Folleto de Algas Escuela Superior Politcnica del Litoral, 1994 Impreso en Ecuador

CAPITULO III
Introduccin al mtodo ficolgico
Objetivos Despus de estudiar este captulo el estudiante deber estar en condiciones de: 1.- Explicar las fases del crecimiento en una poblacin algal. 2.- Explicar las distintas formas de produccin de algas por su naturaleza, por su forma de cosecha y por la pureza del cultivo. 3.- Entender el diagrama del proceso de produccin y conocer las particularidades tcnicas que se dn en cada etapa. 4.- Clasificar por su tamao y uso las algas ms cultivadas en laboratorios comerciales. 5.- Describir los pasos en la tcnica de aislamiento mediante el uso de la pipeta capilar y el rayado en agar. 6.- Explicar el mtodo de purificacin mediante tratamiento con antibiticos. 7.- Conocer los diferentes desinfectantes no voltiles de uso en laboratorios de algas. 8.- Saber el principio en que se basa el mecanismo de esterilizacin. 9.- Reconocer las algas microscpicas comunes de aguas servidas. Sinopsis del captulo Crecimiento de una poblacin algal. Fases de crecimiento. Formas de cultivo. Procedimiento general en la produccin de microalgas. Algas comunes que se cultivan en laboratorios. Contenido nutricional de las microalgas. Aislamiento y purificacin. Mtodos de aislamiento. Mtodos de purificacin. Desinfeccin y esterilizacin. Desinfectantes no voltiles. Mecanismos de esterilizacin. Miscelanea de algas microscpicas presentes en aguas servidas.
Figura 3.1 Fases del desarrollo de un cultivo de microalgas

Miscelanea de preguntas. Bibliografa. Crecimiento de una Poblacin Algal Fases del crecimiento.- En un cultivo de algas del tipo batch (ciclo), el crecimiento se presenta con cinco fases o etapas de desarrollo como se ve en la figura 3.1

Fase de ajuste.- Es la etapa de adaptacin que sufren las algas a las nuevas condiciones del cultivo. Esta fase es corta y no hay incremento neto de la poblacin. Fase exponencial.- Aqu las clulas se duplican sucesivamente en intervalos iguales de tiempo. En esta fase, K es constante. K = (log2 N2 - log2 N1) / (T2 - T1) donde K es la constante de reaccin o tasa especfica de crecimiento (1/das), log es el logaritmo en base 2, N es la medida de la biomasa o nmero de clulas y T es el tiempo. Fase de retardo o declinacin.- En esta etapa el tiempo requerido para duplicar la poblacin aumenta, reduciendose la tasa de crecimiento. Esto se debe a que los nutrientes estn disminudos en el medio, hay un aumento en la concentracin de los metabolitos y una reduccin de la actividad fotosinttica por el incremento de la densidad

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de la poblacin, que reduce la disponibilidad de luz por unidad de clula . Fase estacionaria.- Esta fase es corta y no hay un incremento neto de la poblacin. La tasa de crecimiento se compensa con la de mortalidad celular, de tal modo que = d, donde es la tasa de crecimiento y d es la tasa de mortalidad. Fase de muerte.- Aqu la tasa de mortalidad supera a la tasa de multiplicacin celular, es decir que d > . El crecimiento sostenido de una poblacin depende de la interaccin mutua de factores fsicos, qumicos y biolgicos; dicho crecimiento se expresa grficamente como el incremento en funcin del tiempo de la biomasa o nmero de clulas dentro de un cultivo. El cambio diferencial se representa como : dN / dT = F ( N ) donde F (N) expresa la tasa de cambio de la poblacin en el tiempo. Como esta funcin depende de los factores fsicos y qumicos del medio externo, el resultado cuando el espacio disponible y los nutrientes son limitados es una curva sigmoidea. En condiciones constantes de crecimiento cuando la luz y los nutrientes no cambian en el tiempo F (N) es proporcional al nmero de organismos: F(N)=N K=N(-d)

