Documentos SEQC 2009

Documentos de la SEQC 2009
Sumario
Procedimiento recomendado para la calibracin de termmetros en el laboratorio clnico
Comit Cientfico Comisin de Metrologa Documento G. Fase 3. Versin 2 Preparado por: J. Batista Castellv
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Criterios para la seleccin de un modelo de automatizacin del laboratorio
Comit Cientfico Comisin de Instrumentacin y Sistemas Analticos Documento A. Fase 3. Versin 2 Preparado por: JL Bedini Chesa, S. Esteve Pablador, L. Garca Beltrn, JM Gasalla Herraiz, C. Macas Blanco, M. Martnez Casademont, JM Moreno Cebeira, V. Martnez Vzquez, B. Prieto Garca, G. Serrano Olmedo, J. Torres Nicolau
Recomendaciones preanalticas para la medicin del equilibrio cido-base y gases en sangre

Comit Cientfico Comisin de Magnitudes Biolgicas relacionadas con la Urgencia Mdica Documento H. Fase 3. Versin 5 Preparado por: X. Navarro Segarra, JL Marn Soria, A. Buo Soto, R. Daz Garca, A. Galn Ortega, P. Guevara Ramrez, E. Guilln Campuzano, M. Muoz Prez, P. Oliver Sez, N. del Ro Barcenilla
18 23 27 30 41
Tcnicas para la preparacin de semen en reproduccin asistida
Comit Cientfico Comisin de Seminologa y Tcnicas de Reproduccin Asistida Documento C. Fase 3. Versin 4 Preparado por: I. Snchez, C. Mar, JA Castilla, M. Marcos, I. Martn, A. Galn, MI Jimnez, JM Moreno, MG Serrano, I. Garca-Cobaleda, C. Aulesa, V. Lozano, C. Snchez, J. de Montserrat
Recomendaciones para la estimacin de la incertidumbre de medida en el laboratorio clnico

Comit Cientfico Comisin de Metrologa Documento H. Fase 3. Versin 2 Preparado por: FJ Gella Toms, F. Canalias Reverter, S. Izquierdo lvarez, V. Martnez Vzquez, M. Snchez Manrique
Recomendaciones para el estudio de las gammapatas monoclonales
Documento de consenso. Sociedad Espaola de Bioqumica Clnica y Patologa Molecular (SEQC) y Asociacin Espaola de Hematologa y Hemoterapia (AEHH) Comit Cientfico Comisin de Protenas (SEQC) y Grupo Espaol de Mieloma (AEHH) Documento I. Fase 3. Versin 3 Preparado por: C. Martnez-Br, R. Garca Sanz, J. Martnez-Lpez
Recomendaciones para la calibracin de material volumtrico en el laboratorio clnico

Comit Cientfico Comisin de Metrologa Documento E. Fase 3. Versin 2 Preparado por: R. Ruz Morer
Fotografa de portada: Nria Insa Domicilio Social SEQC: c/ Padilla, 323. Despacho 68, 08025 Barcelona. Tel. 934 462 670. Fax 934 462 672 correo-e: secre@seqc.es. http://www.seqc.es. Edita: Publicaciones Nacionales Tcnicas y Extranjeras, S.A. Redaccin: c/ Padilla, 323 08025 Barcelona. Tel. 934 462 820 Fax. 934 462 064 Impresin: Trajecte. Depsito legal: B-33169/09. ISSN: 2013-5750

Sociedad Espaola de Bioqumica Clnica y Patologa Molecular Comit Cientfico Comisin de Metrologa1 Documento G. Fase 3. Versin 2 Preparado por: J. Batista Castellv
NDICE
0. Introduccin 1. Objeto y campo de aplicacin 2. Normas para consulta 3. Definiciones 4. Requisitos metrolgicos: criterios de aceptacin 5. Procedimiento 5.1 Patrones 5.2 Condiciones previas 5.3 Procedimiento de calibracin 5.4 Clculo del error sistemtico y de la incertidumbre de medida 5.5 Frecuencia de calibracin 6. Aplicaciones 7. Bibliografa Anexo 1. Clculo de la incertidumbre Anexo 2. Ejemplo de resultados de calibracin
2. NORMAS PARA CONSULTA

Asociacin Espaola de Normalizacin. Sistemas de gestin de la calidad. Requisitos. UNE-EN ISO 9001:2000. Madrid: AENOR; 2000. Asociacin Espaola de Normalizacin. Laboratorios Clnicos. Requisitos particulares relativos a la calidad y la competencia. UNE-EN-ISO 15189:2003. Madrid: AENOR; 2003. Centro Espaol de Metrologa. Vocabulario internacional de trminos fundamentales y generales de metrologa (VIM). Madrid: Ministerio de Obras Pblicas, Transportes y Medio Ambiente; 1994.
3. DEFINICIONES
3.1 Calibracin
Conjunto de operaciones que establecen, en condiciones especificadas, la relacin entre los valores de una magnitud indicados por un instrumento de medida o un sistema de medida, o los valores representados por una medida materializada o por un material de referencia, y los valores correspondientes de esa magnitud realizados por patrones (VIM).
0. INTRODUCCIN
Los termmetros que se utilizan para mediciones de temperaturas que pudieran afectar, directa o indirectamente, la calidad de los resultados generados en el laboratorio, deberan estar apropiadamente calibrados. Segn las normas para la gestin de la calidad ISO 15189 e ISO 9001, los laboratorios clnicos deben establecer una programacin que controle y demuestre peridicamente que sus instrumentos de medida se encuentran calibrados y mantener documentos que describan los procedimientos de calibracin y los criterios de aceptacin, as como informes que contengan datos de las calibraciones efectuadas.
3.2. Error mximo permitido (de un instrumento de medida)

Valor extremo de un error permitido por especificaciones, reglamentos, etc. para un instrumento de medida dado (VIM).
3.3. Error sistemtico

Media que resultara de un nmero infinito de medidas del mismo mensurando realizadas bajo condiciones de repetibilidad menos un valor verdadero del mensurando (VIM).
NOTA: Para obtener una estimacin, se realiza un nmero finito de mediciones y se utiliza un valor convencionalmente verdadero del mensurando.
1. OBJETO Y CAMPO DE APLICACIN

Este documento describe un procedimiento para calibrar los termmetros de columna de lquido y los termmetros digitales por el mtodo de comparacin, en el intervalo de temperaturas comprendido entre 0 y 100 C. Aunque determinados termmetros permiten intervalos de medida mayores, no se considera til ampliar el campo de aplicacin de esta recomendacin a otras temperaturas.
3.4. Escala (de un instrumento de medida)

Conjunto ordenado de trazos con cualquier numeracin asociada, que forma parte de un dispositivo indicador de un instrumento de medida (VIM).
Composicin de la Comisin J. Batista Castellv, F. Canalias Reverter, F. J. Gella Toms, B. Gonzlez de la Presa, R. Ruiz Morer, M. Snchez Manrique (Presidente).
1
3.5. Exactitud de un instrumento de medida

Aptitud de un instrumento de medida para dar respuestas prximas a un valor verdadero (VIM).
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3.6. Imprecisin
Coeficiente de variacin de un conjunto de resultados obtenidos al medir repetidamente un mensurando con un mismo procedimiento de medida.
laboratorio clnico. No obstante, determinadas circunstancias pueden exigir requisitos ms o menos estrictos que los aqu recomendados.
Categora A EMP (C) 0,5 1,0 2,0
3.7. Incertidumbre de medida

Parmetro, asociado al resultado de una medicin, que caracteriza la dispersin de los valores que podran razonablemente ser atribuidos al mensurando (VIM).
B C
3.8. Intervalo de medida

Mdulo de la diferencia entre dos lmites de un rango nominal (VIM).
3.9. Patrn
Medida materializada, instrumento de medida, material de referencia o sistema de medida destinado a definir, conservar o reproducir una unidad o uno o varios valores de una magnitud para que sirvan de referencia (VIM).
Para cada termmetro del laboratorio deben establecerse las medidas que con dicho instrumento se efectan y asignarle como error mximo permitido el ms estricto de las categoras de medida que se realizan con el mismo. El error mximo permitido se utilizar como criterio de aceptacin de las calibraciones.
5. PROCEDIMIENTO
5.1 Patrones
Para la calibracin por el mtodo de comparacin debe utilizarse como patrn un termmetro de resolucin adecuada y previamente calibrado con referencia a la Escala Internacional de Temperatura de 1990, EIT-90. Se recomienda usar un termmetro digital con sonda de resistencia de platino del tipo PT 100, acompaado de un certificado de calibracin expedido por un laboratorio acreditado o un instituto nacional de metrologa, debiendo constar en dicho certificado la trazabilidad a patrn de referencia, la incertidumbre expandida y el factor (o probabilidad) de cobertura que se ha utilizado en la clculo de incertidumbre expandida.
3.10. Resolucin
La menor diferencia de indicacin de un dispositivo visualizador que puede percibirse de forma significativa (VIM)
3.11. Trazabilidad
Propiedad del resultado de una medicin o de un patrn tal que pueda relacionarse con referencias determinadas, generalmente a patrones nacionales o internacionales, por medio de una cadena ininterrumpida de comparaciones teniendo todas las incertidumbres determinadas (VIM).
3.12. Valor convencionalmente verdadero (de una magnitud)

Valor atribuido a una magnitud particular y aceptado, algunas veces por convenio, como teniendo una incertidumbre apropiada para un uso dado (VIM).
NOTA: Tambin es denominado valor convencional.
5.2 Condiciones previas

La comparacin de temperaturas se efecta en un bao lquido de agua, glicerina o aceite mineral. El recipiente ha de tener las dimensiones adecuadas al tamao de los termmetros utilizados, con un volumen de lquido de al menos 100 veces el volumen del termmetro a calibrar. El bao ha de ser de temperatura programable y estable, con agitacin constante para garantizar la uniformidad en todo el bao. Los termmetros estn diseados para indicar temperaturas correctamente cuando el bulbo y la columna estn totalmente inmersos en el medio a medir (1 cm de columna puede estar fuera del medio para poder efectuar la lectura). Cuando se va a utilizar un termmetro de inmersin parcial, ste debe ser sumergido en el bao de calibracin a la misma profundidad de uso.
4. REQUISITOS METROLGICOS: CRITERIOS DE ACEPTACIN

El error mximo de medida de temperatura permitido (EMP) en el laboratorio clnico depende sustancialmente del objeto de la medicin. De forma general pueden establecerse las siguientes categoras: A. Mediciones de temperatura de incubacin que pueden afectar al valor de la concentracin cataltica de una enzima o la medicin del pH en la sangre. B. Mediciones de temperatura de incubacin de cultivos celulares. C. Otras mediciones de temperatura, por ejemplo, en reas de almacenaje. Teniendo en cuenta el estado actual de la tecnologa de los instrumentos para la medicin de temperatura utilizables en los laboratorios clnicos, se recomiendan los requisitos para el error mximo permitido de las mediciones de temperatura que se muestran en la siguiente tabla. Estos valores deben considerarse como una aproximacin razonable y aplicable a muchas situaciones del
5.3 Procedimiento de calibracin

a) Seleccionar la temperatura a la que se desee calibrar el termmetro. Para ello escoger la temperatura de uso o tres temperaturas que abarquen la escala del termmetro a calibrar. Se recomienda realizar la calibracin a temperaturas crecientes. b) Sumergir el termmetro a calibrar y la sonda patrn. Colocarlos cerca pero con suficiente espacio entre ellos para asegurar la circulacin del lquido. c) Esperar que la temperatura se estabilice y leer la indicacin de temperatura en ambos termmetros, 5 veces, de forma alternativa y dejando unos 10 segundos entre lecturas. Anotar las indicaciones del patrn (tPi ) y las indicaciones del termmetro a calibrar (tXi).
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5.4 Clculo del error sistemtico y de la incertidumbre de medida

Los clculos descritos se realizan para cada una de las temperaturas de calibracin. a) Calcular la media (tP) y (tX). El valor medio del termmetro patrn (tP) se ha de corregir por la desviacin (si existe) indicada en el certificado. b) Calcular la desviacin tpica (sp) y (sx) c) Calcular el error sistemtico (ES) ES = tP tX d) Calcular la incertidumbre combinada expandida para una probabilidad de cobertura de aproximadamente el 95% (Uc) aplicando la siguiente ecuacin: Uc = 2 x sp2+ sx2 + 0,084 x rp2 + 0,084 x rx2 + 0,25 x Up2
general es suficiente calibrar los termmetros una vez al ao. Tambin deberan calibrarse siempre que exista alguna sospecha de funcionamiento incorrecto o despus de haber sido sometidos a temperaturas inadecuadas u otra situacin que se piense que puede comprometer su funcionamiento.
6. APLICACIONES
El proceso de calibracin de los termmetros permite obtener evidencia objetiva de que, cuando se utiliza el instrumento para efectuar mediciones de temperatura, no se cometen errores inadmisibles, esto es, superiores el error mximo permitido. Es posible que se obtengan resultados insatisfactorios en alguno de los puntos de calibracin. Esto no cuestiona todas las mediciones que se efectuaron con anterioridad con el mismo termmetro, sino tan slo aqullas cercanas al punto de calibracin para el que se obtuvieron resultados anmalos. El instrumento puede utilizarse restringiendo su intervalo de medida o variando el error mximo permitido en funcin de la escala de medida.
En el anexo 1 se detalla el origen y significado de los trminos de esta ecuacin. e) Evaluar los resultados. La suma del valor absoluto de ES con la de Uc debe ser inferior o igual al error mximo permitido. Estas condiciones son aplicables a cada temperatura de calibracin.
7. BIBLIOGRAFA
- Centro Espaol de Metrologa. Procedimiento TH-004 para la calibracin de termmetros de columna de lquido de inmersin total. Madrid: Minis terio de Industria y Energa; Edicin 0, 2004. - National Institute of Standards and Technology (NIST). Description and use of a precision thermometer for the clinical laboratory, SRM 934. Washington; NIST special publication 260-113; 1990.
5.5 Frecuencia de calibracin

La frecuencia de calibracin de un termmetro depende de las caractersticas del instrumento y del uso a que se somete. En
Anexo 1. Clculo de la incertidumbre

Las medidas realizadas con el termmetro, tienen las siguientes fuentes de incertidumbre (u): a) Incertidumbre asociada a la dispersin de las lecturas sp y sx se calcula a partir de la desviacin tpica (s) de 5 medidas repetidas. b) Incertidumbre asociada a la resolucin (ur): la resolucin del termmetro patrn (rp) y la del termmetro a calibrar (rX) ocasionan errores aleatorios de redondeo. La amplitud de la distribucin de posibles errores es igual a la resolucin y, en ese intervalo, cualquier valor tiene las mismas probabilidades de producirse (distribucin rectangular o uniforme). En este tipo de distribucin, la desviacin tpica es igual a la amplitud de la distribucin dividida por la raz cuadrada de 12. Incertidumbre asociada a la resolucin del termmetro patrn urp = rp / urx = rx / 12 = 0,29 rp 12 = 0,29 rx Incertidumbre asociada a la resolucin del termmetro a calibrar
c) La incertidumbre asociada a la calibracin del termmetro patrn: Se calcula a partir de los datos que proporciona el certificado del termmetro patrn. La incertidumbre expandida (generalmente para el 95% de confianza) con un valor del factor de cobertura empleado (habitualmente kp = 2) es: up = Up = Up kp 2 d) Otros componentes de la incertidumbre como por ejemplo el asociado a la deriva de las sondas y los termmetros, as como la homogeneidad y estabilidad del bao, pueden ser ignorados por su escasa relevancia en las aplicaciones habituales del laboratorio clnico. e) La incertidumbre combinada tpica (uc) se calcula a partir de la suma de cuadrados de las incertidumbres de cada componente: uc = uc = sp2+ sx2 + urp2 + urx2 + up2 sp2+ sx2 + 0,084 x rp2 + 0,084 x rx2 + 0,25 x Up2
f) La incertidumbre combinada expandida (Uc) para el intervalo de confianza de aproximadamente el 95% resulta de multiplicar la anterior por el factor de cobertura 2. Uc = 2 x sp2+ sx2 + 0,084 x rp2 + 0,084 x rx2 + 0,25 x Up2
Anexo 2. Ejemplo
Calibracin de un termmetro de columna de mercurio de categora A, a la temperatura de 60 C Caractersticas de la sonda de calibracin Sonda de resistencia de platino PT100 Incertidumbre de calibracin (Up): 0,020 C Resolucin (rp): 0,001 C Caractersticas del termmetro a calibrar Termmetro de columna mercurio, de inmersin total Rango de medida: 0-100 C Resolucin (rx): 0,1 C Incertidumbre asociada a la dispersin de las lecturas calculada a partir de la desviacin tpica de 5 medidas repetidas. tP = 60,138 C sP = 0,00117 C tX = 60,11 C sX = 0,0316 C Incertidumbre asociada a la resolucin de los dos termmetros urp = 0,29 rp = 0,29 x 0,001 urx = 0,29 rx = 0,29 x 0,1 Incertidumbre asociada a la calibracin del termmetro patrn up = 0,020 / 2 Incertidumbre combinada expandida Uc = 2 x Uc = 0,088 Clculo del error sistemtico (ES) ES = tP - tX | ES | = 60,138 - 60,110 = 0,030 C Error total en la medida del termmetro a calibrar |ES + Uc|= 0,030+0,088 = 0,119 C |ES + Uc | < 0,5 C Resultado conforme sP2 + sX2 + 0,084 x rp2 + 0,084 x rx2 + 0,25 x Up2
Uc = 2 x 0,001172 + 0,03162 + 0,084 x 0,0012 + 0,084 x 0,12 + 0,25 x 0,020 2

Sociedad Espaola de Bioqumica Clnica y Patologa Molecular Comit Cientfico Comisin de Instrumentacin y Sistemas Analticos Documento A. Fase 3. Versin 2 Preparado por: JL Bedini Chesa, S Esteve Poblador, L Garca Beltrn, JM Gasalla Herraiz, C Macas Blanco, M Martnez Casademont, JM Moreno Cebeira, V Martnez Vzquez, B Prieto Garca, G Serrano Olmedo, J Torres Nicolau
NDICE
Introduccin Objeto y campo de aplicacin Modelos de automatizacin Fase preanaltica 3.1. Identificacin de los pacientes: hospitalizados y ambulatorios 3.2. Tipos de contenedores 3.3. Identificacin de la muestra 3.4. Configuracin 3.5. Trazabilidad Fase Analtica 4.1. Versatilidad de la automatizacin en la fase analtica 4.2. Gestin de prioridades 4.3. Control de la integridad de las muestras 4.4. Gestin de muestras especiales una vez dentro del proceso analtico 4.5. Gestin de los mdulos del sistema automatizado 4.6. Acceso a la informacin generada sobre la muestra a tiempo real y validacin tcnica de resultados 4.7. Control de la calibracin y controles de calidad 4.8. Recursos humanos necesarios para la gestin y manteni miento del sistema de automatizacin en la fase ana ltica 5. Fase Postanaltica 5.1. Recuperacin de muestras ya procesadas 5.2. Archivo de muestras. Indicacin de caducidad o das de conservacin 5.3. Capacidad de almacenamiento 5.4. Trazabilidad de las muestras 5.5. Conexin de los autoanalizadores con el sistema de in formacin del laboratorio 6. Conclusiones 7. Bibliografa 0. 1. 2. 3. 4.
Las constantes mejoras en la instrumentacin han conducido a un incremento notable de la capacidad productiva del laboratorio clnico. La automatizacin ha permitido hacer ms con menos y los nuevos descubrimientos cientficos han creado, a su vez, nuevas necesidades y procedimientos que han repercutido en un aumento de la demanda de servicios al laboratorio clnico, los cuales se ven sometidos a la presin de los usuarios para la puesta a punto de nuevos procedimientos diagnsticos. En este complejo escenario, los profesionales de los laboratorios no pueden adems olvidar su misin, que consistir, fundamentalmente, en adecuar la tecnologa necesaria para el estudio de fluidos y tejidos del cuerpo humano, con el fin de servir de apoyo a la clnica, proporcionndole informacin fiable y til para el correcto diagnstico de las enfermedades, para el seguimiento evolutivo de las mismas y para el control de la eficacia de la teraputica aplicada. A la hora de seleccionar un modelo de automatizacin se estudiar la fiabilidad y la practicabilidad de las soluciones disponibles. La fiabilidad nos habla de la capacidad que tiene un sistema para mantener una adecuada calidad analtica (veracidad e incertidumbre) a lo largo del tiempo. Por otro lado, la practicabilidad es un ndice de informacin sobre las prestaciones del modelo de inters bajo las condiciones particulares del laboratorio donde se implanta. Para conocer las prestaciones del sistema, nos basaremos en la informacin proporcionada por el fabricante, en la experiencia de otros usuarios y en las publicaciones de evaluaciones de cada modelo. Pero tambin ser imprescindible considerar las caractersticas de cada laboratorio: los puntos fuertes a conservar y, si es posible, mejorar, los aspectos que claramente precisan una mejora o un replanteamiento y aquellas innovaciones que deseamos implementar. Ser de utilidad crear un guin en el que se incluyan todos estos aspectos, para que podamos ir reflejando una a una las soluciones que nos aporta cada modelo de automatizacin y las impresiones que nos suscitan en caso de que podamos valorar diferentes opciones aplicadas en otros laboratorios que compartan nuestras caractersticas bsicas.
0. INTRODUCCIN
Los avances tecnolgicos desarrollados en los ltimos aos pueden condicionar la aparicin e implantacin de nuevos sistemas organizativos, que permitirn agrupar la actividad de varias especialidades del laboratorio clnico, de manera que compartan espacio fsico, recursos humanos y tcnicos.

Este documento recoge una serie de aspectos a considerar para la seleccin de un modelo de automatizacin. No es objeto de este documento la revisin exhaustiva de todas y cada una de las posibles soluciones existentes en el mercado, sino el aportar unas
recomendaciones que faciliten establecer cul sera el modelo ms adecuado para un laboratorio concreto.
Y como ventajas: Permite la gestin integral de la muestra. Sobre todo en cuanto a trazabilidad, custodia, seguridad biolgica y gestin de la fase postanaltica. Representa un ahorro considerable en el nmero de tubos, al tener unidos a la cadena los sistemas que comparten la misma muestra. Permite la preparacin de muestras para ser procesadas en equipos off-line de la cadena. Permite la conexin de distintos sistemas de inmunoanlisis con lo que se puede conseguir un panel muy completo. Permite la mayor optimizacin de recursos humanos.
2. MODELOS DE AUTOMATIZACIN
El concepto de organizacin de laboratorio unificado (core lab) ha variado en los ltimos aos como consecuencia del progreso tecnolgico. Pueden distinguirse dos modelos claramente diferenciados de core lab: el laboratorio totalmente automatizado y el laboratorio automatizado modular. En cualquiera de los dos casos, el laboratorio central obtiene beneficios cuando lleva acoplada toda la gestin del proceso preanaltico.
2.1. Laboratorio totalmente automatizado

Muchos de los desarrollos en el campo de la automatizacin total pueden atribuirse al Dr. M. Sasaki responsable del primer laboratorio que se cre bajo esta concepcin, en la Kochi Medical School de Japn, en 1984. Desde entonces, alrededor de 140 laboratorios japoneses han seguido este esquema. El gran nmero de muestras que procesaban estos centros, una tecnologa que en aquellos momentos pareca definitivamente consolidada y el problema que se haba planteado por la escasez de personal tcnico, permitan plantear esquemas organizativos rgidos y poco flexibles, en los que se conectaban diferentes analizadores a un sistema automatizado de transporte de muestras, en algunas ocasiones diseados por los propios laboratorios. Fuera de Japn, existen pocos laboratorios que hayan adoptado este modelo de automatizacin global, fundamentalmente en EE.UU y Canad. En Europa, estos planteamientos han tenido, hasta el momento, poca repercusin real. Han sido pioneros en la puesta en marcha de sistemas totalmente automatizados los hospitales de Leuven (Holanda), Regensburg (Alemania), Helsinki (Finlandia), el nuevo Hospital Pompidou de Pars (Francia), y el Hospital Clnico de Barcelona (Espaa). Quizs la escasa implantacin de esta modalidad se deba a una serie de factores que es necesario tener en cuenta: Necesidad de una fuerte inversin inicial. Escasa incidencia de la cadena de transporte sobre las prestaciones reales de los instrumentos. Diferencias notables entre los modelos organizativos europeos y los de EEUU y Japn. En la mayora de los Sistemas Sanitarios Europeos, escasa capacidad para aumentar la actividad del laboratorio mediante la adquisicin de nuevas cuotas de mercado. Escasa flexibilidad y modularidad, sobre todo en los sistemas de primera generacin, la mayora de ellos totalmente cerrados. Dependencia para la conexin de nueva tecnologa, de la capacidad de entendimiento entre los fabricantes de sistemas de transporte y los de instrumentos analticos. Dificultades en la comunicacin entre el Sistema Informtico de Laboratorio (SIL) y el sistema de gestin de la cadena de transporte. No es totalmente adecuado para la gestin integral de la urgencia, por lo que en ocasiones puede requerirse un circuito diferenciado. Necesidad de un espacio adecuado. Dificultad de gestionar y organizar, desde una nica y nueva estructura organizativa, personal y actividades asistenciales pertenecientes a diferentes servicios y especialidades de laboratorio.
2.2. Laboratorio automatizado modular

