcitrantes residuales. (Vilpoux y Averous, 2004). 2.2.3 Plsticos completamente biodegradables. Son polmeros 100% biodegradables, pertenecientes a una familia de polisteres de cidos hidroxialacanocos (HA). Entre estos se encuentran los PHA, polilctidos (PLA), polisteres alifticos y polisacridos, y los copolmeros y/o mezclas de los anteriores (Khanna y Srivastava, 2005). Dependiendo de sus caractersticas biodegradables se subdividen en dos grupos: el primer grupo une biopolmeros que son plsticos de origen no biolgico pero tienen propiedades biodegradables o compostables, entre estos figuran copoliesteres alifticos-aromticos sintticos biodegradables, tales como polibutileno tereftalato adipato (PBTA), polibutileno tereftalato succinato (PBTS), y el polibutileno tereftalato glutarato (PBTG).

El segundo grupo incluye polmeros de origen biolgico que son biodegradables o compostables: materiales a base de almidn, materiales a base de celulosa, compuestos y mezclas de PLA y los PHA entre otros (Chanprateep, 2010). 2.3 POLIHIDROXIALCANOATOS

Los PHA son polmeros de HA, que pueden ser sintetizados por una gran variedad de microorganismos (bacterias, hongos y cepas recombinadas); como reserva de carbono y
Agente reticulante. Sustancia que promueve o regula enlaces covalentes intermoleculares entre las cadenas de los polmeros, unindolos para crear una estructura ms rgida.
1

19

energa, usualmente bajo condiciones limitantes de nutrientes esenciales como N, P, O, S, Mg, y en presencia de una fuente de carbono en exceso. Sin embargo, algunas bacterias son capaces de producirlos incluso sin estar sujetas a cualquier tipo de contraste

nutricional; por ejemplo: Alcaligenes lactus (Reddy et al., 2003). Estos biopolmeros son acumulados en forma de grnulos intracelularmente a niveles que alcanzan hasta el 90% del peso seco de la clula (Khanna y Srivastava, 2005). Los PHA se les encuentran haciendo parte de la membrana citoplasmtica y el citoplasma de bacterias, levaduras, plantas y animales, cumpliendo funciones tales como, proteccin de macromolculas, transporte de ADN entre otras. Poseen propiedades similares a varios termoplsticos

sintticos como el polipropileno y, en principio, pueden utilizarse en su lugar (Keshavarz y Roy, 2010). Los PHA varan en sus caractersticas fsicas y qumicas debido a la variedad de monmeros que contienen. Los factores que afectan el contenido de monmeros

incluyen: el tipo de microorganismos (Gram positivos o Gram negativos), los ingredientes del medio de cultivo, las condiciones de fermentacin, los tipos de fermentacin (por lotes, continuos, retroalimentados) y la recuperacin de los mismos (Lee et al., 1999; Castilho et al., 2009). Hasta la fecha se reportaron ms de 150 tipos de PHA producidos biolgicamente (Hofer et al., 2011; Rai et al., 2011).

En algunas plantas se ha inducido la produccin de PHA mediante modificaciones genticas. El descubrimiento de la acumulacin de PHB en el citoplasma de las clulas de Arabidopsis thaliana, fue el inicio de la aplicacin de esta tcnica, que se ha venido aplicando desde el ao de 1992. Desde entonces, se sintetizaron varios tipos de PHA en varias especies como Nicotiana tabacum y Brassica napus, mediante la creacin de rutas metablicas en el citoplasma y en los plstidos o peroxisomas (Khanna y Srivastava, 2005).

Los PHA son completamente biodegradables hasta dixido de carbono (CO2) y agua (H2O) bajo condiciones aerbicas, y hasta metano (CH4) bajo condiciones anaerbicas, por microorganismos que se encuentran en el suelo, mar, lagos, aguas residuales, etc (Vase Figura 1). Tambin pueden ser sujetos a degradacin trmica e hidrlisis enzimtica

20

(Khanna y Srivastava, 2005). En sistemas biolgicos pueden ser degradados usando dipolimerasas microbianas as como por las hidrlisis enzimticas y no enzimticas en tejidos anmales. (Rai et al., 2011).

Figura 1. Ciclo de vida de los PHA (Verlinden, et al., 2007).

2.3.1 Estructura y propiedades de los PHA Los PHA usualmente estn compuestos de monmeros de ( R )--hidroxicidos, en los cuales el grupo R vara desde metil (C1) hasta tridecil (C13) (Vase Figura 2). (Lee et al., 1999; Reddy et al., 2003). La mayora de los PHA reportados presentan configuracin ptica [R], esto debido a la estreoespecificidad de la enzima involucrada en la etapa de polimerizacin (Wiley, 2011).

21

R grupo alquilo C1-C13 X vara desde 100 hasta 35000 unidades. n=1 R= hidrgeno; R= metil; R=etil; R=propil; R=pentil; R=nonil; n=2 R= hidrogeno; Poli (4-hidroxibutirato) R=metil; n=3 R= hidrogeno; Poli (5-hidroxivalerato) R=metil;Poli (5-hidroxihexanato) [P(5HHx)] n=4 R= hexil; Poli (6-hidroxidodecanoato) Poli (4-hidroxivalerato) [P(4HV)] Poli (3-hidroxipropionato) Poli (3-hidroxibutirato) [P(3HB)] Poli (3-hidroxivalerato) Poli (3-hidroxihexanoato) Poli (3-hidroxioctanoato) Poli (3-hidroxidodecanoato)

Figura 2. Estructura qumica de PHA producidos en bacterias.

Las propiedades fsico-qumicas de los PHA son muy similares a las de algunos polmeros de origen petrolero (Polipropileno (PP), Poliestireno (PS), polietileno de baja densidad (PEBD)) (Vase Tabla 4). Estas propiedades pueden ser mejoradas realizando mezclas empleando monmeros como el HV y copolmeros como el P3HB-co-P3HV, los cuales mejoran especficamente las propiedades mecnicas de estos materiales (Wiley, 2011).

22

Tabla 4. Algunas propiedades fsico-qumicas de los PHA y de otros plsticos sintticos Propiedad PHA Polipropileno Poliestireno Polietileno de Baja densidad Cristalinidad (%) Punto de fusin (C) Densidad (g/cm ) Fuerza de tensin (MPa) Temperatura de transicin vtrea (C) Elongacin para quiebre (%) Biodegradabilidad Resistencia a solventes Fuente: Akaraonye et al., 2010 6-1000 Buena Pobre 400 No Buena --No --600 No --3

20-80 30-180 1,05-1,25 20-40 -150 a -4

70 176 0,91 34,5 -10

--240 0,010-0,025 50 100

50 110

10 -110

2.3.2 Clasificacin de PHA Los PHA pueden dividirse en tres grupos, dependiendo del nmero de tomos de carbono que sustituyen a la cadena lateral R. Generalmente varan entre C1-C16 (Suriyamongkol et al., 2007): PHA de longitud de cadena corta o -PHASCL; constan de monmeros como el 3hidroxibutirato (HB o C4) y/o el 3-hidroxivalerato (HV o C5). Tienen propiedades similares a los plsticos convencionales. Son considerados como termoplsticos (Poirier et al., 2001). PHA de longitud de cadena media o PHAMCL; constan de monmeros entre C6-C16 3-HAs. Son considerados como elastmeros y cauchos (Suriyamongkol et al., 2007). PHA de longitud de cadena larga o PHALCL; constan de monmeros de >C16 (Tian et al., 2000).

23

2.3.3 Aplicaciones de los PHA En la Tabla 5, se muestran los diferentes campos de industria y las diferentes aplicaciones de los PHA.

Tabla 5. Aplicaciones de PHA en distintos campos Aplicaciones Ejemplos Tolos los materiales de empaque que son usados Industria de empaques por cortos periodos de tiempo, incluyendo utensilios de comida, aplicaciones electrnicas, entre otros. Industria fotogrfica y de imprenta Los PHA son polisteres que pueden ser fcilmente teidos. Adhesivos sensibles al calor, ltex, geles Otros productos qumicos inteligentes. Los PHA se pueden emplear en la industria cosmtica como removedores de grasa facial. Los PHA se pueden convertir en dioles de PHA Bloque de copolimerizacin para formar copolimerizacin en bloque con otros polmeros. Procesamiento de plsticos Los PHA puede ser usados como coadyuvantes para el procesamiento de plsticos. Como los nylons, los PHA pueden ser convertidos en fibras. Los monmeros de PHA son todos quirales de configuracin ( R ), pueden Industria qumica fina como materiales de ser utilizados la

Industria textil

partida para

la sntesis de antibiticos y otros productos qumicos farmacuticos). (fertilizantes, productos

24

Los PHA son biodegradables, biocompatibles y pueden Biomaterial para implantes mdicos procesarse para convertirlos en

materiales de implantes mdicos. Los PHA tambin se emplean como recubrimientos en la fabricacin de drogas de liberacin controlada. Los monmeros de PHA especialmente el R3HB, tiene efectos de en teraputicos y en las

Mdicas

enfermedades Osteoporosis,

Alzheimer incluso

Parkinson, mejora la

memoria, entre otras. Los oligmeros de PHA pueden ser empleados Aditivos de alimentos saludables como suplementos alimenticios para la

obtencin de cuerpos cetnicos. El operon de sntesis de PHA puede ser usado Industria microbiolgica como regulador metablico o potenciador de resistencia, para mejorar el rendimiento cepas microbianas industriales. Los PHA pueden ser hidrolizados para formar Biocombustibles o aditivos de combustibles hidroxialacanoatos combustibles. Las protenas de unin de grnulos de PHA Purificacin de protenas phasin o PhaP son usadas en la purificacin de protenas recombinantes. La coexpresin de PhaP y los ligandos Administracin de frmacos especficos especficos orientacin enfermos. Fuente: Chen, 2009. pueden ayudar hacia a lograr los una metil esteres que son de

especifica

tejidos

2.3.4 Principales productores de PHA a nivel mundial La produccin de PHA a nivel mundial cada da es ms competitiva en precio con los productos derivados del petrleo. Esto se debe a las nuevas estrategias que se han venido

25

desarrollando con el fin de encontrar nuevas materias primas econmicas y realizando procesos fermentativos ms eficientes. A continuacin (Vase Tabla 6) se presentan el panorama mundial de la produccin de estos biopolmero entre los aos 2003 y 2010.

Tabla 6. Principales productores de PHA en el mundo. Nombre del producto: PHA Compaa Sustrato Precio (US$/kg) Produccin (Ton/ao)

Biomer: P(3HB)

Biotechnoly Co., Alemania

25 (2003) Produccin a 17 (2004) pequea escala 3,75 -6,25 (2010)

50 (2003)

PHB industrial S/A Biocycle: P(3HB) Company, Brazil Biogreen: P(3HB) MirelTM : P(3HB) Mitsubishi GAS Chemical, Japon

Caa de azcar

12,5 -15 (2003) 3,12-3,75 (2010)

1400 (2003) 30-60000 (2010) 10000 (2010)

Metanol

2,75 (2010)

Metabolix, Telles, US Tianan Biologic Material Co., Ltda. Ningbo, China P&G, US

Maz, Azcar

14 -17 (2004) 2,13 (2010)

50000 (2010)

Enmat: PHBV, PHBV+Ecoflex blend NodaxTM:PHBH NodaxTM: PHBH

4,64 (2010) 3,56 (2010) 5,27 (2010)

10000 (2010) 20000-50000 (2010) 2000 (2010)

Lianyi Biotech, China Fuente: Chanprateep, 2010; Posada et al., 2011.

Los precios de los polmeros derivados del petrleo con mayor impacto en la industria qumica se presentan (Vase Tabla 7).

26

Tabla 7. Precios de mercado de biopolmeros y polmeros derivados del petrleo en el ao 2009. Precio del mercado (US$/kg) 3,54 - 4,25 3,11 - 4,81 1,04 1,10 1,04 1,02 0,99 1,15

Nombre del Polmero Polmeros modificados con almidn cido polilctico (PLA) Polipropileno (PP) Polietileno de alta densidad (PEAD) Polietileno de baja densidad (PEBD) Cloruro de polivinlo (PVC) Poliestireno (PS) Tereftalato de polietileno (PET o PETE) Fuente: Castilho et al., 2009

Compaa Novamont, Italia Cargill Dow, US -

2.4

SNTESIS DE PHA

Los PHA son obtenidos por mtodos qumicos y biolgicos. Sin embargo la sntesis qumica es menos empleada debido a sus altos costos.

2.4.1 Sntesis qumica de PHA La mayora de los PHA pueden ser sintetizados qumicamente a partir de lactonas2 sustituidas apropiadamente. La apertura del anillo para la polimerizacin generalmente se realiza con catalizadores a base de Zinc o Aluminio en soluciones acuosas (ej: PHVB, que se obtiene de la polimerizacin de butirolactona y valerolactona promovida por un aluminoxano3 oligomrico como catalizador). Recientemente, se han descrito

procedimientos en los cuales se emplean catlisis enzimticas para realizar el rompimiento del anillo de las lactonas para su polimerizacin, como una estrategia ms limpia empleada en la sntesis qumica de PHA (Wiley, 2011).

2 3

Lactonas: compuesto orgnico del tipo Ester cclico Aluminoxanos: compuestos que se obtienen de la hidrlisis parcial de compuestos de trialquilalumino

27

2.4.2 Sntesis biolgica de PHA En 1923 el bacterilogo Francs Maurice Lemoigne encontr que la cepa bacteriana B. megaterium produca cido 3-hidroxibutrico (P3HB) y tres aos ms tarde, describi el procedimiento para obtener este material empleando clulas bacterianas (Seebach y Fritz, 1999). Inicialmente fue considerado como un material lipdico y solo hasta el ao 1950 se pudo establecer la naturaleza de polister de este compuesto. Por mucho tiempo se pens que las bacterias slo eran capaces de producir P3HB, sin embargo en 1974 Wallen y Rohwedder, identificaron 3HV y 3HHx en extractos de cloroformo (Wiley, 2011). Luego de varios estudios realizados en los siguientes aos se pudo establecer que haba una variedad de HA que podan ser sintetizados por bacterias, tal como se presenta en la Tabla 8.

Tabla 8. PHA sintetizados por diferentes bacterias Bacteria Cupriavidus nector (antes Ralstonia eutropha) PHA producido PHB y PHVB, P(3HB-co-4HB), P(3HB-co-3HV-co-5HV), P(3HB-co-4HV-co-3HV), P(3HB-co-3HV-co-4HV) PHB y PHVB, P(3HB-co-3HP), P(3HB-co-4HB), P(3HB-co-3HV-co-3H4-pentanoato) Homopolmero P(3HV) P(3HB-co-4HB) P(3HB-co-4HB) P(3HB-co-4-Hidroxicaproato [HC]) P(3HB-co-3HC-co-3HO) P(3HB-co-3HV) Sustrato especfico

---

Azohydromonas lata (antes Alcaligenes lactus) Rhodospirillum rubrum Chromobacterium violaceum Delftia acidovarans Methylobacterium Comomonas testoterone Sphaerotilus natans Fuente: Wiley, 2011

--4-cido pentenoico o cido pentanoico Valerato de sodio 1,4-Butanodiol Metanol + 3Hidroxipropionato --Glucosa + propionato de sodio

28

En 1980, los genes que codifican para enzimas que participan en la biosntesis de PHA fueron clonados a partir de R. eutropha (en el presente conocida como C. necator), esto dio lugar a la descripcin de una de las rutas metablicas ms conocida para la biosntesis bacteriana de PHB (Vase Figura 3), esta ruta se describe bsicamente con tres reacciones catalizadas por tres enzimas diferentes. (Reddy et al., 2003): La primera reaccin consiste en la condensacin de dos molculas de acetilcoenzima A (acetil-CoA) para formar acetoacetil-CoA. La reaccin es catalizada por la enzima -cetoacil-SCoA tiolasa. La segunda reaccin es la reduccin de acetoacetil-SCoA a ( R )-3-hidroxibutirilCoA por la enzima dependiente de NADPH, acetoacetil-CoA deshidrogenasa.

