ULTIMOS AVANCES EN LA BIOLIXIVIACIN DE CONCENTRADOS CALCOPIRITICOS

Dr. JUAN RIVADENEIRA H. LIAP-UAI jrivadeneira@liap.cl

Introduccin

Muchas Gracias

Introduccin
Mercado del cobre de acuerdo a su va de procesamiento. Minerales: xidos v/s Sulfuros. Sulfuros: Molienda- Concentrados- nodos-ER- Ctodos. xidos: Chancado- Lixiviacin - SX-EW - Ctodos. Bajos costos en procesos de biolixiviacin de sulfuros. Regeneracin de insumos H2SO4 Plantas de SX-EW amortizadas. Baja intensidad de energa. Foco actual de lixiviacin en bajas leyes. Procesos masivos, Botaderos, ROM. Ambientalmente amigable v/s Fundiciones. No genera gases sulfurosos Nuevos minerales Refractarios o con As

Introduccin
Proceso productivo segn el mineral Exploracin geolgica

Extraccin, Carguo y Transporte

Chancado Cobre Sulfurado Molienda Cobre oxidado

Lixiviacin
Extraccin por solventes Electro obtencin

Flotacin
Fundicin Electro refinacin

Introduccin
Produccin de Cu en Chile
7.000

6.000

5.000 KTon Cu Fino

4.000

Capacidad de fundicin Capacidad de Refinacin

3.000

Cobre en concentrados total Catodos SxEw

2.000

1.000

0 2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015 2016 2017 2018 2019 2020 Capacidad de Fusin de Concentrados y Refinacin de Cobre en Chile Fuente: Cochilco, 2009

Introduccin
Mina Subterranea y a rajo abierto Gobierno nueva Geogrfica Buenayubicacin norma defaenas fundiciones: de las Codelco y Enami son las que debern realizar Tecnologa de punta en planta la mayor inversin
Constanza Prez-Cueto 04/07/2012 Investigacin

y Desarrollo

"Estimamos que son ms de US$1.350 millones (de inversin). Las principales inversiones van a estar en las fundiciones pblicas" dijo a La Tercera, Marcelo Fernndez, jefe de la oficina de Asuntos Atmosfricos del Ministerio de Medio Ambiente.

Terminologa
Biolixiviacin: disolucin de minerales de su fuente mineral por accin microbiana. Bio-oxidacin: es la oxidacin mediante microorganismos del mineral husped que contiene el componente metlico de inters. Tratamiento de minerales refractarios de oro. Bio-mineria: movilizacin de elementos de una materia slida mediada por bacterias y hongos. Bio-hidrometalurgia: campo interdisciplinario en donde se da una cruza entre aspectos microbiolgicos y en especial geo-microbiolgicos y biotecnolgicos con mineraloga, geologa, metalurgia, ingeniera qumica y ingeniera en minas.

Modelos de Mecanismos de Lixiviacin

Directo: Obteniendo electrones directamente de la reduccin del mineral. Adhesin celular al sustrato mineral.

Indirecto: ion frrico como transportador de electrones No requiere contacto de la clula al sustrato.

Modelos de Mecanismos de Lixiviacin

Contacto celular con el sustrato mineral. Excrecin celular de exopolmeros. Acomplejamiento de iones frricos a residuos de cido glucurnico presentes en el exopolmero. Mecanismo de ataque primario. Formacin de tiosulfato como intermediario de la oxidacin del sulfuro. Formacin de grnulos de sulfuro o grnulos de politionato en el espacio peri plasmtico o en la pared celular.

Mecanismos de Lixiviacin
Mecanismo del tiosulfato (FeS2, MoS2, WS2). FeS2 + 6Fe 3+ + H2O S2O32- + 7Fe 2+ + 6H+ S2O32- + 8Fe 3+ + 5H2O 2SO42- + 8Fe 2+ + 10H+

2Fe 3+ + 2S2O32- 2FeS2O 3+ 2Fe 2+ + S4O6 2Mecanismo de poli sulfuros (ZnS, CuFeS2, FeAsS, etc.) MS + Fe 3+ + H+ M 2+ + 0.5 H2Sn + Fe 2+ 0.5 H2Sn + Fe 3+ 0.125 S80 + Fe 2+ + H+ 0.125 S80 + 1.5 O2 + H2O SO42- + 2H+ Precipitacin del hierro frrico 4 Fe 3+ + 12 H2O 4 Fe(OH)3 + 12 H+