En los ltimos aos, la evolucin de la tecnologa ligada a los laboratorios ha planteado propuestas ms flexibles, de tipo modular, que permiten a los laboratorios adaptarse mejor a futuros cambios importantes, tanto de tecnologa como de estructura organizativa de trabajo. En este modelo la instrumentacin se agrupa en islas o mdulos de automatizacin (work-cells), atendiendo a criterios tecnolgicos o de tipo de muestra, de manera que se crean reas, fsicamente independientes, para atender: rea de preanaltica, con clasificacin, centrifugacin, preparacin de alcuotas y sistemas de carga (racks) de los distintos analizadores, de las propias work-cells, o de equipos situados en otras reas del laboratorio. Determinaciones en sangre total, suero, plasma, orina o lquidos biolgicos. Bioqumica bsica, inmunoanlisis homogneos y heterogneos. Algunas de estas work-cells, poseen su propio sistema de transporte mecnico de muestras entre los diferentes mdulos incorporados o estn constituidas por un solo instrumento modular. Hematimetra. Pueden agrupar ms de un equipo, sistema de transporte de muestras propio e incluso sistemas de preparacin y teido automtico de extensiones de sangre. Coagulacin bsica.
Como ventajas de este sistema se pueden considerar: Menor inversin inicial. Mayor flexibilidad en la eleccin de los instrumentos analticos. Resolucin de problemas de la fase preanaltca. No necesita grandes instalaciones. Permite una mejor gestin de la urgencia. Menores limitaciones arquitectnicas. Como inconvenientes: No permite la gestin integral de la muestra. Sobre todo en cuanto a trazabilidad, custodia y gestin de la fase postanaltica, sin un desarrollo informtico especialmente dedicado a tal fin. En los sistemas separados, o se transporta el tubo manualmente, de un analizador a otro, o no hay un ahorro significativo en el nmero de alcuotas. Los sistemas modulares integrados, son totalmente cerrados, al igual que los que se sustentan sobre un solo equipo modular. No permiten la consolidacin del inmunoanlisis, al tener que limitarse al panel desarrollado por el fabricante.
En los siguientes apartados se revisar cada una de las tres fases que comprende la tarea de un laboratorio clnico, a fin de establecer los puntos donde repercute de manera especial la automatizacin del mismo.
longitud, dimetro y tipo de tapn del tubo en los procesos de lectura del sistema de identificacin, centrifugacin, destaponado y posterior retaponado. Es aconsejable la estandarizacin del tubo segn los diferentes especmenes (suero, sangre total, orina, etc.).
3. FASE PREANALTICA
La fase preanaltica es el conjunto de operaciones que se realizan desde que se recibe la peticin hasta que se inicia la fase analtica. Esta fase requiere ms del 57 % del tiempo necesario para dar respuesta a la demanda de una peticin analtica, frente al 25% de la fase analtica (Godolphin 1990). Tambin es en dicha fase donde se producen el mximo nmero de errores, entre el 32 y 75%, segn los trabajos consultados (Bonini 2002) y donde hay ms riesgo en la manipulacin de los especmenes. Algunas ventajas de automatizar la preanaltica son: Mayor bioseguridad: al no existir manipulacin de la muestra Trazabilidad del proceso Liberacin de personal a tareas ms productivas Estandarizacin de procesos: menos errores Mejor gestin de la muestra: menos tubos por extraccin Por todo ello, en estos ltimos aos se ha planteado la necesidad de automatizacin de dicha fase. Los principales aspectos a tener en cuenta son:
3.3 Identicacin de la muestra

Existen principalmente dos opciones para la identificacin de los especmenes: 1) cdigo de barras, y 2) identificacin por radiofrecuencia combinado con cdigo de barras. Es imprescindible valorar tanto la calidad del papel empleado para generar la etiqueta autoadhesiva identificativa como la de la impresin del cdigo de barras, de manera que sea ntida y robusta al rayado. Los cdigos de barras son ledos repetidamente y se debe mantener la calidad durante todo el proceso. En el caso de la utilizacin de radiofrecuencia es necesario prevenir la retirada manual de los tubos de los contenedores, con la resultante prdida de informacin (Melanson 2007). Algunos sistemas preanalticos pueden diferenciar las muestras de un paciente con el mismo cdigo de barras por: la forma-tamao del tubo, el color del tapn, el rack en el que se introducen al sistema o soluciones mixtas (Ej. tamao tubo + color tapn).
3.3.1 Tipos de cdigos de barras que soporta el sistema

Ante la multitud de formatos de cdigo de barras disponibles, conviene seleccionar el que presente mejores caractersticas para cada laboratorio (versatilidad, informacin), el que admita la generacin de un dgito de control (permite chequear la aparicin de errores durante la impresin/interpretacin del mismo) y el que pueda ser ledo por todos los equipos relacionados del laboratorio. Es recomendable considerar la capacidad de compresin de los cdigos en funcin de las necesidades y la calidad de los lectores de los diferentes equipos disponibles en el laboratorio. Algunos sistemas soportan cdigos de barra bidimensionales, con lectores especficos, permitiendo una cantidad de informacin muy superior.
3.1 Identicacin de los pacientes: hospitalizados y ambulatorios
Es deseable la identificacin de los pacientes con la tarjeta sanitaria. Si esta carece de fotografa, ser necesario el DNI, pasaporte, etc. Este proceso debera realizarse en Admisin de Pacientes en el mismo momento del ingreso o de la extraccin. En todo paciente la identificacin es imprescindible, tanto en el momento de la extraccin como durante los procesos preanaltico, analtico y postanaltico, para as solventar posibles incidencias que requieran localizar al paciente. La mayor parte de los sistemas presentes en el mercado ofrecen la posibilidad de identificar al paciente mediante un brazalete, basado en cdigo de barras, banda magntica o microchip, con conexiones WIFI soportadas por programas informticos instalados en PDAs o Tablets PC. Estos sistemas permiten introducir los datos identificativos del extractor (mediante un cdigo personal), as como el momento de la extraccin en tiempo real. Sera deseable que este proceso se realizara de manera inseparable (espacio y tiempo) del etiquetado de los contenedores para realizar la extraccin. Si esto no es posible o el receptor de especmenes y el extractor no son la misma persona, sera deseable que el procedimiento de identificacin positiva se realizara en cada fase. De este modo se garantizara la trazabilidad paciente-peticin-espcimen
3.3.2 Informacin de las etiquetas con el cdigo de barras

Las etiquetas con el cdigo de barras deben contener idealmente la siguiente informacin: Identificacin del paciente: Nombre Identificador unvoco del paciente (nmero de historia clnica, CIP, NSS) Sexo Fecha de nacimiento Identificacin de la muestra: Centro de procedencia (Ej. prefijo alfanumrico) Nmero de peticin (numrico) Prioridad de la muestra (banda de color o sufijo) Destino de distribucin Fecha y hora de extraccin Momento de la extraccin (basal, 30, valle o pico, etc.) Identificacin del contenedor: Tipo de contenedor (tubo primario, frasco 24 horas). Tamao/Volumen (tubo largo, tubo corto, microtubo, etc.) Aditivo (seco con o sin gel, EDTA, citrato, heparina,etc.) Conservante (HCl, Carbonato, etc.)
3.2 Tipos de contenedores

Segn las necesidades del Laboratorio, se debe considerar la posibilidad de manejar otros tipos de contenedores distintos al tubo (vasos, portaobjetos, cultivos, etc.), aunque en estos especmenes de menor frecuencia no parece recomendable su automatizacin. En el caso de que solamente se manejen tubos, el posible uso simultneo de tubos de diferentes caractersticas (medida, fondos redondos o cnicos, etc.), vendr limitado principalmente por la
Condiciones de conservacin (luz, temperatura, etc.) Fecha de caducidad
3.3.3 Informacin de las etiquetas secundarias y alcuotas

Tanto si se generan etiquetas secundarias para placas de cultivo, concentradores de orina, tubos para precipitacin o pretratamiento de muestras, como para tubos secundarios (alcuotas) su identificacin deber mantener la misma informacin que la etiqueta del tubo primario, cambiando el destino de distribucin, de modo que sea posible su trazabilidad al paciente.
rack es uno de los ms extendidos. El tipo de soporte depender principalmente de cada analizador, pero el sistema deber poder gestionar eficientemente los diferentes tipos de soportes utilizados.
3.4.2 Clasicacin y pretratamiento de los especmenes

El sistema debera identificar (clasificar) los especmenes que requieran pretratamiento (centrifugacin, destaponado, alicuotado, predilucin, precipitacin, etc.) y los que no lo precisen (Ej. hemograma). Para ello el sistema debera obtener informacin sobre el contenedor del espcimen (mediante prefijos o sufijos en el cdigo de barras, color del tapn, reconocimiento de imagen del tamao y forma del tubo, etc.), su origen (muestras centrifugadas en puestos remotos de extraccin o extradas in situ), prioridad (muestras urgentes, preferentes o no prioritarias) y cul ser su prximo destino (destaponado, centrifugacin, procesamiento directo, seroteca, etc.). Una vez identificados los requerimientos de los especmenes, deberan ser dirigidos a bandejas de clasificacin para: pretratamiento, puestos de trabajo o instrumento encargado del siguiente proceso. En los casos en que el destino sea un pretratamiento, una vez realizado ste, volver a analizar los nuevos requerimientos y los enviar a su nuevo destino.
3.3.4 Gestin de la identicacin de muestras en extracciones realizadas fuera del laboratorio

La opcin ideal sera que el sistema pudiera generar las etiquetas personalizadas y especficas de contenedor en cualquier punto de extraccin, de modo que se utilizara el mismo sistema que en el laboratorio. Si la infraestructura no lo permite, existen mltiples alternativas como las etiquetas preimpresas (no personalizadas) que indican el tipo de muestra o etiquetas preimpresas sin ninguna otra informacin, diferenciando el espcimen por indicadores indirectos (color del tapn o anillos de color). En todos los casos sera recomendable poder identificar el centro donde se realiz la extraccin.
3.4.3 Centrifugacin selectiva de especmenes

La centrifugacin suele ser una fase crtica dentro de la automatizacin preanaltica, ya que puede convertirse en un autntico cuello de botella para el sistema. Si se decide su inclusin dentro de la cadena de automatizacin, se deberan tener en cuenta las siguientes consideraciones: Prioridad de la muestra: Si incluye muestras urgentes habr que adaptar la puesta en marcha automtica de la centrfuga por tiempo mximo de espera o por la llegada de alguna muestra de alta prioridad. Si slo se incluyen muestras de prioridad normal, se pueden establecer sistemas de trabajo por lotes (completado de posiciones) o por definicin de tiempo de espera mximo. Condiciones de centrifugacin: El sistema debera poder identificar por la informacin del contenedor qu caractersticas de centrifugacin requiere (temperatura mxima, revoluciones y tiempo) y, en el caso de disponer de una nica centrfuga, ser capaz de adaptarla a los requerimiento especficos del lote de especmenes a tratar (4 C para PTH, 37 C para crioglobulinas, y condiciones de tiempo y RPM segn se trate de plasma para test de coagulacin, orinas o sueros). Es posible definir unos parmetros de centrifugacin que nos permitan centrifugar conjuntamente muestras para la obtencin de suero, plasma para coagulacin y orinas.
3.3.5 Etiquetado automtico de los contenedores primarios y secundarios

El sistema debera ser capaz de etiquetar automticamente los contenedores estndar (tubos primarios y secundarios para alcuotas) minimizando as los errores de pre o postetiquetado manual, quedando reservado ste a los contenedores no estndar (placas de cultivo, etc.).
3.4 Conguracin
El diseo en la automatizacin de la fase preanaltica depender del modelo general de automatizacin escogido (ver apdo. 2 Modelos de automatizacin) y cada laboratorio deber estudiar cul se adecua ms a sus necesidades (Reynolds 2002, Holman 2002): Si se opta por el laboratorio totalmente automatizado, la automatizacin ser en todas las fases (preanaltica, analtica y postanaltica). Si el modelo es el laboratorio automatizado modular, podremos distinguir dos configuraciones de automatizacin posibles de la fase preanaltica: el clasificador-alicuotador individualizado, sin conexin a ningn analizador, o varios mdulos (destaponado, centrfuga, etc.) unidos a uno o varios analizadores. Aunque la progresiva automatizacin de todos los especmenes mejoran la calidad y la eficiencia del laboratorio (Dadoun 2002), hay especmenes como gases en sangre, banco de sangre, etc., o muestras con condiciones crticas de oscuridad o temperatura, que pueden no ser fcilmente automatizados, si bien ya existen algunas iniciativas en la lnea de automatizar la carga de muestras para el estudio cido-base y gasometra.
3.4.4. Destaponado/retaponado del tubo primario
La mayora de los sistemas automticos poseen unidades de destaponado, pero no todos estn adaptados para cualquier tipo de tapn (rosca, goma, etc.). Esta caracterstica puede condicionar el tipo o tipos de tubo o contenedor a utilizar. El retaponado suele hacerse con tapones de plstico o taponado trmico con tapas metlicas.
3.4.1 Soportes (racks) para los diferentes especmenes

Existen en la actualidad una amplia variedad de soportes para los diferentes especmenes, aunque el soporte para cinco tubos o
3.4.5. Alicuotado
En el alicuotado automtico se valorar la utilizacin de pipeta desechable para cada muestra, la existencia de sensor de nivel del mdulo de alicuotado y la presencia de detector de cogulos.
Es importante valorar la modalidad de pipeteo, ya que es preferible, por optimizacin de tiempos, la aspiracin de gran volumen de muestra en la pipeta y posterior dispensacin en varias alcuotas (Holman 2002), que la aspiracin y dispensacin individual para cada alcuota. 3.4.5.1VOLUMEN DE LAS ALCUOTAS El sistema debe adaptar el volumen de cada alcuota a los requerimientos del destino y al nmero de pruebas a realizar en cada peticin. Se tendr en cuenta un volumen muerto (especfico del analizador), la suma de los volmenes requeridos para las determinaciones solicitadas y un volumen para repeticiones. En casos de muestras de escaso volumen el sistema debera consultar con el responsable la prioridad de preparacin de alcuotas. Esto que podra establecerse de manera genrica (por ej. marcadores tumorales en pacientes oncolgicos, hormonas en pacientes procedentes de consulta de endocrinologa), debera al menos confirmarse por el usuario o poder seleccionar individualmente las alcuotas prioritarias (serologa en muestra predilisis de un paciente oncolgico) 3.4.5.2 RETAPONADO DE ALCUOTAS Si es necesaria la preparacin de alcuotas, el sistema debera ser capaz de taparlas una vez generadas, ya sea por el propio alicuotador, o por un mdulo independiente de taponado. El retaponado suele hacerse con tapones de plstico o taponado trmico con tapas metlicas. 3.4.5.3 PrEPArACIN DE ALCUOTAS EN CONDICIONES PTIMAS
DE CONSErvACIN DE LA MUESTrA
3.5.2 Registro de tiempos preanalticos

Todo sistema preanaltico debera mantener un registro (Rynning 2007) de los tiempos en los que se realizan todas y cada una de las acciones sobre cada espcimen, comenzando por el momento de la extraccin / recogida de muestra, y finalizando en el momento de su llegada al analizador. Se registrarn todos los tiempos de manipulaciones intermedias (centrifugacin, destaponado, alicuotado y redireccionamiento a los diversos destinos).
4. FASE ANALTICA
Al igual que en cualquier otra fase, en la evaluacin de un sistema de automatizacin debemos plantearnos una reflexin previa acerca de las caractersticas de nuestra fase analtica actual para que la automatizacin se adecue a las caractersticas y posibilidades de nuestro laboratorio, y no el laboratorio a ella. Con este objetivo es til realizar un esquema del flujo de trabajo actual respecto a esta fase. Este esquema debe incluir: El tiempo de la jornada laboral que se dedica a la fase analtica diaria y semanalmente (por ejemplo habr que tener en cuenta turnos de tarde y turnos de fin de semana, si se diese el caso) Una valoracin de la carga de la fase analtica a lo largo de la jornada laboral: tenemos picos de trabajo o es continuo? Incremento del volumen de muestras o del panel de determinaciones que se espera a corto y medio plazo Mantenimiento de los analizadores: a qu hora y/o da se realizan, cunta inversin de tiempo supone, si se dispone de analizadores reflejos que permitan alternar los mantenimientos Frecuencia de las calibraciones y de los controles Tiempos de respuesta pactados: habr que tener en cuenta si el laboratorio recibe muestras para su anlisis en una sola tanda o si las va recibiendo en goteo y si realiza peticiones urgentes Problemas tcnicos frecuentes: filtros atascados, fallo de fotmetro, desajuste de agujas, etctera. Una vez hemos caracterizado el trabajo que realizamos rutinariamente en la fase analtica habr que plantearse cules son los puntos dbiles que hemos encontrado y cmo esperamos mejorarlos y, asimismo, qu cualidades y calidades deseamos preservar. Sera recomendable que, con este diseo de lo que tenemos actualmente y lo que queremos implementar, disesemos un guin de las caractersticas que debera cumplir un sistema automatizado en cuanto a la fase analtica. Puntos fundamentales a incluir en este plan ideal seran los siguientes:
El sistema debera ser capaz de procesar las alcuotas en condiciones adecuadas para evitar la concentracin (taponado inmediato), fotodegradacin (procesamiento tras paneles de metacrilato oscurecido), termodegradacin (los soportes de tubos primarios y alcuotas deberan estar refrigerados) y/o contaminacin del espcimen (puntas desechables). An as, las muestras con condiciones crticas de oscuridad o temperatura pueden no ser fcilmente automatizadas.
3.5 Trazabilidad
3.5.1 Comprobacin de entrada de tubos y otros recipientes al sistema preanaltico
El sistema debe confirmar de manera positiva la entrada de cada uno de los especmenes de la peticin al sistema. En funcin de las incidencias detectadas (falta de peticin, peticin con datos incompletos, peticin duplicada, falta de algn espcimen, sobra algn espcimen, especmenes duplicados, muestras cortas, presencia de cogulos o calidad inadecuada de la muestra) el sistema debera iniciar acciones automticas de correccin (ejemplo: rechazo de muestra duplicada o no solicitada), o avisar al operador para la toma de decisiones (ejemplo: recentrifugacin, reimpresin de etiquetas no legibles, etc.). El proceso de destaponamiento automatizado (en aquellos sistemas que lo posean), no debera realizarse antes del chequeo de llegada, para poder tomar acciones sobre las muestras con incidencias antes de haberlas destaponado. Ser posible la consulta en cualquier momento del estado de la peticin y cada uno de sus especmenes y alcuotas, dejando traza de todos y cada uno de los procesos realizados sobre ellos.
4.1 Versatilidad de la automatizacin en la fase analtica

Un sistema automatizado no debe suponer una limitacin en cuanto a incluir analizadores de diferentes casas comerciales, en la adaptacin del software propio del sistema de automatizacin a la gestin que nosotros queremos realizar del mismo o en la inversin de tiempo que supone el mantenimiento y chequeo del propio sistema.
4.1.1 Posibilidad de conectar los analizadores elegidos a una cadena

Existen dos formas diferentes de entrada de muestras a una cadena, ambas compatibles con la conexin de diferentes analizadores a la misma:
Si el tubo o la alcuota se introduce directamente en la cadena, se disminuye el tiempo de circulacin de las muestras, as como el tiempo de cola en cada analizador. Si existe un brazo robtico que introduce las muestras en la cadena, pueden sacarse las muestras de la cadena temporalmente. A la hora de valorar la opcin ms adecuada para un laboratorio concreto, se tendr en cuenta la existencia de especmenes potencialmente no transportables en cadena y el impacto que genera su entrada manual en cada una de las alternativas antes mencionadas.
4.1.7 Integracin de diferentes reas del laboratorio

Se debe tener en cuenta qu reas sera interesante integrar en la automatizacin, y la mejora que supone respecto a mantenerlas como reas independientes. A su vez, se tendr en cuenta cmo influye su integracin en la fluidez de la fase analtica de una muestra. Por ejemplo, aquellas reas que emplean el mismo tipo de muestra pueden considerarse integrables en un modelo de automatizacin comn con la ventaja de poder reducir el volumen de muestra que se necesitar extraer al paciente, as como el espacio necesario para el almacenamiento de las muestras una vez procesadas. La valoracin de estas y otras ventajas, no obstante, quedar supeditada a la garanta que ofrezca el sistema en lo que se refiere a ausencia de contaminaciones cruzadas y habr en todo caso que evaluar cmo afecta la integracin al tiempo de respuesta establecido como ptimo para cada rea. Habitualmente las reas se agrupan por metodologas (fotometra, turbidimetra, inmunoqumica,), aunque actualmente existen modulares que pueden integrar varias metodologas.
4.1.2 Tiempo necesario para empezar a emitir resultados desde el encendido del sistema (tiempo de respuesta)
Es conveniente establecer el tiempo que requiere el sistema para su puesta en funcionamiento, lo que significa estimar un tiempo mnimo y un tiempo mximo en funcin de la organizacin del trabajo. Para ello, hay que conocer el tiempo necesario para la realizacin de los mantenimientos programados (diario, semanal y mensual), as como para efectuar la carga de reactivos. Esto depender de las caractersticas de los equipos y del laboratorio, de modo que podr contemplarse la posibilidad de un modelo de laboratorio de 24 horas. En cualquier caso, la valoracin del tiempo de puesta en marcha quedar matizada en funcin de los requerimientos de parada del propio sistema (averas, mantenimientos programados y preventivos,).
4.1.8 Accesibilidad a las muestras durante la fase analtica

En un sistema totalmente automatizado, no sera necesario acceder a las muestras una vez introducidas en el proceso analtico, al menos hasta el fin de esta fase. Sin embargo, son mltiples las situaciones en las que es necesario recuperar una muestra, haya terminado o no su anlisis. Por ello, es importante conocer si nuestro sistema dispone de un mecanismo de recuperacin de muestras en esta fase, si registra esta recuperacin, y cmo afecta al proceso de anlisis una vez se reincorpora la muestra al sistema. En algunos casos la solucin pasa por que el sistema haga una alcuota y deje liberado el tubo primario. En este punto una cuestin a valorar es el sistema utilizado para la aspiracin de la muestra en cada analizador integrado. Existen sistemas en los que la muestra circulante es introducida en el analizador mediante un brazo robotizado, lo que supone un secuestro temporal de la muestra, aunque tiene la ventaja de reducir las colas de espera que se generan en aquellos sistemas que aspiran el volumen terico necesario cuando el tubo llega al analizador.
4.1.3 Posibilidad de carga de reactivos durante el funcionamiento del sistema

En funcin del volumen de muestras que procesemos quizs no sea suficiente con una carga de reactivos al comienzo de la jornada. Este puede ser un punto limitante, si para la carga de nuevos reactivos es necesario que el sistema se pare, por lo que habr que considerar cul es el tiempo mximo que se consumira en ese caso.
4.1.4 Capacidad de incorporar instrumentacin de diversa procedencia

Punto clave a tener en cuenta en el caso de aquellos laboratorios que elijan diferentes casas comerciales para la misma o para diferentes reas analticas del laboratorio, por el posible conflicto que podra crearse no slo en la instalacin del sistema automatizado, sino tambin en las conexiones informticas de los diferentes sistemas y en la transmisin bidireccional de la informacin entre cada analizador y el sistema informtico. Habr que considerar si se desea una integracin total de los sistemas mediante conexin a un mismo proceso automatizado, o bien, una integracin parcial.
4.1.9 Manejo de diferentes tipos de contenedores y/o muestras

Un requisito importante de un sistema de automatizacin es la posibilidad de gestionar conjuntamente diferentes tipos de muestras y/o especmenes, as como distintos tipos de contenedores. Es necesario valorar la solucin que el sistema ofrece para las muestras especiales, ya sea por su escaso volumen o por otras causas (peditricas, lquidos biolgicos, orinas, ). Es interesante, asimismo, conocer si el sistema de automatizacin permitir reducir el nmero y/o el volumen de muestras o especmenes requeridos. En el caso de laboratorios en los que es frecuente el manejo de volmenes escasos (hospitales peditricos, unidades de quemados, etc.) hay que considerar si el sistema de automatizacin puede gestionar este tipo de muestras conjuntamente con el resto de las muestras o si necesitarn una gestin especfica: pasarlas a otro tipo de contenedor, etiquetado especial, etc. Adems, sera deseable disponer de un sistema de aviso respecto a la integridad de las mismas.
4.1.5 Capacidad de incorporar nuevas tcnicas con la misma instrumentacin

Se valorar la disponibilidad de canales abiertos, para incorporar tcnicas de otras casas comerciales. Para ello, ser importante conocer el panel de pruebas, por tanto las pruebas problemticas y las que no es posible realizar.
4.1.6 Capacidad de ampliacin y facilidad de renovacin

Se deber prever el posible aumento de la carga de trabajo, y por tanto, la posibilidad de aadir otros analizadores u otros mdulos a los ya disponibles. Ser necesario plantear la posibilidad de compaginar distintas versiones de analizadores.
4.1.10 Taponado/destaponado de tubos

Lo ideal sera trabajar con tubos tapados para una mejor conservacin de la muestra. Si no es posible, se tendr en cuenta si se trabaja
con el tubo primario o con alcuotas. En el primer caso se valorar que el sistema pueda destapar tubos que hayan sido centrifugados previamente por el sistema o externamente. En cada caso habr que conocer la estabilidad de las muestras, las condiciones de almacenamiento de las mismas durante el proceso analtico y la facilidad de su localizacin (organizacin manual, informatizada o robotizada). Otro punto es la necesidad de retapar los tubos una vez procesados y en este caso habr que tener de nuevo en cuenta si se trata de contenedores primarios o alcuotas.
4.1.11 Posibilidad de asumir un aumento en el panel de pruebas y/o en el nmero de peticiones

La versatilidad del sistema de automatizacin debe verse tambin reflejada en la posibilidad de aumentar el nmero de determinaciones a realizar ya que es raro el laboratorio que no aumenta su oferta a medio plazo. Es adems importante tener en cuenta que si se ajustan mucho las prestaciones del sistema al volumen de muestras en un momento dado, una variacin del mismo puede significar que el sistema no lo asuma eficazmente.
que gestionar distintos tipos de urgencias: de UCI, hospitalizados, FIV, etctera. Si se integra la urgencia habr que conocer cmo se gestionan estas muestras y cmo afecta esto al tiempo de respuesta tanto de las muestras urgentes como de las no urgentes. Puede gestionarse previamente desde la fase preanaltica, disponiendo de estas muestras en racks o bandejas especficas y tener una zona reservada para su carga. En este caso habr que valorar la posible prdida de eficacia en la carga de muestras. Otro tipo de gestin sera informatizada mediante la comunicacin con el SIL, en cuyo caso habr que tener en cuenta si todas las muestras que se cargan en nuestro sistema se registran previamente de modo adecuado en el SIL.
4.2.4. Priorizacin de la entrada de muestras para prevenir contaminaciones