Finalmente, los monmeros de ( R ) -3-hidroxibutiril-CoA se polimerizan a PHB por medio de la P(3HB) polimerasa.

Figura 3. Reaccin de biosntesis de PHB.

El homopolmero [P(3HB)] obtenido a partir de B. megaterium es el ms abundante y estudiado de los miembros de la familia de los PHA (Castilho et al., 2009). Este homopolmero es un polister termoplstico que se acumula cerca a la membrana de muchas bacterias, representando hasta el 80% del peso seco de la clula. El PHB es una reserva ideal de carbono, ya que existe en la clula en un estado altamente reducido (es virtualmente insoluble) y ejerce una presin osmtica insignificante sobre los microorganismos que lo sintetizan (Vase Figura 4). (Bright et al., 2003).

29

Figura 4. Micrografa de trasmisin electrnica (TEM) de secciones delgadas de clulas de C. nector PHB24 recombinadas que contienen grandes cantidades (90% peso seco de las clulas) de PHB-co-5% mol de HHx. (Rai. et al., 2011).

2.4.2.1 Rutas metablicas Las rutas metablicas que emplean los diferentes microorganismos para la biosntesis de los PHA son muy variadas y dependen de la maquinaria enzimtica con la que cuentan y del sustrato empleado en el proceso fermentativo. Pueden resumirse como en el caso de la produccin de PHB en solo tres etapas, as como tambin pueden llegar a ser un poco ms complejas como en el caso de la produccin de PHA empleando cidos grasos como fuente de carbono. A continuacin (Figura 5) se presentan algunas rutas conocidas para la biosntesis de PHA realizada por bacterias

30

Figura 5. Biosntesis de PHAs. Abreviaciones: PhaA, 3-cetotiolasa; PhaB, ( R )-3-cetoacil-CoA reductasa (para la biosntesis de PHB, la enzima es acetoacetil-CoA reductasa); PhaC, PHA sintasa o polimerasa; PhaG, ( R )-3-hidroxiacil ACP:CoA transacilasa; PhaJ, ( R )- especifica enoil-CoA hidratasa. PhaC, especfica para monmeros enantiomricos en la configuracin [R] (Aldor Keasling, 2003).

En la Figura 6 se ilustran

las diferentes rutas metablicas, comnmente descritas

dependiendo de la composicin final del biopolmero y del sustrato empleado como fuente de carbono en el proceso fermentativo.

31

Figura 6 . Biosntesis para homopolmeros y copolmeros de PHA a partir de diferentes fuentes de carbono (glucosa, glicerol y cidos grasos). Abreviaturas: PhaZ, PHA dipolimerasa (Gao et al., 2011).

32

2.4.2.2 Sustratos empleados en la produccin bacteriana de PHA La produccin microbiana de PHA abarca un gran nmero de microorganismos e incluso plantas (Singh et al., 2009). A continuacin (Tabla 9), se resumen las principales

bacterias y sustratos puros utilizados en la produccin de PHA y el tipo de material que sintetizan.
Tabla 9. Produccin bacteriana de PHA a partir de diferentes sustratos puros. Sustrato Polihidroxialcanoatos (PHA) Homopolmeros Gram-Positiva Gram-Negativa Bacillus Azotobacter Streptococcus Comamonas Streptomyces Escherichia Pseudomonas Ralstonia Vibrio Bacillus Comamonas Ralstonia Bacillus Alcaligenes Streptococcus Comamonas Vibrio Lactobacillus Comamonas Lactococcus Hydrogenophaga Streptococcus Methylobacterium Paracoccus Pseudomonas Sinorhizobium Bacillus Brachymonas Comamonas Pseudomonas Spirulina Vibrio Comamonas Protomonas Pseudomonas Azotobacter Haloferax Copolmeros Gram-Positiva Gram-Negativa Bacillus Pseudomonas Ralstonia

Glucosa

Fructosa Sacarosa

Bacillus Microlunatus Bacillus

Comamonas Rhizobium Sphingomonas

Lactosa

cidos Grasos

Bacillus Microlunatus

Aeromonas Comamonas Escherichia Pseudomonas

Maltosa Metanol Almidn

33

Glicerol

Xilosa Fuente: Singh et al., 2009

Escherichia Methylobacterium Ralstonia Vibrio Burkholderia Methylobacterium

Adems de fuentes de sustratos puros usados en la produccin de PHA, se emplean sustratos de origen agroindustrial. En la Tabla 10 se presentan los principales residuos agroindustriales estudiados como precursores de PHA.

Tabla 10. Produccin bacteriana de PHA a partir de diferentes desechos agroindustriales. Polihidroxialcanoatos (PHA) Homopolmeros Copolmeros Gram-Positiva Gram-Negativa Gram-Positiva Bacillus Alcaligenes Bacillus Desechos Staphylococcus Azotobacter Agrcolas Burkholderia Escherichia Haloferax Klebsiella Ralstonia Escherichia Productos de Hydrogenophaga Uso Diario Methylobacterium Pseudomonas Sinorhizobium Ralstonia Desechos Grasos Desechos Industriales Actinobacillus Bacillus Rhodococcus Fuente: Singh et al., 2009 Azotobacter Burkholderia Pseudomonas Sustrato

Gram-Negativa Haloferax Klebsiella Pseudomonas Rhizobium Sphingomonas

Pseudomonas Ralstonia

Comamonas Pseudomonas Ralstonia Azotobacter

34

2.5

PRODUCCIN DE PHA

La produccin de PHA se realiza mediante procesos biotecnolgicos tales como: produccin in vitro empleando enzimas aisladas, procesos fermentativos usando microorganismos nativos y modificados genticamente, o a travs de plantas transgnicas (Champrateep, 2010, Laycock et al., 2012). 2.5.1 Produccin de PHA in vitro

La biosntesis de PHA in vitro se realiza a partir de lactonas o cidos hidroxialacanocos empleando lipasas, esterasas y proteasas aisladas. Este procedimiento al no depender de la capacidad metablica del microorganismo ofrece una alternativa en la obtencin de PHA con mayor pureza y propiedades fisicoqumicas especficas (Steinbchel y Fchtenbusch, 1998). 2.5.2 Produccin de PHA mediante fermentacin microbiana La produccin de PHA mediante procesos fermentativos con microorganismos, se puede efectuar con un microorganismo (cultivo puro) o un consorcio de microorganismos (cultivos mixtos). Estos procesos se pueden realizar por lotes, por lotes alimentados o en continuo (Dai et al., 2007). La forma ms simple para la produccin de PHA usando cultivos puros se realiza en dos etapas en un proceso de produccin por lotes. En una primera etapa se realiza el inoculo de la cepa microbiana en un medio estril que contiene: solucin de elementos traza, con una fuente de carbono y nutrientes disponibles (P, N O). En la segunda etapa se limita de forma deliberada alguno de los nutrientes esenciales, tomando lugar la acumulacin de PHA (Laycock et al., 2012). Este mismo principio es empleado en los procesos por lotes alimentados y en continuo, solo que las escalas varan y la productividad se incrementa hasta 1.7 veces ms que en los procesos por lotes (Naranjo et al., 2010). Adems del uso de cepas puras en los procesos fermentativos, tambin se han desarrollado tcnicas

moleculares de recombinacin gentica en busca de incrementar la produccin de PHA, por

35

ejemplo con E. coli se han hecho estudios de recombinacin gentica con genes de C. nector, logrndose resultados de acumulacin de PHA entre 80-90 % del peso seco celular en procesos fermentativos por lotes (Akaraonye et al., 2010). La produccin de PHA usando cultivos mixtos, ofrece una ventaja frente a los cultivos puros, debido a que en este tipo de fermentaciones las condiciones de esterilidad no son requeridas. Aunque no es la nica fuente y tampoco la nica forma de crear este tipo de cultivos, estos consorcios microbianos pueden obtenerse de lodos activados provenientes de plantas de tratamiento de aguas residuales (Villano et al., 2010).

En cualquier caso, se requiere establecer los valores ptimos para cada uno de los parmetros operacionales involucrados en el proceso fermentativo. Los de mayor

incidencia son: la temperatura, pH y el tiempo de fermentacin (Kulprechaa et al:, 2009)

La temperatura

La temperatura es una variable de gran inters en la mayora de los procesos que involucran metabolismo microbiano. Esta variable es reportada como determinante para, el tipo biopolmero y las caractersticas que adquiera (Johnson et al., 2010). La gran mayora de autores han desarrollado sus experimentos a 30 C, independiente del microorganismo empleado en el proceso fermentativo Entre estos figuran Hfer et al. (2011); Obruca et al. (2011); Naranjo (2010), Ko-Sin et al ( 2010) y Zakaria et al., (2010), quienes trabajaron con Methylobacterium extorquens, Bacillus megaterium CCM 2037, Bacillus megaterium, Cupriavidus. nector H16 y Comamonas sp EB162, respectivamente.

pH inicial del sistema

El pH es uno de los factores que ms influye en la dinmica de los procesos biolgicos, por esta razn algunos autores han investigado tanto su efecto individual, como el efecto combinado que tenga con otras variables como la temperatura y el tipo de sustrato, sobre el

36

proceso de produccin de PHA (Villano et al., 2010; Pandian et al., 2010), En la Tabla 11 se presentan algunos intervalos de pH evaluados para la produccin de PHA, utilizando diferentes cepas.

Tabla 11. Valores de pH para diferentes cepas microbianas empleadas en la produccin de PHA Cepa Valores de pH 2 3 4 5 6 7 8 9 6 7 8 7 8 9 10 11 6.5 7 7.5 Ref.

Vibrio spp. MK4

Arun et al., 2009

Bacillus megaterium BA-019

Kulpreecha et al., 2009

Bacillus megaterium SRPK-3

Pandian et al., 2010

Comamonas sp. EB162

Zakaria et al., 2010

8 Fuente: Salazar, 2011 a) Valor reportado para la mxima produccin de biomasa seca

Tiempo de fermentacin Los tiempos de fermentacin juegan un papel muy importante dentro de los bioprocesos, con este parmetro se definen en algunas ocasiones costos de proceso y viabilidad de produccin a grandes escalas. Es importante saber que en procesos biolgicos donde se

37

trabaja con bacterias, los tiempos de crecimiento y produccin se encuentran en un pequeo rango dentro del proceso fermentativo. Los reportes muestran tiempos de fermentacin que van desde las 36 h, hasta las 120 h de fermentacin, para diferentes microorganismos (Kulpreecha et al. (2009), Pandian et al. (2010), Shen X. et al., (2009), Valappil et al (2007) 2.3.3 Produccin de PHA en plantas transgnicas

En 1992, Pioret y colaboradores demostraron por primera vez la expresin en Arabidopsis

thaliana de Acetoacetil CoA- reductasa y PHB sintasa a partir de genes de Ralstonia

eutropha. Sin embargo las tecnologas en este campo a penas se estn desarrollando, por ejemplo la Metabolix Inc., empresa productora de biopolmeros, ha estado desarrollando estas tecnologas en plantas de Nicotiana tabacum pero aun se encuentran en la fase de estudios preliminares (Laycock et al., 2012).

2.6

MTODOS DE EXTRACCIN DE PHA.

La etapa de extraccin de los biopolmeros (PHA) va seguida de la disolucin de ste en un solvente adecuado, como cloroformo, diclorometano, 1,2-dicloroetano o piridina. Los residuos de la pared celular (detritos) son removidos por filtracin y/o centrifugacin. En un ltimo paso, la purificacin se puede llevar a cabo empleando mezclas de solventes ( ej: agua/solventes orgnicos). A continuacin (Tabla 12), se resumen los mtodos de extraccin empleados para la recuperacin de estos biopolmeros de origen bacteriano.

38

Tabla 12. Mtodos de extraccin de PHA Mtodo de extraccin Ventajas Eliminacin de Extraccin con solventes endotoxinas/alta pureza. No hay degradacin del polmero Desventajas Quiebre de la morfologa de los grnulos de PHA. Alto precio / baja recuperacin Baja Digestin por surfactantes Tratamiento de altas densidades celulares Surfactante: digestin de Puereza:99,5% Recuperacin >90% Resultados (%wt)

pureza/tratamiento de altas densidades celulares aguas residuales necesario/degradacin del polmero por SDS. Pureza>95%. Velocidad de liberacin >90% Pureza:99% Recupercin:94% Pureza:97% Recupercin:91% Sal disdica Surfactante-EDTA. Pureza: 98% . Recuperacin:86,6% Grandes volmenes de aguas residuales Puereza:98.7% Recupercin:93,3%

Digestin por NaClO

Alta pureza Baja degradacin del polmero de alta pureza Degradacin limitada/bajos costos de operacin Alta pureza/contaminacin ambiental baja Alta recuperacin y alta pureza/bajos costos de operacin

Degradacin del polmero Rquiere altas cantidades de solvente

Digestin por NaClO y Cloroformo

Digestin por NaClO y surfactantes

Digestin por quelatos y surfactantes Disolucin selectiva de Masa celular no-PHB mediante protones (NPCM) Digestin enzimtica

Puereza:98.7% Recupercin:95,4%

Buena recuperacin

Altos costos de las enzimas

Puereza:92,6% Recupercin:90%

39

Disrupcin con molino de bolas Homogenizacin de alta presin

No requiere el uso qumicos No requiere el uso qumicos Bajos costos, baja toxicidad Uso de dbiles condiciones de extraccin Alta pureza

Requieres de muchos pases por el equipo Disrupcin pobre/velocidad de disrupcin baja Poca recuperacin

Rendimiento: 98%. Pureza: 95%

CO2 Supercrtico

Recuperacin: 89%

Utilizando la fragilidad celular Clasificacin por aireacin Flotacin por aire disuelto

Puereza:99% Recupercin:96% Rendimiento: 90%. Pureza: 97%

Baja recuperacin Requiere muchos pasos consecutivos de flotacin las clulas secreta espontneamente los grnulos de PHB

No requiere el uso qumicos

Pureza: 86%

No es necesario Liberacin espontanea extraer las sustancias qumicas Fuente: Posada et al., 2011

Rendimiento: 80%

2.7

MTODOS DE DETECCIN, CUANTIFICACIN Y CARACTERIZACIN DE PHA.