Por la pureza del cultivo, ste se puede clasificar en: Cultivos axnicos: Son cultivos libres de bacterias y estriles, para mantener la productividad por un perodo prolongado de tiempo. Estos cultivos son delicados y de cuidado. Requieren todo el tiempo de material estril y asepcia. Cultivos monoespecficos (clonales) : Aqu la poblacin de microalgas est parcialmente contaminada por otros microorganismos como bacterias y protozoarios. Son empleados en cultivos del tipo batch y extensivos. Procedimiento General en el Cultivo de las Microalgas Mantenimiento de cepas: En esta etapa la cepas (stocks) de algas se mantienen en fiolas o matraces de 250 cc con 100 ml de medio de cultivo y/o en placas con agar. El medio de cultivo se prepara segn el procedimiento descrito para cada caso y segn la especie, sea sta de mar o de agua dulce. Esta etapa tiene carcter de cultivo axnico por lo que un mximo de cuidado se debe tener para no contaminar las cepas. La intensidad de luz debe estar entre 500 y 1000 lux y la temperatura de 15 grados centgrados constante. La cepa se mantiene en una incubador que brinda todas estas facilidades. Las cepas tambin se mantienen en tubos de ensayo con tapa rosca o de algodn de 20 cc. Cultivo inicial: El cultivo inicial se desarrolla en fiolas o matraces de 500 cc con 250 ml de medio. La inoculacin de las algas se realiza cuando las fiolas esterilizadas han alcanzado la temperatura ambiente, transfiriendo aspticamente bajo una campana de luz UV, un volmen de 1 a 5 ml de cepa al medio fresco. La boca de estos recipientes se debe flamear para quemar microorganismos que pueden ingresar al interior. Luego de la inoculacin las fiolas son puestas en la estantera iluminada junto a uno de los matraces viejos para observar luego de uno a dos das el crecimiento rpido del nuevo cultivo. Estos cultivos deben agitarse manualmente en forma peridica y suavemente, a fin de variar la posicin de las clulas. La intensidad de luz debe estar entre 1500 y 2000 lux . Cultivo intermedio: Esta etapa se desarrrolla en fiolas o matraces de 1000 a 2000 cc, con medios del 60 al 65% de la capacidad total. Se transfieren los antiguos cultivos que hacen de stock (cultivo inicial) de 4 a 7 das. Esta inoculacin se hace bajo el mismo esquema del caso anterior evitando que las algas sedimentadas pasen al nuevo medio. Se transfieren aproximadamente del 80 al 90% del volumen total. Los nuevos recipientes son agitados con aire filtrado a mximo 1m. La temperatura se puede mantener a 18 grados centgrados, igual que para la etapa anterior. La intensidad de luz puede ajustarse entre 2000 y 2500 lux. Cultivo de 10 a 20 l. (Carboys): Los cultivos intermedios son empleados como inculo para los recipientes de 10 a 20 litros, (ver fig. 3.2). El agua de mar

Formas de Cultivo Por su naturaleza los cultivos se pueden clasificar en: Cultivo intensivo: Aqu los factores de crecimiento se mantienen bajo un sistema controlado, de tal manera que se pueda obtener una mxima respuesta en la produccin. Cultivo extensivo: En esta clase de cultivo slo se controla las variables ms accesibles en su manejo, tales como las caractersticas del medio y la densidad del cultivo. Por la forma de cosechar los cultivos se pueden clasificar en: Cultivos contnuos: La poblacin algal, las caractersticas qumicas del medio, la temperatura y finalmente la luz son mantenidas en un valor constante por perodos prolongados, procurando un flujo sostenido de requerimientos y de salida del producto. Cultivos batch: Estos cultivos son intermitentes, se implementan de una sola vez y son cosechados completamente despus de que la produccin algal alcance un nivel apropiado, medido en nmero de clulas por ml. En el momento de la cosecha el cultivo debe estar en la fase exponencial. Cultivos semicontinuos: Aqu se cosecha una parte del medio segn la produccin y se renueva el volmen cosechado por medio de un cultivo fresco.