En caso de integrar diferentes reas del laboratorio en el sistema de automatizacin, puede ser necesario definir rutas diferentes de entrada de los tubos a los analizadores en funcin de las peticiones. Se podrn utilizar alcuotas diferentes para cada analizador o bien, puntas desechables. Si no se van a realizar alcuotas en todo el proceso, la mejor solucin ser utilizar puntas desechables; pero si esta previsto realizar alcuotas, se considerar una para muestras potencialmente contaminantes.
4.2 Gestin de prioridades

Los requerimientos en la gestin de prioridades sern ms o menos estrictos, dependiendo si se trata de un laboratorio que slo trabaja la rutina, o si integra la urgencia (24 horas de trabajo continuado). Esta gestin tambin ser diferente si la secuencia de recepcin de muestras es un goteo continuo o picos de recepcin a determinadas horas. Adems, si se integran diferentes reas de laboratorio, es muy importante conocer si el sistema est totalmente libre de posibles contaminaciones, en cuyo caso no ser necesaria la priorizacin de determinadas muestras (ej: serologa), as como establecer qu pruebas se desea informar con un tiempo de respuesta mnimo.
4.2.5 Ecacia en cuanto a gestin de pruebas reejas, diluciones y/o comprobaciones

Durante la fase analtica ser necesario realizar nuevas determinaciones de una muestra en proceso o ya analizada, para realizar pruebas reflejas, diluciones, repeticiones o comprobaciones. Para ello, ser preciso conocer la capacidad que tiene de mantener un volumen predefinido de reserva en el analizador o el tiempo mximo estimado que debe permanecer una muestra en la zona de descarga antes de ser retirada del sistema. Algunos analizadores disponen de un sistema de rerun automtico cuando la muestra todava est en el equipo; aunque tambin hay sistemas informticos que gestionan la recuperacin de las muestras una vez han salido del analizador.
4.2.1 Priorizacin de muestras segn procedencia

Es importante priorizar las muestras en funcin de su procedencia, o incluso del diagnstico del paciente. Por tanto el sistema de automatizacin tendr que ser capaz de gestionar prioridades en base a las necesidades y podr hacerlo con diferentes sistemas que tendremos que valorar segn los requerimientos: gestin preanaltica totalmente automatizada (mediante racks predefinidos como prioritarios o mediante etiquetas de color) o por gestin del software analtico (comunicacin directa con el SIL). Si estn integradas en el mismo laboratorio la rutina y la urgencia, se valorar el utilizar distintos equipos, o equipos con rotor para las muestras prioritarias.
4.3 Control de la integridad de las muestras

Si se persigue una verdadera automatizacin total de la fase analtica, sta debe incluir un mecanismo de valoracin de la integridad de la muestra que incorpore: Deteccin de fibrina Deteccin y cuantificacin (ndices numricos) de interferencias por hemlisis, lipemia e ictericia Deteccin del nivel de muestra Volumen muerto requerido Y todo ello debe estar informatizado de manera que se disponga de estos datos durante la validacin de resultados.
4.2.2 Priorizacin de determinaciones si el volumen de la muestras es insuciente

En primer lugar, ser necesario conocer el volumen requerido para la realizacin de cada prueba, y sera valioso un sistema que permita reconocer ese volumen mnimo de modo que, en caso de resultar insuficiente, la muestra sea gestionada con base en un algoritmo preestablecido segn servicios de procedencia y diagnsticos, que priorice la realizacin de determinadas pruebas.
4.2.3 Inuencia de la integracin de la urgencia en los tiempos de respuesta

Primero se debe definir el tiempo de respuesta deseado para las urgencias, ya que no es lo mismo una muestra urgente con un tiempo de respuesta (emisin de resultados) mximo de una hora que de tres horas. Es ms, puede darse el caso de que el laboratorio tenga
4.4 Gestin de muestras especiales una vez dentro del proceso analtico
Es importante conocer qu ocurre con los tubos con mltiples rutas, tubos duplicados (no ser necesario procesarlos) y tubos sin identificar.
4.5 Gestin de los mdulos del sistema automatizado

4.5.1 Reactivos
Es importante para la versatilidad del sistema de automatizacin la posibilidad de cargar reactivos sin necesidad de parar el sistema. Aunque en general esta capacidad est ligada y depende de los analizadores y no de los sistemas de automatizacin, para valorar el impacto de gasto de recursos que supone la carga de reactivos, habr que tener en cuenta: Si requieren reconstitucin previa (liofilizados) o estn listos para el uso Las necesidades de conservacin (humedad, temperatura) en el compartimento de reactivos antes de utilizarlos y una vez abiertos La capacidad de almacenaje que tiene el analizador Caducidades de los reactivos (una vez reconstituidos y/o una vez abiertos). En un sistema automatizado se debe tener informacin en tiempo real de los reactivos disponibles en cada uno de los analizadores que estn integrados y esta informacin incluir: caducidad, nmero de lote, fecha de calibracin, controles, volumen disponible en los analizadores de modo individual y en conjunto, etctera.
comentarios a determinadas pruebas para muestras hemolizadas, lipmicas o ictricas. Registro por fechas, de todos los mantenimientos, incidencias y averas. Registro por fechas, de lotes y caducidades de controles y calibradores. Capacidad de almacenar, por fechas, resultados de pacientes, controles y calibraciones. El resultado de una prueba puede contener errores importantes debidos a problemas en cualquiera de los elementos que intervienen en la realizacin de la misma (muestras, materiales, reactivos, calibradores, instrumentos, personal, etc.). El personal tcnico normalmente dispone de un procedimiento que le indica las comprobaciones o acciones que debe realizar (repeticiones, diluciones, calibraciones, cambios de reactivos, avisos, etc.) en funcin de determinados criterios basados normalmente en valores o rangos de resultados, de alarmas de los equipos o de resultados del control de calidad. Esto es lo que se suele denominar validacin tcnica para distinguirla de la validacin facultativa. Los sistemas analticos automatizados deben de tener la capacidad de realizar estos procesos de una forma rpida y eficaz, facilitando toda la informacin necesaria para una correcta realizacin de la validacin tcnica. Tras la validacin tcnica de los resultados el autoanalizador debe de permitir visualizarlos de forma clara, si es necesario como en el caso de controles y calibradores en forma de grficos (de evolucin por ejemplo) y ofrecer la posibilidad de imprimirlos en papel cuantas veces sean necesarias. Resultados anmalos Se deben establecer lmites de alarma en el instrumento que obligan a una accin inmediata de comprobacin o de aviso al facultativo responsable. Los tcnicos encargados de la validacin tcnica deben conocer los lmites de alarma y la actuacin consecuente. El autoanalizador debe ser capaz de realizar de forma automtica algunas acciones (repeticiones, generacin de nuevas pruebas, anulacin de pruebas) tras la orden emitida por el sistema informtico del laboratorio.
4.5.2 Velocidad de procesamiento

De todo lo expuesto hasta ahora se deduce que habr un parmetro que englobar todas las especificaciones mencionadas, que es la velocidad de procesamiento. Se deber conocer el nmero de determinaciones a la hora en condiciones de rutina, as como el tiempo necesario para obtener un resultado urgente, teniendo en cuenta una situacin de carga mxima del sistema. En la velocidad de procesamiento influir qu constituyentes han sido solicitados. Ser necesario adaptar o modificar las prioridades de anlisis segn la carga de trabajo en un determinado analizador para evitar cuellos de botella, para lo que ser importante conocer la capacidad de entrada de muestras en los distintos equipos.
4.6 Acceso a la informacin generada sobre la muestra a tiempo real y validacin tcnica de resultados
Una vez que la muestra est dentro del sistema de automatizacin es muy importante, para la trazabilidad de la misma y de los resultados que se obtengan, la posibilidad de gestionar los datos generados por la muestra durante el anlisis a tiempo real y que exista un sistema intuitivo, sencillo y global que indique el estado de la muestra en cada momento. Con esta informacin se nos debe facilitar la posibilidad de realizar una validacin tcnica de resultados, ya sea manual o informatizada mediante algoritmos, y disponer de un sistema de avisos para aquellos resultados no normales o no esperados. Se deben considerar los siguientes aspectos: Posibilidad de crear, modificar o anular datos de una muestra durante el anlisis. Acceso a los resultados en tiempo real, y conocer la hora exacta a la que han sido generados. Posibilidad de generar textos predeterminados segn algorit mos adaptados a perfiles de resultados concretos. Por ejemplo,
4.7 Control de la calibracin y controles de calidad

En cuanto a la calidad del anlisis es fundamental la gestin de las calibraciones y de los controles de calidad. Por tanto, habr que tener en cuenta: Si la calibracin es automtica con frecuencia preestablecida o manual a demanda El tiempo requerido para la calibracin: preparacin de material, anlisis de los calibradores, exportacin y valoracin de datos, controles de calidad programados, etc. La posibilidad de visualizar la curva de calibracin final y las acumuladas. La edicin de unidades de calibracin Programacin de los controles de calidad segn algoritmos disponibles (cada cierto tiempo, cada determinado nmero de muestras,), valores de referencia, alarmas, criterios para su aceptacin (basados en diagnstico, grficas Levey-Jennings, coeficiente de variacin biolgico intraindividual,). Control de la absorbancia de los blancos de reaccin.
Por otra parte, dado que en estos sistemas automatizados pueden utilizarse varios analizadores que realicen las mismas determinaciones y una muestra puede tener que ser analizada en varios aparatos, resulta muy importante asegurar la trazabilidad entre las calibraciones y las determinaciones realizadas en cada muestra. En el sistema deber quedar registrado cules son los calibradores y controles con los que aseguramos la trazabilidad de las determinaciones que realizamos a cada muestra.
4.8 Recursos humanos necesarios para la gestin y mantenimiento del sistema de automatizacin en la fase analtica
La automatizacin de la fase analtica suele conllevar una reorganizacin de recursos humanos definiendo nuevas tareas y responsabilidades. As, hay que tener en cuenta:
Los autoanalizadores deben llevar incorporado un sistema que permita la dilucin automtica postanlisis con posibilidad de diversas diluciones para la repeticin de las muestras, cuando sea necesaria. Capacidad de repeticin de parmetros de modo automtico tras la orden emitida durante el proceso de validacin. Los tubos finalizados son almacenados automtica o manualmente, o destruidos. Los tubos con pruebas pendientes vuelven a la fase preanaltica, mediante: Sistema manual Sistema automatizado/robotizado
5.2 Archivo de muestras

Una vez terminado su procesamiento, las muestras son almacenadas por periodos de tiempo variables con el fin de realizar comprobaciones y ofrecer al clnico la posibilidad de solicitar nuevas pruebas a la vista de los resultados. Otras veces las muestras se guardan con fines cientficos o legales. Debido a que en los grandes laboratorios se manejan miles de muestras diariamente, resulta muy til que sea el SIL el que gestione los archivos de muestras. La gestin de los archivos de muestras implica la creacin y el mantenimiento de un nmero variable de almacenes en los que cada muestra ocupa un lugar fijo asignado de forma manual o automtica y controlado por el sistema informtico. Existen funciones de bsqueda de muestras o grupos de muestras con determinados criterios. En algunos casos existen instrumentos automticos de archivo de muestras, que son controlados por el sistema informtico. Caractersticas de calidad. En todos los laboratorios deben existir: 1. Archivo temporal de muestras/especmenes. 2. Archivo indefinido de muestras/especmenes. El tiempo y las condiciones del archivo de muestras deben adaptarse al reflejado para cada una de las magnitudes analticas en la cartera de servicios. En cuanto a la temperatura de conservacin, ser importante establecer si las muestras tienen que ser mantenidas refrigeradas (4 C) o congeladas (-20 C, o 80 C) en funcin de los parmetros a analizar. Indicacin de caducidad o das de conservacin
Temperatura ambiente: Todas las muestras que se vayan a analizar inmediatamente o sangre total para obtener suero o plasma Refrigeracin (4 6 C): Suero, plasma y muestras para anlisis bacteriolgico que no se vayan a analizar antes de 4 horas Congelacin a -20 C: Suero o plasma que se vaya a almacenar a largo plazo En ocasiones se precisa la utilizacin de conservantes
4.8.1 Personas necesarias para el funcionamiento del sistema y cualicacin necesaria

Ser necesario conocer los horarios de todo el personal, la organizacin vara segn sea personal fijo o a turnos.
4.8.2 Formacin de personal

Con todo nuevo sistema es necesario un periodo de familiarizacin que puede ser muy variable en el tiempo y que si no se valora adecuadamente puede generar en el personal dedicado al sistema de automatizacin desconfianza y desasosiego. Debera haber una formacin inicial para la puesta en marcha del sistema, y una continua para la actualizacin.
4.8.3 Mantenimientos del sistema

Existen dos tipos de mantenimientos a realizar en el sistema: los que realizar el servicio tcnico de la casa comercial del sistema de automatizacin y/o de los analizadores y los mantenimientos que realizarn los tcnicos del laboratorio. Estos deben quedar claramente establecidos y se tendrn en cuenta para la gestin del sistema.
4.8.4 Servicio tcnico especializado para la resolucin de incidencias

Al igual que cada analizador tendr establecido un servicio tcnico de apoyo para la resolucin de incidencias, el sistema de automatizacin debe tener su propio servicio (on-line y/o presencial) para solventar cualquier problema o fallo que pueda surgir en el mismo y deber quedar claramente establecido el horario y las personas responsables de la cobertura de este servicio. Se valorar: La disponibilidad de servicio tcnico 24 horas o va on line. Asistencia cercana e inmediata. Existencia de soporte de aplicaciones, diagnstico y resolucin de incidencias a tiempo real. Servicio de formacin a cargo de la casa comercial encargada del sistema de automatizacin o de los analizadores aislados.
5. FASE POSTANALTICA
5.1 Recuperacin de muestras ya procesadas
El sistema automtico debe ofrecer la posibilidad de cargar muestras a posteriori, evitando interrupciones en la rutina y asegurando una rpida disponibilidad de los resultados.
5.3 Capacidad de almacenamiento

El almacenamiento refrigerado de muestras con recuperacin automtica puede mejorar el flujo de trabajo, especialmente para aquellas muestras que necesitan ampliar algn parmetro.
Slo dos fabricantes ofrecen esta posibilidad en la actualidad, pero hay otros muchos trabajando en ello. Es importante determinar qu muestras es necesario almacenar (tubo primario o alcuota), cunto tiempo empleamos en la recuperacin automtica de la muestra, y los mecanismos para corregir un funcionamiento defectuoso. La dimensin del laboratorio, el volumen de pruebas y el nmero de ampliaciones son importantes para determinar el coste-beneficio de este tipo de almacenamiento. El almacenamiento de la muestra primaria y de las posibles alcuotas generadas en el laboratorio, debe hacerse de acuerdo con una poltica aprobada.
5.3.1 Sistema de taponado

En aquellos sistemas que no requieran el destapado de los tubos o alcuotas para su procesamiento, o bien sean capaces de retaponarlos a posteriori, se garantizar mejor la integridad de los constituyentes durante el almacenamiento de las muestras.
5.4 Trazabilidad de las muestras

El sistema debe permitir localizar en todo momento una muestra concreta. En el caso de muestras ya procesadas que pueden ser requeridas para un reanlisis, ampliacin de pruebas solicitadas, etc, ser el propio sistema informtico el que facilitar esta tarea.
5.5 Conexin de los autoanalizadores con el sistema de informacin del laboratorio

Cuando se utilizan equipos informticos o equipo de anlisis automatizado para la toma, procesado, registro, informe de laboratorio, almacenamiento o recuperacin de los datos de anlisis, el laboratorio se debe asegurar de que: a) el software informtico, incluyendo el que est incorporado en el equipo, se documenta y valida de forma adecuada para su utilizacin en la instalacin; b) se establecen e implementan procedimientos para proteger la integridad de los datos en todo momento; c) los equipos informticos y el equipo automatizado se mantienen para asegurar su funcionamiento apropiado y se proporcionan las condiciones ambientales y de funcionamiento necesarias para mantener la integridad de los datos; d) los programas y rutinas informticos estn adecuadamente protegidos para impedir el acceso, alteracin o destruccin por personal ocasional o personas no autorizadas. El equipo, incluyendo el hardware, el software, los materiales de referencia, los reactivos y otros materiales fungibles, y los sistemas analticos se deben proteger contra desajustes o alteraciones que puedan invalidar los resultados de los anlisis. Es fundamental minimizar el riesgo de problemas o errores a la hora de transmitir los resultados desde el autonalizador al sistema informtico del laboratorio. Dicha conexin puede efectuarse de tres modos diferentes: Directamente a los puertos de los terminales del laboratorio Centralizadas en un servidor de terminales usando cableado estructurado Mediante un sistema de concentracin de informacin (middleware) que se conecta, por un lado, con el SIL y, por otro, con los distintos analizadores integrados en el sistema de automatizacin.
En un modelo de laboratorio altamente automatizado, un fallo del sistema de informacin de la cadena puede provocar una importante incidencia en cada una de las etapas anteriormente descritas. Por tanto, ser interesante que el dilogo entre los mdulos analticos y el sistema informtico sea lo ms eficaz posible, alertando enseguida de cualquier fallo en las conexiones. Slo as se podr garantizar que una incidencia informtica no desencadene retrasos innecesarios en la emisin de los resultados. Ser necesario establecer cules son los equipos crticos del sistema, y evaluar su capacidad de trabajo en modo manual, as como establecer las pautas a seguir en caso de que sea preciso recuperar resultados ya obtenidos para realizar un volcado de datos al sistema informtico del laboratorio, una vez se haya restablecido su correcto funcionamiento. Por otra parte, los sistemas analticos deben tener una extensa capacidad de almacenamiento de datos de resultados de pacientes, calibraciones y controles de calidad. Si el operador puede transferir todos esos datos directamente a un CD-ROM u otro dispositivo de almacenamiento, como un disco duro externo, para facilitar su archivo y almacenamiento, las prestaciones del autoanalizador aumentan considerablemente. Tambin se valorar la capacidad del sistema de exportar los datos (tanto resultados de pacientes como de control de calidad) de una forma accesible para su posterior manejo en una base de datos externa o un programa estadstico. Por ltimo, el sistema debe asegurar la integridad de los resultados una vez terminado el proceso analtico, registrando cualquier modificacin realizada a posteriori e identificando en todo momento al usuario que la realiza mediante contraseas personalizadas. El software ha de estar validado considerando las normas de calidad y proteccin de datos vigentes.
6. CONCLUSIONES
En los ltimos aos los avances en la informtica, y por tanto, en la automatizacin han dado un vuelco a la idea tradicional que se tena de laboratorio clnico. Los hospitales cada vez invierten ms en realizar una gestin que les permita reducir costes, por ello un correcto planteamiento inicial a la hora de programar un nuevo laboratorio puede ser fundamental para obtener beneficios a largo plazo. La fase preanaltica automatizada poco a poco va implantndose, pues se minimizan los errores que muy frecuentemente se cometen en esta etapa. La fase analtica aunque actualmente es la ms automatizada, podra mejorarse estudiando las distintas posibilidades existentes en el mercado, as como nuestra situacin actual y el tipo de laboratorio que nos gustara o nos sera posible tener. La fase postanaltica, quizs es la peor resuelta, pero ya existen muchas opciones en el mercado que habra que estudiar Por tanto, los sistemas de automatizacin global, en un futuro cercano sern indispensables en cualquier laboratorio clnico, pues adems de las muchas ventajas que aportan, nos permiten obtener la informacin necesaria para la certificacin y acreditacin.
7. BIBLIOGRAFA
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Anexo. Listado de aspectos a tener en cuenta al comparar modelos de automatizacin con vistas a la seleccin del ms adecuado a las necesidades del laboratorio
Etapa preanaltica Identificacin de pacientes Identificacin de especmenes Sistema de numeracin de especmenes Identificacin de tipo de muestra Cdigos de barras que soporta el sistema Posibilidad de impresin de etiquetas (para contenedores, personalizadas, para alcuotas) Identificacin de especmenes cuya extraccin es externa al laboratorio Etiquetado automtico de los contenedores primarios Clasificacin y pretratamiento de especmenes Trazabilidad Fabricante X*
Etapa analtica Posibilidad de integrar el sistema en una cadena Equipos disponibles y metodologas empleadas Panel de pruebas Posibilidad de canales abiertos Posibilidad ampliar: - pruebas - equipos Pruebas problemticas Pruebas imposibles Reactivos: informacin de caducidades y lotes preparacin y conservacin presentaciones disponibles frecuencia de calibracin Mantenimiento: - tiempo necesario - manual/automtico ndice hemlisis, lipemia e ictericia Deteccin fibrina Deteccin volumen Resolucin muestras especiales: contaminantes lquidos biolgicos orinas Posibilidad de: dilucin repeticin y comprobacin pruebas reflejas Tiempo de obtencin resultados: rutina urgencia Posibilidad de intercalar las urgencias
Fabricante X*
Calibradores: preparacin estabilidad informacin de lotes y caducidades frecuencia y programacin Controles: preparacin estabilidad informacin de lotes y caducidades frecuencia y programacin Almacenaje de resultados de pacientes, controles y calibraciones Posibilidad de intervencin manual en el sistema Servicio tcnico Servicio de aplicaciones Software Trazabilidad
Fabricante X* Etapa postanaltica Recuperacin de muestras ya procesadas Capacidad de almacenamiento de muestras Condiciones de refrigeracin Retaponado de tubos Trazabilidad Dilogo con el SIL Autonoma y capacidad de volcado de datos Tipo de conexiones Capacidad de almacenamiento de datos Versatilidad del soporte informtico para la exportacin de datos * El nmero de fabricantes consultados debera ser al menos 3 (establecer una columna para cada fabricante).

Sociedad Espaola de Bioqumica Clnica y Patologa Molecular Comit Cientfico Comisin de Magnitudes Biolgicas relacionadas con la Urgencia Mdica Documento H. Fase 3. Versin 5 Preparado por: X. Navarro Segarra, J. L. Marn Soria, A. Buo Soto, R. Daz Garca, A. Galn Ortega, P. Guevara Ramrez, E. Guilln Campuzano, M. Muoz Prez, P. Oliver Sez, N. del Ro Barcenilla.
NDICE
1. Introduccin 2. Objeto y campo de aplicacin 3. Consideraciones preanalticas y fuentes de error
3.1. Contenedores 3.2. Anticoagulantes 3.2.1. Tipo 3.2.2. Proporcin 3.2.3. Errores atribuibles al anticoagulante 3.3. Muestra: obtencin y tipos 3.3.1. Sangre venosa 3.3.2. Sangre arterial 3.3.3. Sangre capilar arterializada 3.3.4. Errores durante el procedimiento de obtencin 3.4. Manejo y conservacin de la muestra 3.4.1. Errores derivados de la conservacin y transporte 4. Recomendaciones 5. Bibliografa
Por otro lado, las variaciones de la ventilacin pulmonar y del proceso de la respiracin determinan variaciones en la presin parcial de los gases sanguneos (pO2 y pCO2) que llevan implcitos cambios en el equilibrio cido-base. Existen diversos procesos nosolgicos cuyo manejo puede beneficiarse de la medicin del pH, pO2 y pCO2. En general, esta prctica est justificada cuando se desea evaluar la capacidad de oxigenacin del paciente, el buen funcionamiento de los procesos de ventilacin pulmonar y respiracin (intercambio de gases), el equilibrio cido-base y controlar la oxigenoterapia. Dado que la medicin de estas magnitudes puede estar asociada a procesos patolgicos que pueden comprometer de manera importante la vida del paciente y que en funcin de este resultado pueden iniciarse maniobras diagnsticas o teraputicas invasivas para l, la calidad del resultado entregado es especialmente importante y por ello conviene conocer las causas potenciales de un resultado inexacto.