La deteccin de inclusiones de PHA se realiza mediante una diferenciacin apropiada con tintes lipoflicos, esto debido la naturaleza lipdica que exhiben estos materiales. Entre los tintes ms usados se encuentran el Azul de Nilo A y el Negro de Sudan B. En la tincin con Azul de Nilo-A, las clulas son fijadas por calor y al ser observadas bajo luz

fluorescente (= 362460 nm), emiten una fuerte coloracin anaranjada cuando la prueba es positiva (Ostle y Holt, 1982). Con el Negro de Sudan B, la fijacin de las clulas se hace

40

al aire libre y la prueba es positiva si se presenta una coloracin azul-violeta

bajo

iluminacin directa. S la coloracin es amarillo-caf la prueba es negativa (Byrom y Byrom, 1991; Serafim et al., 2002). Uno de los mtodos eficaces para la cuantificacin de PHA es la cromatografa de gases (GC), empleando como patrn interno cido benzoico, en el cual se establecen tiempos de retencin especficos para cada uno de los tipos de estructuras presentes en las muestras. Una tcnica que brinda mayor informacin es la cromatografa de cases acoplada con un detector selectivo de Masa (GC-MSD), que permite conocer las concentraciones de los componentes de la muestras (Keum et al., 2008). Para poder realizar el anlisis mediante estas tcnicas las molculas de PHA se deben extraer del interior de las clulas realizando procesos de lisis o dispersin y por ltimo procesos derivativos que permita obtener compuestos voltiles que faciliten la lectura en el equipo (Braunegg et al.,1978). La cuantificacin de PHA tambin se realiza mediante anlisis espectroscpico de resonancia magntica nuclear con Carbono 13 (RMN-13C). Esta tcnica permite determinar los grupos terminales y las posibles ramificaciones de las molculas presentes en las muestras (Khardenavis et al., 2009). Adems de estas tcnicas tambin encontramos la espectroscopia infrarroja con transformada de Fourier FTIR y RMN-1H, herramientas que se emplean en el presente, para la caracterizacin de estos compuestos (Jan et al., 1996 ; Shrivastav et al., 2010).

41

3. OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GENERAL

Encontrar un sistema bacteria-sustrato apropiado para la produccin de bioplsticos, utilizando subproductos agroindustriales de naturaleza oleaginosa y cepas microbianas nativas.

3.2 OBJETIVOS ESPECFICOS

Evaluar la capacidad productora de PHA de tres cepas bacterianas nativas potencialmente productoras de PHA, en aceites de Jatropha, ricino y frituras, lactosuero, glicerol (grado reactivo y residual), como fuentes de carbono. Seleccionar el sistema bacteria-sustrato ms promisorio, con base en la mayor produccin de biomasa y la mayor acumulacin de PHA. Establecer las mejores condiciones de operacin a escala de laboratorio, para la produccin de PHA, utilizando el sistema bacteriasustrato ms promisorio. Aplicar una metodologa de extraccin de PHA para valorar su produccin a partir del sistema bacteriasustrato ms promisorio.

42

4.

METODOLOGA

4.1 LUGAR DE EXPERIMENTACIN El desarrollo experimental de esta investigacin, se llevo a cabo en los laboratorios de la Facultad de Ciencias de la Universidad Nacional de Colombia, Sede Medelln (UNALMED): Venenos Naturales (Micotoxinas), Anlisis y Procesos Ambientales, Biologa Celular y Molecular y, Anlisis Instrumental. 4.2 MATERIALES Y REACTIVOS

4.2.1 Reactivos y Equipos Menores

Los equipos menores y algunos reactivos empleados en el desarrollo de la parte experimental de la investigacin, se listan en la Tabla 13.

Tabla 13. Equipos y reactivos utilizados en el desarrollo de la investigacin Equipos Cabina de Bioseguridad ESCO Autoclave de mesa Tuttnauer 2540ML Agitador orbital con control de temperatura InnovaTM 4400 Ultracentrfuga Jouan MR22 Balanza analtica de precisin (0.0001g) pH-metro Metrohm Plancha de agitacin con calentamiento Espectrofotmetro UV-Visible Shimadzu UV-160 Reactivos Sulfato de amonio ((NH4)2SO4) Extracto de levadura (OXOID) Fosfato monobsico de potasio(KH2PO4) Fosfato dibsico de sodio (Na2HPO4) Sulfato de magnesio heptahidratado (MgSO4.7H2O) Agar nutritivo MERCK TRIS-HCl 0.1M cido dinitrosaliclico (DNS)

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Transferpette (100-1000l, 100-5000 l) BRAND Incubadora BINDER Horno-Estufa Nevera (-20) Freezer (-70C) Liofilizador Labcono Vidriera general Tubos Falcons (15 , 50ml) Tubos Eppendorf

Hipoclorito de sodio 5% p/v (NaClO) cido poli-3-hidroxibutrico Acido clorhdrico (HCl 5N) Hidrxido de sodio (NaOH 5N) Metanol grado reactivo 95% v/v (CH3OH) Cloroformo grado reactivo 99% v/v (CHCl3) n-Hexano grado reactivo 95% v/v (C6H6) Acetona grado reactivo 99% v/v (CH3COCH3) Glicerol Grado Reactivo (GGR) 99.5% v/v (C3H8O3) Marca JT Baker Glicerol residuo de la produccin de biodiesel a partir de aceite de palma Solucin de elementos traza (SET)

Extractor de Gases CEX 120

4.2.2 Sustratos Como fuente de carbono para el crecimiento de las cepas nativas, se utilizaron tres sustratos de naturaleza oleaginosa (aceite de Jatropha, aceite de ricino, aceite de frituras), dos muestras de glicerol, una comercial (GR) y una residual (subproducto del biodiesel) (RSB)), y una de lactosuero, los cuales se conservaron bajo refrigeracin (- 4C) hasta su utilizacin. Es de anotar que el glicerol y la lactosa, presente en el lactosuero, son de naturaleza glicosdica (azcar alcohol y disacrido, respectivamente), pero en matrices crudas, generalmente se encuentran acompaados de residuos grasos. Los aceites de Jatropha y de ricino fueron donados por el Departamento Fisicoqumico de Biolgicos y Contaminados, de la empresa Biocombustibles S.A, la cual los utiliza como materia prima para la produccin de biodiesel. El aceite de frituras fue recolectado en la Cafetera Central de la Universidad Nacional de Colombia, Sede Medelln.

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El lactosuero fue suministrado por la Planta de Leche de la Universidad Nacional de Colombia, Sede Medelln, ubicada en el ncleo del Volador. El GGR, fue suministrado por el Laboratorio de Venenos Naturales de la Universidad Nacional de Colombia, Sede Medelln, mientras que GRSB (81,6%) provino de la empresa Oleoflores Ltda., ubicada en el Municipio de Codazzi (Cesar), donde lo obtienen como subproducto durante la produccin de biodiesel a partir de aceite de palma. Estos sustratos fueron escogidos por su naturaleza qumica (oleaginosa, glicosdica alcohlica), dado que las cepas productoras de PHA pueden seguir dos rutas, una a partir de azcares y otra partiendo de cidos grasos (Vanse Figuras 5 y 6). As, se espera que los microorganismos puedan crecer fcilmente sobre los aceites de Jatropha, ricino y frituras. En la Tabla 14 se relacionan los cidos grasos presentes en diferentes aceites, incluyendo el aceite de palma, del cual provena el aceite de frituras utilizado en esta investigacin.

Tabla 14. Composicin Qumica de los aceites de Jatropha, Ricino y Palma % cidos Grasos Saturado Larico C12:0 Mirstico C14:0 Palmtico C16:0 Esterico C18:0 Dihidroxiesterico C18:0 Araqudico C20:0 Eicosenoico Insaturado Palmitoleico C:16:1 Ricinoleico C18:1 Oleico C18:1 Linoleico C18:2 Linolenico C18:3 Fuente: a) Ko-Sin et al., 2010 b) Gui et al., 2008 Jatropha < 0.01 0.1 17.1 ; 14.2b 4.3 ; 6.9b --< 0.01 --1.2 --a 42.0 ; 43.1b 34.8 ; 34.3b 0.1 Aceite Ricino ----1.0 1.0 0.7 --0.3 --89.5 3.0 4.2 0.3 Palma ----45.0 5.0 ----------40 10 ---

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El lactosuero se escogi para la produccin de PHA, debido a que, adems de lactosa posee cidos grasos provenientes de sus triacilgliceroles. En la Tabla 15, se presenta la

composicin de los lactosueros dulce (pH 6.45) y cido (pH 5).

Tabla 15. Composicin Qumica de lactosuero

Parmetro pH Agua Extracto seco Lactosa Protenas Grasa Sales minerales

Fuente: Guerrero et al., 2010

Composicin de Lactosuero Dulce 6.45 93 - 95% 5-7% 4.53- 5.3 % 0.6 - 1.1% 0.1 - 0.4% 0.5 - 0.7%

cido 5 93 - 95% 5-7 % 3.8-5.2 % 0.2-1.1% 0.1 -0.5% 0.5 - 1.2%

Aunque el glicerol es un azcar-alcohol, hace parte de todos los aceites y grasas, vinculado a los cidos grasos saturados como los cidos lurico, palmtico, esterico e insaturados como el oleico y linoleco, entre otros, por lo que constituye un producto de la hidrlisis y la transesterificacin de triacilgliceroles. En las Tablas 16 se presenta la composicin caracterstica del GGR
Tabla 16. Composicin caracterstica de GGR

Composicin Glicerol J.T. Baker (GR) Parmetro Pureza Esteres de cidos grasos (como cido Butrico ) Residuos despus de ignicin Trazas de impurezas (en ppm): Hierro(Fe) Plomo (Pb) Mercurio (Hg) Zinc (Zn) Fuente: Biblioteca Tcnica de J.T.Baker, 2006 Valor 99.5% 0.05% mx. 0.005% mx. 5.0 mx. 2.0 mx. 10.0 mx. 2.0 mx.

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En Tablas 17 se presenta la composicin de glicerol obtenido durante la produccin de biodiesel (crudo), a partir de aceite de palma.

Tabla 17. Composicin del glicerol en la fase obtenida por decantacin, en la produccin de biodiesel a partir de aceite de palma. Sustancia % p/p

Glicerol Agua Metanol Metilesteres Monoglceridos Diglceridos Triglceridos Jabones Catalizador Otros (Sales y trazas de bases o cido) As (ppm)
Fuente: Cardeo et al., 2011

84.6 4.82 0.77 0.03 0.22 0.09 0.77 4.30 5.17 0.77 0.04 mx.

4.3 CEPAS BACTERIANAS En la investigacin se evaluaron tres cepas bacterianas nativas (Vase Figura 7) dela coleccin del grupo de investigaciones PROBIOM, aisladas a partir de diferentes residuos industriales, y seleccionadas, con base en pruebas bioqumicas, moleculares y analticas, por su capacidad para producir PHA:

Bacillus megaterium y Bacillus sp., aisladas de suelos contaminados con jugo de fique, por la estudiante Silvia Alexandra Snchez Moreno (Snchez, 2007) en el marco de su tesis de maestra Produccin de polihidroxialcanoatos a partir de residuos orgnicos

agroindustriales.

Lactococcus lactis, aislada de muestras de lactosuero, por la estudiante Ana Carolina Cardona, en el marco de su trabajo de grado de pregrado en Ingeniera Biologica

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Figura 7. Morfologa macro y microscpica de las colonias de cepas: A) B. megaterium B) Bacillus sp. 1 y 2. Caractersticas macroscpicas de las colonias, 3. Microscopa de Fluorescencia a 450 nm con azul de Nilo y 4. Coloracin de Gram. (Sanchez et al., 2007)

El potencial de las cepas para producir PHA a partir de residuos azucarados, fue evaluado por Alejandro Salazar Villegas en su trabajo de maestra Parmetros operacionales ptimos para la produccin de bioplsticos a partir de fuentes renovables azucaradas (Salazar, 2011). En esta investigacin se evalu el potencial para producir PHA a partir de sustratos oleaginosos, glicerol y lactosuero.

4.4 MEDIOS DE CULTIVOS

Para la evaluacin de los microorganismos (B. megaterium, Bacillus sp., L. lactis), se prepararon medios de cultivos suplementados con fuentes de carbono de distinta naturaleza y origen (aceites de Jatropha, ricino, frituras, lactosuero, glicerol, y glicerol residual) (Vase Seccin 4.2). Cada cepa bacteriana se hizo crecer en los diferentes medios de cultivo, tal como se describe en las secciones siguientes.

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4.4.1 Medio de cultivo con lactosuero como fuente de Carbono.

Para la evaluacin de este sustrato como fuente de carbono, se prepar un medio mnimo de sales (MMS) en agua, el cual contena por L de solucin: 1.2 g de KH2PO4, 11 g de Na2HPO4.12H2O, 16 g de NH4Cl, 1.4 g de MgSO4 .7H2O, 1 mL de Solucin acuosa de Elementos Traza (SET); que contena por L: 10 g de FeSO4.7H2O, 2.25 g de ZnSO4.7H2O, 1 g de CuSO4.5H2O, 0.5 g de MgSO4.5H2O, 2 g de CaCl2.2H2O, 0.23 g de Na2B4O7.10H2O, 0.1g de (NH4)6Mo7O24, 10 mL de HCl al 35%, y lactosuero 20 g/L . El medio se suplement con de extracto de levadura (1 g/L) y se ajust a pH 7.0 con una solucin de NaOH 5N. Finalmente, se autoclav (15 psig, 121C, durante 15 min), para la subsiguiente inoculacin de los microorganismos.

Previo a su adicin, el lactosuero se someti a un tratamiento de limpieza para eliminar interferentes como las protenas: inicialmente se acidific con HCl 5N hasta un pH < 4.0, seguidamente se autoclav (15 psig y 121C por 15 min), se dej enfriar a temperatura ambiente y se centrifug a 10000 rpm durante 15 min. El sobrenadante se filtr, para eliminar las partculas flotantes, con papel de filtracin rpida marca Whatman, Banda Roja, grado 589/3 (125 mm dimetro). Del filtrado se tom el volumen necesario para ajustar una concentracin de (20 g/L) en el medio de cultivo (Pantazaki et al., 2009).

4.4.2 Medios de cultivo con aceites (ricino, Jatropha, Frituras) como fuentes de Carbono.

Para el crecimiento de las cepas bacterianas se utiliz un medio mnimo de sales (MMS) que contena, por L de agua: 1.2 g de KH2PO4, 11 g de Na2HPO4.12H2O, 16 g de NH4Cl, 1.4 g de MgSO4 .7H2O, 1 mL de Solucin de Elementos Traza (SET), preparada tal como se describe en la Seccin 4.4.1. Antes de la adicin del aceite, el medio se llev a pH 7.0 con NaOH 5N. Posteriormente, se le adicion la fuente de carbono (aceite de ricino,

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Jatropha o frituras, segn el caso) a 20 g/L, y se suplement con extracto de levadura (1g/L). Finalmente, se autoclav (15 psig, 121C, durante 15 min).

En la Figura 8 se pueden observar las muestras de los aceites evaluados en esta fase de la investigacin.