A)

K 2 SO 4 3Fe 2 SO 4 3 12H2 O 2KFe 3 SO 4 2 OH 6 6H2 SO 4

B)
TEMPERATURA, C

200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0

0 1 2 3

Fe2O3 FeO(OH) Fe3+ Fe(OH)3

4 5 6 7 8 9

pH
Formacin de Jarosita potsica. A) formula de la reaccin qumica conducente a la formacin de jarositas potsicas. B) diagrama de temperaturas y pH de estabilidad de compuestos de in frrico, se muestran los parmetros de formacin y estabilidad de las especies que conforman jarositas y hidrxidos de Hierro ( Geothita y Hematita), en rojo se muestra el rea en que es posible encontrar el in frrico en solucin y las estrellas muestran las condiciones operacionales utilizadas en las experiencias de biolixiviacin llevadas a cavo en esta tesis con microorganismos mesfilas, termfilos Moderados y termfilos extremos ( 39, 50 y 70 C Respectivamente) y en condiciones de iso pH 1,5. Adaptado de G. von Weert and R.J.M. van Lier, Aqueous Pressure Oxidation of Silver Bearing Cyamide Refractory Concentrates in Acidic Sulfate and Sulfate Iodide Media, TMS EPD Congress JOM 1994, pp 12.

REACCIONES DE OXIDACIN DE MINERALES CUPROSOS

H.R.Watling (2006) The bioleaching of sulphide minerals with emphasis on copper sulphides hydrometallurgy 84: 81 -108

Microorganismos descritos en procesos de Biolixiviacin de calcopirita TRFLP

H. Huber, K.O.Stetter. (1998) Hyperthermophiles and their possible potential in biotechnology Journal of Biotechnology 64: 39-52.

Mina Subterranea y a rajo abierto

Buena ubicacin Geogrfica de las faenas

Tecnologa de punta en planta Investigacin y Desarrollo

pH 1,5 Aerobiosis
O2

O2

SO4=

H2SO4

H2SO4

Fe2(SO4)3
pH 7 NAD(P)H H+ NAD(P) ATP H+ H+ O2 Fe SO4

Fe2(SO4)3 FeSO4+ CuSO4 + S

K Fe3(SO4)2(OH)6

CuFeS2

H2O
ADP + Pi
O2

O2

Acidithiobacillus ferrooxidans
O2

O2 O2

3+ 2+ Modelo propuesto de ataque indirecto por Fe con oxidacin de Fe bacterial y O2 como aceptor de electrones en Acidithiobacillus ferrooxidans. Se muestra capa de precipitados de jarosita y precipitados de RISCs que se forma tanto sobre la bacteria como sobre la partcula a biolixiviar. Se incluye ataque de in frrico sobre la partcula de calcopirita y la generacin de un azufre elemental como subproducto de la reaccin. Modelo propuesto para ataque Indirecto en condiciones Mesoflicas.

pH 1,5 Aerobiosis
O2 O2

S K Fe3(SO4)2(OH)6

CuFeS2
S

O2
O2

Acidithiobacillus ferrooxidans
O2 O2 O2

Modelo propuesto de ataque directo con oxidacin de RISCs y O2 como aceptor de electrones en Acidithiobacillus ferrooxidans.
Se muestra capa de precipitados de jarosita y precipitados de RISCs que se forma tanto sobre la bacteria como sobre la partcula a biolixiviar. Se incluye ataque de la bacteria sobre los precipitados de RISCs en la superficie de la partcula de calcopirita, los compuestos RISCs al ser extremadamente insolubles en medio acuoso requieren que la bacteria ataque de forma directa la superficie del mineral ( lnea punteada negra). Modelo propuesto para explicar el ataque Directo en condiciones Mesoflicas, Termoflicas moderadas y Termoflicas extremas, utilizando oxigeno como aceptor final de los electrones.

pH 1,5

Anaerobiosis

CuFeS2

Acidithiobacillus ferrooxidans

Modelo propuesto de ataque directo con oxidacin de RISCs y Fe ferrooxidans.