Este documento establece recomendaciones para una correcta obtencin, conservacin, transporte y preparacin de las muestras de sangre destinadas a la medicin del pH, la pO2 y la pCO2. De igual modo, se revisan las posibles fuentes de variabilidad o error originadas en la fase preanaltica que pueden afectar al resultado del anlisis. No es objeto de este documento la revisin profunda de la tcnica de extraccin para los diferentes tipos de muestra.
1. INTRODUCCIN
Un aspecto crtico de la fisiologa humana es la capacidad del organismo para preservar la homeostasis o equilibrio fisiolgico. La importancia de la homeostasis de la concentracin de hidrogeniones (H+) radica, entre otros procesos fundamentales para la vida, en su implicacin directa o indirecta en mltiples reacciones celulares, en la conformacin de las protenas y en el intercambio de iones a travs de las membranas celulares. Tanto una excesiva alcalinidad como una excesiva acidez son incompatibles con la vida por lo que el pH debe mantenerse en un estrecho margen (6,8 a 7,8), an ms estrecho cuando se trata de los valores considerados fisiolgicos (7,35 a 7,45). No es fcil medir la concentracin de hidrogeniones en los tejidos, pero los cambios que tienen lugar en stos pueden interpretarse a travs de las variaciones de pH que se producen en la sangre. El pH del medio interno se mantiene estable gracias a los tampones o sistemas amortiguadores que existen en dicho medio, el ms importante de todos ellos es el sistema formado por el cido carbnico y el bicarbonato, ya que mediante la modificacin de la ventilacin pulmonar o de la reabsorcin tubular renal pueden modificarse la pCO2 y la concentracin de bicarbonato respectivamente.
3. CONSIDERACIONES PREANALTICAS Y FUENTES DE ERROR

Los resultados de los anlisis de gases sanguneos son susceptibles de sufrir diversos tipos de errores preanalticos debido a una praxis incorrecta en su obtencin y manipulacin antes de su procesamiento o en su preparacin en el mismo laboratorio. La responsabilidad de reducir la incidencia de errores preanalticos recae fundamentalmente en el laboratorio, que debe suministrar procedimientos escritos detallando los requisitos de la muestra y su manipulacin. Los procedimientos deben ser reunidos en un manual que debe estar disponible para el personal del laboratorio y en todas las reas de recogida de muestras (enfermera, quirfano, etc.). Estos procedimientos deben incluir apartados sobre la verificacin y preparacin del paciente, la identificacin y transporte de la muestra y sobre los factores
preanalticos que la afectan de modo directo, como por ejemplo una anticoagulacin inadecuada, la posible dilucin por la heparina, la puncin venosa en lugar de arterial, un lavado deficiente de la va del catter, contaminacin con aire o la conservacin incorrecta.
3.2.2. Proporcin
El volumen de heparina utilizado debe ser alrededor del 5% del volumen total de la muestra y nunca superior al 10%. Se ha demostrado que 200 L de heparina sdica o de litio (1.000 UI/ mL) evitan la coagulacin de 5 mL de sangre (alcanzando una concentracin final de 40 UI/mL) sin afectar la medicin de pH, pO2, pCO2 (18-21). En el caso del uso de jeringas convencionales donde la heparinizacin deba realizarla el usuario, puede ser recomendable lavar la jeringa con un chorro de heparina sdica o de litio (1.000 IU/mL) y vaciarla luego (lo que deja aproximadamente un volumen residual de 0,1 mL en una jeringa estndar de 2 mL). Esto permite la anticoagulacin adecuada de una muestra de 2 a 4 mL de sangre y asegura que el anticoagulante no sea aadido en exceso pudiendo alterar el resultado (4, 7).
3.1. Contenedores
Se han evaluado y recomendado muchos tipos de recipientes. Uno de los primeros fue la jeringa de vidrio, que probablemente debe considerarse un recipiente de referencia con el que comparar la exactitud de otro tipo de recipientes (jeringas de plstico regulares, jeringas de plstico especializadas y los tubos capilares). El vidrio es un material inerte e impermeable a los gases, lo que convertira a las jeringas de vidrio en el dispositivo ptimo para la obtencin de la muestra si no fuera por sus diversas desventajas. Entre stas destacan la necesidad de esterilizarlas adecuadamente si van a reutilizarse, la posibilidad de rotura y un coste inicial relativamente alto. Los dispositivos usados mayoritariamente son las jeringas estndar de plstico (polipropileno) de 1 a 5 mL y las jeringas de plstico diseadas especficamente para contener una muestra destinada a la medicin de gases en sangre. Todas ellas eliminan la necesidad de esterilizar el dispositivo, son ms baratas y relativamente irrompibles. Su principal desventaja tcnica es el intercambio de gases a travs del plstico (pues se trata de un material permeable) que puede representar un problema importante segn el tipo de plstico, las presiones parciales de los gases del espcimen, la temperatura y el tiempo de conservacin. Cuanto mayor es la diferencia existente entre la pO2 y pCO2 de la sangre y la del aire ambiental, mayor es la posibilidad de intercambio entre ambos medios (1,2). Las jeringas de plstico diseadas especialmente para el anlisis de gases incorporan ventajas tcnicas como el mbolo elevable, que se desplaza debido a la presin arterial y la heparinizacin previa del dispositivo, muchas veces con heparina cristalina que minimiza los errores por dilucin pudindose obtener muestras de pequeo volmen de de manera fcil. Otro tipo de recipiente aceptable para recoger y transportar la muestra son los tubos capilares especiales de vidrio heparinizados, siempre que se sellen convenientemente. Sin embargo, la variable proporcin de sangre capilar que pueden contener, adems de la dificultad que ofrecen para una ptima homogeneizacin (3), pueden conducir a errores de difcil estimacin.
3.2.3. Errores atribuibles al anticoagulante

El efecto interferente del anticoagulante sobre la muestra de sangre puede producirse por quelacin o por dilucin si se usa un preparado lquido aadido en exceso en jeringas corrientes no heparinizadas. Los fenmenos de interferencia son particularmente probables cuando el volumen de muestra es muy bajo respecto al de anticoagulante, situacin frecuente en la realizacin de gasometras por diversos motivos. La interferencia por dilucin debida al exceso de heparina produce una disminucin de la pCO2 en la muestra al equilibrarse los gases de la muestra con los de un lquido con una composicin similar al aire ambiental (este efecto se puede observar con diluciones superiores al 10%). La concentracin de bicarbonato y exceso de base (parmetros calculados a partir de la pCO2) tambin se vern afectados. El pH es muy resistente a este efecto de dilucin (incluso con diluciones del 50%) y la pO2 puede incrementarse si la dilucin es alta (35-50%) (18-21). Otra fuente de error preanaltico es la deficiente dosificacin de heparina (en jeringas no heparinizadas por el fabricante). Como efecto, se producir la coagulacin de la muestra que dejar de ser homognea y, por tanto, adecuada para su fin. La presencia de cogulos dar lugar a mediciones inexactas por el paso de microcogulos al sistema analtico que interfirieren el contacto del electrodo con la muestra. Por otro lado, los microcogulos pueden inutilizar el sistema, demorando la atencin urgente de otros pacientes. La interferencia por quelacin producir una disminucin de la concentracin del in calcio si los centros de enlace de la heparina no estn convenientemente saturados o tamponados con este in (heparinas equilibradas con electrolitos) (2,11). El incremento de la presin osmtica del plasma al aadir una sustancia seca que no atraviesa las membranas (como la heparina), produce una disminucin del agua intraeritrocitaria con la posible disminucin del VCM y aumento de la CHCM (12).
3.2. Anticoagulantes
3.2.1. Tipo
La medicin de pH, pO2 y pCO2 debe efectuarse en sangre homogeneizada tratada con heparina (sdica o de litio) liofilizada o lquida, a una concentracin de 1.000 UI/mL, al ser ste el anticoagulante de eleccin. Los oxalatos, citratos y el EDTA no son aceptables para estos fines. La heparina de mayor concentracin (5.000 10.000 UI/mL) no debera usarse ya que puede alterar el pH (dado su carcter cido) y el calcio inico (por su efecto quelante) (4). El pH de la heparina sdica estar aproximadamente entre 6 y 8 (5). En el caso de la heparina lquida la pCO2 y la pO2 suelen tener valores cercanos al aire ambiente (pCO2=7,5 mm Hg y pO2=160 mm Hg). Las jeringas que contienen heparina liofilizada (congelada y desecada) presentan notables ventajas: a) ahorro de tiempo, ya que no es necesario humidificar previamente el cuerpo de la jeringa con heparina lquida y b) no se plantean problemas de dilucin por el exceso de anticoagulante.
3.3 Muestra: obtencin y tipos

Deben seguirse todas aquellas recomendaciones dirigidas a la prctica segura de los diferentes tipos de puncin, as como aquellas maniobras dirigidas a impedir daos colaterales sobre el paciente. En el proceso de recogida de la muestra, debe prestarse especial atencin a los procedimientos bsicos de identificacin del paciente, identificacin de la procedencia del espcimen (arterial, venosa o capilar) y, por supuesto, el seguimiento de una correcta tcnica extractora (1,3,4,8). Debe explicarse correctamente al paciente el fin de la prueba, la no necesidad de restringir la ingestin de alimentos o lquidos y,
durante la extraccin, la posibilidad de aparicin de dolor pulstil en el caso de la puncin arterial, as como la necesidad de respirar normalmente (1,3,8). El paciente debe estar en un estado de equilibrio ventilatorio antes y durante la extraccin para asegurar que la muestra es representativa del estado del paciente. Debe evitarse, por tanto, la ansiedad y el dolor. El paciente que respira espontneamente debe mantenerse en reposo durante 15 min. y en caso de respiracin asistida u oxigenoterapia no deben introducirse cambios al menos 30 minutos antes de la extraccin. Debe escogerse el decbito supino que asegura una correcta y homognea ventilacin pulmonar.
3.3.1 Sangre venosa

Las muestras de sangre venosa se recomiendan para valorar el estado del equilibrio cido-base del paciente y no son vlidas para conocer el estado de oxigenacin del mismo (9). En algunos casos se utilizan, de forma adicional a la muestra arterial, muestras venosas mixtas extradas a partir de un catter de Swan-Ganz (arteria pulmonar) para evaluar la pO2, saturacin de O2, la diferencia arterio-venosa de la concentracin de O2 en sangre venosa mixta, la funcin pulmonar (shunt) y el consumo de oxgeno.
3.3.2. Sangre arterial

La sangre arterial resulta el espcimen preferido para el estudio de los gases sanguneos y equilibrio cido-base. Las arterias son conductos en los que, en esencia, no se produce intercambio gaseoso y por lo tanto una muestra arterial tiene el mismo pH, pCO2 y pO2 que la sangre del ventrculo del que procede. As pues, refleja de forma precisa la fisiologa cido-bsica y el estado de oxigenacin del organismo, derivado de la fisiologa pulmonar. La extraccin puede realizarse bien por puncin directa de la arteria o a partir de un catter arterial. El lugar preferido para la puncin suele ser la arteria radial. Para asegurarse de la existencia de un correcto flujo colateral por la arteria cubital se utiliza la maniobra de Allen modificada (1) que, con un procedimiento simple, permite evaluar la existencia de dicho flujo. Otros lugares de puncin, cuando la arteria radial no es adecuada, son la humeral, la peda y la femoral como ltima opcin.
lactato) (2,4,9). Es preferible, por lo tanto, la extraccin de muestras capilares y arteriales para obtener resultados sistmicos del equilibrio cido-base y de las presiones parciales de los gases en sangre. Si se usan catteres permanentes o cnulas para la toma de muestras, debe ponerse especial atencin en que el fluido o las soluciones de lavado se eliminen completamente del sistema. La contaminacin de la muestra con lquido procedente de una perfusin determinar la disminucin de los valores de la pCO2 y la obtencin de valores de pO2 cercanos a los 150 mm Hg al equilibrarse los gases de la muestra con los del lquido en perfusin, cuyas presiones son cercanas al aire ambiental (10). La sangre debe recogerse en condiciones anaerobias para impedir el intercambio de gases con el aire circundante y debe sellarse el contenedor para asegurar el mantenimiento de la anaerobiosis. En ningn caso la muestra debe quedar sellada por una aguja sino por un tapn o mecanismo diseado especficamente para sellar la muestra, mantener la anaerobiosis y evitar cualquier riesgo biolgico potencial. Puesto que el aire ambiente contiene una pCO2 prcticamente nula y una pO2 de alrededor de 150 mm Hg, la presencia de aire en la muestra tender a reducir la pCO2 (produciendo un aumento en el pH) y a aumentar o disminuir la pO2 equilibrando la muestra con el aire ambiente (10). Por lo tanto, sea cual sea el origen de la muestra, deber impedirse la formacin de burbujas que representan una fuente de error en la medicin de los gases sanguneos al alterar las presiones parciales de stos en la muestra. Este efecto es mayor cuanto mayor es la superficie de contacto aire/sangre (burbujas pequeas y mltiples) y se manifiesta sobre todo en la pO2 (11). Cuando se toman muestras capilares arterializadas, la primera gota se debe eliminar pues sta es rica en fluido extracelular y puede ser una causa de mediciones errneas al alterar la concentracin de ciertos electrolitos como el potasio o producir interferencias por dilucin. Adems, debe dejarse fluir la sangre siguiente en un capilar heparinizado sin exprimir, pues de hacerlo se produce un vertido de productos a partir del componente intra y extracelular que pueden alterar el valor de diversas magnitudes.
3.4. Manejo y conservacin de la muestra

Idealmente, la muestra destinada a la medicin de pH, pO2, pCO2 debe procesarse inmediatamente tras su extraccin. Cuando esto no es posible, deben contemplarse las siguientes recomendaciones generales, destinadas a paliar las desviaciones en los resultados debidas al proceso de conservacin (6,13): Las muestras en jeringas de plstico destinadas a la medicin de pH y gases en sangre deben medirse dentro de los 30 minutos tras su extraccin. La conservacin de la jeringa de plstico en aguahielo producir cambios en las presiones parciales de los gases sanguneos (sobre todo en la pO2), debido a un aumento del gradiente entre la muestra y el aire exterior al producirse una disminucin relativa del O2 en la muestra debido al enfriamiento (aumenta la solubilidad del O2 y aumenta la afinidad de la hemoglobina por el O2). Por lo tanto, si el anlisis se puede realizar en un plazo de 30 minutos es mejor la conservacin a temperatura ambiente. Si no puede garantizarse la medicin en los 30 minutos siguientes a la obtencin de la muestra, sta debe recogerse en recipiente de cristal y almacenarse en aguahielo (0-4 C) hasta su anlisis. Los resultados son estables durante al menos una hora. La sangre que se obtiene para el estudio del gradiente alveoloarterial o de shunt debe analizarse dentro de los cinco minutos que suceden a su extraccin independientemente de la temperatura de conservacin.
3.3.3. Sangre capilar arterializada

La sangre capilar, cuidadosamente recogida, puede manejarse de manera muy semejante a la sangre arterial contando, adems, con la ventaja de requerir slo pequeas cantidades de sta para la determinacin. El uso de sangre capilar para la medicin de gases y del equilibrio cido base puede ser necesario cuando la puncin arterial es muy difcil o est contraindicada (recin nacidos, personas obesas, quemados, pacientes en sncope, etc.). La muestra deber ser sangre capilar arterializada, para ello debe conseguirse una vasodilatacin local por masaje y calentamiento del lecho capilar con agua a una temperatura # 42 C durante 10 a 15 minutos (3,4).
3.3.4. Errores durante el procedimiento de obtencin

Una mala praxis en la obtencin de la muestra de sangre venosa puede hacer que esa muestra slo refleje el equilibrio cido-base de una extremidad y no del organismo en su totalidad. En el caso de obtencin de una muestra de origen venoso, al ser una extraccin destinada a la medicin del equilibrio cido-base, debe tenerse especial precaucin con el uso del torniquete. La oclusin producida debe minimizarse, de lo contrario la anoxia hstica producir alteraciones en las magnitudes medidas (acidemia, incremento del
Debera utilizarse la jeringa de vidrio conservada en agua-hielo cuando el paciente presente leucocitosis o trombocitosis, ya que para ralentizar el consumo de oxgeno por estas clulas, debe enfriarse la muestra con los condicionantes explicados en el primer punto. De no existir la posibilidad de jeringa de vidrio puede usarse la de plstico analizando la muestra inmediatamente. Para la medicin de la pO2, pCO2 y del equilibrio cido-base, es necesario que las muestras sean homogeneizadas cuidadosamente antes de las mediciones para evitar la sedimentacin. La homogeneizacin debe ser ms intensa cuando la muestra se ha sometido a enfriamiento. Las muestras en capilares de vidrio debern volver a mezclarse moviendo la barrita de metal desde un extremo a otro del tubo durante unos 10 segundos. Las jeringas de vidrio o plstico debern invertirse 10 veces y luego agitarse mediante giros sobre los dos ejes del recipiente de la muestra durante 60 segundos. Durante el mezclado no debera formarse ninguna burbuja o espacio muerto (4). Para detectar y evitar la presencia de cogulos deben despreciarse de 100 a 200 L de la jeringa. La existencia de cogulos puede dar lugar a mediciones inexactas al interferir sobre el electrodo directamente. Adems, al despreciar estas primeras gotas se purga la sangre en la jeringa evitando la introduccin de burbujas de aire en el instrumento.
1) Contenedor Se recomienda el uso de jeringas de plstico especficamente diseadas para gasometras tratadas con heparina seca equilibrada con electrolitos. 2) Anticoagulante Se recomienda heparina seca equilibrada con electrolitos con el fin de evitar errores por dilucin. La dosificacin de heparina deber prevenir la coagulacin y evitar efectos de dilucin, por ello cuando se use heparina lquida la dosis ser de 40 L de heparina sdica o de litio (1.000 UI/mL) por cada mililitro de sangre (alcanzando una concentracin final de 40 UI/mL). 3) Muestra La muestra debe representar el estado de ventilacin del paciente, por lo tanto el paciente que respira espontneamente debe hallarse estable y no deben introducirse cambios en la media hora que precede a la extraccin en el que est sometido a ventilacin asistida o en tratamiento con oxigenoterapia. La sangre arterial es el espcimen preferido para el estudio de los gases sanguneos. Las muestras de sangre venosa slo se recomiendan para valorar el estado del equilibrio cido-base del paciente y no son vlidas para conocer el estado de oxigenacin. La sangre capilar arterializada es vlida para la valoracin del equilibrio cido-base y presiones parciales de los gases y puede utilizarse cuando la extraccin arterial es difcil o est contraindicada. 4) Estado de la muestra: burbujas y cogulos La muestra debe conservarse en anaerobiosis, para ello deben extraerse las burbujas que se hayan generado durante la extraccin y sellar convenientemente el contenedor. Se recomienda rechazar la muestra ante la presencia de burbujas o cogulos visibles. 5) Conservacin: tiempo y temperatura Contenedores de plstico: deben analizarse lo antes posible. La demora en el anlisis no debe exceder los 30 minutos tras la extraccin, conservndose a temperatura ambiente. Cuando se esperan pO2 elevadas o en estudios especiales (gradiente alveolo-arterial o shunt) deben analizarse antes de cinco minutos. Contenedores de vidrio: deben analizarse antes de 30 minutos tras la extraccin. Si no fuera posible, se conservarn a 0-4 C en agua-hielo no ms de una hora. Cuando se esperan pO2 elevadas o en estudios especiales (gradiente alveolo-arterial o shunt) deben analizarse antes de cinco minutos. 6) Preparacin de la muestra: homogeneizacin y purga de la jeringa La alcuota de la muestra que se transferir al analizador debe ser homognea y representativa de la muestra. Para ello debe homogeneizarse adecuadamente la muestra y despreciar las primeras gotas para asegurar la ausencia de cogulos y eliminar cualquier burbuja residual.
3.4.1. Errores derivados de la conservacin y transporte

Las muestras obtenidas para la medicin de la presin parcial de gases en la sangre y equilibrio cido-base pueden afectarse durante la conservacin y transporte debido a los siguientes procesos (2,11,13): a) Metabolismo de las clulas de la sangre: la gliclisis, principalmente en los eritrocitos, ocasiona la formacin de lactato y cambios en el pH, bicarbonato y exceso de base hacia el intervalo de la acidosis metablica. El consumo de oxgeno por los leucocitos (0,1 mL de oxgeno de 100 mL de sangre en 10 min. a temperatura corporal) y plaquetas disminuye la pO2 y aumenta la pCO2. La cada en pO2 se acelera si en la muestra original la pO2 estaba elevada. Los procesos metablicos pueden reducirse enfriando la muestra (10). b) Intercambio de gases: Como se ha mencionado, los materiales plsticos no son absolutamente impermeables a los gases, mientras que los capilares y jeringas de vidrio permanecen sin alteraciones en los gases durante al menos una hora si se conservan en hieloagua. En las jeringas de plstico, se producen cambios despus de pocos minutos de obtenida la muestra en la pO2 (incrementos mayoritariamente). Se ha podido demostrar que la entrada de O2 a la jeringa de plstico es mayor cuando se refrigera la muestra que cuando permanece a temperatura ambiente. Este fenmeno no afecta a las jeringas o capilares de cristal (2,13,14,15). c) Sedimentacin celular: se ha demostrado variabilidad de la medida en las magnitudes pH, pO2 y pCO2 cuando se compara la fraccin rica en clulas con la fraccin rica en plasma. Este fraccionamiento es fruto de la sedimentacin de la muestra durante el transporte o espera en el propio laboratorio, por lo que es fundamental la homogeneizacin de la muestra previamente al anlisis (11).
5. BIBLIOGRAFA
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4. RECOMENDACIONES
Se resumen los principales factores a tener en cuenta en el anlisis de las muestras destinadas a la medicin del equilibrio cido-base y gases en sangre.
5. Approved IFCC recommendations on whole blood sampling, transport, and storage for simultaneous determination of pH, blood gases, and electrolytes. Burnett RW, Covington AK, Fogh-Andersen N, Klpmann WR, Maas AHJ, Mller-Plathe O, Siggaard-Andersen O, van Kessel AL, Wimberley PD, Zijlstra WG. Eur J Clin Chem Clin Biochem 1995; 33: 247 53 6. NCCLS. Blood gas pre-analytical considerations: specimen collection, calibration and controls. C27-A. 1993 7. Qumica clnica, tcnicas de laboratorio-fisiopatologa-mtodos de anlisis; teora, anlisis y correlacin. Kaplan L.A., Pesce A.J. Buenos Aires, Argentina. Edit. Mdica Panamericana; 1988 8. Recommendations for collection of skin puncture blood from children, with special reference to production of reference values. Alstrm T, Dahl M, Grsbeck R, Hagenfeldt L, Hertz H, Hjelm M, Jrvenp AL, Kantero R, Larsson A, Leskinen EE. Scand J Clin Lab Invest 1987; 47: 199-205 9. NCCLS. Procedures for the collection of diagnostic blood specimens by venipuncture; approved standard. H3-A5. 5th Ed. 2003 10. Clinical application of blood gases. Shapiro, B.A.; Harrison, R.A.; Walton, J.R. 2 ed. Year Book Medical Publisher, Chicago, 1977 11. Clark CG, Rayfield JM, Clague AE, Preanalytical errors in simultaneous blood gas, electrolyte and metabolite analysis. Blood Gas News 1998; 7: 125 12. Obtencin de muestras sanguneas de calidad analtica. Mejora continua de la etapa preanaltica. Luis Morn Villatoro. Edit. Panamericana, 2001
13. Effects of syringe material, sample storage time and temperature on blood gases and oxygen saturation in arterialised human blood samples. Knowles TP, Mullin RA, Hunter JA, Douce FH. Respiratory care. 2006; 51: 732-6 14. Changes in oxygen measurements when whole blood is stored in iced plastic or glass syringes. Mahoney JJ, Harvey JA, Wong RJ, Van Kessel AL. Clin Chem 1991; 37: 1244-8 15. Stability of pO2, pCO2 and pH in heparinized whole blood samples: influence of storage temperature with regard to leukocyte count and syringe material. Schmidt C, Mller-Plathe O. Eur J Clin Chem Clin Biochem 1992; 30:767-73 16. www.radiometer.es. Diciembre 2007 17. www.deep-picture.com/Preanalytical. Diciembre 2007 18. Sampling and storing of blood for determination of acid-base status. Siggaard-Andersen O. Scand J Clin & Lab Invest. 1961; 13: 196-204 19. Hamilton RD, Crockett RJ, Alpers JH. Arterial blood-gas analysis: potential errors due to the addition of heparin. Anaesth Intensive care. 1978; 6: 251-5 20. Dake MD, Peters J, Teague R. The effect of heparin dilution on arterial blood-gas analysis. Western J Med. 1984; 140: 792-3 21. Hutchison AS, Ralston SH, Dryburgh FJ, Small M, Fogelman I. Too much heparin: possible source of error in blood-gas analysis. BMJ. 1983; 287: 1131-2

Sociedad Espaola de Bioqumica Clnica y Patologa Molecular Comit Cientfico Comisin de Seminologa y Tcnicas de Reproduccin Asistida Documento C. Fase 3. Versin 4 Preparado por: I. Snchez, C. Mar, JA. Castilla, M. Marcos, I. Martn, A. Galn, MI. Jimnez, JM. Moreno, MG. Serrano, I. Garca-Cobaleda, C. Aulesa, V. Lozano, C Snchez, J de Montserrat
NDICE
1. Introduccin 2. Objeto y campo de aplicacin 3. Bases fisiolgicas de la capacitacin del espermatozoide 4. Objetivo de las tcnicas de preparacin de semen 5. Preparacin del semen 5.1. Materiales y medios necesarios: 5.2. Mtodos de preparacin del semen: 5.2.1. Migracin 5.2.2. Gradientes de densidad 5.3. Muestra 5.3.1. Semen fresco 5.3.2. Semen congelado 5.4. Resultados 6. Recomendaciones 7. Conclusiones 8. Bibliografa
El campo de aplicacin de esta tcnica es: 1. Diagnstico, en el estudio bsico de la pareja estril. 2. Tratamiento, preparacin del semen para la tcnica de repro duccin asistida de eleccin. 3. Seleccin de espermatozoides para pruebas funcionales.
3. BASES FISIOLGICAS DE LA CAPACITACIN DE LOS ESPERMATOZOIDES

Los espermatozoides de todos los mamferos placentarios son incapaces de fecundar el ovocito directamente desde el eyaculado, y deben experimentar un proceso en el que se producen cambios moleculares denominados capacitacin. Los espermatozoides adquieren la capacidad de fecundar el ovocito despus de haber permanecido durante un tiempo en el tracto genital femenino. Actualmente no se conocen todos los sucesos implicados en el complejo proceso de la capacitacin. Se diferencian las siguientes etapas (5,6): 1. Fluidificacin de la membrana celular debido a modificaciones de la estructura lipdica. 2. Flujo de Ca++ hacia la cabeza y flagelo del espermatozoide. 3. Generacin de cantidades controladas de especies reactivas de oxgeno 4. Fosforilacin de protenas en los residuos de serina, treonina y tirosina. La modificacin de los esteroles de la membrana plasmtica del espermatozoide se inicia tras la retirada del plasma seminal (7). Sustancias captadoras como la albmina localizadas en el moco cervical actuaran facilitando los cambios en el componente lipdico de la membrana del espermatozoide (8). En condiciones in vivo los espermatozoides mviles se separan del resto del eyaculado por migracin activa a travs del moco cervical. La capacitacin de los espermatozoides se puede conseguir in vitro, si son sometidos durante el tiempo necesario, a unas condiciones de cultivo que faciliten y aporten los cambios y las seales de transduccin de forma semejante a las condiciones in vivo (8). La capacitacin es un fenmeno reversible necesario para la induccin del movimiento hiperactivo, la capacidad de interactuar con la zona pelcida, la reaccin acrosmica y el inicio de la fusin con el ovocito (5).
1. INTRODUCCIN
La preparacin de los espermatozoides es un requisito previo para la realizacin de cualquier tcnica de reproduccin asistida, incluyendo la inseminacin artificial. Persigue dos objetivos: 1. Eliminar el plasma seminal que contiene sustancias inhibidoras de la capacitacin, prostaglandinas, agentes infecciosos y protenas antignicas. 2. Separar los espermatozoides mviles de los inmviles, de los leucocitos, de las clulas germinales inmaduras y de otras clulas redondas. La finalidad de este proceso es seleccionar los espermatozoides mviles morfolgicamente normales y mejorar la calidad de los mismos, porque disminuye la liberacin de linfoquinas y reduce la formacin de radicales libres (1). El resultado de la preparacin, junto con otros factores dependientes de la mujer, determinar la tcnica de reproduccin asistida a aplicar en cada caso (2). El adecuado procesamiento de la muestra va a influir en la capacidad fecundante del espermatozoide, tanto in vivo como in vitro y ser fundamental para el xito de la reproduccin asistida (3,4).