Figura 8. Aceites empleados en las diferentes fermentaciones: A) Ricino B) Jatropha C) Frituras

4.4.3 Medios de cultivo con glicerol comercial y glicerol residual como fuentes de carbono. Se evaluaron dos muestras como fuentes de carbono: glicerol GR (99.5 % v/v) y glicerol producido colateralmente en la industria de biodiesel (81.6 % v/v). Para la preparacin de 1 L de los medios de cultivo en agua, se utilizaron: 10 g de Glicerol GR (o residual (GRSB)), 1 g de (NH4)2SO4, 1.5 g de KH2PO4, 9 g de Na2HPO4.12H2O, 0.2 g de MgSO4.7H2O, 1 mL de SET (Vase Seccin 4.4.1). El medio se suplement con 1 g/L de extracto de levadura y se llev a pH 7.0 con NaOH 5N. Seguidamente se autoclav (15 psig, 121C, durante 15 min). Siguiendo las sugerencias de Cavalheiro y colaboradores (2009), la fuente de carbono se autoclav separadamente antes de adicionarse al medio.

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4.5 CONDICIONES DE CRECIMIENTO MICROBIANO Para evaluar el crecimiento bacteriano en los diferentes sustratos propuestos como fuente de carbono (Vase Seccin 4.4), se llevaron a cabo experimentos a escala de laboratorio, bajo agitacin orbital y temperatura controlada. En todos los casos se utilizaron

erlenmeyers de 250 mL, con un volumen de trabajo de 50 mL, en el que se consider un 10% v/v para el inoculo. A continuacin se describen las condiciones operacionales especficas de cada sistema bacteria: sustrato evaluado.

4.5.1 Fermentaciones con lactosuero como fuente de carbono

Las fermentaciones de los tres sistemas bacteria:sustrato resultantes de combinar el lactosuero con: B megaterium, Bacillus sp., y L. lactis. se realizaron a 30C y 150 rpm (Salazar et al., 2011). Las variables que se analizaron para realizar la seleccin del sistema bacteria-sustrato ms promisorio fueron: la biomasa seca y la presencia de PHA, producidos bajo las mismas condiciones operacionales (T 30C, pH 7.0, 150 rpm), El seguimiento del crecimiento bacteriano se monitore durante 72 h, tomando muestras a diferentes tiempos, cada punto de la curva de crecimiento se evalu por triplicado.

Para la identificacin qumica (GC/MSD) del PHA, se realizaron extracciones de muestras compuestas de biomasa, obtenidas para cada cepa, con la biomasa producida en los triplicados de cada punto muestreado a lo largo de los procesos fermentativos. As se obtuvieron tres extractos, correspondientes a los sistemas B. megaterium: lactosuero, Bacillus sp., y L. lactis.

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4.5.2 Fermentaciones con aceites (Jatropha ricino, frituras) y glicerol (GGR), como fuentes de Carbono.

Para escoger el mejor sistema bacteria-sustrato, se desarroll un diseo experimental factorial 4x3; con cuatro factores (cuatro fuentes de carbono: (S1) aceites de ricino, (S2) Jatropha, (S3) fritura y (S4) GGR) y 3 niveles (3 microorganismos: (Mo1) B. megaterium, (Mo2) Bacillus sp., (Mo3) L. lactis); con serie de tres repeticiones, manteniendo constantes el tiempo de reaccin (48 h), la temperatura ( 30 C), el pH 7.0, la velocidad de agitacin (200 rpm), la concentracin de sustrato (20 g/L) y el volumen de medio de cultivo (50 mL) (Vase Tabla 18). Las variables respuestas fueron: la cantidad de biomasa (g/L) y la acumulacin de PHA (g/L).

Tabla 18. Diseo factorial para la seleccin del mejor sistema bacteria:sustrato (T: 30C; pH 7.0 y velocidad de agitacin de 200 rpm; t de fermentacin 48 h) Ensayo 1 S1Mo1 S1Mo2 S1Mo3 S2Mo1 S2Mo2 S2Mo3 S3Mo1 S3Mo2 S3Mo3 S4Mo1 S4Mo2 S4Mo3 Ensayo 2 S1Mo1 S1Mo2 S1Mo3 S2Mo1 S2Mo2 S2Mo3 S3Mo1 S3Mo2 S3Mo3 S4Mo1 S4Mo2 S4Mo3 Ensayo 3 S1Mo1 S1Mo2 S1Mo3 S2Mo1 S2Mo2 S2Mo3 S3Mo1 S3Mo2 S3Mo3 S4Mo1 S4Mo2 S4Mo3

S: Sustrato (1: A. Ricino; 2: A. Frituras; 3: A. Jatropha; 4: GGR) Mo: Microorganismo (1: B. megaterium; 2: Bacillus sp.; 3: L. lactis).

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En estos experimentos, el tiempo de fermentacin se redujo de 72, aplicadas a los sistemas con lactosuero, a 48 horas, con base en la revisin bibliogrfica: En la literatura referente a la produccin de PHA, en matrices oleaginosas y en glicerol, reportan tiempos menores o iguales a las 48 h. As, por ejemplo, Tian et al., (2000), utilizando Pseudomona mendocina 0806 sobre sustratos tales como los cidos mirstico y oleico, caractersticos los aceites evaluados en esta investigacin, encontraron mayor acumulacin de biomasa y produccin de PHA a las 48 h; Ko-Sin et al., (2010) reportaron el mismo tiempo para dos variables, al trabajar con C. nector H16 y aceite de Jatropha. Por su parte, Lopez-Cuellar et al., (2010) reportaron mayor produccin de PHB y de biomasa, despus de las de 40 h para una cepa de W. eutropha en aceite de canola; y Naranjo (2010) reporto mayor produccin de PHB, a las 45 h, empleando una cepa de B. megaterium y glicerol.

Para la identificacin qumica (GC/MSD) del PHA se realizaron extracciones de muestras compuestas de biomasa, obtenidas para cada cepa, con la biomasa producida en los triplicados de cada punto muestreado a lo largo de los procesos fermentativos. No obstante, solo se sometieron a anlisis mediante GC/MSD, los de mayor peso.

4.5.3 Fermentaciones con glicerol residual (GRSB) como fuente de Carbono Los ensayos con GRSB se realizaron siguiendo el protocolo descrito para el GGR (Vase Seccin 4.5.2) pero con un tiempo de fermentacin de 72 horas, tomando muestras (por triplicado) para determinacin de biomasa a las 0, 8, 12, 24, 36 y 72 h.

4.6 MEJORES CONDICIONES OPERACIONALES PARA LA PRODUCCIN DE PHA EN EL SISTEMA BACTERIA: sustrato.

Para establecer, a escala de laboratorio, las mejores condiciones de operacin del sistema bacteria:sustrato, se realiz un diseo experimental factorial mediante anlisis de superficies de respuesta con serie de tres repeticiones. Las variables respuesta del sistema

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fueron: produccin de biomasa seca por unidad de volumen, concentracin de PHA por unidad de volumen y rendimiento Yp/s. Las constantes fueron: el tiempo de reaccin (48 h), la velocidad de agitacin (200 rpm) y el volumen del medio de cultivo (50mL). La zona de trabajo se delimit con la ayuda del software STATGRAPHICS, mediante la opcin crear diseo y tomando en cuenta valores de referencia mnimos y mximos (Vase Tabla 31).

En la Tabla 19 se resumen los valores de T, pH y concentracin de sustrato que se estimo el diseo experimental.

Tabla 19. Niveles para cada factor evaluado en la produccin de PHA Niveles
T(C) 1 2 3 4 5 25 30 35 ----pH 5 6 7 8 9

Factores
Concentracin del sustrato (g/L) 8 10 15 20 22

En la Tabla 20, se presenta el diseo experimental propuesto para la evaluacin de las diferentes condiciones, en las que se combinan cinco concentraciones (C1: 8 g/L, C2: 10 g/L, C3: 15 g/L C4: 20 g/L, C5: 22 g/L), cinco valores de pH ( pH1: 5, pH2: 6 pH3: 7, pH4 :8 pH5: 9) y tres valores de T ( T1: 25 C; T2: 30C; T3: 35 C).

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Tabla 20. Diseo experimental superficies de respuesta. T1

C1pH3(1) C1pH3(2) C2pH2(1) C2pH2(2) C2pH4 (1) C2pH4 (2) C3pH1 (1) C3pH1(2) C3pH3(1) C3pH3(2) C3pH3(3) C3pH3(4) C3pH5(1) C3pH5(2) C4pH2(1) C4pH2(2) C4pH4(1) C4pH4(2) C5pH3(1) C5pH3(2)

T2
C1pH3(1) C1pH3(2) C2pH2(1) C2pH2(2) C2pH4 (1) C2pH4 (2) C3pH1 (1) C3pH1(2) C3pH3(1) C3pH3(2) C3pH3(3) C3pH3(4) C3pH5(1) C3pH5(2) C4pH2(1) C4pH2(2) C4pH4(1) C4pH4(2) C5pH3(1) C5pH3(2)

T3
C1pH3(1) C1pH3(2) C2pH2(1) C2pH2(2) C2pH4 (1) C2pH4 (2) C3pH1 (1) C3pH1(2) C3pH3(1) C3pH3(2) C3pH3(3) C3pH3(4) C3pH5(1) C3pH5(2) C4pH2(1) C4pH2(2) C4pH4(1) C4pH4(2) C5pH3(1) C5pH3(2)

C: concentracin de sustrato; T: temperatura; pH; (X): N de repeticiones para cada experimento

El anlisis de los datos obtenidos mediante el diseo experimental, se realiz utilizando los software: SAS (Statistical Analisys System) y STATGRAPHICS. Estos permitieron hacer los anlisis de varianza (ANOVA) y graficar las superficies de respuesta y las interacciones presentadas entre las diferentes variables.

El anlisis de los resultados se hizo mediante la herramienta del software SAS, que realiz procedimientos de RSREG, y mediante la metodologa de superficies de respuesta y, con la herramienta anlisis de diseo del programa estadstico STATGRAPHICS, se analizaron los efectos lineales, cuadrticos y de interaccin, para temperatura, pH y
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concentracin de sustrato, sobre los trminos de produccin de biomasa, PHA y Yp/s. Adems, se hizo el anlisis del efecto global de cada uno de los parmetros, considerando de manera conjunta todos sus componentes (lineal, cuadrtico e interacciones) (Vase Anexo A).

4.7 METODOLOGAS DE ANLISIS

Para la seleccin del mejor sistema bacteria:sustrato, se hizo seguimiento microbiano (biomasa seca) y qumico (concentracin de PHA) a los experimentos descritos en la Seccin 4.5, siguiendo las metodologas presentadas a continuacin:

Determinacin de biomasa seca

Los medios de cultivo fueron centrifugados a 8000 rpm a 20 C, durante un periodo de 5 min, en una centrifuga refrigerada Marca JOUAN Modelo MR22. Los centrifugados se resuspendieron en buffer TRIS-HCl pH 7.0 y se congelaron a -70C, para su posterior liofilizacin (-50C y 0.05 mBar). Los liofilizados se pesaron para determinacin de biomasa. Para los medios con aceite, se requiri una centrifugacin previa con n-hexano (8000 rpm, 20 C, 5 min) para separar la biomasa del medio oleaginoso. Extraccin y caracterizacin qumica mediante GC/MSD de los PHA

Los PHA fueron extrados de la biomasa bacteriana usando dispersiones de cloroformo (99% v/v) e hipoclorito de sodio (5% p/v) (Jacquel et al., 2008). Se adicion 1mL de cada reactivo por cada 20 mg de biomasa seca. Las muestras se agitaron a 30 C y 200 rpm durante 1h y se centrifugaron (5 min, 8000 rpm) para separar la fase orgnica, enriquecida con el PHA. A la fase orgnica, se le adicion metanol (95% v/v), gota a gota, hasta ver precipitacin. Seguidamente se dej en reposo a 4C, transcurridas 12 h se descart el

56

sobrenadante y el precipitado se lav varias veces con metanol. Finalmente el polmero se someti a secado (60C) y se pes.

La caracterizacin del biopolmero se realiz en el Laboratorio de Cromatografa de la UIS, mediante cromatografa de gases con detector selectivo de masas, operado en el modo de Monitoreo de Ion Selectivo (GC-MS/SIM). Para la cuantificacin se aplic la norma ISO 5509 (2000), la cual requiere la derivatizacion del biopolmero hasta los metilsteres correspondientes. La columna empleada en el anlisis fue DB-WAX [60 m x 0.25 mm x 0.25 m]. La inyeccin se realiz en modo splitless (Viny = 1 L). Se utiliz PHB (19.6 g) como material de referencia y cido benzoico como estndar interno. En el Anexo B se detallan los datos de calibracin suministrados por el Laboratorio.

57

5. RESULTADOS Y DISCUSIN

5.1 SELECCIN DEL SISTEMA BACTERIA: SUSTRATO La seleccin del mejor sistema bacteria sustrato, se hizo con base en la biomasa seca y la cantidad de PHA producidos en cada una de las fermentaciones descritas en las Seccin 4.5. 5.1.1 EVALUACIN DE LAS FERMENTACIONES CON EL SISTEMA BACTERIA: LACTOSUERO Al evaluar las diferentes cepas nativas en medio con lactosuero, se evidenci la mxima produccin de biomasa a las 24 h, 48h y 36 h, para L. lactis., Bacillus sp., y B. megaterium respectivamente, como se muestra en las Secciones 5.1.1.1 a .51.1.3

5.1.1.1 Sistema Lactococcus lactis: Lactosuero La mayor produccin de biomasa con la cepa L. lactis en medio enriquecido con lactosuero (20 g/L) se present a las 24 h, con valores de 0.88 0.04 g/L (Vase Tabla 21 y Figura 9).

Tabla 21. Valores de biomasa seca obtenidos en el sistema de fermentacin L. lactis-Lactosuero (T 30C) pH 7.0; Velocidad de agitacin 150 rpm sustrato 2% v/v, inoculo 10% v/v. Tiempo (h) 0 24 36 48 72 Biomasa seca (g/L) 0.57 0.03 0.88 0.04 0.16 0.02 0.28 0.01 0.15 0.01

Como se aprecia en la Figura 9 el microorganismo present un comportamiento exponencial entre las 0 y 24 h, seguido de una caida hasta las 40 h. Despues se present un

58

nuevo pero pequeo incremento en la biomasa hasta las 48 h, tiempo en el que de nuevo, empez a caer, hasta alcanzar valores de 0.15 0,01 g/L a las 72 h. Esto puede asociarse a la presencia en el medio de cultivo , de otros compuestos que empiezan a ser degradados por los microorganismos cuando la fuente principal de carbono se agota.

Figura 9.Crecimiento de L. lactis en Lactosuero (T 30C) pH 7.0; Velocidad de agitacin 150 rpm sustrato (20 g/L), inoculo 10% v/v

5.1.1.2 Sistema Bacillus sp: Lactosuero En la Tabla 22 se registran los valores de biomasa seca obtenidos en el tiempo para la cepa Bacillus sp., en medio enriquecido con lactosuero (20 g/L). En este caso el valor ms alto (0.22 0.02 g/L) se present a las 48 h y solo represent la cuarta parte de la biomasa obtenida con la cepa L. lactis, en tan solo 24 h.