3+

como aceptor de electrones en Acidithiobacillus

Se muestra capa de precipitados de jarosita y precipitados de RISCs que se forma tanto sobre la bacteria como sobre la partcula a biolixiviar. Se incluye ataque de la bacteria sobre los precipitados de RISCs en la superficie de la partcula de calcopirita, los compuestos RISCs al ser extremadamente insolubles 3+ en medio acuoso requieren que la bacteria ataque de forma directa la superficie del mineral ( lnea punteada negra). A la vez al utilizar Fe como aceptor final de los electrones la bacteria genera espacios en su pared celular capaces de unir 3+ precipitados de Fe permitiendo mejorar las capacidades de unirse al sustrato a biolixiviar. Modelo propuesto para explicar el ataque Directo en condiciones Mesoflicas, Termoflicas moderadas y Termoflicas Extremas con frrico como aceptor final de los electrones.

CuFeS2

K Fe3(SO4)2(OH)6

PROCESO GEOCOAT
Sistema de Biolixiviacin de Concentrados en Pilas
Aireacin e irrigacin controlada para conservar el calor y as maximizar la biolixiviacin. Especies Biolgicas atacan los sulfuros y liberan los metales bsicos a la solucin. El concentrado es recubierto sobre un sustrato de tamao controlado (Roca estril o mineral de baja ley) y apilado. La pila se irriga con solucin cida con nutrientes que se recicla. Se emplea aire a baja presin para suplir oxigeno- soplado desde la base de la Pila. SX-EW. Fierro y Arsnico se remueven va precipitacin.

Los metales preciosos pueden recuperarse si estn presentes.

GEOCOAT
clonamiento
Flujo de Solucion

Cubierta de concentrado (0.5 1.0mm) sobre ripio de soporte

Ripio de soporte +4mm 25 mm

Flujo de Aire

Espacios libres permiten alta permeabilidad

Balance trmico GEOCOAT

clonamiento
Conveccin Evaporacin Radiacin
Condicin de borde

Irrigacin

Solucines Las reacciones generan calor en la pila

Transporte de solucin y aire al interior de la pila La energa es generada por las reacciones de lixiviacin

Conduccin

Aireacin

Aireacin y Evaporacin

Condicin de Borde

La acumulacin de calor en la pila es determinada por el balance entre la tasa de lixiviacin , la tasa de riego y la tasa de aireacin combinada con las condiciones de borde.

Balance trmico GEOCOAT

Temperatura C
20
Perdida de calor y calor en soluciones de riego condensacin

70

Accumulacin de Temperatura

Evaporacin

Aireacin
0

Profundidad m

Riego

Sobre Sobre Temperatura irrigacin aireacinideal enfra

Inculos microbiolgicos
Obtenidos a partir de Bancos de microorganismos pre adaptados a los concentrados de Pucobre y entregados por el Dr Greg Olsen, Little Bear laboratories, Inc ( Geosynfuels, Golden, CO). Campaas de bioprospeccin realizadas en el norte de Chile. Lugares impactados por la industria minera y seleccionados de acuerdo a su capacidad de biolixiviar concentrados calcopirtico en pruebas de matraces. drenajes cidos de minas. soluciones ricas de percolacin. tranques de relaves (Chaaral). rio salado y caleta palitos. fuentes termales del norte de Chile en particular las termas de rio Negro y El Tatio.

Bio prospeccin de Inculos

clonamiento

Zona alta ZA

Zona media ZM

Zona baja ZB

Concentrado de Calcopirita
Biolixiviacin en matraz (1L)
Anlisis qumicos, granulomtricos y Mineralgicos

Anlisis de biodiversidad y qumicos

Generacin de inculo para

Biolixiviacin en tanque agitado (35L) Prelixiviacin cido/frrica en tanque (50L)

Anlisis de biodiversidad y qumicos Anlisis qumicos, granulomtricos

Anlisis comparativos de diversidad y abundancia relativa por RFLP, T-RFLP caracterizacin de especies dominantes por clonamiento y secuenciacin Anlisis qumicos comparativos

Generacin de inculo para

Biolixiviacin en Columnas ( Cuarzo y Ripios , 2 y 6 m de altura)

Anlisis de biodiversidad y qumicos

Anlisis mineralgicos concentrado calcopirtico.