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antes de ser enriquecida con los nutrientes es bien filtrada a 1m y esterilizada con UV. Dejar en reposo el agua por una hora para reducir los perxidos generados, fertilizar e inocular. Estos perxidos afectan los pigmentos fotosintticos de las algas. Flamear la boca de cada recipiente y tomar las precauciones del caso para prevenir la contaminacin, evitando adems transferir las algas sedimentadas de los cultivos intermedios. La intensidad luminosa se ajusta entre 2000 y 5000 lux. La temperatura se mantiene entre 18 y 20 grados centgrados. En cultivos batch las poblaciones algales alcanzan densidades mayores a los 4 millones de clulas por ml. Filtrar el aire como en el caso anterior. Cultivo masivo: El grado de contaminacin bacteriana es mayor en esta etapa. La iluminacin por lo general se coloca en la parte superior de los recipientes y la intensidad puede estar entre 4000 y 5000 lux. Los recipientes para estos cultivos son blancos en su parte interior o son transparentes en su totalidad. Los inculos son obtenidos de la etapa anterior que presentan un crecimiento rpido y carecen de sedimento. En los cultivos masivos la aireacin no es filtrada y generalmente se desarrolla externamente, aprovechando la iluminacin del sol. (Fig. 3.2)

Algas Comunes que se Cultivan en Laboratorios Muchas son las especies de algas que se cultivan y usan en laboratorios de larvas, siendo la ms frecuente las diatomeas y los flagelados. Ellas son reconocidas mundialmente como especies adecuadas por su fase de cultivo y elevado valor nutricional. La tabla VI muestra algunas especies de uso comn en laboratorios de produccin de larvas.
Tabla VI. Especies de algas utilizadas en laboratorios
Especie Tamao ( ) 30 18 35 10 16 5 12 5 100 Uso

Chaetoceros affinis Chaetoceros gracilis Chaetoceros eibenii Thalassiosira pseudonana Skeletonema costatum Isochrysis galvana Tetraselmis sp. Chlorella sp Nitzschia sp.

larvas larvas, juveniles larvas, juveniles, adultos juveniles, adultos larvas, juveniles, adultos larvas, juveniles, adultos larvas, juveniles, adultos larvas, zooplancton juveniles, adultos.

Contenido Nutricional de las Microalgas Los niveles nutricionales de las algas que se cultivan con los diferentes medios enriquecidos y consecuentemente el poder alimenticio de una especie algal depende de las condiciones generales de crecimiento dadas en el laboratorio. La nutricin de las larvas y juveniles depende del contenido y naturaleza de los constituyentes bioqumicos de las algas, los que representan la base para la formacin de los nuevos tejidos, restauracin de aquellos que han sido afectados y para el metabolismo normal de los organismos de cra. Una combinacin de algas como dieta brinda un mayor valor nutritivo debido a que contienen un surtido de la mayora de los requerimientos nutricionales necesarios para el crecimiento de las larvas, sean estas de camarn, moluscos y peces. Ver tabla IV. Los componentes qumicos de las microalgas no siempren son constantes, refirindose a aquellas que se cultivan. Estos niveles dependern del tipo y contenido de nutrientes usados en el medio enriquecido, de la condicin de la cepa de alga cultivada, de las condiciones de iluminacin y temperatura, de la fase de crecimiento en que las algas son cultivadas y de la calidad del agua de mar empleada en el cultivo. Anormalidades en alguno(s) de estos factores alterarn significativamente la composicin bioqumica de las microalgas cultivadas. Un cultivo algal considerado viejo ya no aportar con mayores ventajas nutricionales para una cra larvaria.

Figura 3.2 Diagrama general del proceso de produccin de microalgas

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Aislamiento y Purificacin La aplicacin de los siguientes mtodos para una colecta natural de algas microscpicas produce cultivos monoespecficos o axnicos. Aunque tales mtodos son sencillos sin embargo, la preparacin de cultivos axnicos requieren paciencia y perserverancia. Los medios enriquecidos usados para fines de aislamiento y purificacin pueden ser aquellos que se revisan en el siguiente captulo para agua dulce y salada. Las condiciones de iluminacin y temperatura son las mismas descritas para el cultivo intermedio. Entre los mtodos de aislamiento ms usados se nombran: 1.- Pipeta capilar (simplificado). 2.- Rallado en agar. 3.- Aislamiento en agar. 4.- Rociado en plato. Entre los mtodos de purificacin ms conocidos tenemos: 1.- Lavado. 2.- Antibiticos. 3.- Potasio telurito. Instrumentos pticos requeridos: Estereo-microspio con iluminacin de abajo hacia arriba. Microscopio ptico compuesto. Equipos: Incubador iluminado con control de temperatura. Campana estril. Cmara de Neubauer. Implementos: Mechero de gas. Asa de platino con gancho de 4 mm. Tacho para desechos de vidrio. Recipiente para pipetas usadas. Vidrios y plasticos: Tubos de ensayo con tapa rosca (18 x 150 mm). Pipetas Pasteur de 9" tapadas con algodn en la boca ancha. Goteros de caucho para usarlos con las pipetas Pasteur. Envase metlico con tapa para guardar pipetas Pasteur y esterilizar.