59

Tabla 22. Valores de biomasa seca obtenidos en el sistema de fermentacin Bacillus spLactosuero (T 30C) pH 7.0; Velocidad de agitacin 150 rpm sustrato 20 g/L, inoculo 10% v/v Tiempo (h) 0 24 36 48 72 Biomasa seca (g/L) 0.09 0.01 0.10 0.02 0.05 0.01 0.22 0.02 0,11 0.01

La baja cantidad de biomasa generada por este sistema, se relaciona con su

la baja

capacidad de Bacillus sp. para asimilar el lactosuero (Figura 10). En este sistema, la etapa de adaptacin del microorganismo al medio fue ms lenta que la del L. lactis, en el mismo sustrato y bajo las mismas condiciones, y su fase exponencial empez despus de las 30 h. Seguida una cada alrededor de alrededor de las 48 h, hasta alcanzar 0,11 0,01 g/L a las 72 h.

Figura 10. Crecimiento de Bacillus sp., en Lactosuero (T 30C) pH 7.0; Velocidad de agitacin 150 rpm sustrato (20g/L), inoculo 10% v/v

60

5.1.1.3 Sistema B. megaterium : Lactosuero Los valores de biomasa obtenidos para la cepa B. megaterium en lactosuero como fuente de carbono (20 g/L) se registran e ilustran en la Tabla 23 y Figura 11, respectivamente. En este caso se observ una fase exponencial entre las 0 y 36 h, con un valor mximo de biomasa (0,59 0,06 g /L) a las 36 h de fermentacin, . seguida de una fase de disminucin desde las 36 h, la cual se prolonga posiblemente hasta despus de las 72 h, tiempo en el que se obtuvieron 0,40 0,05 g de biomasa/L

Tabla 23. Valores de biomasa seca obtenidos en el sistema de fermentacin B. megateriumLactosuero (T 30C) pH 7.0; Velocidad de agitacin 150 rpm sustrato 20g/L, inoculo 10% v/v Tiempo (h) 0 24 36 48 72 Biomasa seca (g/L) 0.46 0.05 0.58 0.07 0.59 0.06 0.45 0.03 0.40 0.05

Figura 11. Crecimiento de B. megaterium en Lactosuero (T 30C) pH 7.0; Velocidad de agitacin 150 rpm sustrato (20g/L), inoculo 10% v/v

61

En la Tabla 24 se registran los valores de PHB detectados en los extractos polimricos para cada uno de los sistemas bacteria:lactosuero. Como se puede ver, la mayor concentracin de biopolmero (0,4 mg/g) se detect para el sistema B megaterium: Lactosuero. Pese a que la mayor concentracin de biomasa (0.88 0.04 g/L) se dio con sistemas L. lactis: Lactosuero, en ste el biopolmero se detect en concentraciones traza. Posiblemente el L. lactis, logr su crecimiento con base en el metabolismo de la degradacin de lactosa, sustrato difcil de asimilar por los microorganismos que carecen de lactasa, enzima responsable de su degradacin.

Tabla 24. Concentracin del monmero metileter metilester del cido 3-hidroxibutrico en los extractos de diferentes sistemas bacteria: Lactosuero

Compuesto Metileter metilester del cido

NMC*, mg/g Concentracin en las muestras, mg/g B. megaterium Bacillus sp. L. lactis 0,2 0,4 0,2 0,2

3-hidroxibutrico
*NMC: nmero mnimo de cuantificacin.

Los resultados permiten establecer la combinacin B. megaterium: lactosuero como el mejor sistema bacteria: lactosuero. No obstante, los valores de biomasa [0.88 0.04 g/L (24h), 0.22 0.02 g/L (48 h) y 0.59 0.06 g/L (36 h), con L. lactis, Bacillus sp., y B. megaterium], obtenidos en los tres sistemas evaluados se encuentran muy lejos de los valores de biomasa (3.1 g/L, 36 h) que se obtienen con B. megaterium en un medio enriquecido con glucosa y operado bajo las mismas condiciones (T: 30 C, pH 7.0,

concentracin de sustrato 20 g/L y velocidad de agitacin de 150 rpm) (Salazar , 2011) y los obtenidos (2.82 g/L, 30 h) por Obruca et al, (2011) en un sistema B. megaterium: suero de queso, (con la fuente de carbono optimizada) que a su vez, son ms bajos que los obtenidos con glucosa como sustrato.

62

El lactosuero, sustrato reportado como posible fuente de carbono en la produccin de biopolmeros, a partir de la cepa B. megaterium (Pantazki et al., 2009; Obruca et al., 2011), en este caso no present un buen rendimiento, posiblemente porque estaba contaminado con otros productos colaterales del proceso de quesos que se desarrolla en la planta de lcteos de la cual se muestreo, tales como protenas no precipitadas, las cuales pueden actuar como inhibidores que afectaron el proceso fermentativo. Sin embargo, Obruca et al, report valores es un sistema optimizado para el sustrato de 2.82 g/L biomasa y 1.05 g/L de PHB, incluso estos valores se encuentra por debajo de los reportados por Salazar ,2011.

Por tanto, y como el objetivo es buscar sustratos econmicos, que permitan superar los rendimiento de PHA obtenidos con sustratos como glucosa, utilizada a nivel industrial, no se recomienda el sistema B. megaterium: lactosuero, como sustrato alterno para producir PHA.

5.1.2

EVALUACIN DE LOS SISTEMAS BACTERIA: sustrato oleaginoso y

BACTERIA : glicerol

El arreglo factorial establecido y desarrollado segn la descripcin de la Seccin 4.5.2, para evaluar el comportamiento de las cepas nativas en los medios suplementados con aceites (Jatropha, ricino, frituras) y el glicerol comercial, permiti determinar de manera rpida cul de los sustratos y cepas, combinados, resultaban mejores para la produccin de biomasa y de PHA. En la Tabla 25, se registran los valores de biomasa seca obtenidos para las cepas B. megaterium, Bacillus sp., L. lactis en los diferentes sustratos y en la Figura 12 se ilustran de manera comparativa los mismos; como se puede apreciar la mejor respuesta se present con el sistema B. megaterium- glicerol, seguido de los sistemas B. megaterium A. de ricino, Bacillus sp.- A. de fritura y Bacillus sp.- Ricino

63

Tabla 25. Valores de biomasa seca obtenida con B. megaterium, Bacillus sp., L. lactis en medios enriquecidos con diferentes fuentes de carbono (aceite de fritura, aceite de ricino, aceite de Jatropha y glicerol) T 30C, pH 7.0, Velocidad de agitacin 150 rpm, Inoculo 10 % v/v, t 48 h. Biomasa (g/L) Microorganismo B. megaterium Bacillus sp L. lactis Aceite Fritura 0.35 0,02 0.45 0,16 0.21 0,11 Ricino 0.58 0,02 0.45 0,07 0.27 0,03 Jatropha 0.44 0,08 0.41 0,18 0.19 0,08 Glicerol 1.23 0,05 0.24 0,06 0.17 0,11

Figura 12. Biomasa seca obtenida en los diferentes sistemas (microorganismo-sustrato). (Fuente de carbono (20 g/L, tiempo de fermentacin 48 h, temperatura 30C, pH 7.0)

Todos los sistemas bacteria: sustrato fueron sometidos a extraccin; no obstante, la produccin de PHA solo se analiz en los sistemas B. megaterium: glicerol, el cual arrojo la mayor cantidad de biomasa (1.23 0,05 g/L) y B. megaterium: Aceite de frituras, en el que pese a que el crecimiento bacteriano fue ms bajo (0.35 0,02 g/L), el microorganismo se

64

expone a una fuente de sustrato mucho ms econmica que el glicerol. Aunque en los sistemas B. megaterium: A. ricino y Bacillus sp : A ricino, hubo crecimiento bacteriano y de su biomasa seca se obtuvieron pequeas cantidades extractos polimricos (< 10 mg), no se sometieron a anlisis GC/MSD, dado que el crecimiento microbiano es bajo y el A. de ricino se utiliza fuertemente en las industrias energtica (produccin de biodiesel) y qumica (produccin de pinturas), en consecuencia el proceso para producir PHA debera ser excelente para poder competir con los otros proceso industriales. En los sistemas con aceite de Jatropha, por su parte no hubo precipitado polimrico visible. En la Tabla 26, se registran los pesos de los extractos obtenidos para cada sistema bacteria:sustrato

Tabla 26. Extractos polimricos obtenidos para B. megaterium, Bacillus sp., L. lactis en medios enriquecidos con diferentes fuentes de carbono (glicerol (GGR) , aceite de: frituras, ricino, Jatropha). Peso biopolmero (mg) Microorganismo B. megaterium Bacillus sp L. lactis Aceite Fritura 25 N.P N.P Ricino 9.7 5.4 N.P Jatropha N.P N.P N.P Glicerol (GGR) 11,9 N.P N.P

N.P: No hubo precipitado visible en los viales.

En la Figura 13 se presenta el espectro (GC/MSD) de los metilester derivados del (a) cido 3-hidroxibutirico PHB) comercial y de los biopolmeros extractados de los sistemas (b) B. megaterium- glicerol y (c) B. megaterium- A. de frituras. La seal a 23.358 min corresponde al metileter metilester del cido 3-hidroxibutrico (compuesto de referencia para la cuantificacin), y la que aparece a 40.841 min, al ster del cido benzico

65

(estndar interno) y en la Tabla 27, se registran los valores PHB detectados en los extractos polimricos evaluados.

66

Figura 13. Espectro de masas (GC/MS) de los metilester derivados de (a) cido 3-hidroxibutrico (PHB) comercial;(b) extracto polimrico obtenido de la fermentacin con el sistema B megaterium- glicerol y (c) extracto polimrico obtenido de la fermentacin con el sistema B megaterium- A. de frituras

Tabla 27.Concentracin del monmero metileter metilester del cido 3-hidroxibutrico en los extractos los sistemas B. megaterium: Glicerol; B. megaterium: aceite de frituras

Compuesto Metileter metilester del cido

NMC*, mg/g

Concentracin en las muestras, mg/g B. megaterium

0,2 3-hidroxibutrico

F 7,6

G 11,8

*NMC: nmero mnimo de cuantificacin. F: aceite de frituras, G: glicerol

Como se puede apreciar, y como era de esperar, el mejor resultado (11.8 mg/g de PHB) fue obtenido en el sistema B megaterium: glicerol, con el que a las 48 h de fermentacin se obtuvo mayor concentracin de biomasa ( 1.23 0,05g/L). Por lo que fue seleccionado como el mejor sistema bacteria:sustrato para la produccin de PHB. No obstante, el

67

sistema B megaterium: aceite de fritura, en cuyos extractos se detectaron 7.6 mg/g de PHB, resulta promisorio, por lo que debera evaluarse con detalle en otros estudios. En consecuencia y con el nimo de disminuir costos en el proceso de produccin de PHB, se procedi a realizar los ensayos con el glicerol residual, empleando las mismas condiciones de operacin (concentracin de sustrato, temperatura, pH y velocidad de agitacin), utilizadas en este ensayo para el glicerol grado reactivo. De obtener resultados similares, para la produccin de biomasa seca, se procedera a optimizar los parmetros operacionales con glicerol residual. 5.1.2.3 Sistema B. megaterium : glicerol residual (GRSB)

Los valores de biomasa seca producida por la cepa B. megaterium en medio con GRSB (20 g/L) y con glucosa (20 g/L), se registran en la Tabla 28. La glucosa es el sustrato por excelencia, empleado en la produccin de PHA a nivel industrial (Chanprateep 2010), por lo que fue tomado como referente en esta etapa el proceso. Los datos fueron obtenidos en el grupo PROBIOM, bajo las mismas condiciones operacionales.

Tabla 28. Valores de biomasa seca producida en los sistemas B. megaterium-glicerol RSB y B. megaterium-glucosa. (T: 30 C, concentracin de Sustrato (20 g/L), pH 7.0, inoculo: 10% v/v) Tiempo (h) 0 8 24 36 48 72 144
a)

Biomasa (glicerol residual) (g/L) 0.18 0.05 1.51 0.14 2.66 0.06 3.07 0.11 2.80 0.03 2.21 0,05 ---

Biomasa (glucosaa ) (g/L) 0.164 0.008 --1.91 0.124 3.096 0.124 --2.138 0.176 0.552 0.028

Datos reportados por Salazar (2011), obtenidos simultneamente con los de las fermentaciones en

glicerol, bajo condiciones operacionales iguales. y que fueron compartidos con esta investigacin

68

.
Figura 14. Curvas de crecimiento de B. megaterium en glicerol residual y B. megaterium en glucosa. Condiciones operacionales: (T 30 C, concentracin de fuente de carbono 20 g/L, pH 7.0, inoculo:10% v/v)

Como se puede apreciar B. megaterium muestra una tendencia de crecimiento microbiano muy similar en los dos sistemas, alcanzando valores mximos de biomasa de 3.07 0.11 g/L, en el medio con GRS , y de 3.096 0.124 g/L, en medio con glucosa ,a las 36 h y bajo las mismas condiciones de fermentacin. Esto puede atribuirse al conjunto enzimtico que posee, las cuales les permite asimilar los dos sustratos rpidamente, puesto que el glicerol es un azcar-alcohol que puede ser incorporado en la ruta metablica de los carbohidratos para la sntesis de PHA, adems por lo observado en los resultados al encontrarse crecimiento en aceites de la cepa, es de suponer que poseen enzimas capaces de degradar los cidos grasos y usarlos como fuentes de carbono , es por ellos que en medios con GRSB, a parte de glicerol, obtendran una fuente de carbono adicional que sigue la ruta metablica para la sntesis de PHA a partir de cidos grasos. (Vanse Figuras 5 y 6) Ahora, comparando la biomasa obtenida (1.23 0.05 g/L) a las 48 horas con GGR y la obtenida (2.80 0.11 g/L) a las mismas condiciones operacionales con GRSB se observa

69

mejor comportamiento de la cepa en GRSB ; el microorganismo aprovecha las diferentes fuentes de carbono presentes en el sustrato como se explico anteriormente, pues como se presenta en la Tabla 17 este sustrato no es completamente puro. Este comportamiento coincide con el de Cupriavidus nector en glicerol puro (rendimientos Yp/x = 0.37 y Yp/s =0.36) y en glicerol residual,(subproducto del proceso biodiesel a partir de aceites refinados, (rendimientos Yp/x = 0.45 y Yp/s =0.34), (Cavalheiro et al, 2009).