Los laboratorios clnicos, en respuesta a la creciente necesidad, deben ofrecer en su cartera de servicios tcnicas de preparacin de semen para reproduccin asistida. El objeto de este documento es establecer unas recomendaciones para la realizacin de las tcnicas de recuperacin de espermatozoides mviles.
4. OBJETIVOS DE LAS TCNICAS DE PREPARACIN DE SEMEN

El plasma seminal puede contener agentes infecciosos que deben eliminarse antes de cualquier tcnica de reproduccin asistida, ya que
son susceptibles de provocar infecciones en la mujer y contaminar los cultivos de ovocitos y embriones (9). El contacto durante un tiempo prolongado de los espermatozoides con el plasma seminal produce un efecto adverso, puede impedir de forma permanente la fecundacin. As la separacin de los espermatozoides del plasma seminal debe realizarse lo ms rpido y eficazmente posible (3,10). Por lo tanto los objetivos de las tcnicas de preparacin de semen sern: 1. Separar los espermatozoides del plasma seminal que contiene sustancias decapacitantes, prostaglandinas y linfoquinas. 2. Retirar los espermatozoides muertos, leucocitos, clulas redondas y agentes infecciosos. 3. Aportar un medio de cultivo que contenga molculas captadoras de esteroles (albmina) y una composicin inica que apoye la homeostasis del espermatozoide y facilite las seales de transduccin (calcio, bicarbonato) (8).
Los mtodos que utilizan solo lavado, deberan abandonarse y emplear tcnicas ms seguras de preparacin de espermatozoides (4). Para los mtodos de migracin el movimiento del espermatozoide es un requisito esencial. En los mtodos de adherencia-filtracin, es necesaria la combinacin de la movilidad de los espermatozoides con la adherencia a las matrices de filtracin (lana de vidrio, sefadex) (11). Los gradientes de densidad separan los espermatozoides en funcin de su punto isopcnico. Los mtodos avanzados se desarrollan para investigacin. De todos los mtodos, los que realmente tienen utilidad clnica son los de migracin y gradientes de densidad, el resto no se exponen en el documento.
5.2.1 Migracin
Se basan en la capacidad de movimiento de los espermatozoides, de migrar desde el semen al medio cultivo. Dentro de esta categora existen dos formas principales Swim Up directo y Swim Up convencional. 5.2.1.1 SWIM UP DIRECTO El semen licuado se deposita debajo o sobre un medio de cultivo y los espermatozoides con buena movilidad se dirigen al medio de cultivo de forma semejante al proceso in vivo a travs del moco cervical. El proceso consta de varias fases: 1. Colocar aproximadamente 250 L de semen licuado en el fondo de un tubo no cnico (para aumentar la superficie de contacto). Utilizar tantos tubos como sea necesario para mejorar la recuperacin de los espermatozoides. 2. Depositar sobre el semen 500 L de medio de cultivo resbalando por las paredes del tubo, con cuidado de que no se mezcle con el semen. 3. Dejar en un incubador a 37C formando un ngulo de 45, para aumentar la interfase, durante un tiempo entre 30-60 minutos dependiendo de la calidad del semen. No ms tiempo para evitar la contaminacin con plasma seminal (10) 4. Pasado este tiempo aspirar aproximadamente 300 L de medio de cultivo, con cuidado de no aspirar semen (para lo cual durante todo el proceso se debe mantener el ngulo del tubo). Si hay ms de un tubo de una misma muestra se unifica todo el aspirado en un nico tubo. 5. Si el volumen obtenido es mayor de 500 L, valorar el grado de movilidad y la concentracin de los espermatozoides. Centrifugar y llevar a un volumen final de 300-500 L para inseminar. 5.2.1.2 SWIM UP CONVENCIONAL Se basa en el mismo principio pero requiere un primer paso de lavado 1. Aadir medio de lavado en una proporcin v/v, homogeneizar. 2. Centrifugar durante 10 minutos a 500 g. Se recomienda una centrfuga de cabezal fijo para que el botn celular tenga una amplia superficie de contacto con el medio de cultivo. 3. Retirar el sobrenadante con cuidado de no aspirar el botn celular. 4. Aadir resbalando lentamente por las paredes del tubo 500 L de medio de lavado. Continuar el proceso desde el punto 3 del mtodo anterior. El inconveniente de estos mtodos es que los espermatozoides inmaduros y el resto de las clulas permanecen en contacto durante todo el proceso con los espermatozoides maduros y pueden producir efectos adversos sobre estos. Adems muchos de los espermatozoides mviles pueden quedar atrapados en el fondo del sedimento y no alcanzar nunca el medio de cultivo (4). La ventaja respecto del mtodo anterior es que disminuye la contaminacin con el plasma seminal (10).
5. PREPARACIN DEL SEMEN

5.1 Materiales y medios necesarios
Todos los materiales empleados as como los medios de cultivo deben ser estriles y manejarse en condiciones de asepsia, en campana de flujo laminar. Los medios de cultivo han de atemperarse antes de su uso y tener la certificacin CE. Los medios de cultivo deben tener una osmolalidad entre 280-300 mOsm/kg. El pH debe mantenerse en un rango entre 7.2-7.4, para ello es necesario utilizar medios tamponados. Los tampones ms utilizados son: HEPES, fosfato o bicarbonato. Los medios tamponados con bicarbonato necesitan una atmsfera rica en CO2 y una temperatura de 37C para que se mantenga el equilibrio inico, por lo que tienen que usarse en estufa con temperatura y CO2 controlados. Adems los medios deben tener una concentracin de calcio, bicarbonato y protenas especfica para que los espermatozoides adquieran la capacidad de fecundar. Los medios para la preparacin de semen son de dos tipos: 1. Medios para preparacin de gradientes. Los ms usados contienen una suspensin coloidal de partculas de slice unidas de forma covalente a molculas de silano y se preparan en solucin isotnica. 2. Medios de lavado y cultivo. Se recomienda utilizar medios que no requieran CO2, porque la mayor parte del proceso se realiza en atmsfera aire. Los medios especficos para semen suelen estar tamponados con HEPES y pueden usarse en atmsfera area. Contienen protenas, mayoritariamente albmina que acta como captadora y transportadora de molculas, as como la concentracin de sales necesaria para la homeostasis del espermatozoide y en la mayora de los casos gentamicina como agente bacteriosttico.
5.2 Mtodos de preparacin del semen

Los mtodos incluyen desde la simple dilucin y centrifugacin hasta tcnicas ms complicadas. 1. Dilucin y lavado del semen 2. Migracin 3. Gradientes de densidad 4. Adherencia-Filtracin 5. Mtodos avanzados: anticuerpos monoclonales, tecnologa de microesferas (anexina V magnetic-activated cell sorting), electroforesis, cido hialurnico, dextrano
Para mejorar la tasa de recuperacin de espermatozoides mviles se puede fraccionar la muestra en varios tubos, procesarlos siguiendo el protocolo y unificar el aspirado de cada tubo en un nico tubo. Se debe valorar y si es necesario, se centrifugar y resuspender en un volumen entre 300-500 L de medio de cultivo para inseminar.
5.2.2 Gradientes de densidad

Los gradientes de densidad disgregan las partculas en funcin de su densidad de flotacin. Los diferentes componentes se separan hasta alcanzar una posicin en la que su densidad sea igual a la de su entorno (situacin de flotabilidad neutra), donde ya no se desplaza ms. Los espermatozoides maduros son clulas compactadas y alcanzan el gradiente de mayor densidad (el fondo del tubo). El plasma seminal permanece flotando sobre el gradiente de menor densidad y las clulas, los espermatozoides inmaduros y muertos se sitan en la interfase entre los dos gradientes. Los gradientes de densidad utilizados actualmente parten de una suspensin coloidal de partculas de slice unidas de forma covalente a molculas de silano, se utilizan de forma discontinua en soluciones isotnicas a una concentracin del 80 y del 40% y pueden adquirirse ya preparadas. Se recomienda utilizar volmenes de 0,5-1 mL de cada gradiente de concentracin. Se preparan los tubos que sean necesarios por muestra teniendo en cuenta que no se debe depositar ms de 1,5 mL de semen por tubo. 1. Dispensar 0,5 mL del gradiente de 40% en un tubo cnico, a continuacin con una jeringa de 1 mL conectada a una aguja larga de carga, depositar 0,5 mL del gradiente de 80% en el fondo del tubo (cono), muy despacio para que el gradiente de 40% suba y queden bien definidas las dos capas. 2. Decantar el semen licuado, resbalando por las paredes de los tubos, con cuidado de no romper la interfase. El semen debe quedar encima del gradiente de 40%. 3. Centrifugar a 300 g durante 20 minutos. 4. Aspirar las distintas capas con una pipeta pasteur en la zona del menisco para evitar alterar las interfases y las posibles contaminaciones, hasta alcanzar claramente el gradiente de 80%, donde se encuentra el sedimento con los espermatozoides maduros. Repetir el proceso con todos los tubos de la misma muestra. 5. Cambiar de pipeta, al aspirar el/los sedimentos. Transferir a un nico tubo nuevo (para evitar contaminaciones) con 1-2 mL de medio de lavado, homogeneizar y centrifugar a 500 g durante 10 min. 6. Retirar todo el sobrenadante, con cuidado de no aspirar el botn celular. 7. Resuspender en 300-500 L de medio de cultivo.
Semen criopreservado antes de iniciar terapias que pueden comprometer la capacidad reproductora del paciente, cuando exista dificultad para conseguir coordinar el momento de la inseminacin con la recogida del semen, parejas serodiscordantes, etc. Semen de donante. En determinadas circunstancias como son oligozoospermias severas, ausencia de espermatozoides en testculo, enfermedades hereditarias en las que el varn es el portador y mujeres sin pareja masculina. La muestra de semen criopreservada contiene un agente crioprotector que debe ser retirado antes de utilizarla para cualquier tcnica de reproduccin asistida. La forma habitual para descongelar el semen es dejar las pajuelas de seguridad biolgica a temperatura ambiente durante 10 minutos. 1. Decantar el contenido de las pajuelas en un tubo estril. 2. Diluir (aproximadamente a 1/5) en medio de lavado. La dilucin debe ser un proceso lento para evitar el choque osmtico (14). Se aaden lentamente, homogeneizando, durante al menos 10 minutos (gota a gota) 4,5 mL de medio de lavado, para que se produzca el equilibrio osmtico sin dao para el espermatozoide. 3. Procesar igual que el semen fresco, preferiblemente por gradientes de densidad. Una vez descongelado el semen y antes de procesarlo debe valorarse la concentracin y el grado de movilidad de los espermatozoides.
5.4 Resultados
Una vez terminada la tcnica hay que calcular el porcentaje de espermatozoides con movilidad progresiva y realizar el recuento de los mismos siguiendo las directrices de la ESHRE (13). Los resultados se obtienen multiplicando el tanto por ciento de espermatozoides con movilidad progresiva, por los millones de espermatozoides recuperados y por el volumen final. Se expresar como millones de espermatozoides recuperados con movilidad progresiva. Si el semen se va a utilizar para inseminacin artificial se informar como millones inseminados y se calcularn multiplicando por el volumen inseminado. En caso de utilizar parte del volumen eyaculado, los resultados deben expresarse en funcin del volumen utilizado, y multiplicarse por el factor de correccin. La relacin del total de espermatozoides presentes en el eyaculado con el nmero de espermatozoides mviles recuperados, se expresa como porcentaje de recuperacin (4) y se calcula con la siguiente formula:
Porcentaje de recuperacin = [(VF x CF x REM)/(VU x CI x IEM) ]x 100 VF= volumen final CF= concentracin final de espermatozoides REM= tasa de espermatozoides con movilidad progresiva recuperados VU= volumen semen utilizado CI= concentracin inicial de espermatozoides IEM=tasa de espermatozoides con movilidad progresiva en el eyaculado
5.3 Muestra
5.3.1 Semen fresco
La muestra de semen debe recogerse siguiendo las recomendaciones de la fase preanaltica previamente publicadas (12). Pasados 30 minutos de la eyaculacin separar una alcuota de semen para su valoracin siguiendo las recomendaciones de la ESHRE (13).
5.3.2 Semen congelado

En aquellas situaciones en las que no se puede emplear semen fresco se puede recurrir a semen congelado. Existen dos tipos de muestras de semen criopreservadas:
6. RECOMENDACIONES
Para el correcto desarrollo de este proceso se debe tener en cuenta las siguientes recomendaciones:
Utilizar siempre material estril. Deben utilizarse pipetas Pasteur en lugar de agujas para aspirar espermatozoides. La preparacin del semen debe comenzar no ms tarde de 30 minutos de la eyaculacin, ya que la capacidad de fecundar el ovocito puede verse afectada. Aspirar siempre las diferentes fases en la zona del menisco para no alterarlas. No mezclar plasma seminal con los espermatozoides recuperados, puede impedir la capacitacin. Si el semen preparado va ser utilizado para inseminacin artificial, deber usarse lo antes posible. Diluir muy lentamente el semen descongelado. Centrifugar siempre a los g recomendados. Clculo de los g de una centrifuga: g= 0.0000112 x r x N2 g= fuerza centrifuga en el fondo del tubo r= radio de la centrifuga en cm N= revoluciones /minuto
espermtica en el estudio de infertilidad, capaces de predecir el embarazo con alta especificidad y valor predictivo positivo en parejas con subfertilidad masculina (reaccin acrosmica, unin a la zona pelcida HZA) (1,19,21).
8. BIBLIOGRAFIA
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7. CONCLUSIONES
El papel de los parmetros seminales como factor pronstico en la fertilidad masculina est actualmente sometido a debate (2,15,16). Se ha propuesto el test de recuperacin de espermatozoides mviles (REM) en el estudio de la pareja estril como prueba para distinguir que parejas se beneficiarn de la inseminacin artificial y cuales no, porque incluye la concentracin, la movilidad as como los efectos del procesamiento de los espermatozoides (17,18). Es difcil establecer un nmero mnimo de espermatozoides recuperados para realizar inseminaciones intratero y obtener una tasa de gestacin adecuada. Los niveles umbral en los distintos trabajos oscilan desde 0.8 a 5 millones. No se ha podido identificar un umbral ptimo de REM que permita aconsejar a las parejas. Se requieren estudios adicionales para evaluar la capacidad predictiva del REM en los estudios de fertilidad (19). Algunos autores proponen que cada centro establezca su punto de corte en funcin de datos clnicos y de laboratorio de cada centro (17,18). Una revisin Cochrane sobre las diferentes tcnicas de preparacin de semen concluye (20): 1. En cuanto a resultados clnicos (tasa de embarazo/tasa de recin nacidos vivos). No hay evidencia cientfica suficiente para recomendar una tcnica de preparacin de semen, al considerar resultados de los ensayos cuasialeatorios, la tcnica de gradientes de densidad puede parecer mejor, pero necesita confirmarse con ensayos clnicos aleatorios. 2. Respecto a los parmetros seminales tras la preparacin de semen. La tcnica de gradientes parece mejor en cuanto a concentracin de espermatozoides y a tasa de recuperacin de espermatozoides mviles, mientras que la tcnica de swim up recupera los espermatozoides con mejor movilidad, y en cuanto a la morfologa no se encontraron preferencias. En trminos generales la tcnica de gradientes puede parecer superior, aunque debe confirmarse con ensayos clnicos de calidad Debido a que no existe una conclusin definitiva para definir que caracterstica del semen puede predecir la capacidad de fecundar, algunos autores proponen el uso de pruebas adicionales de funcin

Sociedad Espaola de Bioqumica Clnica y Patologa Molecular Comit Cientfico Comisin de Metrologa Documento H. Fase 3. Versin 2 Preparado por: F.J. Gella Toms, F. Canalias Reverter, S. Izquierdo lvarez, V. Martnez Vzquez, M. Snchez Manrique
NDICE
0. Introduccin 1. Objeto y campo de aplicacin 2. Normas para consulta 3. Definiciones 4. Fuentes de incertidumbre 4.1 Definicin del mensurando 4.2 Imprecisin 4.3 Valor asignado al calibrador 4.4 Error sistemtico 5. Clculo de la incertidumbre 6. Interpretacin 7. Aplicaciones 8. Limitaciones 9. Bibliografa
pueden mantenerse sus principios generales (5,6). Por otra parte, la complejidad y el coste de obtener una estimacin de la incertidumbre de medida deben ser proporcionales con los requisitos de calidad aplicables a la utilizacin clnica de los resultados.

Este documento proporciona recomendaciones para la estimacin de la incertidumbre de medida en los laboratorios clnicos, teniendo en cuenta las limitaciones que son propias de las mediciones biolgicas y los principios bsicos de la GUM. La incertidumbre de medida no se aplica a las pruebas de tipo cualitativo, en las que el resultado no es un valor numrico.
2. NORMAS PARA CONSULTA

Centro Espaol de Metrologa. Vocabulario internacional de trminos fundamentales y generales de metrologa (VIM). Madrid: Ministerio de Obras Pblicas, Transportes y Medio Ambiente;1994. Asociacin Espaola de Normalizacin (AENOR). Productos sanitarios para diagnstico in vitro. Medicin de magnitudes en muestras de origen biolgico. Trazabilidad metrolgica de los valores asignados a los calibradores y a los materiales de control. UNE-EN ISO 17511. Madrid: AENOR; 2004. Asociacin Espaola de Normalizacin (AENOR). Laboratorios Clnicos. Requisitos particulares relativos a la calidad y la competencia. UNE-EN-ISO 15189. Madrid: AENOR; 2007. Directiva 98/79/CE del Parlamento Europeo y del Consejo sobre Productos Sanitarios para Diagnstico In Vitro. Diario Oficial de las Comunidades Europeas L 331/1.
0. INTRODUCCIN
Los resultados que proporciona el laboratorio clnico deben ser exactos (veraces y precisos) para que permitan una interpretacin clnica correcta y para que sean comparables con resultados anteriores o posteriores y entre distintos laboratorios. Tradicionalmente se ha relacionado la exactitud con el error de medida. No obstante, el error de medida de los resultados del laboratorio clnico es casi siempre desconocido. En cambio, es posible atribuir una incertidumbre de medida y una trazabilidad metrolgica a cada resultado. La incertidumbre es una expresin numrica del grado de duda del resultado. La trazabilidad relaciona el resultado con referencias establecidas permitiendo su reproducibilidad en el tiempo y entre laboratorios (1,2). En la estimacin de la incertidumbre de medida se asume que cualquier error sistemtico es eliminado, corregido o ignorado, se evalan los efectos aleatorios sobre el resultado de una medida y se establece un intervalo en el que se encuentra el valor verdadero de la magnitud medida con un determinado nivel de confianza (3). La norma para la acreditacin de laboratorios ISO 15189 requiere una estimacin de la incertidumbre de los resultados. La apropiada metodologa para estimar la incertidumbre se describe en la Gua para la Expresin de la Incertidumbre de Medida (GUM). La GUM (4) fue desarrollada de forma conjunta por diversos organismos internacionales de normalizacin y metrologa para su utilizacin en laboratorios de calibracin y ensayo y aplicada a medidas fsicas o de anlisis qumico. En la actualidad, la GUM es de difcil aplicacin a las medidas que se realizan en el laboratorio clnico, aunque
3. DEFINICIONES
3.1 Analito
Componente que se indica en el nombre de una magnitud mensurable
3.2 Calibracin
Conjunto de operaciones que establecen, en condiciones especificadas, la relacin entre los valores de una magnitud indicados por un instrumento de medida o un sistema de medida, o los valores representados por una medida materializada o por un material de referencia, y los valores correspondientes de esa magnitud realizados por patrones (VIM)
3.3 Calibrador
Material de referencia cuyo valor se utiliza como variable independiente en una funcin de calibracin (ISO 17511) NOTA: Existe una jerarqua metrolgica de calibradores (ver ISO 17511)
3.13 Trazabilidad (metrolgica)

Propiedad del resultado de una medicin o de un patrn tal que pueda relacionarse con referencias determinadas, generalmente a patrones nacionales o internacionales, por medio de una cadena ininterrumpida de comparaciones teniendo todas las incertidumbres determinadas (VIM)
3.4 Error mximo permitido

Valor extremo de un error permitido por especificaciones, reglamentos, etc. (VIM) NOTA: Tambin denominado error mximo tolerable o lmite de error permitido
4. FUENTES DE INCERTIDUMBRE
Son fuentes que contribuyen a la incertidumbre de un resultado las siguientes: obtencin de la muestra, preparacin de la muestra, calibradores o materiales de referencia, magnitudes de entrada (por ejemplo, absorbancias), equipo instrumental empleado, condiciones ambientales, estabilidad de la muestra y cambios de operarios. La incertidumbre relacionada con la obtencin y preparacin de la muestra es de dificil estimacin y debe ser reducida mediante la rigurosa normalizacin de procedimientos. En este documento solo se consideran las fuentes de incertidumbre de la fase analtica, que se inicia cuando la muestra interacciona con el primer paso tcnico del procedimiento de medida (por ejemplo, colocar la muestra en un analizador) y termina con la obtencin de un valor numrico, resultado de la medida. Los principales componentes de la incertidumbre de la fase analtica corresponden a la indefinicin del mensurando, la estabilidad de la muestra en el sistema de medida, la calibracin, los volmenes dispensados, el lote de reactivos, el equipo instrumental, los operarios y las condiciones ambientales. En los apartados siguientes, se comentan con mayor detalle los principales componentes. La incertidumbre de medida es un parmetro que se asocia especficamente a cada resultado. En los laboratorios clnicos, es imposible realizar una estimacin particular de la incertidumbre de medida para cada mensurando de cada muestra, por lo que se realiza una estimacin general de la incertidumbre de medida para un mensurando definido y para valores del mismo cercanos a los de decisin clnica.
3.5 Error sistemtico

Media que resultara de un nmero infinito de medidas del mismo mensurando realizadas bajo condiciones de repetibilidad menos un valor verdadero del mensurando (VIM) NOTA: Para obtener una estimacin, se realiza un nmero finito de mediciones y se utiliza un valor convencionalmente verdadero del mensurando. NOTA: Tambin llamado desviacin y sesgo
3.6 Exactitud (de medida)

Grado de concordancia entre el resultado de una medicin y un valor verdadero del mensurando (VIM)
3.7 Imprecisin
Coeficiente de variacin de un conjunto de resultados obtenidos al medir repetidamente un mensurando con un mismo procedimiento de medida
3.8 Imprecisin interdiaria

Imprecisin observada en un laboratorio a partir de resultados obtenidos en das diferentes NOTA: Los resultados pueden estar afectados por distintas calibraciones (calibracin diaria, semanal, etc.), distintos operadores, distintos lotes de calibradores y distintos lotes de reactivos
4.1. Denicin del mensurando

El mensurando se define mediante los siguientes parmetros: a) Analito a medir. Por ejemplo: protena, ion sodio, colesterol, antiestreptolisina O, hemoglobina, nmero de leucocitos, etc. b) Sistema. Por ejemplo: suero, orina, sangre venosa, lquido pleural, etc. c) Tipo de magnitud y unidad. Por ejemplo: concentracin de sustancia (mmol/L), concentracin de masa (g/L), concentracin cataltica (nkat/L), etc. d) Procedimiento de medida. Habitualmente descrito en un procedimiento documentado de trabajo o similar. La existencia de diferentes formas moleculares del analito puede introducir incertidumbre en los resultados. Esta fuente de incertidumbre puede reducirse o eliminarse mediante la cuidadosa definicin del procedimiento de medida, ya que pueden reaccionar de diferente manera con unas u otras formas moleculares. Otra fuente de incertidumbre relacionada con la definicin del mensurando son las posibles reacciones cruzadas e interferencias que pueden ocurrir con algunas muestras y que deben estar identificadas y documentadas para prevenir, en lo posible, su influencia. En resumen, la incertidumbre ocasionada por la indefinicin del mensurando no puede ser cuantificada, pero puede ser reducida o eliminada mediante la detallada especificacin del mensurando.
3.9 Incertidumbre de medida

3.10 Magnitud (mensurable)

Atributo de un fenmeno, cuerpo o sustancia, que es susceptible de ser distinguido cualitativamente y determinado cuantitativamente (VIM)
3.11 Mensurando
Magnitud particular sometida a una medida (VIM)
3.12 Procedimiento de medida

Conjunto de operaciones, descritas de forma especfica, utilizadas en la ejecucin de mediciones particulares segn un mtodo dado (VIM) NOTA: Existe una jerarqua metrolgica de procedimientos de medida (ver ISO 17511)
4.2. Imprecisin
La mayor parte de los componentes de la incertidumbre de medida de la fase analtica se encuentran contenidos en la estimacin de la imprecisin interdiaria (CVid) que normalmente se obtiene empleando materiales de control. Esta estimacin debe realizarse con el suficiente nmero de datos para recoger las diferentes fuentes de incertidumbre que aplican. Se recomienda un mnimo de 6 meses de datos y una nueva estimacin cada ao. En el periodo de recogida de datos, deberan incluirse varias calibraciones para recoger la incertidumbre generada por el proceso de calibracin. En cambio no es necesario utilizar distintos lotes de calibrador si se dispone de la incertidumbre del valor asignado. La estimacin del CVid debe realizarse para un valor del mensurando cercano a los valores de decisin clnica.
ufc: incertidumbre estandar relativa (%) del factor empleado para corregir un error sistemtico1. Se recomienda expresar la incertidumbre combinada para un nivel de confianza del 95% (incertidumbre expandida, Uc). Para ello, se multiplica el valor de uc por k = 2. La incertidumbre expandida relativa debe expresarse con dos cifras significativas, por ejemplo: 4,2%, 16%.
6. INTERPRETACIN
La estimacin de la incertidumbre de medida proporciona una indicacin cuantitativa del nivel de duda que el laboratorio tiene en cada resultado y es por tanto un elemento clave en el sistema de calidad analtico de los laboratorios clnicos. La incertidumbre expandida relativa de un mensurando debera ser inferior a dos tercios del error mximo permitido. En caso de que fuera superior, deberan estudiarse con mayor detalle las diferentes fuentes de incertidumbre, identificar las ms significativas y realizar las acciones oportunas para reducirlas.
4.3. Valor asignado al calibrador