Platos Petri de vidrio o plsticos de 100 x 15 mm. Fiolas para 125 ml. Los mtodos de aislamiento y purificacin a describirse son generales y aplicables a muchas especies algales, no estan dirigidos para especies especficas. Las fuentes de algas para aislamiento slo incluyen muestras planctnicas y se refieren a colecciones naturales. Metodos de aislamiento. Es necesario el aislamiento de una unidad algal y la colocacin de la misma en un medio de cultivo adecuado para su multipliacin, a fin de establecer un cultivo unialgal (monoespecfico). El trmino unidad se refiere a cualquier clula, colonia, filamento, pieza o parte del talo y cuerpo reproductivo. Un cultivo unialgal establecido es necesario para preparar un cultivo axnico. De todos los mtodos nombrados para aislamiento el de pipeta capilar y el de rayado en agar son los ms empleados para este fin. Las algas menores a 10 difcilmente son aisladas con pipeta capilar. Filamentos pueden aislarse con pipeta capilar . Pipeta capilar (simplificado) La tapa de un plato Petri invertido se emplea como rea para aislamiento: a) Coloque de 10 a 15 gotas de una coleccin natural en el centro de la tapa invertida. b) Coloque 8 gotas de un medio de cultivo adecuado en 8 posiciones rodeando la coleccin natural. Marque primero con nmero la posicin de cada gota por la cara interior de la tapa. c) Usando una pipeta Pasteur nueva estirada y estril, transfiera las algas deseadas de la coleccin natural a la gota nmero 1 del medio de cultivo. d) Transfiera una sola alga desde la gota nmero 1 hasta la gota nmero 2. e) Repita este proceso de transferencia con el resto de las gotas del medio de cultivo hasta asegurarse que una sola unidad algal requerida est presente en una gota. f) Transfiera esta unidad algal a tubos de ensayos que contienen el medio de cultivo esterilizado. Como precaucin, esta unidad algal en una gota puede ser transferida primero a un fragmento de un cubreobjeto que descansa en un portaobjeto, para examinarla con el microscopio compuesto. El fragmento con la gota y la unidad es entonces transferido al tubo de ensayo con el medio de cultivo para su desarrollo. De esta manera se asegura que una sola unidad algal es aislada y que efectivamente va al medio de cultivo. g) Coloque los tubos bajo condiciones favorables para crecimiento. (Fig. 3.3)

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Rayado en agar Este mtodo brinda mayor facilidad para aislar algas de tamao igual o menor a 10 m de dimetro. Tambin produce cultivos axnicos.

Figura 3.4 Aislamiento de una unidad algal: Mtodo Rallado en Agar

Figura 3.3 Aislamiento de una unidad algal: Mtodo Pipeta Capilar

a) Prepare platos Petri (vidrio o plstico) de 100 x 15 mm, conteniendo medio de cultivo solidificado con 1 a 1,5% de agar. b) Coloque dos gotas de coleccin natural cerca de la periferia en el medio solidificado. Con el asa de platino (punta esterilizada sumergida en alcohol y quemada), bajo criterio de asepsia, rayar en paralelo la muestra de la coleccin en el agar. c) Cubra el plato, inviertalo e incubar de 4 a 8 dias bajo adecuada condicin de crecimiento. d) Pasado este tiempo observar directamente en el estereomicroscopio el rayado y seleccione las colonias deseadas que estn libres de otros organismos. e) Remueva las colonias seleccionadas usando una pipeta Pasteur estirada estril o el asa de platino y colquelas en una gota de medio de cultivo estril sobre un cubreobjeto. En un microscopio compuesto observe las unidades de algas deseadas y que sean de la misma especie. f) Repita el procedimiento de rayado de una sola zona, constatar y nuevamente incubar para que se formen las colonias. Este segundo rayado reduce la contaminacin por bacterias y asegura agrupaciones de unidades algales de la misma especie. g) Transfiera las unidades algales de una colonia a un medio lquido (tubo de ensayo) o solidificado. (Fig. 3.4) Mtodos de Purificacin Unidades algales aisladas con pipeta capilar pueden presentar contaminantes asociados como bacterias.