Los resultados encontrados en esta evaluacin y la capacidad de B. megaterium para acumular PHA en GGR (Vase Tabla 27), muestran el potencial de la cepa para producir PHA a partir de GRSB, con mejores rendimientos de produccin de biomasa, este ltimo es lo que lo vuelve muy atractivo para la produccin de biopolmeros. Ante esto, se procedi a realizar la evaluacin de las condiciones ptimas, para la produccin de PHB a partir de GRSB un subproducto de la industria del biodiesel, siguiendo el diseo experimental descrito en la seccin 4.6

5.2 MEJORES CONDICIONES OPERACIONALES PARA LA PRODUCCIN DE PHA EN EL SISTEMA BACTERIA: GLICEROL RESIDUAL Los reportes sobre investigaciones en la que se analizan parmetros operacionales en sistemas con glicerol como fuente de carbono, son pocos (Vase Tabla 29). Particularmente con B. megaterium y glicerol, se encuentran los de naranjo, quien utiliz una cepa de B. megaterium aislada de un sedimento marino del estuario de Baha Blanca, Argentina, sobre glicerol como fuente de carbono.(Naranjo, 2010)

70

Tabla 29. Produccin de PHA diferentes cepas bacterianas, empleando glicerol como sustrato Condiciones operacionales para la produccin de PHA evaluadas en trabajos previos Cepa
C. necator H16

Fuente de C
Glicerol (8688%)a/ Glicerol Residual (1174.5 g/L)b

pH

T (C)

Concentracin (g/L)
20

% PHB en Biomasa seca

62a

Ref.
Cavalherio et al., 2009

6.8

30

38

C. necator JMP 134 y Paracoccus denitrificans DSMZ 413 Zobellella denitrificans MW1 Escherichia coli CT1061 C. necator NCIMB 11842 B. megaterium

Glicerol crudo

7.0

35

20

70

Mothes et al., 2007

Glicerol

7.3

41

15

66.9

Mohammad et al., 2009 Pablo et al., 2008 Naranjo et al., 2010 Naranjo et al., 2010

Glicerol

N.R

37

22 20 50 20 50

42,31 45.32 55.99 23.74 30.2

Glicerol

6.8

30

Glicerol

7.0

30

N.R : No Reporta.

Con base los niveles de los diferentes factores reportados en la Tabla 29, se determinaron los rangos de Temperatura, pH y concentracin de sustrato, para realizar el diseo estadstico para evaluar las mejores condiciones de operacin del sistema B. megaterium GRSB que fue presentado en la Seccin 4.6. As, los valores mximos y mnimos fueron establecidos teniendo en cuenta que La mayora reportan temperatura de 30C para la produccin de PHA y no se han considerado proceso a 25C. Por lo que el diseo experimental aplicado incluy temperaturas de 25C, 30C y 35C. En la Tabla 11 se observan estudios con variaciones en pH desde 2 hasta 11 para distintos microorganismo encontrndose acumulacin de PHA en pH bsicos y neutros. Ante esto, se propuso una zona de bsqueda, para determinar la influencia

71

de este parmetro sobre el sistema B. megaterium-glicerol RSB, evaluando valores de pH por encima y por debajo de 7.0. Los mayores valores de acumulacin de PHB se reportan a concentraciones de sustrato de15 g/L y 20 g/L. No obstante, el diseo experimental aplicado sugiri concentraciones de 8 g/L, 10 g/L, 15 g/L, 20 g/L y 22 g/L.

A continuacin se presentan los resultados obtenidos para cada una de las variables respuesta que fueron objeto de estudio, bajo el diseo experimental propuesto.

5.2.1 Produccin de biomasa seca y de PHA En las Tablas 30 a 32, se muestran los valores de biomasa seca y de PHA, as como los rendimientos (YP/S), obtenidos para el sistema B. megaterium: GRSB, en cada una de las condiciones evaluadas. La mayor produccin de biomasa (4.62 g/L), se obtuvo a T1 (25C) bajo las condiciones C4pH4 (C4, 20 g/L y pH4, 8), mmientras que la mayor produccin de PHA (3.06 g/L) se dio a 25C con las condiciones C3pH3 (C3, 15 g/L y pH3, 7), con un porcentaje de PHA en biomasa seca de 86,69 % y un rendimiento YP/S de 204.1 mg/g (Vase Tabla 30).

Tabla 30. Biomasa seca y concentracin de PHA obtenidos en el sistema B. megaterium-GRSB, Temperatura: 25C. Muestra C1pH3 C1pH3 C2pH2 C2pH2 C2pH4 C2pH4 C3pH1 C3pH1 C3pH3 Biomasa seca (g/L) 1.57 1.11 2.11 2.84 1.47 1.15 3.86 3.22 2.70 Produccin de PHA (g/L) 0.33 0.36 2.02 2.52 0.45 0.38 1.39 1.40 2.42 YP/S (mg/g) 41.5 45.0 202.4 252.4 45.2 38.0 92.7 93.3 161.1

72

C3pH3 C3pH3 C3pH3 C3pH5 C3pH5 C4pH2 C4pH4 C4pH4 C5pH3 C5pH3

3.52 3.18 3.53 3.73 3.67 1.69 4.62 3.73 3.12 3.43

2.71 3.02 3.06 0.88 0.89 0.91 0.97 1.05 0.99 1.04

180.8 201.3 204.1 58.8 59.6 45.5 48.4 52.3 45.0 47.4

Al variar la temperatura de operacin a T2 (30 C), se observ una mayor produccin de biomasa (3.69 g/L) bajo las condiciones C3pH5 (C3, 15 g/L y pH5, 9), mientras que la mayor produccin de PHA (0.81 g/L ) se dio bajo las condiciones C3pH1 (C3, 15 g/L y pH1, 5), con un porcentaje de PHA en biomasa seca de 96,89 % y un rendimiento YP/S de 54.0 mg/g (Vase Tabla 31). Este incremento en la temperatura afect de forma negativa el crecimiento bacteriano y la acumulacin de PHA.

Tabla 31. Biomasa seca y concentracin de PHA obtenido en el sistema B. megaterium-GRSB, Temperatura: 30C. Muestra C1pH3 C1pH3 C2pH2 C2pH2 C2pH4 C2pH4 C3pH1 C3pH1 C3pH3 C3pH3 C3pH3 C3pH5 C3pH5 C4pH2 Biomasa seca (g/L) 1.41 2.20 1.51 1.40 2.80 2.75 0.94 0.84 2.68 3.21 2.06 3.64 3.69 1.72 Produccin de PHA(g/L) 0.41 0.49 0.41 0.49 0.56 0.41 0.75 0.81 0.48 0.54 0.62 0.39 0.32 0.27 YP/S (mg/g) 51.1 61.2 41.2 49.2 56.0 40.6 50.0 54.0 32.1 35.7 41.3 26.1 21.5 13.4

73

C4pH2 C4pH4 C4pH4 C5pH3 C5pH3

2.26 2.29 2.86 2.39 2.12

0.14 0.55 0.48 0.55 0.53

6.9 27.6 24.1 25.2 51.2

Al pasar a una temperatura de operacin del sistema de T3 (35C), la mayor produccin de biomasa (4.46 g/L) se dio bajo las condiciones C3pH1 (C3 15 g/L y pH1 5.0). Mientras que la mayor produccin de PHA (0.74 g/L) se dio con las condiciones C4pH2 (C4 20 g/L y pH 6.0), con un porcentaje de biomasa seca de 45.04 % y un rendimiento YP/S de 36,8 mg/g (Vase Tabla 32)
Tabla 32. Biomasa seca y concentracin de PHA obtenido en el sistema B. megaterium-GRSB, Temperatura: 35C. Muestra C1pH3 C1pH3 C2pH2 C2pH2 C2pH4 C2pH4 C3pH1 C3pH1 C3pH3 C3pH3 C3pH3 C3pH3 C3pH5 C3pH5 C4pH2 C4pH2 C4pH4 C4pH4 C5pH3 Biomasa seca (g/L) 1.58 1.55 2.02 3.10 3.27 2.33 4.46 2.46 2.24 3.27 2.30 1.97 2.68 2.60 1.63 1.43 2.88 2.43 2.04 Produccin de PHA (g/L) 0.17 0.16 0.21 0.24 0.25 0.29 0.19 0.15 0.45 0.40 0.42 0.27 0.45 0.44 0.74 0.66 0.16 0.13 0.27 YP/S (mg/g) 20.8 19.5 21.0 23.8 24.6 29.0 12.9 10.1 29.7 26.9 27.7 18.1 30.0 29.2 36.8 32.9 8.0 6.3 12.2

Estos resultados indican que un incremento en la temperatura del sistema incide negativamente en la produccin de PHA.

74

5.2.2 Superficies de respuesta produccin de biomasa En las superficies construidas (Figuras 15a17a), se ilustra el comportamiento del sistema (B. megaterium-GRSB) con respecto a la biomasa producida, bajo las condiciones evaluadas en funcin de la concentracin de sustrato (glicerol residual ) y el pH. Por otra parte, los modelos estadsticos ajustados al sistema (ver Anexo B), estimaron los valores que maximizan la produccin de biomasa (ptimos) de cada uno de los factores estudiados, para cada una de las temperatura evaluadas (25C, 30C y 35 C) (Vase Tabla 32). En la Figura 15a, superficie construida para la biomasa a T1 (25C) , se observa una curvatura con un posible mximo de concentracin de biomasa, para C5pH5 (22 g/L, pH 9.0). Por otra parte, para condiciones cercanas a C1pH3 (8 g/L, pH 7.0), se observa la regin de menor concentracin para la biomasa. En la regin intermedia se observa un mximo aparente de biomasa, para valores de pH alrededor de C3pH3 (15 g/L, pH 7.0). El diagrama de contornos (Figura 15b) muestra la tendencia del sistema hacia los puntos mximos de biomasa. En la superficie construida para la biomasa a T2 (30 C) (Figura 16a), se presenta una curvatura hacia un posible mximo de concentracin de biomasa, C1pH5 (8 g/L, pH 9.0). Para valores de C1pH1 (8 g/L, pH 5.0) se observa el punto en la superficie de menor concentracin para la biomasa. El diagrama de contornos (Figura 16b) muestra la tendencia del sistema hacia los puntos mximos de concentracin biomasa. En la Figura 17a, se ilustra la superficie construida para la biomasa a T3 (35 C), en la que se aprecia la tendencia del sistema para su valor mximo en la regin seleccionada para condiciones del sistema alrededor de C3pH5 (15 g/L, pH 9.0). El diagrama de contornos (Figura 17b) muestra la tendencia del sistema hacia los puntos mximos de concentracin biomasa.

75

a)

b)

Figura 15. Biomasa obtenida en el sistema B. megaterium: glicerol residual 25 C. a) Superficie de respuesta para la biomasa. b) Diagrama de contornos para la superficie estimad en funcin del pH y la concentracin de biomasa. La flecha indica las condiciones hacia donde se maximiza la produccin de biomasa para el sistema.

76

a)

b)

Figura 16 Biomasa obtenida en el sistema B. megaterium: glicerol residual 30C. a) Superficie de respuesta para la biomasa. b) Diagrama de contornos para la superficie estimada, en funcin del pH y la concentracin de biomasa. La flecha indica las condiciones hacia donde se maximiza la produccin de biomasa para el sistema.

77

a)

b)

Figura 17. Biomasa obtenida en el sistema B. megaterium: glicerol residual 35C. a) Superficie de respuesta obtenida para la biomasa. b) Diagrama de contornos para la superficie estimada, en funcin del pH y la concentracin de biomasa. La flecha indica las condiciones hacia donde se maximiza la produccin de biomasa para el sistema.

78

En la Figura 18, se visualizan los efectos principales de cada una de las condiciones operacionales que se evaluaron. Como se observa, un incremento en la temperatura entre T1 y T3, presenta un efecto negativo en la produccin de biomasa. Contrariamente, se observa que el incremento en el pH tiene un efecto positivo sobre la variable respuesta. Por ltimo, se ve como la concentracin del GRSB, presenta un efecto positivo en los valores intermedios evaluados (10 g/L y 15 g/L), mientras que en los extremos el efecto sobre la concentracin de biomasa es negativo.

Figura 18. Efectos principales de cada una de las condiciones operacionales evaluadas sobre la produccin de biomasa

Segn el modelo estadstico, la combinacin de los condiciones operacionales donde se maximiza la biomasa, para la regin de estudio seleccionada, sugiere C5pH5T1 (22 g/L, pH 9.0, 25 C) y estima una biomasa de 5.42 g/L. (Vanse 33).

79

Tabla 33. Valores ptimos estimados de pH, concentracin para cada una de las temperaturas evaluadas (25C, 30 C y 35 C), que permiten la mxima produccin de biomasa en el sistema B. megaterium: glicerol residual Valores ptimos Factor 25C 30C 35C Concentracin de glicerol residual (g/L) pH Biomasa Estimada (g/L) 22.0 9.0 5.42 12.5 9.0 3.58 16.7 9.0 3.28

5.2.3 Superficies de respuesta produccin de PHA Las superficies obtenidas (Figura 19a 21a), muestran las regiones evaluadas y el comportamiento del sistema B. megaterium-glicerol residual con respecto a la produccin de PHA, bajo las condiciones de operacin propuestas. En las Figuras 19-21b y en la Tabla 35 se presentan los valores operacionales que maximizan la produccin de PHA (ptimos) a las diferentes temperaturas evaluadas (25C, 30C y 35C).

En la Figura 19a, se muestra la superficie construida para la concentracin de PHA a T1(25 C) , se observa un mximo de concentracin de PHA en la regin de estudio seleccionada de biomasa, para valores alrededor de C3pH3 (15g/L pH 7.0). Por otra parte para valores de C1pH5 (8 g/L, pH 9.0), se observa la menor concentracin para PHA. El diagrama de contornos (Figura 19b) muestra la regin donde se encuentra el punto mximo para la concentracin de PHA, a las condiciones de pH y concentracin de sustrato que se seleccionaron en el diseo experimental.

En la superficie construida para la concentracin de PHA a T2 (30 C) (Figura 20a), se presenta una regin para el posible mximo de concentracin de PHA en el sistema, a C3pH1 (15 g/L, pH 5.0); A valores de C1pH5 (8 g/L, pH 9.0), se observa el punto en la superficie de menor concentracin para acumulacin de PHA. El diagrama de contornos (Figura 20b) muestra la tendencia del sistema hacia los puntos mximos de concentracin PHA.

80

En la Figura 21a, se ilustra la superficie construida para la concentracin de PHA a T3 (35C). En este caso se presenta un punto de silla para valores entre C2(10 g/L) y C3 (15g/L) y valores de (pH3 7.0) y (pH4 8.0), con un posible mximo para valores alrededor de C5pH5 (22 g/L, pH9.0). El diagrama contornos (Figura 21b) muestra la tendencia del sistema hacia los puntos mximos de concentracin de PHA.

81

a)

b)

Figura 19. Produccin de PHA en el sistema B. megaterium: glicerol residual a 25 C. a) Superficie de respuesta obtenida para la acumulacin de PHA. b) Diagrama de contornos para la superficie estimada en funcin de la concentracin de biomasa y del pH. La flecha indica la zona donde se encuentra el punto mximo esperado para el sistema en las condiciones evaluadas.

82

a)

b)

Figura 20. Produccin de PHA en el sistema B. megaterium: glicerol residual a 30 C. a) Superficie de respuesta obtenida para la acumulacin de PHA. b) Diagrama de contornos para la superficie estimada en funcin de la concentracin de biomasa y del pH. La flecha indica la zona donde se encuentra el punto mximo esperado para el sistema en las condiciones evaluadas.

83

a)

b)

Figura 21 Produccin de PHA en el sistema B. megaterium: glicerol residual a 35 C. a) Superficie de respuesta obtenida para la acumulacin de PHA. b) Diagrama de contornos para la superficie estimada en funcin de la concentracin de biomasa y del pH. La flecha indica la zona donde se encuentra el punto mximo esperado para el sistema en las condiciones evaluadas.