El laboratorio clnico debe conocer la incertidumbre y la trazabilidad metrolgica de los valores asignados a los materiales de calibracin que utiliza. Como habitualmente se trata de materiales comerciales, el fabricante debe proporcionar estos datos (Directiva 98/79/CE). Junto con el valor de incertidumbre debe especificarse tambin el factor de cobertura empleado. Normalmente, la incertidumbre se expresa como incertidumbre expandida (U) para un nivel de confianza del 95% (factor de cobertura = 2). La incertidumbre estndar (u) se calcula dividiendo U por el factor de cobertura. La u relativa (%) del valor asignado al calibrador no debera variar excesivamente lote a lote y debera ser generalmente ms baja que el CVid.
7. APLICACIONES
La incertidumbre de medida debe ser utilizada principalmente para la: Seleccin de procedimientos de medida que cumplan las especificaciones de exactitud. Interpretacin objetiva de la significacin de un cambio entre dos valores consecutivos de una magnitud bioqumica. Interpretacin objetiva de la significacin de un resultado en comparacin con un valor de decisin clnica

La estimacin de la incertidumbre de medida asume que cualquier error sistemtico significativo del procedimiento de medida ha sido eliminado, corregido o es ignorado (4,6,7). La identificacin de un eventual error sistemtico debera realizarse durante la validacin del procedimiento de medida. Cuando se corrige un error sistemtico mediante un factor, la correccin tiene una incertidumbre asociada (ufc) que debe ser considerada en el clculo de la incertidumbre de medida combinada1. Los errores sistemticos ocasionados en el uso rutinario del procedimiento de medida por las inevitables diferencias entre distintas calibraciones se comportan de forma aleatoria a largo plazo, con lo que este componente de la incertidumbre se recoge en el CVid.
8. LIMITACIONES
El valor de la incertidumbre de medida vara con la concentracin del mensurando y puede ser sustancialmente diferente para concentraciones muy bajas o muy altas del analito. Por este motivo se recomienda realizar su estimacin para una concentracin cercana a los valores de decisin clnica. Los materiales de control que se utilizan para estimar la imprecisin interdiaria pueden no ser representativos del comportamiento analtico que tienen las muestras de los pacientes.
5. CLCULO DE LA INCERTIDUMBRE
La incertidumbre se calcula combinando sus diversas fuentes. Para ello, los laboratorios clnicos deberan definir cada mensurando, especificando el procedimiento de medida, y realizar para cada uno de ellos el clculo de la incertidumbre combinada a partir de los datos de control interno de la calidad y otros datos, segn la siguiente frmula: Donde: uc: incertidumbre estndar combinada relativa (%) CVid: imprecisin (coeficiente de variacin) interdiaria ucal: incertidumbre estandar relativa (%) del valor asignado al calibrador (ver 4.3)
1
9. BIBLIOGRAFA
1. Gella FJ. Recomendaciones para la utilizacin de calibradores con tra zabilidad metrolgica en el laboratorio clnico. Quim Clin 2005; 24:474-6. 2. Gella FJ. Trazabilidad metrolgica y laboratorio clnico. Ed Cont Lab Clin 2004; 8:1-11. 3. National Pathology Accreditation Advisory Council. Requirements for the estimation of measurement uncertainty (2007 edition). Australia 2007. 4. Guide to the expression of uncertainty in measurement (1995). ISO Geneva. 5. White GH, Farrance I. Uncertainty of measurement in quantitative me dical testing. A laboratory implementation guide. Clin Biochem Rev 2004; 25:suppl (ii). 6. Kristiansen J. The guide to the expression of uncertainty in measure ment approach for estimating uncertainty: An appraisal. Clin Chem 2003; 49:1822-9. 7. Thienpont LM. Calculation of measurement uncertainty Why bias should be treated separately. Clin Chem 2008; 54:1587-8.
La comisin de Metrologa publicar prximamente recomendaciones para la estimacin del error sistemtico y para la estimacin de la incertidumbre asociada a su correccin (ufc)

Documento de consenso Sociedad Espaola de Bioqumica Clnica y Patologa Molecular (SEQC) y Asociacin Espaola de Hematologa y Hemoterapia (AEHH) Comit Cientfico Comisin de Protenas1 (SEQC) y Grupo Espaol de Mieloma2 (AEHH) Documento I. Fase 3. Versin 3 Preparado por: C. Martnez-Br, R. Garca Sanz y J. Martnez-Lpez
NDICE
0. Introduccin 1. Objeto y campo de aplicacin 2. Metodologa 2.1 Estudio en suero 2.1.1 Deteccin del componente o protena monoclonal 2.1.1.1 Electroforesis en soporte slido 2.1.1.2 Electroforesis capilar 2.1.1.3 Cadenas ligeras libres de inmunoglobulinas 2.1.2 Identificacin del componente o protena monoclonal 2.1.2.1 Inmunofijacin 2.1.2.2 Inmunosustraccin e inmunotipado 2.1.3 Medida 2.1.3.1 Densitometra 2.1.3.2 Espectrofotometra UV 2.2 Estudio en orina 2.2.1 Deteccin 2.2.1.1 Electroforesis en gel de agarosa 2.2.1.2 Electroforesis capilar 2.2.1.3 Medida de distintas protenas en orina 2.2.2 Identificacin 2.2.3 Medida 2.2.4 Tipo de muestra de orina 3. Requerimientos clnicos 3.1 En el momento del diagnstico 3.1.1 Deteccin del componente monoclonal 3.1.2 Identificacin del componente monoclonal 3.1.3 Medida del componente monoclonal 3.2 En el seguimiento de los MM quiescentes, MM en fase de plateau y GMSI 3.3 En el seguimiento de pacientes bajo tratamiento 3.4 En recadas o progresiones de pacientes previamente tratados 4. Requerimientos analticos
1
4.1 Deteccin del componente monoclonal 4.2 Identificacin del componente monoclonal 4.3 Medida del componente monoclonal 5. Metodologa recomendada 5.1 Deteccin (cribado) del componente monoclonal 5.2 Identificacin del componente monoclonal 5.3 Medida del componente monoclonal 5.4 Estudio en orina 5.5 Monitorizacin de MM en tratamiento 5.6 Monitorizacin de MM quiescentes, GMSI y MM en fase de plateau 5.7 Deteccin de recidivas y casos especficos con escasa sntesis de protena monoclonal 6. Propuesta de protocolo de seguimiento 7. Conclusiones 8. Bibliografa
0. INTRODUCCIN
Las gammapatas monoclonales (GM) constituyen un conjunto de trastornos diversos asociados a una proliferacin de clulas B maduras (1,2). Se caracterizan (con alguna excepcin como es el caso del mieloma no secretor) por la secrecin de molculas de inmunoglobulinas (intactas o fragmentos) homogneas desde el punto de vista inmunoqumico y electrofortico, a las que habitualmente se conoce como componente monoclonal (CM) (1). Aunque en la mayora de los casos las GM no tienen consecuencias clnicas importantes a lo largo de la vida del individuo, en ocasiones se producen manifestaciones clnicas debido a la proliferacin celular clonal neoplsica o al efecto biolgico de la protena monoclonal sobre diferentes rganos o sistemas. Las condiciones clnicas que se asocian a gammapatas monoclonales se listan en la tabla I (modificada de Merlini, Aguzzi y Whicher) (3).
Composicin de la Comisin de Protenas de la SEQC: M C. Crdenas Fernndez, M. Corts Rius, M. Fernndez Garca, M. Garca-Montes (asociado), I. Llompart Alabern, C. Martnez-Br (Presidente), D. Prez Surribas, T. Rodrguez Gonzlez, C.Valldecabres Ortiz, JA. Viedma Contreras, E. Zapico Muiz. 2 Composicin del Grupo Espaol de Mieloma de la AEHH: A. Alegre, J.Bargay, J. Besalduch, J, Blad, M T. Cibeira, F. de Arriba, J. de la Rubia, J. Daz-Mediavilla, J. Garca-Laraa, R. Garca-Sanz, M. Hernndez-Garca, JJ. Lahuerta, J. Martnez-Lpez, R. Martnez-Martnez, M V. Mateos, A. Oriol, F. Prosper, L. Rosiol, JF. San Miguel, A. Sureda
Las dos entidades clnicas sintomticas ms importantes asociadas a trastornos de clulas B maduras son el mieloma mltiple (MM) y la macroglobulinemia de Waldenstrm (MW). En estos casos la GM es clnicamente sintomtica, ya sea debido a la proliferacin neoplsica de clulas B o a sus efectos patolgicos directos sobre algn rgano diana. Sin embargo, estas dos enfermedades representan una proporcin relativamente pequea de todos los CM detectados en el laboratorio. En contraposicin a estos casos, existe una serie de GM que cursan de manera asintomtica o, si son secundarias, con una clnica slo relacionada con la propia enfermedad de base. Dentro de este grupo de GM, se encuentran las gammapatas monoclonales de significado incierto (GMSI) que corresponden a aquellos procesos con presencia de una protena monoclonal con carcter permanente y de concentracin estable en el tiempo. Para establecer este diagnstico es imprescindible que no haya sntomas o lesiones propias de MM, MW o deterioro orgnico por depsito de sustancia amiloide o inmunoglobulinas. Adems, es necesario descartar la presencia de otros sndromes linfoproliferativos como leucemia linfoide crnica o linfomas, as como la presencia de diversos trastornos asociados con gammapata monoclonal transitoria (1) (tabla I). En este sentido, una caracterstica esencial de las GMSI es la estabilidad de la situacin clnica y de las magnitudes biolgicas. Los criterios que permiten establecer el diagnstico diferencial entre GMSI, MM quiescente y MM sintomtico se detallan en la tabla II (4). Aunque la GMSI puede considerarse una etapa premaligna del MM (5), la tasa de progresin de GMSI a MM sintomtico es de tan slo un 1% anual (6). Por su parte, el MM (aproximadamente, 1.1% de todos los tipos de cnceres y entre un 10% y un 15% de los de tipo hematolgico (2)), ocasiona un 2% de todas las muertes atribuibles a cncer y posee el ndice de mortalidad ms elevado de todos los cnceres (1). No obstante, la aparicin de nuevos tratamientos ha hecho que la mediana de supervivencia haya subido hasta los 5 aos (7) y en algunas series llegue a superar los 8 aos (8). Adems, se han establecido nuevos criterios diagnsticos, a la vez que un Sistema
Internacional de Estratificacin (ISS) ha ido sustituyendo el sistema clsico de Durie y Salmon (9,10). Sin embargo, a pesar de haberse introducido nuevos tipos de tratamiento, el MM sigue siendo una enfermedad incurable. Puesto que la concentracin de la inmunoglobulina monoclonal est relacionada directamente con la masa del clon de clulas que la produce (con la excepcin del mieloma no secretor), el CM constituye un marcador bioqumico esencial tanto en el momento del diagnstico del MM (10,11) como en la monitorizacin y en la evaluacin de la respuesta al tratamiento (los cambios en la concentracin del componente monoclonal representan el principal indicador utilizado en la evaluacin de la respuesta al tratamiento (1)). La contribucin del laboratorio al estudio de las GM es determinante para su correcto diagnstico y seguimiento. El diagnstico de una GM supone la realizacin de una electroforesis de protenas sricas y urinarias seguida, en caso de sospecharse un CM, de un estudio inmunoqumico que permite identificar el isotipo de inmunoglobulina implicada en dicho CM, con su posterior cuantificacin. La interpretacin de la electroforesis de protenas por un profesional experto es imprescindible puesto que un porcentaje no despreciable de GM se diagnostica en el laboratorio por la deteccin de un CM en la electroforesis. Los mtodos citados anteriormente permiten, en la mayora de los casos, detectar e identificar las protenas monoclonales. Sin embargo, en una minora de casos en los que la poblacin de clulas plasmticas no sintetiza o secreta protena monoclonal en cantidad suficiente, es posible que sta no llegue a ser detectada o identificada. As, la sensibilidad de los procedimientos hasta aqu comentados puede resultar eventualmente insuficiente ante entidades clnicas tales como MM no secretores, sndrome de POEMS, MM secretores de cadenas ligeras, amiloidosis AL, o MM de inmunoglobulinas (Ig) intactas o enteras que responden favorablemente al tratamiento y entran en respuesta completa. Por todo lo expuesto anteriormente, el laboratorio debe disponer de mtodos analticos y estrategias que permitan la deteccin, identificacin y medida de los CM con las mximas garantas de
Tabla I. Condiciones clnicas asociadas a gammapata monoclonal

Clnicamente manifiestas Derivadas de enfermedades malignas de las clulas B Mieloma Mltiple y sus variantes Mieloma sintomtico Mieloma quiescente, latente o asintomtico Mieloma no secretor Leucemia de clulas plasmticas Mieloma Osteosclertico (POEMS) Plasmocitoma seo Solitario Extramedular Otros procesos linfoproliferativos Macroglobulinemia de Waldenstrm Linfoma No Hodgkin Leucemia linfoctica crnica Enfermedad de cadenas pesadas (, , ) Enfermedades relacionadas con la presencia de CM Crioglobulinemia Amiloidosis AL Enfermedad por depsito de cadenas ligeras o pesadas Polineuropatas secundarias a CM Crioaglutininas *CM: componente monoclonal Sin clnica
Gammapatas monoclonales transitorias Infecciones (vricas o bacterianas) Enfermedades autoinmunes Estados de inmunodeficiencia transitorios Reconstitucin de la mdula sea despus de un trasplante de progenitores hematopoyticos
Gammapatas monoclonales de significado incierto (GMSI)
Tabla II. Criterios diagnsticos y diagnstico diferencial de las gammapatas monoclonales

DEFINICIN DE GAMMAPATAS MONOCLONALES Gammapata Monoclonal de Mieloma asintomtico (Mieloma Mieloma Mltiple Significado Incierto (GMSI) Mltiple Quiescente) sintomtico 30 g/L en suero y/o <30 g/L en suero Presente b presente en orina y o o <10% y Ausente >10% y Ausente >10% b y Presente
CM Plasmocitosis medular Dao orgnico a
a) Dao orgnico o lesin tisular relacionada con el Mieloma o con la proliferacin de clulas plasmticas: anemia con reduccin de la Hb de al menos 20 g/L respecto al nivel normal o nivel de Hb <100 g/L; y/o aumento del calcio srico >0.25 mmol/L (1 mg/dL) por encima de lo normal o cifra absoluta de Ca >2.75 mmol/L (11 mg/dL); y/o lesiones seas lticas u osteoporosis con fracturas compresivas no atribuibles a otra causa; y/o insuficiencia renal (creatinina >173 mol/L (2 mg/dL). [Se resume con el acrnimo ingls CRAB: Calcium increase, Renal impairment, Anemia and Bone lesion]. Tambin se incluiran otros signos/sntomas menos frecuentes: hiperviscosidad sintomtica; amiloidosis y/o infecciones bacterianas recurrentes (>2 episodios graves con ingreso en 12 meses). b) En caso de mieloma mltiple sintomtico no se requiere un nivel mnimo de componente monoclonal o infiltracin plasmocitaria de la mdula sea, siempre y cuando ambos hallazgos coexistan con la presencia de dao orgnico. Componente monoclonal Plasmocitosis medular Dao orgnico DISCRASIAS DE CLULAS PLASMTICAS ESPECIALES Mieloma no secretor Plasmocitoma solitario del hueso Plasmocitoma extramedular Ausente Presente o ausente Presente o ausente (Inmunofijacin negativa) y y y 10% o presencia de Ausente Ausente plasmocitoma y y y Presente Ausente Ausente y y rea de destruccin nica, debida a Presencia de tumoracin de clulas infiltracin por clulas plasmticas plasmticas clonales clonales Seriada sea radiolgica normal Seriada sea radiolgica normal
Otros
fiabilidad y sensibilidad, aplicando cada uno de ellos segn el tipo de gammapata monoclonal y el momento evolutivo de cada enfermedad. As, se puede garantizar una ptima monitorizacin de los pacientes con MM, que permita una categorizacin exacta del grado de respuesta al tratamiento y asegure simultneamente la deteccin precoz de recidivas.

El presente documento pretende establecer las caractersticas de los mtodos analticos habitualmente empleados para la deteccin, identificacin y medida de los componentes monoclonales, citando su sensibilidad analtica, y recomendando las mejores opciones analticas para el diagnstico y seguimiento de las gammapatas monoclonales.Asimismo, se define la estrategia de laboratorio que se debera seguir ante la deteccin de un componente monoclonal en la electroforesis, estableciendo la periodicidad con la que debe realizarse el seguimiento analtico del paciente, de acuerdo con el tipo de gammapata monoclonal (ya se trate de MM o de GMSI), y el tratamiento al que est sometido el paciente.
primera fase de deteccin del CM, una posterior de identificacin y finalmente una de cuantificacin o medida del CM (12). Cabe destacar aqu que aunque hay autores que sostienen que la deteccin de cadenas ligeras libres en suero puede desplazar al estudio en orina, esta posibilidad no cuenta an con evidencia cientfica suficiente y por el momento sigue siendo necesario el estudio del CM en orina (13), tal como acaba de ratificarse recientemente en el XIIth International Myeloma Workshop celebrado en Washington (14).
2.1 Estudio en suero

2.1.1. Deteccin del componente o protena monoclonal
La electroforesis de protenas sricas constituye, por norma general, el primer paso en la bsqueda de CM. Es recomendable procesar suero en lugar de plasma para as obviar la presencia de fibringeno, con movilidad electrofortica similar a la de algunas inmunoglobulinas. Los CM suelen migrar en la zona de la electroforesis, si bien pueden aparecer en cualquier regin electrofortica, desde la zona 1 hasta el extremo ms catdico de la regin (6) , sobreponindose o no a cualquiera de las zonas normalmente observadas en la electroforesis. Por ello, es necesario que la interpretacin final del proteinograma corra a cargo de un profesional de laboratorio experimentado. Debe analizarse el trazado electrofortico para observar el aspecto y la localizacin del pico monoclonal, ya que
2. METODOLOGA
Para el estudio analtico correcto de las GM deben analizarse muestras de suero y de orina. En ambos casos debe pasarse por una
resulta imprescindible para estudiar la evolucin del componente a lo largo del tiempo, con o sin tratamiento. Slo de este modo se puede distinguir bien si las modificaciones de la zona donde migra el CM son debidas a variaciones en el CM o a alteraciones de la fraccin policlonal de las inmunoglobulinas, pues su significado puede ser completamente opuesto. 2.1.1.1. ELeCTROFOReSIS eN SOPORTe SLIDO En este tipo de electroforesis la resolucin final obtenida est fuertemente influenciada por el tipo de soporte empleado y por las caractersticas fsicas de la tcnica electrofortica (pH, voltaje, temperatura, etc.). La sensibilidad analtica alcanzada vara en funcin del colorante empleado (de mayor a menor sensibilidad, violeta cido, azul brillante de Coomassie y negro amido). En caso de optar por este tipo de electroforesis, el soporte recomendado es el gel de agarosa (prcticamente ha quedado obsoleta la electroforesis en acetato de celulosa) utilizando cualquiera de los tres colorantes aqu mencionados. La evaluacin del trazado electrofortico supone una inspeccin visual del gel, y posteriormente se valora las distintas fracciones por densitometra (evala la intensidad de la coloracin de cada una de las zonas del gel de acuerdo a la diferente afinidad que tienen las protenas por el colorante). 2.1.1.2. ELeCTROFOReSIS CAPILAR Constituye una alternativa electrofortica de creciente implantacin en los laboratorios clnicos, y es el mtodo mayoritariamente empleado entre los participantes en el Programa de Garanta de la Calidad de los Laboratorios Clnicos de la Sociedad Espaola de Bioqumica Clnica y Patologa Molecular, en el ao 2007 (15). Se realiza en sistemas totalmente automatizados que emplean volmenes muy reducidos de muestra y aplican un elevado voltaje. La resolucin que proporcionan estos sistemas es similar a la obtenida con geles de agarosa. La diferencia esencial respecto a una electroforesis en soporte slido estriba en que no se realiza tincin alguna. La medida de las diferentes fracciones se realiza por espectrofotometra directa en la zona UV, y se interpreta directamente el espectro de absorcin. La electroforesis capilar constituye una muy buena opcin electrofortica para el estudio de las GM en suero, especialmente en centros con un gran nmero de muestras. Con ambas tcnicas electroforticas pueden observarse trazados que lleven a interpretaciones errneas (falsos positivos y falsos negativos) que se resumen en la tabla III. Este fenmeno puede incluso observarse ms frecuentemente si se opta por un mtodo electrofortico de alta resolucin. Por ello, aunque esta ltima opcin proporciona una mayor sensibilidad analtica, no debera
considerarse como mtodo de primera lnea en la deteccin de componentes monoclonales. 2.1.1.3. CADeNAS LIGeRAS LIBReS De INMUNOGLOBULINAS eN SUeRO Las cadenas ligeras libres de inmunoglobulinas pueden medirse en suero por un mtodo especfico basado en una reaccin inmunoqumica (Ag-Ac) (16). El procedimiento implica la medida de los dos tipos (kappa - y lambda -) de cadenas ligeras libres de inmunoglobulinas con dos antisueros especficos distintos y con el posterior clculo del cociente /, que es el que permite sospechar monoclonalidad, aunque no puede confirmarla. Es importante saber que en la conformacin normal de la inmunoglobulina, la asociacin de las cadenas ligeras y pesadas enmascara ciertos epitopos de la cadena ligera que quedan expuestos cuando sta se encuentra circulando libremente, y son estos epitopos los que se utilizan para la produccin del antisuero especfico anti-cadenas ligeras libres. El principal inconveniente del mtodo es la falta de estandarizacin (17) (no existe material de referencia internacional) y la falta de experiencia que existe sobre este componente biolgico, dado que su empleo en el laboratorio clnico es relativamente reciente. Adems, estn descritos diferentes intervalos de referencia segn el tipo de analizador utilizado para la medida de las cadenas ligeras libres de inmunoglobulinas, motivo por el cual cada laboratorio debera de establecerse sus propios valores de referencia (18). La principal utilidad de la medida de las cadenas ligeras libres de inmunoglobulinas en suero es la de poder identificar aquellas situaciones en las que la protena monoclonal sintetizada y secretada en la circulacin est presente a concentraciones no detectables por electroforesis o por un mtodo inmunoqumico de identificacin (deteccin negativa e identificacin negativa), tales como mielomas no secretores o poco secretores, amiloidosis, enfermedad por depsito de cadenas ligeras, sndrome de POEMS, mielomas con buena respuesta al tratamiento y algunos mielomas secretores de cadenas ligeras. La presencia de un cociente / alterado en estas situaciones permite mantener un elevado ndice de sospecha de persistencia de la protena monoclonal y puede facilitar diagnsticos difciles as como un seguimiento ms objetivo de estos casos; adems constituye un marcador tanto del grado de respuesta alcanzado con el tratamiento como de deteccin precoz de recidivas (19,20). Recientemente han sido publicadas unas recomendaciones internacionales en las que se resume las principales indicaciones de la medida de las cadenas ligeras libres de inmunoglobulinas en suero (21): 1) en el diagnstico, su uso juntamente con la electroforesis y la inmunofijacin (inmunosustraccin o inmunotipado) permite alcanzar mayor sensibilidad; 2) presenta valor pronstico en la gran
Tabla III. Interpretaciones errneas en la electroforesis

Falsos positivos (se informa de un CM que no existe) Fibringeno (y sus productos de degradacin) Protena C reactiva Variantes fenotpicas de protenas (transferrina, C3, 1-antitripsina, hemoglobina) Muestras contaminadas y muestras sometidas a procesos repetidos de congelacin / descongelacin Administracin endovenosa de contrastes iodados * CM: componente monoclonal * C3: fraccin C3 del complemento Falsos negativos (no se informa de un CM que s existe) CM dbil CM dbil superpuesto a una banda Inmunoglobulinas monoclonales polimerizadas (banda de aspecto policlonal) Crioglobulinas
mayora de discrasias de clulas plasmticas; 3) permite un seguimiento objetivo en gammapatas con escasa secrecin de protena monoclonal; 4) en los MM tratados es necesaria la normalizacin del cociente / para determinar la denominada Respuesta Completa estricta (CRe). Ello ha hecho que el grupo internacional de mieloma haya recomendado utilizar esta metodologa (21). En GMSI, se ha descrito que la presencia de un cociente / srico alterado constituye un factor de riesgo de progresin hacia malignidad (22).
2.1.2. Identicacin del componente o protena monoclonal