Tambin el manejo prolongado de cepas de algas pueden contaminarse en un momento con microorganismos que utilizan los mismos nutrientes del medio y cuando se desarrollan pueden afectar las algas. La presencia de microorganismos y bacterias contaminantes pueden detectarse con el microscopio compuesto o mediante prueba y anlisis microbiolgico conocido. Entonces es necesario eliminar o inhibir el crecimiento de dichos microorganismos in situ mediante procedimientos qumicos. Se asume que todo aparato, equipo, implemento o medio de cultivo estn esterilizados antes de ser usados. Tratamiento con antibiticos Puede usarse un antibitico o una combinacin de stos para eliminar o inhibir el crecimiento de microorganismos que se adhieren a las clulas algales. El presente procedimiento corresponde a uno descrito por J. R. Stein en su texto Handbook of phycological methods: a) Preparar la solucin de antibiticos, disolviendo primero 100 mg de penicilina G y 50 mg de sulfato de estreptomicina juntos en 10 ml de agua destilada. Agregar a este preparado 10 mg de cloranfenicol que ha sido disuelto primero en 1 ml de ethanol al 95% y agitar bien. b) Filtrar esta solucin rpidamente con filtro de membrana (0.2 - 0.45 ). c) Colocar 1ml de cultivo algal contaminado en cada uno de los seis Erlenmeyer (fiolas) de 125 ml que contienen 50 ml de medio de cultivo estril. d) Agregar uno de los siguientes volmenes de la solucin de antibitico en cada fiola: 3, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125 ml. Esto provee concentraciones de penicilina de aproximadamente 20 a 500 mg/l. y los niveles que corresponden a los otros 2 antibiticos. e) Las fiolas debidamente tapadas son puestos bajo condiciones favorables de crecimiento. f) Despus de 24 - 48 horas aspticamente transfiera algunas unidades algales de cada fiola a tubos de ensayo conteniendo medio de cultivo estril y libre de antibiticos. Hacer esto por triplicado en cada intervalo de tiempo. g) Colocar estos tubos en condiciones favorables de

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crecimiento. Chequear los tubos y hacer pruebas de contaminacin bacteriolgica despus de 2 y 3 semanas, ver fig. 20 En ocasiones las algas pueden contaminarse con otras especies algales como las verde - azules y estas pueden ser eliminadas usando antibiticos. Medios de cultivo conteniendo 25 ppm. de estreptomicina pueden resultar efectivos. El uso de antibiticos requiere cuidado en la concentracin de los agentes qumicos y en la duracin del tiempo en que las algas son expuestas al tratamiento. (Fig. 3.5)

Desinfeccin y Esterilizacin Los trminos desinfeccin y esterilizacin parecen sinnimos, sin embargo hay diferencias fundamentales entre ellos. Desinfeccin significa la reduccin del nmero de bacterias hasta un nivel aceptable: bacteriosttico. Esterilizacin significa el proceso en el cual se asegura la total inactivacin de todos los microorganismos: bactericida. A continuacin se exponen mecanismos para desinfeccin y esterilizacin: Desinfectantes no voltiles El uso de estos compuestos est confinado a la reduccin de la carga microbiana de los instrumentos y superficies. Los siguientes desinfectantes son ms comnmente usados, ellos pueden ser aplicados directamente sobre las superficies o los implementos pueden ser sumergidos en ellos: a) Lisol al 3,5 % (v/v): Acta rpidamente sobre clulas vegetativas (en capacidad de reproducirse). No es efectivo contra las esporas. Puede quemar la piel al tener contacto con este desinfectante. b) Cloro (hipoclorito): Usado en solucin a una concentracin de 400 ppm, como cloro activo. El compuesto ms usado en nuestro medio es el HTH. Como hipoclorito es efectivo contra las esporas entre 15 y 70 minutos de accin. La preparacin de esta solucin de hipoclorito corroe los instrumentos metlicos. c) Formaldehdo: En solucin al 5% es considerado efectivo a temperatura ambiente. Requiere de 24 horas para ser efectivo. Pequeas cantidades de materia orgnica restringen mucho su accin. Es irritante a los ojos y a la mucosa nasal.