En la Figura 22, se presentan los efectos principales de cada una de las condiciones operacionales que se evaluaron. Como se puede observar un incremento entre T1 y T3, presenta un efecto negativo en la produccin de PHA. Mientras que un incremento en el pH, hasta valores cercanos a pH 7.0, tiene un efecto positivo sobre la variable respuesta;

84

por encima de 7.0, el pH tiene efecto negativo sobre la concentracin de PHA. Por ltimo, se ve como la concentracin del glicerol residual, presenta un efecto positivo en los valores intermedios evaluados (10 g/L y 15 g/L), mientras que en los extremos el efecto sobre la concentracin de PHA es negativo.

Figura 22. Efectos principales sobre concentracin de PHA , de cada una de las condiciones operacionales evaluadas

Segn el modelo estadstico, la combinacin de los condiciones operacionales donde se maximiza la produccin de PHA, para la regin de estudio seleccionada, sugiere una concentracin de glicerol residual de 14.8 g/L, un pH 6.7 y una temperatura de proceso de 25 C. Con estas condiciones el modelo estima una concentracin de PHA de 2,81 g/L (Vase Tabla 34).
Tabla 34. Valores ptimos estimados de pH, concentracin para cada una de las temperaturas evaluadas (25C, 30 C y 35 C), que permiten la mxima produccin de PHA en el sistema B. megaterium: glicerol residual Valores ptimos Factor 25C 30C 35C Concentracin de glicerol residual (g/L) pH PHA Estimado (g/L) 14.8 6.7 2.81 13.0 5.8 0.67 22.0 5.0 0.69

85

5.3.4 Superficies de respuesta rendimiento de sustrato en producto global Yp/s Las superficies encontradas (Figuras 23a 25a) para el rendimiento de PHA por unidad de sustrato (Yp/s), muestran las regiones de inters para el sistema evaluado. Mientras que en las Figuras 23b-25b y en la Tabla 35 se presentan los valores operacionales que maximizan Yp/s (ptimos) a las diferentes temperaturas evaluadas (25C, 30C y 35C).

En la Figura 23a, se muestra la superficie construida para el rendimiento Yp/s a T1 (25 C), se observa una curvatura hacia un posible mximo de concentracin de Yp/s, alrededor de C3pH3 (15g/L, pH 7.0). Las condiciones extremas C5pH1 (22g/L, pH 5.0) y C1pH5 (8 g/L, pH5 9.0) presentaron los valores minimos del sistema para Yp/s. mximos de rendimiento Yp/s. El diagrama de contornos (Figura 23b) muestra la tendencia del sistema hacia los puntos

En la superficie construida para el rendimiento Yp/s a T2 (30 C) (Vase Figura 24a), se observa claramente que el mximo rendimiento no se encuentra en la zona de estudio propuesta para la optimizacin; Sin embargo, se puede ver que para valores de pH cidos y concentraciones bajas de sustrato, el rendimiento incrementa. El diagrama de contornos (Figura 24b) muestra la tendencia del sistema hacia los puntos mximos de rendimiento Yp/s.

En la Figura 25a, se ilustra la superficie construida para el rendimiento Yp/s a T3 (35C). Se aprecia la tendencia del sistema hacia su valor mximo, para valores cercanos a C2pH4 (10g/L, pH8.0). El diagrama de contornos (Figura 25b) muestra la tendencia del sistema hacia los puntos mximos rendimiento Yp/s.

86

Figura 23. Rendimiento de PHA por unidad de sustrato en el sistema B. megaterium: glicerol a 25 C. a) Superficie de respuesta obtenida para YP/S. b) Diagrama de contornos para la superficie obtenida, en funcin de la concentracin y el pH. La flecha indica la zona donde se encuentra el punto mximo esperado para el sistema en las condiciones evaluadas.

87

Figura 24. Rendimiento de PHA por unidad de sustrato en el sistema B megaterium: glicerol a 30 C. a) Superficie de respuesta obtenida para YP/S. b) Diagrama de contornos para la superficie obtenida, en funcin de la concentracin y el pH. La flecha indica la zona donde se encuentra el punto mximo esperado para el sistema en las condiciones evaluadas.

88

Figura 25. Rendimiento de PHA por unidad de sustrato en el sistema B megaterium: glicerol a 35 C. a) Superficie de respuesta obtenida para YP/S. b) Diagrama de contornos para la superficie obtenida, en funcin de la concentracin y el pH. La flecha indica la zona donde se encuentra el punto mximo esperado para el sistema en las condiciones evaluadas.

89

En la Figura 26, se presentan los efectos principales de cada una de las condiciones operacionales que se evaluaron. Como se puede observar un incremento en la temperatura entre 25 C y 35 C presenta un efecto negativo en el rendimiento Yp/s, mientras que el incremento en el pH tiene un efecto positivo sobre la variable respuesta en valores cercanos a pH 7.0, por encima de este valor el efecto sobre la variable respuesta es negativo. Por ltimo, se ve que la concentracin del glicerol residual, presenta un efecto positivo en los valores intermedios evaluados (10 g/L y 15 g/L), mientras que en los extremos el efecto es negativo.

Figura 26. Efectos principales sobre el rendimiento de producto por unidad de sustrato Yp/s, de cada una de las condiciones operacionales evaluadas.

De acuerdo al modelo estadstico, la combinacin de los condiciones operacionales donde se maximiza el rendimiento Yp/s, para la regin de estudio seleccionada, sugiere una concentracin de glicerol residual de 13.2 g/L, un pH de 6.3 y una temperatura de proceso de 25 C y, estima un rendimiento Yp/s =199.6 mg/g (Vase Tabla 35).

90

Tabla 35. Valores ptimos estimados de pH, concentracin para cada una de las temperaturas evaluadas (25C, 30 C y 35 C), que permiten el mximo rendimiento Yp/s en el sistema B. megaterium: glicerol residual Factor Concentracin glicerol residual (g/L) pH YP/S Estimado (mg/g) Valores ptimos 25C 13.2 6.3 199.6 30C 8.0 5.0 60.8 35C 8.0 9.0 41.0

91

6. CONCLUSIONES

Al cultivar la cepa nativa B. megaterium en medio liquido suplementado con GGR como fuente de carbono, se forma un sistema combinado bacteria: sustrato muy promisorio para la produccin de PHB, que permite utilizar GRSB al 81.6% v/v y obtener 2.80 g/L de PHB, un rendimiento de Yp/s 186.8 en un proceso operado a 25C, pH 7 y concentracin de sustrato de 15 g/L.

Los valores ptimos para el sistema se dan bajo condiciones de operacin (concentracin de GRSB 14.8 g/L, pH 6.7; T 25C) con una produccin de PHB de 2.81 g/L y un rendimiento Y p/s 199.6 mg/g.

La zona de trabajo para optimizar el sistema B. megaterium-GRSB y obtener mayores cantidades de biopolmero (estimadas en g/L), se encuentra a temperaturas cercanas a los 25C, concentraciones de glicerol residual cercanas a los 15 g/L y pHs prximos a la neutralidad.

La utilizacin del sistema B. megaterium-glicerol residual para la produccin de PHB, constituye un proceso doblemente verde, en tanto que se solucionara el problema de la industria del Biodiesel asociado a la generacin de glicerol residual y a la vez, se generara un producto de valor agregado, que contribuira a disminuir la contaminacin por plsticos derivados del petrleo.

La cepa B. megaterium tiene la propiedad de crecer en sustratos azucarados, en sustratos oleaginosos y en glicerol, en este ltimo caso tiene la ventaja de producir PHB en cantidades similares a las que se producen a partir de residuos azucarados, bajo las condiciones de operacin utilizadas en esta experimentacin.

92

El lactosuero no resulto buen sustrato para la produccin de PHA con las cepas nativas B. megaterium, Bacillus sp. y L. lactis, bajo las condiciones de operacin (T: 30C ; pH 7.0 y concentracin de sustrato (20 g/L) aplicadas en esta investigacin. En los sistemas bacteria:sustrato, solo se alcanzaron cantidades de PHB por debajo de los 0.4 mg de PHB/g de extracto microbiano.

La cepa nativas B. megaterium, mostr capacidad para producir PHA (concentracin de sustrato 20 g/L, pH 7.0, T: 30C) en sistemas combinados con aceite de Jatropha, aceite de ricino y aceite de frituras, con una produccin de biomasa de 0,44 g/L; 0,58g/L y 0,35 g/L respectivamente. valores que resultan bajos si se comparan con los obtenidos para sistema B. megaterium-GGR (1,23 g/L). . Todos los sustratos evaluados (aceite de ricino, aceite de frituras, aceite de Jatropha, GGR, GRSB y lactosuero) resultaron aptos para el crecimiento de las cepas B. megaterium, Bacillus sp. y L. lactis; no obstante, las bajas concentraciones de biomasa obtenidas, son una limitante para la produccin de PHA.

El sistema B megaterium-aceite de fritura, resulta prometedor para la produccin de PHB, con este se alcanzaron concentraciones de PHB de 7.6 mg /g de extracto microbiano, valor que podra desinteresar si se compara con el obtenido (11,8 mg/g extracto microbiano) por el sistema B megaterium-GRSB, pero llama la atencin si se tiene en cuenta que ese valor es obtenido a partir de un desecho muy barato.

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105

ANEXOS ANEXO A. ANLISIS ESTADSTICO

BIOMASA

En la Tabla 1, se muestran los efectos y las interacciones entre la concentracin de sustrato y el pH inicial del medio sobre la obtencin de biomasa, para un proceso de fermentacin con el sistema B. megaterium : GRSB a una temperatura de 25C, acompaados de los datos de error estndar y V.I.F (factor de inflacin de varianza) para cada uno de los efectos individuales y combinados.

Tabla 1. Efectos estimados para la produccin Biomasa; sistema B. megaterium: GRSB; T= 25 C

Efecto Promedio A:pH B: Concentracin glicerol res AA AB BB

Estimado 13,4662 -6,19964 -0,179289 0,192022 0,2381 -0,0393716

Error Estndar 7,57121 3,20724 0,776293 0,209962 0,0839873 0,0167806

V.I.F. 174,991 169,157 148,341 125,02 72,4866

En la Figura 1, se pueden apreciar los efectos individuales y los efectos combinados entre la concentracin y el pH. La lnea azul indica los efectos significativos para el sistema (positivos y/o negativos), por ejemplo en este caso podemos observar que el efecto combinado de la concentracin y el pH tiene un efecto positivo sobre el sistema mientras que el factor cuadrtico de la concentracin afecta negativamente la produccin de biomasa en el sistema.

106

Figura 1. Diagrama de pareto para la produccin de biomasa para el sistema B. megaterium: GRSB; T: 25 C

En la Tabla 2, se muestran los efectos y las interacciones entre la concentracin de sustrato y el pH inicial del medio sobre la produccin de biomasa, para un proceso de fermentacin con el sistema B. megaterium : GRSB a una temperatura de 30C, acompaados de los datos de error estndar y V.I.F (factor de inflacin de varianza) para cada uno de los efectos individuales y combinados.

Tabla 2. Efectos estimados para la produccin Biomasa; sistema B. megaterium: GRSB; T= 30 C

Efecto promedio A:pH

Estimado 2,50309 2,485

Error Estndar 0,176251 0,297704

V.I.F. 1,0

En la Figura 2, se pueden apreciar los efectos individuales y los efectos combinados entre la concentracin y el pH. La lnea azul indica los efectos significativos para el sistema (sean positivos o negativos), para este caso podemos observar que solo el efecto individual del pH es significativamente positivo en la produccin de biomasa.

107

Diagrama de Pareto Estandarizada para Biomasa

A:pH BB AB B:Concentracin AA 0 2 4 6 Efecto estandarizado 8 10

+ -

Figura 2. Diagrama de pareto para la produccin de biomasa para el sistema B. megaterium :GRSB; T: 30 C

En la Tabla 3, se muestran los efectos y las interacciones entre la concentracin de sustrato y el pH inicial del medio sobre la produccin de biomasa, para un proceso de fermentacin con el sistema B. megaterium : GRSB a una temperatura de 35C, acompaados de los datos de error estndar y V.I.F (factor de inflacin de varianza) para cada uno de los efectos individuales y combinados.

Tabla 3. Efectos estimados para la produccin Biomasa; sistema B. megaterium: GRSB; T= 35 C

Efecto promedio A:pH B: Concentracin glicerol res AA AB BB

Estimado 2,51357 -0,0916667 -0,440152 1,21584 1,239 -1,65535

Error Estndar. 0,338159 0,571181 0,492152 0,989285 1,38504 0,968553

V.I.F. 1,0 1,0 1,34992 1,0 1,34992

En la Figura 3, se pueden apreciar los efectos individuales y los efectos combinados entre la concentracin y el pH. La lnea azul indica los efectos significativos para el sistema

108

(positivos y/o negativos), para este caso podemos observar que para una temperatura de 35C, no hay efectos individuales significativos sobre la produccin de biomasa.

Diagrama de Pareto Estandarizada para Biomasa

BB AA AB B:Concentracin A:pH 0 0,4 0,8 1,2 1,6 Efecto estandarizado 2 2,4

+ -

Figura 3. Diagrama de pareto para la produccin de biomasa para el sistema B. megaterium: GRSB; T: 35 C

En la Tabla 4, se muestran los efectos y las interacciones entre la concentracin de sustrato, el pH inicial del medio y la temperatura sobre la produccin de biomasa, para el proceso de fermentacin con el sistema B. megaterium : glicerol residual , acompaados de los datos de error estndar y V.I.F (factor de inflacin de varianza).

Tabla 4 Efectos estimados para la produccin Biomasa; sistema B. megaterium: GRSB

Efecto Promedio A:pH B:Concentracin glicerol res. C:Temperatura AB AC BC

Estimado 5,39238 -2,73308 0,614231 -0,114306 0,0842667 0,0722031 -0,0368838

Error Estndar 5,6673 1,477 0,482487 0,325088 0,055064 0,040868 0,00958541

V.I.F. 81,4611 152,02 56,615 123,495 104,435 66,0747

En la Figura 4, se pueden apreciar los efectos individuales y los efectos combinados entre la concentracin del sustrato, el pH y la temperatura. La lnea azul indica los efectos
109

significativos para el sistema (sean positivos o negativos). En este caso se observar que el efecto combinado entre la concentracin de sustrato y la temperatura afecta negativamente al sistema.

Figura 4. Diagrama de pareto para la produccin de biomasa para el sistema B. megaterium: GRSB

En la Tabla 5, se presenta el anlisis de varianza para la produccin de biomasa en el sistema B. megaterium-glicerol residual, para las diferentes condiciones operacionales (temperatura, pH y concentracin de GRSB)

Tabla 5. Anlisis de variancia para la produccin de biomasa para el sistema B. megateriumglicerol residual

Fuente

Suma de Grados de Cuadrado de la Cuadrados Libertad Media A:pH 1,55729 1 1,55729 B:Concentracin 0,737088 1 0,737088 C:Temperatura 0,0562289 1 0,0562289 AB 1,06513 1 1,06513 AC 1,41962 1 1,41962 BC 6,73407 1 6,73407 Error Total 23,6499 52 0,454806

Razn-F 3,42 1,62 0,12 2,34 3,12 14,81

Valor-P 0,0699 0,2087 0,7265 0,1320 0,0831 0,0003

110

Total (corr.)