Todos los mtodos de identificacin se basan en la combinacin de una separacin de las protenas por electroforesis y una reaccin inmunoqumica con antisueros especficos (anti-, anti-, anti-, anti-, anti-). El antisuero utilizado (afinidad, avidez, ttulo) constituye una variable fundamental de los mtodos inmunoqumicos. Si no se produce reaccin con los antisueros anti-, anti-, anti-, y s se produce con anti- o anti- debe enfrentarse la muestra a otros antisueros (anti-d, anti- y anti- libres, y anti-e). La inmunoelectroforesis no se recomienda como mtodo de identificacin de los componentes monoclonales detectados por electroforesis al poseer menor resolucin, practicabilidad y rapidez analticas que los otros mtodos, y ofrecer problemas en su interpretacin. 2.1.2.1. INMUNOFIJACIN El mtodo de identificacin ms extendido entre los laboratorios clnicos es la inmunofijacin (IFE), debido a sus buenas prestaciones analticas y facilidad de interpretacin. Este fue el mtodo mayoritariamente empleado entre los participantes en el Programa de Garanta de la Calidad de los Laboratorios Clnicos de la Sociedad Espaola de Bioqumica Clnica y Patologa Molecular, en el ao 2007 (15). La inmunofijacin consiste en la separacin de las protenas por electroforesis en gel de agarosa, seguida de una segunda etapa de inmunoprecipitacin de la protena monoclonal con los anticuerpos especficos. El gel consta de seis canales de reaccin, aplicndose muestra en cada uno de ellos para que se produzca la migracin electrofortica; posteriormente, en cada canal se aplica un anticuerpo determinado. Finalmente, debe procederse a la tincin del gel (violeta cido, azul brillante de Coommassie, negro amido) y consiguiente decoloracin. Igual que sucede con una electroforesis convencional, los resultados se ven influenciados por las condiciones electroforticas y el tipo de colorante empleado. Es importante destacar aqu que se trata de la tcnica convencional ms sensible de la que se dispone. Aunque su elevada sensibilidad generalmente no es necesaria en el momento del diagnstico, resulta esencial para evaluar la respuesta teraputica en aquellos pacientes con MM o MW con elevado grado de respuesta al tratamiento, ya que en muchos pacientes el componente monoclonal no se detecta por electroforesis, pero s se identifica por inmunofijacin. 2.1.2.2. INMUNOSUSTRACCIN e INMUNOTIPADO Estos mtodos de identificacin de CM se han desarrollado simultneamente a la implantacin de la electroforesis capilar, y se han adaptado al mismo sistema electrofortico. El principio del mtodo consiste en realizar una electroforesis despus de que la posible protena monoclonal haya reaccionado con antisueros especficos en los pocillos del analizador preparados para tal uso. As, al final de todo el estudio, a cada muestra sospechosa de tener un CM se le habr realizado una primera electroforesis capilar
(deteccin de CM) seguida de una reaccin inmunoqumica y de una segunda electroforesis capilar que permitir concluir el proceso. Como ventajas de estos mtodos frente a la inmunofijacin, puede destacarse su practicabilidad y su rapidez, puesto que se trata de un procedimiento totalmente automatizado. Como inconveniente principal destaca el hecho de que bandas muy dbiles o muy tenues (sospechadas a travs de la inspeccin del primer trazado electrofortico) que levantan dudas respecto a su monoclonalidad, pueden no quedar perfectamente categorizadas. Otro inconveniente importante de estos dos mtodos es que los sistemas capilares actuales no estn todava adaptados para enfrentar la muestra de suero frente a otros tipos de anticuerpos distintos de anti-, anti-, anti-, anti- y anti-, y por lo tanto en caso de duda, debe procederse a realizar una inmunofijacin. Cabe destacar que, cuando existe una fuerte sospecha clnica de gammapata monoclonal maligna, o para confirmar una remisin completa de un paciente con MM, debe siempre realizarse inmunofijacin del suero y la orina, aunque la electroforesis no evidencie la presencia de un componente monoclonal.
2.1.3. Medida del componente o protena monoclonal

Para la medida del CM el laboratorio clnico puede optar por dos principios de medida que son la densitometra (realizada tras una electroforesis en gel de agarosa) y la espectrofotometra directa en la zona UV (realizada a 200 nm 214 nm, segn el sistema, tras una electroforesis capilar). En cualquier caso, debe aplicarse siempre la misma estrategia de medida del CM, para evitar que el empleo de diferentes principios de medida pueda incidir en las decisiones clnicas. Respecto a los mtodos inmunoqumicos como turbidimetra y nefelometra, si bien con muy buenas prestaciones analticas, no son los adecuados para medir la protena monoclonal debido a que los antisueros empleados reconocen tanto la inmunoglobulina monoclonal como la policlonal, y por lo tanto no deben ser utilizados con esta finalidad. Sin embargo, pueden considerarse como mtodos complementarios a los que se comentan a continuacin. 2.1.3.1. DeNSITOMeTRA En el caso de la electroforesis en gel de agarosa, posteriormente a la inspeccin visual cuidadosa para detectar bandas con signos de monoclonalidad (an a bajas concentraciones), se procede a una lectura densitomtrica del gel que proporciona una estimacin cuantitativa de la concentracin de protena monoclonal (ya que refleja la cantidad de colorante fijado a la protena). Las principales limitaciones del procedimiento se manifiestan en la medida de CM dbiles sobre fondo de inmunoglobulinas policlonales y en la subjetividad para decidir los puntos de corte del rea correspondiente al CM. 2.1.3.2. ESPeCTROFOTOMeTRA UV En el caso de emplear la electroforesis capilar, la visualizacin de un componente monoclonal se completa con una integracin del rea bajo la curva de dicho pico obtenida por espectrofotometra en la zona UV. Este principio de medida presenta una mayor exactitud en la medida de la protena monoclonal puesto que la absorbancia a 200 nm 214 nm es directamente proporcional a la cantidad de enlace peptdico de la muestra. Sin embargo, los problemas citados en el apartado anterior se reproducen tambin en este caso (medicin de un CM pequeo sobre un fondo policlonal, decisin arbitraria de los puntos de corte de la banda y medida de las inmunoglobulinas monoclonales pero tambin de las policlonales).
2.2. Estudio en orina

En la orina, la finalidad del estudio analtico de las GM radica en detectar e identificar la presencia de cadenas ligeras libres de inmunoglobulinas monoclonales (proteinuria de Bence-Jones).
2.2.3. Medida
La medida del componente monoclonal en orina ofrece mayores dificultades que en suero. Pueden emplearse la densitometra y la espectrofotometra UV, aunque no estn exentas de inconvenientes. La espectrofotometra UV es problemtica debido a la presencia en la orina de numerosas sustancias que absorben en la zona UV y requiere dializar previamente la muestra de orina para eliminar las interferencias. Adems, en ambos casos, debe utilizarse un procedimiento capaz de medir todas las protenas en orina (albmina, globulinas y protenas de baja masa molar como las cadenas ligeras de inmunoglobulinas). Quizs aqu tengan un valor aadido los mtodos inmunoqumicos (nefelometra y turbidimetra), concretamente para medir cadenas ligeras de inmunoglobulinas en los casos en que existe una proteinuria de Bence Jones. Aunque los antisueros comercializados para la medida de la concentracin de cadenas ligeras (libres o totales) de inmunoglobulinas reconocen tanto las cadenas ligeras monoclonales como las policlonales, estos mtodos permiten un seguimiento ms objetivo de la cantidad de cadenas ligeras que se excretan por orina.
2.2.1. Deteccin
Los mtodos de deteccin del CM en suero sirven tambin para la deteccin del CM en orina, aunque con las adaptaciones pertinentes. As como el estudio de las gammapatas monoclonales en suero es bastante uniforme entre los distintos laboratorios, en el caso de la orina, las estrategias varan de un laboratorio a otro. Las opciones ms empleadas se listan a continuacin: 2.2.1.1. ELeCTROFOReSIS eN GeL De AGAROSA Puede realizarse, ya sea de manera convencional (concentrando la muestra en funcin de la concentracin de protenas en la misma) ya sea de alta resolucin. Se pueden emplear distintos colorantes, aunque el Violeta cido es el que ofrece mayor sensibilidad. 2.2.1.2. ELeCTROFOReSIS CAPILAR Si bien es una metodologa ampliamente utilizada para la deteccin de CM en suero, su uso para las muestras de orina es limitada, debido a su ms reciente adaptacin. Aunque no se dispone actualmente de estudios comparativos contrastados en orina, es posible que a medida que se extienda su uso, la electroforesis capilar constituya una buena alternativa metodolgica para el estudio del CM en orina. En caso de utilizar esta metodologa, debe procederse previamente a una dilisis de la orina para eliminar sustancias interferentes presentes en la muestra y que absorben en la regin UV. 2.2.1.3. MeDIDA De DISTINTAS PROTeNAS eN ORINA La medida de la concentracin de distintas protenas en orina (albmina, inmunoglobulina G, 1-microglobulina, cadenas ligeras libres o totales de inmunoglobulinas) y el clculo posterior de diversos cocientes (cociente entre suma de protenas individuales como albmina, inmunoglobulina G y 1-microglobulina, y la protena total; cociente / -totales o libres-) permite sospechar la presencia de proteinuria de Bence Jones (23,24) .
2.2.4. Tipo de muestra de orina

La medida de protenas en orina se ha realizado tradicionalmente en orina de 24 horas. Los diversos inconvenientes (tanto para el paciente como para el laboratorio) de trabajar con orina de 24 horas convierten lo que sera la muestra ideal para obviar la variabilidad intraindividual en la excrecin diaria de protenas en una muestra difcil de obtener correctamente, y lo que es ms importante, con la posibilidad de poder llevar a confusin en la interpretacin de los resultados de la medida de distintas magnitudes proteicas. Son diversos los estudios que avalan la posibilidad de utilizar muestras aleatorias de orina, expresando los resultados en funcin de la creatinina de la muestra (25,26). El cociente protena/creatinina permite corregir las posibles variaciones en la concentracin de la orina. Distintas sociedades cientficas y grupos de expertos recomiendan el uso de muestras de orina aisladas para la medida de la proteinuria (27,28). En el caso concreto de la proteinuria de Bence Jones, las guas de prctica clnica vigentes siguen expresando la proteinuria como cantidad excretada (gramos o miligramos por 24 horas). Por otra parte, debido a que existe cierto grado de degradacin enzimtica bacteriana de las cadenas ligeras de inmunoglobulinas, algunos grupos de expertos recomiendan el uso de la segunda muestra del da (29) (expresando la proteinuria en funcin de la concentracin de la creatinina de la muestra), para as descartar aquella orina que durante toda la noche ha ido acumulndose en la vejiga urinaria. Inevitablemente, el hecho de utilizar muestras de orina aisladas y expresar los resultados de la proteinuria en funcin de la creatinina de la muestra, hace necesario definir unos nuevos valores discriminantes equivalentes a los establecidos en las guas de prctica clnica actuales, en el contexto de las gammapatas monoclonales.
2.2.2. Identicacin
La presencia de cadenas ligeras libres monoclonales en orina (proteinuria de Bence-Jones) debe confirmarse por un mtodo inmunoqumico. Los mtodos de identificacin del CM en suero (inmunofijacin, inmunosustraccin o inmunotipado) sirven tambin para la identificacin del CM en orina, con las consiguientes adaptaciones. Nuevamente, la eleccin de la metodologa deber basarse en las necesidades de sensibilidad para la muestra concreta (por ejemplo, si la determinacin se lleva a cabo para confirmar una respuesta completa en un mieloma que presentaba proteinuria monoclonal, se requerir inmunofijacin). Puede optarse ya sea por una combinacin de un antisuero anticadenas pesadas (,,), adems de los antisueros frente a cadenas ligeras totales de tipo y de tipo (por lo tanto tres antisueros distintos), ya sea por el empleo de antisueros anti-cadenas ligeras libres de inmunoglobulinas de tipo y de tipo (dos antisueros).
3. REQUERIMIENTOS CLNICOS
3.1. En el momento del diagnstico
3.1.1. Deteccin del componente monoclonal
Ante la sospecha de una gammapata monoclonal, es imprescindible que el clnico disponga desde el momento del diagnstico, de una electroforesis de protenas en suero con el grfico del trazado electrofortico. Ello facilita el seguimiento del CM durante la
evolucin, ya sea bajo tratamiento (para constatar su descenso) o en abstencin teraputica (para controlar un posible ascenso). Dada la mayor resolucin grfica de la electroforesis capilar, este es el mtodo preferido desde el punto de vista clnico. En todos los casos se necesita tambin el estudio de protenas en orina, no slo para identificar los casos de gammapatas monoclonales de cadenas ligeras, sino tambin para complementar el estudio diagnstico en gammapatas con CM de inmunoglobulinas intactas o enteras. La proteinuria de Bence Jones puede tener un valor pronstico y evolutivo relevante (de hecho, hasta el 60% de los MM de inmunoglobulina intacta tiene proteinuria de Bence Jones). Puesto que la observacin del pico monoclonal en el trazado electrofortico constituye para el clnico la mejor forma de evaluar la gammapata monoclonal, es recomendable incorporar el grfico del trazado electrofortico al informe del laboratorio.
Respecto a la medida de cadenas ligeras libres de inmunoglobulinas, puede resultar de inters la determinacin absoluta de la cadena ligera libre perteneciente al clon tumoral en MM secretores de cadenas ligeras y en Amiloidosis AL (21). Sin embargo, aunque ya hay numerosos estudios que avalan su uso, todava no existe suficiente experiencia como para hacer una recomendacin firme respecto a su empleo generalizado en este apartado.
3.2. En el seguimiento de los MM quiescentes, MM en fase de plateau y GMSI

La caracterstica esencial de estos casos es que los pacientes estn asintomticos aunque presentan un CM medible. Estos pacientes son seguidos durante mucho tiempo, muchas veces aos e incluso decenios, sin que precisen tratamiento alguno. Aparte de la vigilancia que hay que prestar sobre la posible aparicin de sntomas y signos clnicos, el seguimiento se basa en la observacin del componente monoclonal. Debe prestarse especial atencin al posible aumento de la concentracin del CM (se producir seguramente en algn momento u otro en el curso de la enfermedad), aunque por lo general con elevaciones poco apreciables. Por ello, es fundamental medir con la mxima exactitud el componente monoclonal para asegurar que el valor obtenido corresponde al CM y que las posibles variaciones respecto a concentraciones anteriores son debidas exclusivamente a variaciones en la concentracin del CM (y no a otras alteraciones como expansiones policlonales o cambios en la eleccin de los puntos de corte del proteinograma). En este apartado, no es necesario identificar el CM de manera repetida. Aunque la cuantificacin de cada una de las inmunoglobulinas por nefelometra o turbidimetra no proporciona una medida exacta del componente monoclonal, al clnico le supone una informacin complementaria al proteinograma, especialmente cuando el CM es de tipo IgA o IgM. Si el paciente presenta una proteinuria de Bence Jones, la medida de cadenas ligeras (libres o totales) en orina es de gran ayuda. Por otra parte, la periodicidad recomendada de los controles analticos (electroforesis con medida del CM) vara segn el tipo de paciente: Pacientes tratados que han alcanzado una fase de plateau (o respuesta parcial sostenida): cada 1-3 meses, dependiendo del riesgo de progresin, de acuerdo a criterios clnicos. Pacientes con MM quiescente: - Pacientes con alto riesgo de progresin: cada 3 meses - Pacientes con bajo riesgo de progresin: cada 6 meses Pacientes con GMSI: - Pacientes con alto riesgo de progresin: cada 3-6 meses. - Pacientes con bajo riesgo de progresin: cada 12 meses. Pacientes con gammapatas asociadas a otras condiciones clnicas: no necesitan seguimiento si desaparecen.
3.1.2. Identicacin del componente monoclonal

Una vez detectado el CM, es necesario identificar convenientemente el isotipo de inmunoglobulina que lo integra (cadena pesada y cadena ligera). Si bien en ciertos casos la medida por nefelometra o turbidimetra de las inmunoglobulinas y de las cadenas ligeras totales permite intuir el tipo de inmunoglobulina que conforma el CM, no puede nunca obviarse la identificacin del CM por inmunofijacin, inmunosustraccin o inmunotipado. En caso de que no se haya podido detectar el CM por electroforesis pero persista la sospecha clnica de gammapata monoclonal, es obligatorio proceder a una inmunofijacin de la muestra. Esto puede suceder en los siguientes supuestos: Mieloma mltiple oligosecretor y no secretor Amiloidosis primaria tipo AL Enfermedad por depsito de cadenas ligeras Mieloma osteosclertico o sndrome de POEMS Plasmocitoma solitario (seo o extraseo) Polineuropatas por componente monoclonal Crioglobulinemias y Sndrome por crioaglutininas Slo despus de comprobar que no se aprecia CM por electroforesis ni por inmunofijacin, que el cociente / srico es normal y que no existe proteinuria de Bence Jones, se podra excluir un diagnstico de gammapata monoclonal.
3.1.3. Medida del componente monoclonal

Junto a la electroforesis de protenas debe proporcionarse la concentracin de protenas y la concentracin de cada una de las distintas fracciones del proteinograma; es altamente recomendable que el laboratorio no proporcione nicamente datos expresados en porcentajes. Siempre que la morfologa y la migracin del CM lo permitan, la medida del componente monoclonal debe realizarse a partir de la electroforesis, delimitando el pico en el trazado y ajustando el rea para su determinacin de forma individual, separada del resto de las regiones. Pese a la subjetividad que implica este mtodo, es el ms fiable desde el punto de vista clnico. La medida de inmunoglobulinas por mtodos como la nefelometra o la turbidimetra puede resultar un mtodo complementario a la electroforesis, concretamente en casos en que la delimitacin del rea del CM resulta difcil (CM sobre fondo policlonal o superpuesto a otras regiones del proteinograma), y es de ayuda en el seguimiento de los pacientes para conocer la respuesta alcanzada cuando el CM no se puede cuantificar por electroforesis.
3.3. En el seguimiento de pacientes bajo tratamiento

En este apartado, la finalidad principal del tratamiento consiste en la reduccin de la concentracin del componente monoclonal. Por este motivo, en el seguimiento clnico, el objetivo primordial es evaluar esta pretendida reduccin a travs de su medida. Los protocolos clnicos persiguen, en principio, una respuesta objetiva ahora definida como parcial (RP). Esta respuesta parcial implica una reduccin del CM en suero y en orina, mayor o igual al 50 y al 90%, respectivamente. Hay grupos que definen adems la respuesta parcial muy buena (RPMB),
cuando la reduccin en suero supera el 90%. De nuevo, la mejor forma de evaluar estas reducciones es midiendo el pico monoclonal en el trazado electrofortico; la concentracin de las inmunoglobulinas aporta una informacin complementaria al clnico (especialmente en casos IgA e IgM, y en los pacientes con proteinuria de Bence Jones). Con los tratamientos actuales (que, adems de los nuevos frmacos, incluyen altas dosis de quimioterapia y transplante de progenitores hematopoyticos TPH-), en muchos pacientes se consigue una reduccin de la concentracin del CM que lo convierte en indetectable por electroforesis. Esta respuesta al tratamiento se asocia con una notable mejora en la evolucin de los pacientes y se obtiene en un 40-65% de los pacientes jvenes (30) y en ms del 35% de los mayores de 65 aos (31). Sin embargo, en estos casos la sensibilidad del proteinograma es insuficiente para poder definir correctamente el grado de respuesta alcanzado y se hace necesario recurrir a tcnicas ms sensibles, como la inmunofijacin. As se define la RC como la situacin en la que, aparte de conseguir mejora clnica y desaparicin de la plasmocitosis medular, el CM desaparece tanto en la electroforesis como en la inmunofijacin. Los casos en los que el pico desaparece de la electroforesis pero permanece en la inmunofijacin se consideran como Respuestas casi Completas (RcC). En la experiencia espaola, el porcentaje de casos que alcanza RC tras TPH es del 40%, mientras que para RcC es del 24%, y ello conlleva un pronstico notablemente diferente (32). Por este motivo, debe realizarse una inmunofijacin a todos los pacientes en tratamiento que presentan una electroforesis sin componente monoclonal. Adems, dado que tras el TPH pueden aparecer bandas oligoclonales que compliquen la interpretacin de la electroforesis e inmunofijacin, es necesario que todos estos pacientes dispongan de una muestra anterior en la que se distinga bien el componente monoclonal para tomarlo como referencia y poder compararlo con la muestra en la que puede haber desparecido. Idealmente, la inmunofijacin de referencia tendra que ser la del momento del diagnstico. Actualmente, el inmunotipado y la inmunosustraccin no tienen sensibilidad suficiente para definir la respuesta completa ni cuentan con evidencias que respalden que la desaparicin del CM con estos procedimientos tenga una relevancia clnica superior a la inmunofijacin. La utilizacin de la medida de cadenas ligeras libres de inmunoglobulinas ha proporcionado algunas evidencias sobre el hecho de que la normalizacin de su cociente supone una ventaja pronstica relevante. Esto es especialmente atribuible a mielomas Bence Jones, Amiloidosis y MM no secretores, pero las evidencias respecto al mieloma de inmunoglobulina intacta son todava poco consistentes. En cualquier caso, muchos grupos ya consideran un cociente / (libres) normal como criterio de respuesta y, de hecho, el Internacional Myeloma Working Group (9) ha definido la Respuesta Completa estricta (RCe), en la que adems de los criterios de RC citados anteriormente, se exige la normalizacin del cociente / y una inmunohistoqumica negativa en la mdula sea. No obstante, la utilidad de este nivel de respuesta todava no ha sido validada en estudios multicntricos, por lo que aunque sera deseable disponer de esta informacin, hoy por hoy no es todava obligatoria. Resulta algo similar a lo que sucede con la RC inmunofenotpica y molecular, definida por citometra de flujo y por reaccin en cadena de la polimerasa o PCR, cuya informacin parece muy til (33), pero tambin necesita ser validada.
embargo, conviene recordar aqu que es posible que se produzcan fenmenos de escape, en los que las clulas plasmticas sintetizan menores cantidades de cadenas pesadas pero mantienen la produccin de cadenas ligeras (se asiste a un cambio en el componente monoclonal en pacientes bajo seguimiento, generalmente tratados, de inmunoglobulina completa a slo cadena ligera). As, puede suceder que aunque parece que el paciente permanece estable (en relacin a su CM en suero) en realidad est progresando con un aumento del componente monoclonal a expensas slo de cadenas ligeras. Por lo tanto, es obligatorio realizar electroforesis e inmunofijacin en suero (siendo tambin altamente recomendable medir las cadenas ligeras libres), y tambin medir la proteinuria de Bence Jones (34).
4. REQUERIMIENTOS ANALTICOS
4.1. Deteccin del componente monoclonal
Sea cual sea el mtodo electrofortico por el que se opte, existen unos requisitos mnimos que garantizan una separacin de elevada calidad (35): visualizacin de la banda tenue de prealbmina deteccin de ciertos estados de heterozigosis de la 1-antitripsina visualizacin de los dos componentes principales de la zona 2 (haptoglobina y 2-macroglobulina) visualizacin de los dos principales componentes de la zona beta (transferrina y C3 nativo) deteccin de componentes monoclonales de concentracin igual o inferior a 1 g/L y de oligoclonalidad en la zona gamma Independientemente del tipo de soporte, y del colorante y del sistema empleado en el caso de usar gel de agarosa, el mtodo seleccionado debe cumplir estas caractersticas. La sensibilidad metrolgica de la electroforesis capilar es ligeramente superior a la de la electroforesis en gel de agarosa (siempre y cuando no se empleen tinciones especficas y no se trate de electroforesis de alta resolucin). Empleando gel de agarosa y con cualquiera de los colorantes citados anteriormente o con electroforesis capilar se alcanza la sensibilidad analtica citada previamente. Tal como se ha apuntado, es muy importante la interpretacin final del proteinograma por parte de un profesional de laboratorio con experiencia demostrada en la tcnica. La electroforesis en gel de agarosa y la electroforesis capilar cumplen los objetivos analticos de calidad en cuanto a la imprecisin analtica de las distintas fracciones del proteinograma. En la tabla IV se expone los valores de la imprecisin analtica deseable y los de la variabilidad biolgica (36). La falta de datos referentes a variabilidad biolgica de las cadenas ligeras libres de inmunoglobulinas en suero dificulta el establecimiento de estndares analticos de imprecisin. En los distintos trabajos en los que se cita la imprecisin analtica interserie alcanzada, los coeficientes de variacin son inferiores al 11% para ambos tipos de cadenas ligeras (37,38,39) aunque en algn caso (13) se alcanzan valores cercanos al 20%.
4.2. Identicacin del componente monoclonal

Las guas de prctica clnica de National Academy of Clinical Biochemistry (NACB) (2) recomiendan que el mtodo de identificacin de los CM en suero presente un lmite de deteccin de 0,2 g/L. El lmite de deteccin alcanzado con la IFE (negro amido azul brillante de Coomassie o violeta cido) para este tipo de muestra alcanza este nivel de sensibilidad. En el caso de la orina,
3.4. En recadas o progresiones de pacientes previamente tratados

En estos casos el abordaje es semejante al momento del diagnstico, por lo que la estrategia debe ser la misma (ver epgrafe 3.1). Sin
Tabla IV. Especificaciones analticas

Variacin biolgica CVIntra % Albmina 1 2 3,1 11,4 10,3 10,1 14,6 CVInter % 4,2 22,6 12,7 9,1 12,3 CVa % 1,6 5,7 5,2 5,1 7,3 Especificaciones deseables ES % 1,3 6,3 4,1 3,4 4,8 ET % 3,9 15,7 12,6 11,7 16,8
CVIntra coeficiente de variacin intraindividual - CVInter coeficiente de variacin interindividual CVa coeficiente de variacin analtico - ES error sistemtico - ET error total
la sensibilidad para la deteccin de CM (esencialmente cadenas ligeras libres de inmunoglobulinas) debe ser inferior a 10 mg/L.
4.3. Medida del componente monoclonal

Las prestaciones analticas relativas a la densitometra y la electroforesis capilar se corresponden con las expuestas para la electroforesis en gel de agarosa y la electroforesis capilar, respectivamente.
Inmunofijacin: en caso de no visualizarse CM realizar la etapa siguiente. Medida de las cadenas ligeras libres de inmunoglobulinas en suero y clculo del cociente / (libres).
5.6. Monitorizacin de MM quiescentes, GMSI y MM en fase de plateau