Figura 3.5 Purificacin: Secuencia de un tratamiento con Antibiticos

d) Alcohol: Como etanol al 70% ( v/v ). No es un buen desinfectante, por lo que es ms usado por su efecto antes que por su eficiencia. Mecanismos de esterilizacin

Otros antibiticos pueden ser usados para purificacin como las sulfonamidas. Para comprobar la presencia de los contaminantes se puede recurrir a la directa observacin en el microscopio de contraste de fase: 1. Aspticamente tome muestras del cultivo de algas. 2. Colquelas en lminas portaobjetos estriles y si es necesario agregar medios de cultivo estriles a las muestras. 3. Cbralos con laminillas cubreobjetos estriles. 4. Observe al microscopio equipado con iluminacin de contraste de fase. 5. Usando el mayor aumento posible: 20X/10X /40 aumento, buscar la presencia de microorganismos en la muestra.

El calor hmedo es la forma ms usada para producir esterilizacon. Es aplicable a todos los medios y materiales que pueden resistir temperaturas de 100 a 120 grados centgrados. a) Autoclavado (olla a presin): La esterilizacin se logra por autoclavado a 121 grados centgrados en vapor puro y saturado a 15 lb / plg2 de presin. Asegurarse que todo el aire del interior sea removido. El tiempo requerido para lograr una esterilizacin correcta vara segn el volmen a ser tratado: 100 ml requieren 10 minutos, 2 litros requieren 20 y 5 litros requieren 35 minutos aproximadamente. b) Bao en agua hirviendo: En un recipiente de acero inoxidable ponga a hervir agua destilada (100 grados

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centgrados). Coloque aqu el medio o los instrumentos a esterilizarse, dejndo que se caliente por 10 minutos. Este mtodo elimina clulas vegetativas, pero no las esporas. Es un mecanismo empleado slo en emergencias. c) Filtracin: Grandes volmenes de medio pueden filtrarse a travs de papel filtro de mayor dimetro (125 mm.), bajo presin normal y sin vaco. Aunque el vaco puede emplearse tambin, el efecto de la presin normal simplifica el filtrado de grandes volmenes de lquido, ver fig. 3.6 Volmenes de medio para cultivos iniciales e intermedios pueden esterilizarse con unidades de filtracin al vaco y membrana microporosa de 0.5 . Usar 5 lb. de presin cuando se filtra con estas membranas. (Fig. 3.7)

Medida del crecimiento El objetivo de contar algas no es slamente establecer la poblacin (densidad) de clulas por mililitro que hay en un recipiente, sino tambin determinar numricamente el grado de divisin celular en un determinado tiempo. Los resultados permiten estimar en cierto modo la situacin de un cultivo y relacionarlo con la curva de crecimiento de esa poblacin algal. El mtodo empleado para contar algas es sencillo. Implica el uso de un dispositivo que permita el contaje. De todos los dispositivos conocidos el ms usado en los laboratorios marinos comerciales de nuestro medio es el hemocitmetro. Para fines de investigacin tambin se usa la cmara de Sedgwick-Rafter. Dispositivos de conteo y usos:
Dispositivo Tamao de la clula 2 - 30 um Densidad
5 X 10 4 - 107

Objetivos
10X o 20X

Hemocitmetro (0.1 mm deep) Sedgwick-Rafter

50 - 500 um

30 X 104

2.5 a 10X y 20X

Por lo general estos dispositivos son bien usados para contar algas que se cultivan en recipientes, pero no necesariamente son muy convenientes para contar poblaciones naturales.Los mtodos para estimar biomasa de algas de ambientes naturales generalmente requieren de la sedimentacin del plancton. Equipos y accesorios: Microscopio estandard.
Figura 3.6 Filtros de 125 mm. de dimetro para volmenes mayores