48.9808

58

En la Tabla 6. Se muestra los valores ptimos estimados por el modelo estadstico para la produccin de biomasa en el sistema B. megaterium glicerol residual. En este punto no se fijo la temperatura como una constate sino como otra variable.
Tabla 6. Puntos ptimos para la biomasa en el sistema B. megaterium GRSB.

Factor pH Concentracin glicerol residual (g/L) Temperatura (C) Biomasa (g/L)

Optimo 9,0 22,0 25,0 4,74

El modelo ajustado estim, que el mximo de biomasa se podra obtener bajo las condiciones presentadas en la Tabla 6, con una concentracin de biomasa (4,74 g/L) BIOPOLIMERO (PHA) En la Tabla 7, se muestran los efectos y las interacciones entre la concentracin de sustrato y el pH inicial del medio sobre la produccin de PHA, para un proceso de fermentacin con el sistema B. megaterium : GRSB a una temperatura de 25C, acompaados de los datos de error estndar y V.I.F para cada uno de los efectos individuales y combinados.

Tabla 7. Efectos estimados para la produccin de PHA para el sistema B. megaterium: GRSB ; T: 25C

Efecto Promedio A:Concentracion B:pH AA AB BB

Estimado -16,3906 1,38528 8,43215 -0,0881242 0,182 -0,831939

Error Estndar 4,52006 0,463452 1,91474 0,0100181 0,0501409 0,125349

V.I.F. 169,157 174,991 72,4866 125,02 148,341

111

En la Figura 7, se pueden apreciar los efectos individuales y los efectos combinados entre la concentracin y el pH. La lnea azul indica los efectos significativos para el sistema (positivos y/o negativos), para este caso podemos observar que la acumulacin de PHA se ve favorecida por los efectos individuales y combinados de estas dos condiciones de operacin.
Diagrama de Pareto Estandarizada para PHA

AA

+ -

BB

B:pH

AB

A:Concentracion 0 2 4 6 Efecto estandarizado 8 10

Figura 7. Diagrama de pareto para la produccin de PHA para el sistema B. megaterium: GRSB; T: 25 C

En la Tabla 8, se muestran los efectos y las interacciones entre la concentracin de sustrato y el pH inicial del medio sobre la produccin de PHA, para un proceso de fermentacin con el sistema B. megaterium : GRSB residual a una temperatura de 30C, acompaados de los datos de error estndar y V.I.F para cada uno de los efectos individuales y combinados.

Tabla 8. Efectos estimados para la produccin de PHA para el sistema B. megaterium: GRSB; T: 30C

Efecto promedio A:Concentracin B:pH AA

Estimado -0,078572 0,0868864 0,320045 -0,00946271

Error Estndar 2,60778 0,267382 1,10468 0,00577979

V.I.F. 169,157 174,991 72,4866

112

AB BB

0,0275 -0,0583365

0,0289281 0,072318

125,02 148,341

En la Figura 8, se pueden apreciar los efectos individuales y los efectos combinados entre la concentracin y el pH. La lnea azul indica los efectos significativos para el sistema (positivos y/o negativos), para este caso podemos observar que no hay efectos significativos sobre el sistema B. megaterium: GRSB.

Diagrama de Pareto Estandarizada para PHA

AA AB BB A:Concentracion B:pH 0 0,4 0,8 1,2 1,6 Efecto estandarizado 2 2,4

+ -

Figura 8. Diagrama de pareto para la produccin de PHA para el sistema B. megaterium: GRSB; T: 30 C

En la Tabla 9, se muestran los efectos y las interacciones entre la concentracin de sustrato y el pH inicial del medio sobre la produccin de PHA, para un proceso de fermentacin con el sistema B. megaterium : GRSB a una temperatura de 35C, acompaados de los datos de error estndar y V.I.F para cada uno de los efectos individuales y combinados.

113

Tabla 9. Efectos estimados para la produccin de PHA para el sistema B. megaterium: GRSB; T: 35C

Efecto promedio A:Concentracion B:pH AA AB BB

Estimado -4,56253 0,618439 1,44523 -0,005719 -0,06 -0,0384692

Error Estndar 1,69921 0,174224 0,719801 0,00376606 0,0188493 0,0471218

V.I.F. 169,157 174,991 72,4866 125,02 148,341

En la Figura 8, se pueden apreciar los efectos individuales y los efectos combinados entre la concentracin y el pH. La lnea azul indica los efectos significativos para el sistema (positivos y/o negativos), para este caso podemos observar que el efecto individual de la concentracin del sustrato favorece la acumulacin de PHA en el sistema B. megaterium:
GRSB, mientras que el efecto combinado lo desfavorece.

Diagrama de Pareto Estandarizada para PHA

A:Concentracion AB B:pH AA BB 0 1 2 Efecto estandarizado 3 4

+ -

Figura 9. Diagrama de pareto para la produccin de PHA para el sistema B. megaterium: GRSB; T: 35 C

En la Tabla 10, se muestran los efectos y las interacciones entre la concentracin de sustrato, el pH inicial del medio y la temperatura sobre la produccin de biomasa, para el

114

proceso de fermentacin con el sistema B. megaterium GRSB, acompaados de los datos de error estndar y V.I.F (factor de inflacin de varianza).

Tabla 10. Efectos estimados para la produccin de PHA para el sistema B. megaterium: glicerol residual;

Efecto Promedio A:Temperatura B:pH C:Concentracin AA AB AC BB BC CC

Estimado 1,79887 0,486645 -0,904436 0,00930976 -2,65563 0,855655 0,118788 -1,29965 0,697667 -1,68261

Error Estndar 0,222565 0,914121 0,652741 0,561587 0,751113 0,937317 0,779893 0,438003 0,597353 0,417796

V.I.F. 5,38886 7,02097 7,0 4,16585 7,45314 7,0 1,42259 1,0 1,35037

En la Figura 10, se pueden apreciar los efectos individuales y los efectos combinados entre la concentracin del sustrato, el pH y la temperatura. La lnea azul indica los efectos significativos para el sistema (sean positivos o negativos). En este caso no se observan efectos significativos sobre el sistema.
Diagrama de Pareto Estandarizada para PHA

CC AA BB B:pH BC AB A:Temperatura AC C:Concentracin 0 1 2 3 Efecto estandarizado 4 5

+ -

Figura 4. Diagrama de pareto para la produccin de PHA para el sistema B. megaterium: GRSB 115

En la Tabla 11, se presenta el anlisis de varianza para la produccin de biomasa en el sistema B. megaterium-glicerol residual, para las diferentes condiciones operacionales (temperatura, pH y concentracin de glicerol residual)

Tabla 11. Anlisis de variancia para la produccin de PHA para el sistema B. megaterium- GRSB

Fuente A:Temperatura B:pH C:Concentracin AA AB AC BB BC CC Error total Total (corr.)

Suma de Cuadrados 0,0773954 0,524289 0,0000750481 3,41368 0,227573 0,00633535 2,40435 0,372504 4,42929 13,6542 29,9324

Gl Cuadrado Medio Razn-F 1 1 1 1 1 1 1 1 1 50 59 0,0773954 0,524289 0,0000750481 3,41368 0,227573 0,00633535 2,40435 0,372504 4,42929 0,273085 0,28 1,92 0,00 12,50 0,83 0,02 8,80 1,36 16,22

Valor-P 0,5968 0,1720 0,9868 0,0009 0,3657 0,8796 0,0046 0,2484 0,0002

En la Tabla 12. Se muestra los valores ptimos estimados por el modelo estadstico para la produccin de PHA en el sistema B. megaterium glicerol residual. En este punto no se fijo la temperatura como una constate sino como otra variable.

Tabla 12. Puntos ptimos para PHA en el sistema B. megaterium glicerol residual

Factor pH Concentracin glicerol residual (g/L) Temperatura (C) PHA (g/L)

Optimo 6,30 14,6 25,0 2,00

El modelo ajustado estim, que el mximo de PHA se podra obtener bajo las condiciones presentadas en la Tabla 12, con una concentracin de PHA (2,00 g/L).

116

 RENDIMIENTO Yp/s

En la Tabla 13, se muestran los efectos y las interacciones entre la concentracin de sustrato y el pH inicial del medio sobre el rendimiento Yp/s, para un proceso de fermentacin con el sistema B. megaterium : GRSB a una temperatura de 25C, acompaados de los datos de error estndar y V.I.F, para cada uno de los efectos individuales y combinados.

Tabla 13. Efectos estimados para el rendimiento Yp/s; sistema B. megaterium: GRSB ; T= 25 C

Efecto promedio A:pH B:Concentracin AA AB BB

Estimado 188,526 -85,0833 -57,3859 -221,305 257,53 -280,364

Error Estndar 17,2674 29,1661 25,1307 50,5157 70,7241 49,4571

V.I.F. 1,0 1,0 1,34992 1,0 1,34992

En la Figura 13, se pueden apreciar los efectos individuales y los efectos combinados entre la concentracin y el pH. La lnea azul indica los efectos significativos para el sistema (positivos y/o negativos), por ejemplo en este caso podemos observar que los efectos individuales desfavorencen el sistema B. megaterium: GRSB, mientras que el efecto combinado lo favorece.

117

Diagrama de Pareto Estandarizada para Yp/s

BB AA AB A:pH B:Concentracin 0 1 2 3 Efecto estandarizado 4 5 6

+ -

Figura 13. Diagrama de pareto para la produccin el rendimiento Yp/s, para el sistema B. megaterium: GRSB; T: 25 C

En la Tabla 14, se muestran los efectos y las interacciones entre la concentracin de sustrato y el pH inicial del medio sobre el rendimiento Yp/s, para un proceso de fermentacin con el sistema B. megaterium : GRSB a una temperatura de 30C, acompaados de los datos de error estndar y V.I.F, para cada uno de los efectos individuales y combinados.

Tabla 14. Efectos estimados para el rendimiento Yp/s; sistema B. megaterium: GRSB; T= 30 C

Efecto Promedio A:pH B:Concentracin AA AB BB

Estimado 43,1243 -12,5333 -35,9439 -15,3501 17,64 -15,4016

Error Estndar 6,32713 10,6871 9,20843 18,51 25,9148 18,1221

V.I.F. 1,0 1,0 1,34992 1,0 1,34992

En la Figura 14, se pueden apreciar los efectos individuales y los efectos combinados entre la concentracin y el pH. La lnea azul indica los efectos significativos para el sistema (positivos y/o negativos), en este caso podemos observar la concentracin del

118

sustrato presenta un efecto negativo en el rendimiento Yp/s del sistema B. megaterium: GRSB
Diagrama de Pareto Estandarizada para Yp/s

B:Concentracin A:pH BB AA AB 0 1 2 Efecto estandarizado 3 4

+ -

Figura 14. Diagrama de pareto para la produccin el rendimiento Yp/s, para el sistema B. megaterium: glicerol residual; T: 30 C

En la Tabla 15, se muestran los efectos y las interacciones entre la concentracin de sustrato y el pH inicial del medio sobre el rendimiento Yp/s, para un proceso de fermentacin con el sistema B. megaterium : GRSB a una temperatura de 35C, acompaados de los datos de error estndar y V.I.F, para cada uno de los efectos individuales y combinados.

Tabla 15. Efectos estimados para el rendimiento Yp/s; sistema B. megaterium: GRSB; T= 35 C

Efecto Promedio A:pH B:Concentracin AA AB BB

Estimado 26,4077 4,3 -5,88636 -10,0313 -44,94 -15,8284

Error Estndar 3,47266 5,86564 5,05407 10,1593 14,2234 9,94637

V.I.F. 1,0 1,0 1,34992 1,0 1,34992

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En la Figura 15, se pueden apreciar los efectos individuales y los efectos combinados entre la concentracin y el pH. La lnea azul indica los efectos significativos para el sistema (positivos y/o negativos), se observa que el efecto combinado entre pH y concentracin del sustrato presenta un efecto negativo en el rendimiento Yp/s del sistema B. megaterium: GRSB.
Diagrama de Pareto Estandarizada para Yp/s

AB

+ -

BB

B:Concentracin

AA

A:pH 0 1 2 Efecto estandarizado 3 4

Figura 15. Diagrama de pareto para la produccin el rendimiento Yp/s, para el sistema B. megaterium: GRSB; T: 35 C

En la Tabla 16, se presenta el anlisis de varianza para rendimiento Yp/s, en el sistema B. megaterium-GRSB, para las diferentes condiciones operacionales (temperatura, pH y concentracin de glicerol residual)

Tabla 16. Efectos estimados para el rendimiento Yp/s; sistema B. megaterium: GRSB

Efecto Promedio A:Temperaruta B:Concentracin C:pH AA AB AC

Estimado 71,0292 -76,98 -33,0721 -31,1056 44,97 25,7497 44,6917

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Error Estndar 11,691 11,0854 14,2388 16,5252 19,2005 17,4389 20,2391

V.I.F. 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

BB BC CC

-103,865 76,7433 -82,2289

28,0218 40,0714 28,6216

1,34992 1,0 1,34992

En la Figura 16, se pueden apreciar los efectos individuales y los efectos combinados entre la concentracin del sustrato, el pH y la temperatura. La lnea azul indica los efectos significativos para el sistema (sean positivos o negativos). En este caso no se observa que el efecto combinado del la temperatura y el pH favorecen Yp/s en el sistema B. megaterium
GRSB; mientras que el efecto individual de la temperatura lo desfavorece.
Diagrama de Pareto Estandarizada para Yp/s

A:Temperaruta BB CC AA B:Concentracin AC BC C:pH AB 0 2 4 Efecto estandarizado 6 8

+ -

Figura 16. Diagrama de pareto para la produccin el rendimiento Yp/s, para el sistema B. megaterium: GRSB

En la Tabla 17, se presenta el anlisis de varianza para el rendimiento Yp/s, en el sistema B. megaterium- GRSB, para las diferentes condiciones operacionales (temperatura, pH y concentracin de glicerol residual)

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Tabla 17. Anlisis de variancia para el rendimiento Yp/s, para el sistema B. megaterium- GRSB

Fuente A:Temperaruta B:Concentracin C:pH AA AB AC BB BC CC Error total Total (corr.)

Suma de Cuadrados 59259,2 6629,53 4354,0 6741,0 2679,26 5992,04 16883,0 4507,3 10143,0 61443,4 170101,

Gl 1 1 1 1 1 1 1 1 1 50 59

Cuadrado Medio 59259,2 6629,53 4354,0 6741,0 2679,26 5992,04 16883,0 4507,3 10143,0 1228,87

Razn-F 48,22 5,39 3,54 5,49 2,18 4,88 13,74 3,67 8,25

Valor-P 0,0000 0,0243 0,0656 0,0232 0,1461 0,0318 0,0005 0,0612 0,0060

En la Tabla 18. Se muestra los valores ptimos estimados por el modelo estadstico para el rendimiento Yp/s en el sistema B. megaterium GRSB. En este punto no se fijo la temperatura como una constate sino como otra variable.

Tabla 18. Puntos ptimos para el rendimiento Yp/s en el sistema B. megaterium GRSB Factor pH Concentracin (g/L) Temperatura (C) Yp/s (mg/g) Optimo 5,57 11,2 25,0 153,64

El modelo ajustado estim, que el mximo de rendimiento Yp/s, se podra obtener bajo las condiciones presentadas en la Tabla 12, con un rendimiento Yp/s (153,64 mg/g).

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