Electroforesis srica con medida del CM, por densitometra o espectrofotometra asociada a electroforesis capilar.
5. METODOLOGA RECOMENDADA
5.1. Deteccin (cribado) del componente monoclonal
Indistintamente electroforesis en gel de agarosa o electroforesis capilar.
5.7. Deteccin de recidivas y casos especcos con escasa sntesis de protena monoclonal
Inmunofijacin, y en caso de no visualizarse CM saltar a la etapa siguiente. Medida de cadenas ligeras libres de inmunoglobulinas en suero y clculo del cociente / (libres).
5.2. Identicacin del componente monoclonal

Tanto en suero como en orina, es preferible la inmunofijacin a la inmunosustraccin o al inmunotipado (concretamente en CM de baja concentracin o en aquellos casos que requieren para su identificacin de antisueros frente a IgD, IgE, cadenas ligeras libres). La inmunosustraccin y el inmunotipado son vlidos tambin para identificar el CM siempre y cuando ste no sea de baja concentracin. En la inmunofijacin el posible CM detectado por la electroforesis se pone de manifiesto por la reaccin con el anticuerpo especfico; se evidencia de esta manera una banda mejor coloreada y ms fcil de identificar que la banda resultante de la electroforesis. Por el contrario, en la inmunosustracin y el inmunotipado, se asiste a una eliminacin del posible CM a consecuencia de la reaccin con el anticuerpo especfico.
6. PROPUESTA DE PROTOCOLO DE SEGUIMIENTO

En la figura 1 se muestra una estrategia general aplicable al estudio de los componentes monoclonales en el laboratorio y en la figura 2, una propuesta de seguimiento clnico de las gammapatas monoclonales. No obstante, las pautas de seguimiento clnico y analtico de las GM difieren segn se trate de GMSI o de MM. En todos los casos, es recomendable remitir al laboratorio muestra de sangre y de orina a fin de asegurar un estudio exhaustivo. En el caso de los MM no tratados, debe realizarse un seguimiento del CM cada 1-3-meses si hay alto riesgo de progresin o cada 6 meses si el riesgo es bajo. El estudio bioqumico supone la monitorizacin del CM mediante electroforesis con posterior medida del CM por densitometra o espectrofotometra UV. No es necesario repetir en cada control analtico la identificacin del isotipo (la localizacin y correcta delimitacin del pico en el trazado electrofortico, y su medida ajustada son suficientes). Adems, suele aadirse la medida de la concentracin srica de las inmunoglobulinas A, G y M (a menudo est reprimida la sntesis de las inmunoglobulinas no implicadas en el CM). En orina debe descartarse la presencia de proteinuria de Bence-Jones. En MM bajo tratamiento, el seguimiento debe realizarse a intervalos de tiempo ms reducidos, por norma general a las 4-5 semanas. Una vez alcanzada la respuesta, los controles se pueden espaciar a una determinacin cada mes o cada tres meses segn el riesgo de progresin. Se recomienda monitorizar el CM mediante electroforesis, aadiendo la inmunofijacin si el CM ha desaparecido
5.3. Medida del componente monoclonal

Densitometra (gel de agarosa) o espectrofotometra UV (electroforesis capilar)(preferentemente esta ltima).
5.4. Estudio en orina

Deteccin: electroforesis o cribado mediante la medida de distintas protenas urinarias. Identificacin: inmunofijacin. Medida: cualquiera de los comentados, si bien la medida por mtodos inmunoqumicos de cadenas ligeras de inmunoglobulinas (libres o totales) permite realizar un seguimiento ms objetivo de la cantidad de cadenas ligeras excretada.
5.5. Monitorizacin de MM en tratamiento

Electroforesis y en caso de que persista el CM, medida del mismo. Si no se observa CM pasar a la etapa siguiente.
manera ms continuada, cada 3 a 6 meses. Tambin es altamente recomendable descartar la presencia de proteinuria de Bence-Jones. Aquellas GM asociadas a otras condiciones clnicas (gammapatas monoclonales transitorias y enfermedades relacionadas con la presencia de CM) deben monitorizarse de acuerdo a la enfermedad de base en cuestin, requiriendo normalmente de electroforesis e identificacin. En las GM transitorias, la desaparicin progresiva del CM obliga a utilizar alguna tcnica inmunoqumica de identificacin (preferentemente inmunofijacin) para confirmar definitivamente la normalizacin del trazado electrofortico. En caso de que los controles se efecten anualmente, slo se recomienda repetir la inmunofijacin si el pico monoclonal no se visualiza con facilidad en la electroforesis.
7. CONCLUSIONES
La contribucin del laboratorio al estudio de las gammapatas monoclonales es determinante para su correcto diagnstico y seguimiento. Las opciones analticas empleadas para el diagnstico y la monitorizacin de las GM pueden resumirse en dos grandes metodologas: electroforesis e inmunofijacin. Ambos tipos de estudios analticos son imprescindibles para poder categorizar adecuadamente la gammapata monoclonal en funcin del isotipo de inmunoglobulina y de la concentracin del componente monoclonal. Una vez diagnosticada la gammapata monoclonal, no siempre es necesario pasar nuevamente por ambas etapas (deteccin e identificacin). As, mientras no vare el CM detectado en la electroforesis (ni en su morfologa ni en su concentracin), no es necesario repetir sistemticamente el estudio inmunoqumico de identificacin (inmunofijacin, inmunosustraccin o inmunotipado). En los casos en que se aprecie una disminucin marcada del CM, o en los que el CM se halle ya desde su inicio en una baja concentracin, as como en la valoracin de la respuesta al tratamiento es imprescindible realizar el estudio inmunoqumico (inmunofijacin, inmunosustraccin o inmunotipado), pudindose quizs obviar en estos casos la electroforesis convencional en los controles posteriores. Para poder confirmar la ausencia del CM, es obligatorio disponer de una inmunofijacin negativa, ya que sta es la tcnica ms sensible y la nica que ha demostrado utilidad clnica contrastada. Por otra parte, el estudio de la protena monoclonal en orina es obligatorio. Adems, puesto que en las gammapatas monoclonales la prdida del control sobre la regulacin de la sntesis normal de inmunoglobulinas queda reflejada por la alteracin del cociente srico / (libres), la medida de dichas cadenas ligeras constituye una opcin recomendable en aquellas situaciones en las que la protena monoclonal sintetizada tiene una concentracin muy baja (MM no secretor y oligosecretor, MM Bence Jones, Amiloidosis AL, algunos plasmocitomas. Sndrome de POEMS y MM en remisin). La presencia de un cociente / (libres) alterado en estas situaciones permite mantener un elevado ndice de sospecha sobre la persistencia de la protena monoclonal y por lo tanto, podra ser un criterio de respuesta y un factor pronstico.
Figura 1. Propuesta de seguimiento analtico de los componentes monoclonales
Figura 2. Propuesta de seguimiento clnico de las gammapatas monoclonales
del trazado electrofortico. En caso de que por ninguno de los dos procedimientos anteriores se ponga de manifiesto la presencia de la protena monoclonal, se recomienda, aunque no sea obligatorio, medir las cadenas ligeras libres de inmunoglobulinas en suero. Conviene adems determinar la concentracin de las inmunoglobulinas A, G y M, y debe realizarse un estudio de la proteinuria de Bence-Jones. En las GMSI clnicamente estables el seguimiento se realiza con carcter semestral o anual (segn el riesgo de progresin) mediante electroforesis e inmunofijacin, inmunosustraccin o inmunotipado, y medida del CM por densitometra o espectrofotometra a UV, y se recomienda tambin determinar la concentracin de las inmunoglobulinas A, G y M. Dado que el riesgo de progresin hacia MM sintomtico es mayor en pacientes con GMSI con CM de tipo A o M, con concentraciones superiores a 15 g/L, con cociente srico / (libres) patolgico, con inmunoparesia o con menos de un 5% de plasmocitos medulares normales respecto a plasmocitos totales, se recomienda seguir a los pacientes que cumplan estos requisitos de
8. BIBLIOGRAFA
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Recomendaciones para la calibracin de material volumtrico en el laboratorio clnico*

Sociedad Espaola de Bioqumica Clnica y Patologa Molecular (SEQC) Comit Cientfico Comisin de Metrologa Documento E. Fase 3. Versin 2 Preparado por: R. Ruz Morer
ndice
0 Introduccin 1 Objeto y campo de aplicacin 2 Normas para consulta 3 Definiciones 4 Requisitos metrolgicos: criterios de aceptacin 5 Procedimiento 5.1 Patrones 5.2 Condiciones ambientales 5.3 Procedimiento de calibracin 5.4 Clculo del error sistemtico y de la incertidumbre de medida 5.5 Frecuencia de calibracin 6 Aplicaciones 7 Bibliografa Anexo 1. Clculo de la incertidumbre
1 Objeto y campo de aplicacin

La presente recomendacin describe un procedimiento gravimtrico para la calibracin de pipetas y dispensadores mecnicos, de volmenes superiores a 0,05 mL 2.
2 Normas para consulta

Asociacin Espaola de Normalizacin. Aparatos volumtricos accionados mediante pistn. Parte 1: Terminologa, requisitos generales y recomendaciones de uso. UNE-EN-ISO 8655-1: 2002. Madrid: AENOR; 2002. Asociacin Espaola de Normalizacin. Aparatos volumtricos accionados mediante pistn. Parte 2: Pipetas tipo pistn. UNE-ENISO 8655-2: 2002. Madrid: AENOR; 2002. Asociacin Espaola de Normalizacin. Aparatos volumtricos accionados mediante pistn. Parte 5: Dispensadores. UNE-EN-ISO 8655-5: 2002. Madrid: AENOR; 2002. Asociacin Espaola de Normalizacin. Aparatos volumtricos accionados mediante pistn. Parte 6: Mtodos gravimtricos para la determinacin del error de medicin. UNE-EN-ISO 8655-6: 2002. Madrid: AENOR; 2002. Asociacin Espaola de Normalizacin. Laboratorios Clnicos. Requisitos particulares relativos a la calidad y la competencia. UNE-EN-ISO 15189: 2003. Madrid: AENOR; 2003. Asociacin Espaola de Normalizacin. Sistemas de gestin de la calidad. Requisitos. UNE-EN-ISO 9001:2000. Madrid:AENOR; 2000. Centro Espaol de Metrologa. Vocabulario internacional de trminos fundamentales y generales de metrologa (VIM). Madrid: Ministerio de Obras Pblicas, Transportes y Medio Ambiente; 1994.
0 Introduccin
Las pipetas que se utilizan para la dispensacin de volmenes que pudieran afectar, directa o indirectamente, la calidad de los resultados generados en el laboratorio, deberan estar apropiadamente calibradas. Segn las normas para la gestin de la calidad ISO 15189 e ISO 9001, los laboratorios clnicos deben establecer una programacin que controle y demuestre peridicamente que sus instrumentos de medida se encuentran calibrados y mantener documentos que describan los procedimientos de calibracin y los criterios de aceptacin, as como informes que contengan datos de las calibraciones efectuadas.
Este documento se public en su primera versin en Quim Clin 2006; 25:104-110, con varios errores que se explicaban en una fe de erratas posteriormente publicada en Quim Clin 2007; 26:85. Esta segunda versin difiere de la primera nicamente en que se han corregido los errores mencionados.
*
Composicin de la Comisin: J. Batista Castellv, F. Canalias Reverter, FJ. Gella Toms, B. Gonzlez de la Presa, R. Ruz Morer, M. Snchez Manrique (Presidenta)
Entidad Nacional de Acreditacin. Expresin de la incertidumbre de medida en las calibraciones. CEA-ENAC-LC/02 (Rev.1). Madrid: ENAC; 1998 Sociedad Espaola de Bioqumica Clnica y Patologa Molecular. Comit Cientfico. Comisin de Metrologa. Recomendaciones para la calibracin de balanzas y para la estimacin de la incertidumbre de las medidas de masa en el laboratorio clnico. Barcelona: Quim. Cln. 2004; 23: 35-39.
3.7. Intervalo de medida

Mdulo de la diferencia entre dos lmites de un rango nominal (VIM)
3.8. Patrn
Medida materializada, instrumento de medida, material de referencia o sistema de medida destinado a definir, conservar o reproducir una unidad o uno o varios valores de una magnitud para que sirvan de referencia (VIM).
3 Deniciones
3.1. Calibracin
Conjunto de operaciones que establecen, en condiciones especificadas, la relacin entre los valores de una magnitud indicados por un instrumento de medida o un sistema de medida, o los valores representados por una medida materializada o por un material de referencia, y los valores correspondientes de esa magnitud realizados por patrones (VIM).
NOTA: En el caso de material volumtrico, es el conjunto de operaciones que establecen la relacin entre el volumen dispensado y el volumen nominal o seleccionado correspondiente del aparato (ISO).
3.9. Rango de indicacin

Conjunto de valores limitado por las indicaciones extremas (VIM).
3.10. Resolucin
La menor diferencia de indicacin de un dispositivo visualizador que puede percibirse de forma significativa (VIM).
3.11. Trazabilidad
Propiedad del resultado de una medicin o de un patrn tal que pueda relacionarse con referencias determinadas, generalmente a patrones nacionales o internacionales, por medio de una cadena ininterrumpida de comparaciones teniendo todas las incertidumbres determinadas (VIM).
3.2. Error mximo permitido (de un instrumento de medida)

Valor extremo de un error permitido por especificaciones, reglamentos, etc., para un instrumento de medida dado (VIM).
NOTA: En el caso de material volumtrico, es el valor extremo superior o inferior permitido para la desviacin del volumen dispensado a partir del volumen nominal o el volumen seleccionado de un aparato volumtrico accionado mediante pistn (ISO).
3.12. Valor nominal

Valor redondeado o aproximado de una caracterstica de un instrumento de medida que sirve de gua para su utilizacin (VIM).
4. Requisitos metrolgicos: criterios de aceptacin

El error mximo de medida de volumen permitido (EMP) en el laboratorio clnico depende sustancialmente del objeto de la medicin. De forma general pueden establecerse las siguientes categoras: A. Mediciones de volumen que pueden afectar al valor de una magnitud de un patrn/calibrador o relacionadas con un proceso de calibracin. Por ejemplo, en la reconstitucin de un calibrador liofilizado. B. Mediciones de volumen que pueden afectar al valor de una magnitud de un material de control o relacionadas con procesos de control/verificacin. Por ejemplo, en la reconstitucin de un control liofilizado C. Mediciones de volumen que pueden afectar el valor de una magnitud de una muestra. Por ejemplo, en procedimientos de medida manuales o dilucin de una muestra para su reproceso D. Otras mediciones de volumen. Por ejemplo, en la preparacin de disoluciones de reactivos. Teniendo en cuenta el estado actual de la tecnologa de los instrumentos para la dispensacin de volumen utilizables en los laboratorios clnicos, se recomiendan los requisitos para el error mximo permitido de las mediciones de volumen que se muestran en la siguiente tabla. Estos valores deben considerarse como una aproximacin razonable y aplicable a muchas situaciones del laboratorio clnico. No obstante, determinadas circunstancias pueden exigir requisitos ms o menos estrictos que los aqu recomendados.

Media que resultara de un nmero infinito de medidas del mismo mensurando realizadas bajo condiciones de repetibilidad menos un valor verdadero del mensurando (VIM).
NOTA: En el caso de material volumtrico, es la diferencia entre el volumen dispensado y el volumen nominal o volumen seleccionado de un aparato volumtrico accionado mediante pistn (ISO).
3.4. Exactitud (de un instrumento de medida)

Aptitud de un instrumento de medida para dar respuestas prximas a un valor verdadero (VIM).
3.5. Imprecisin
Coeficiente de variacin de un conjunto de resultados obtenidos al medir repetidamente un mensurando con un mismo procedimiento de medida.
3.6. Incertidumbre de medida

2
Para volmenes inferiores a 0,05 mL, la evaporacin durante el proceso de calibracin debe ser compensada por clculo o tomar medidas adicionales para evitarla.
Recomendaciones para la calibracin de material volumtrico
categora A B C D
EMP (%) 1 2 3 5
5.4. Clculo del error sistemtico y de la incertidumbre de medida

a) Los clculos se realizan individualmente para cada uno de los puntos de calibracin4. b) Calcular el valor medio (vm) y la desviacin tpica (si) de cada serie de 10 medidas. c) Calcular el error sistemtico relativo (ESrel), expresado en %, restando el valor nominal (vn) de la media obtenida para dicho volumen, y dividiendo posteriormente por el valor nominal.
Para cada pipeta o dispensador del laboratorio deben establecerse las medidas que con dicho instrumento se efectan y asignarle como error mximo permitido el ms estricto de las categoras de medida que se realizan con el mismo. El error mximo permitido se utilizar como criterio de aceptacin de las calibraciones.
5. Procedimiento
5.1. Patrones
Para la calibracin de las pipetas debe utilizarse como patrn una balanza previamente calibrada y de resolucin adecuada para el volumen de la pipeta a calibrar. La balanza puede ser calibrada por el propio laboratorio clnico3 o por una empresa externa, en cuyo caso la calibracin debe acompaarse de un certificado de calibracin expedido por un laboratorio acreditado o un instituto nacional de metrologa, debiendo constar en dicho certificado la trazabilidad al patrn nacional, la incertidumbre expandida y el factor (o probabilidad) de cobertura que se ha utilizado en el clculo de la incertidumbre expandida.
d) Calcular la incertidumbre relativa combinada expandida para una probabilidad de cobertura de aproximadamente el 95% (Urel), expresada en %:
En el ANEXO-1 se detalla el origen de los trminos de esta ecuacin. e) Evaluar los resultados. La suma del valor absoluto de ESrel con la U rel debe ser inferior o igual al error mximo permitido. Estas condiciones son aplicables a todos los puntos de calibracin.
5.5. Frecuencia de calibracin

Se recomienda calibrar las pipetas y dispensadores cada 3 meses. Tambin deberan calibrarse siempre que exista alguna sospecha de funcionamiento incorrecto o de haber sido sometidas a algn trato inadecuado u otra situacin que pueda comprometer su funcionamiento.
5.2. Condiciones ambientales

Deben evitarse situaciones ambientales extremas, procurando que la calibracin se realice bajo condiciones similares a las de uso de la pipeta. Evitar las corrientes de aire y reducir en lo posible la duracin de la ejecucin de las medidas u otras condiciones que pudieran favorecer la evaporacin.
6. Aplicaciones
El proceso de calibracin de las pipetas y dispensadores permite obtener evidencia objetiva de que, cuando se utiliza el instrumento para efectuar dispensaciones de volumen, no se cometen errores inadmisibles, esto es, superiores el error mximo permitido. Es posible que, en el caso de las pipetas de volumen variable, se obtengan resultados insatisfactorios en alguno de los puntos de calibracin (por ejemplo en el volumen de valor ms bajo). Esto no cuestiona todas las mediciones que se efectuaron con anterioridad con la misma pipeta, sino tan slo aqullas cercanas al punto de calibracin para el que se obtuvieron resultados anmalos. La pipeta puede utilizarse restringiendo su intervalo de medida o variando el error mximo permitido en funcin de la escala de medida.
5.3. Procedimiento de calibracin

Cuando la pipeta es de volumen variable, seleccionar para la calibracin el volumen mnimo, el volumen mximo y un volumen intermedio, y para cada uno de ellos proceder como sigue: a) Antes de realizar la calibracin debe llevarse a cabo una inspeccin visual de la balanza, comprobar que est adecuadamente calibrada y llevar a cabo su limpieza, si es oportuno. b) Colocar el recipiente de pesada en el plato de la balanza, pesarlo y anotar el valor de la tara (que se tendr en cuenta para seleccionar la incertidumbre expandida correspondiente al punto de calibracin de la balanza ms cercano a la masa total que se mide). Realizar un ajuste a 0 de la tara. c) Dispensar el volumen de agua destilada correspondiente al volumen nominal de la pipeta en el recipiente y anotar el valor de la pesada. d) Repetir el apartado c 10 veces consecutivas.
7. Bibliografa
Dybkaer R. Vocabulary for use in measurement procedures and description of reference materials inlaboratory medicine. Eur J Clin Chem Clin Biochem 1997; 35:141-173.
3 4
Ver documento "Recomendaciones para la calibracin de balanzas y para la estimacin de la incertidumbre de masa en el laboratorio clnico.
La Comisin de Metrologa de la SEQC ha preparado una hoja de clculo apropiada para estos fines y que puede ser obtenida en el sitio de la Comisin de Metrologa de la web de la Sociedad
Anexo 1. Clculo de la incertidumbre

Las medidas realizadas con la pipeta, tienen las siguientes fuentes de incertidumbre (u): a) Incertidumbre debida a la medida (ui). Los errores aleatorios de dispensacin originan imprecisin en las medidas. Este componente de la incertidumbre puede ser calculado a partir de la desviacin tpica de las medidas repetidas (si). ui = si b) Incertidumbre debida a la resolucin (ur). La resolucin (r) de la pipeta ocasiona errores aleatorios de redondeo. La amplitud de la distribucin de los posibles errores es igual a la resolucin y, en ese intervalo, cualquier valor tiene las mismas probabilidades de producirse (distribucin rectangular o uniforme). En este tipo de distribucin, la desviacin tpica (sr) es igual a la amplitud de la distribucin dividida por la raz cuadrada de 12.
ms cercano a la masa total que se mide (incluyendo recipiente)5, generalmente para el 95% de confianza, y el valor del factor de cobertura empleado (habitualmente kp = 2)
d) Otros componentes de la incertidumbre, como el ocasionado por la presin del aire y la densidad del agua, pueden ser ignorados por su escasa relevancia en las aplicaciones habituales del laboratorio clnico. La incertidumbre combinada tpica (uc) puede calcularse a partir de la suma de cuadrados de las incertidumbres de cada componente:
y la incertidumbre combinada expandida (Uc) para el intervalo de confianza de aproximadamente el 95% resulta de multiplicar la anterior por el factor de cobertura 2.
(En las pipetas de volumen fijo, el valor de resolucin es 0). c) Incertidumbre debida al patrn (up). Se calcula a partir de los datos que proporciona el certificado de calibracin de la balanza: la incertidumbre expandida (Up) del punto de calibracin de la balanza
Finalmente, la incertidumbre relativa combinada expandida (Urel) resulta de dividir la incertidumbre absoluta combinada expandida por el valor medio medido de cada punto de calibracin (vm)6 y, multiplicndola por 100, se expresa en porcentaje.
Urel
En caso de disponer nicamente del valor de la incertidumbre relativa y expandida (Urel) respecto al punto de calibracin de la balanza requerido, calcular Up mediante: Up = valor masa x Urel/100.
5 6
Teniendo en cuenta el tamao habitual del EMP, se ha considerado despreciable la diferencia entre volumen medido y el valor nominal.
Sociedad Espaola de Bioqumica Clnica y Patologa Molecular

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Documentos de la SEQC 2009

Criterios para la seleccin de un modelo de automatizacin del laboratorio

Recomendaciones preanalticas para la medicin del equilibrio cido-base y gases en sangre

Tcnicas para la preparacin de semen en reproduccin asistida

Recomendaciones para la estimacin de la incertidumbre de medida en el laboratorio clnico

Recomendaciones para el estudio de las gammapatas monoclonales

Recomendaciones para la calibracin de material volumtrico en el laboratorio clnico

Procedimiento recomendado para la calibracin de termmetros en el laboratorio clnico

2. NORMAS PARA CONSULTA

3.2. Error mximo permitido (de un instrumento de medida)

3.3. Error sistemtico

1. OBJETO Y CAMPO DE APLICACIN

3.4. Escala (de un instrumento de medida)

3.5. Exactitud de un instrumento de medida

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Procedimiento recomendado para la calibracin de termmetros en el laboratorio clnico

3.7. Incertidumbre de medida

3.8. Intervalo de medida

3.12. Valor convencionalmente verdadero (de una magnitud)

5.2 Condiciones previas

4. REQUISITOS METROLGICOS: CRITERIOS DE ACEPTACIN

5.3 Procedimiento de calibracin

Documentos de la SEQC 2009 3

5.4 Clculo del error sistemtico y de la incertidumbre de medida

5.5 Frecuencia de calibracin

Anexo 1. Clculo de la incertidumbre

4 Documentos de la SEQC 2009

Procedimiento recomendado para la calibracin de termmetros en el laboratorio clnico

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1. OBJETO Y CAMPO DE APLICACIN

6 Documentos de la SEQC 2009

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2.2. Laboratorio automatizado modular

Documentos de la SEQC 2009 7

3.3 Identicacin de la muestra

3.3.1 Tipos de cdigos de barras que soporta el sistema

3.1 Identicacin de los pacientes: hospitalizados y ambulatorios

3.3.2 Informacin de las etiquetas con el cdigo de barras

3.2 Tipos de contenedores

8 Documentos de la SEQC 2009

Criterios para la seleccin de un modelo de automatizacin del laboratorio

Condiciones de conservacin (luz, temperatura, etc.) Fecha de caducidad

3.3.3 Informacin de las etiquetas secundarias y alcuotas

3.4.2 Clasicacin y pretratamiento de los especmenes

3.3.4 Gestin de la identicacin de muestras en extracciones realizadas fuera del laboratorio

3.4.3 Centrifugacin selectiva de especmenes

3.3.5 Etiquetado automtico de los contenedores primarios y secundarios

3.4.4. Destaponado/retaponado del tubo primario

3.4.1 Soportes (racks) para los diferentes especmenes

Documentos de la SEQC 2009 9

3.5.2 Registro de tiempos preanalticos

4.1 Versatilidad de la automatizacin en la fase analtica

4.1.1 Posibilidad de conectar los analizadores elegidos a una cadena

10 Documentos de la SEQC 2009

Criterios para la seleccin de un modelo de automatizacin del laboratorio

4.1.7 Integracin de diferentes reas del laboratorio

4.1.8 Accesibilidad a las muestras durante la fase analtica

4.1.3 Posibilidad de carga de reactivos durante el funcionamiento del sistema

4.1.4 Capacidad de incorporar instrumentacin de diversa procedencia

4.1.9 Manejo de diferentes tipos de contenedores y/o muestras

4.1.5 Capacidad de incorporar nuevas tcnicas con la misma instrumentacin

4.1.6 Capacidad de ampliacin y facilidad de renovacin