Hemocitmetro 0.1 mm deep (Improved Neubauer) con cubre objeto No. 2 Pipetas Pasteur con bulbo (gotero) para llenar la cmara. Piceta con agua destilada para limpieza de accesorios. Tubos de ensayo, preferentemente con tapa rosca, para las muestras de algas. Fijativos para inmovilizar algas mtiles con el lugol o la formalina al 5%. Uso del hemocitmetro: Coloque el cubreobjeto bien limpio sobre los pilares de soporte de la cmara. Usando una pipeta Pasteur que contiene la muestra de algas, en ngulo de 45 grados, deposite una gota en cada ranura del hemocitmetro para llenar el espacio. Es conveniente esperar por tres minutos antes de proceder al contaje en el microscopio,para dejar que las unidades algales se asienten debidamente. Use objetivos

Figura 3.7 Unidad de filtracin al vaco para esterilizar volmenes menores

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asentadas justo en medio de cualquier lnea de los cuadros, sean de las internas o de los laterales, aunque este criterio no se aplica cuando apenas es un 25% del cuerpo de la clula el que est topando la lnea. (Fig. 3.8) Consideraciones: Es necesario homogenizar el cultivo y seleccionar el dispositivo indicado para el conteo, en el que las algas se distribuyan adecuadamente.

A.- HEMOCITOMETRO: La gota de la suspensin algal se coloca en cada ranura de la cmara B.-La flecha indica la frecuencia del contaje. La suma total de las clulas en los cuatro cuadros se divide para 4 y este valor se multiplica por 10.000 para obtener la densidad de la poblacin (NB de clulas/ml.)
Figura 3.8 Contaje de clulas

Si el alga crece adherida al recipiente (bnticas por ejmplo), la muestra puede ser tomada raspando un area y homogenizandola luego para tomar nuevamente la muestra. Hay cultivos que no se pueden contar y demandan otros mecanismos que no implican el uso de las cmaras de contaje. Cuando una clula se encuentra en franco proceso de divisin (fisin binaria), la unidad se cuenta como dos por que representa el material de dos clulas. Si las divisiones se presentan en un alto nmero entonces habr que cambiar la hora del contaje. La seleccin del disposotivo a usarse depende de la densidad del cultivo, del tamao y forma de la clula y de la presencia de algn material celular que pueda influir en el llenado de la cmara. Despus de seleccionado el dispositivo, su limpieza es importante, incluyendo los accesorios, para lograr una correcta distribucin de las clulas en la cmara. Es conveniente dejar que las clulas se asienten por unos tres minutos en la cmara y luego proceder a contar.
.

de 20X o 40X segn cul le sea ms claro y cmodo para proceder. Mantenga un orden en la secuencia del contaje para evitar errores de suma. No considere las clulas que estn

Carteria Euglena Phormidium Tetraedron Lepocinclis Anabaena

Pyrobotrys

Agmenellum Arthrospira Chlorogonium Phacus Chlorella

Spirogyra

Oscillatoria

Nitzschia

Chlorococcum

Lyngbya

Chlamidomonas

Anacystis

Stigioclonium

Figura 3.9 Miscelanea de algas microscpicas presentes en aguas servidas

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Miscelanea de preguntas 1.- Nombre las fases o etapas de desarrollo de una poblacin algal. 2.- Indique los factores que caracterizan los cultivos contnuos de algas. 3.- Cundo un cultivo es considerado axnico? 4.- Describa las condiciones tcnicas del cultivo intermedio dentro del procedimiento general en la produccin de microalgas. 5.- Mencione el tamao y uso de la especie Chaetoceros eibenii. 6.- Nombre los mtodos de aislamiento ms conocidos. 7.- Describa los pasos que se dn en el proceso de purificacin empleando antibiticos. 8.- Indique la concentracin de cloro (ppm) cuando es usado como desinfectante. 9.- Describa la esterilizacin por autoclavado. 10.- Dibuje tres especies de algas presentes en aguas servidas. Bibliografa de consulta: 1) Handbook of Phycological Methods, Culture Methods and Growth Measurements. Janet R. Stein. 1973. 2) Illustration of the Marine Plankton of Japan. Dr. I. Yamaji. Third Edition, July 1984. 3) Tecnologia de Cultivo de Microalgas. Eduardo Uribe T.. Universidad Catlica del Norte. Coquimbo, Chile 1992. 4) Acta Oceanogrfica del Pacfico. Dr. R. Jimenez. INOCAR. Vol 2 No 2. 1983.