Composicin mineralgica global
ESPECIES CALCOPIRITA COVELINA ENARGITA PIRITA ESFALERITA MAGNETITA HEMATITA LIMONITA RUTILO GANGA TOTAL % PESO 52,68 0,11 0,05 27,73 0,05 2,78 1,36 0,05 0,05 15,12 100,00 %S 18,44 0,04 0,02 14,81 0,02 %Cu 18,23 0,08 0,03 %Fe 16,02 %Zn %As

0,01 12,92 0,03 2,01 0,95 0,03 (*) 31,93

33,32

18,33

0,03

0,01

Composicin mineralgica 100% base minerales sulfurados de cobre

ESPECIES CALCOPIRITA COVELINA ENARGITA TOTAL % PESO 99,68 0,22 0,10 100,00 %S 22,87 0,05 0,02 22,94 %CU 34,49 0,14 0,05 34,68 %Fe 30,30 0,01 30,31

Asociaciones mineralgicas de sulfurados de cobre (por especies)

ESPECIES

CALCOPIRITA COVELINA ENARGITA

Libre 93,09 50,00 100,00

Asoc. Gn. 2,19 50,00

Asoc. Py 3,84

Inclu. Gn. 0,77

Inc. Py/Gn 0,11

TOTAL 100,00 100,00 100,00

Asociaciones mineralgicas de sulfurados de cobre (% Cu)

ESPECIES Libre

CALCOPIRITA COVELINA ENARGITA

TOTAL

32,11 0,07 0,05

32,23

Asoc. Gn. 0,76 0,07 0,83

Asoc. Py 1,32

Inclu. Gn. 0,27

Inc. Py/Gn 0,04

1,32

0,27

0,04

TOTAL 34,49 0,14 0,05 34,68

Grado de liberacin de cobre

Libre 92,91 Asociado 6,20 Ocluido 0,89 TOTAL 100,00

Caracterizacin qumica de los concentrados TRFLP calcopirticos

A) Recibido

LEY Muestra Concentrado Rougher

S % 29.93

Cu % 17.75

Fe % 26.04

As % 0.02

Ag g/T 29.40
3+ )

Au g/T 3.95

Cl% 0.08

CaCO3 Si % % 2.88 3.29

B) pre-lixiviados mediante agitacin cida Frrica (10grL/Fe

Leyes S Muestras Pre Lixiviado

Termfilos (Ripios) Moderados (Ripios) Mesfilas (Ripios) Termfilos(Cuartiza) Moderados (Cuartiza) Mesfilas (Cuartiza)

CuT FeT %
17.75 17.05 16.95 16.95 17.15 17.25

Cl%
0.081 0.081 0.081 0.088 0.075 0.075

As %
0.016 0.019 0.019 0.018 0.019 0.020

Ag

Au CaCO3 %
2.96 2.88 2.84 2.87 2.88 2.94

Si %
3.21 3.29 2.96 3.06 2.78 2.83

%
29.66 29.93 30.1 29.61 30.04 30.1

%
25.48 26.04 25.46 25.82 26.24 26.36

g/T g/T
34.9 29.4 31.5 28.4 28.6 30.1 4.09 3.95 3.74 3.24 4.24 4.08

5 4 3 2 1

Vista panormica del deposito de ripios de biolixiviacin dispuesto en Planta Biocobre. En la actualidad Planta Biocobre dispone de ms de 7 Millones de Toneladas de Ripios de biolixiviacin en 5 niveles o bancos superpuestos de 10 mts de altura cada uno. Muestras de estos ripios fueron lavadas y seleccionadas granulomtricamente ( 3 a 12 mm) para ser usadas como matriz soporte en pruebas de biolixiviacin en columnas de concentrados de flotacin de mineral de calcopirita.

Anlisis qumicos de la fraccin utilizada de ripios de lixiviacin (Biocobre) y de clonamiento las muestras de Cuarzo utilizados como roca soporte.

Muestra Roca Soporte S % Ripios 3.34 CuT % 0.41 FeT % 11.39 Cl% 0.102

Leyes As % 0.007 Ag g/T 3.3 Au g/T 0.14 CaCO3 % 1.76 SiO2 % 25.01

Cuarzo

0.03

0.00

0.00

0.012

0.002

0.0

0.0

0.27

99.58

Determinacin mediante tcnica de Digestin cida y determinacin de minerales mediante espectrometra de Absorcin Atmica (AAS)

(a)

(b)

(c)

(d)

Imgenes de muestras de los minerales utilizados en pruebas de biolixiviacin. Como roca soporte (a,b) y del concentrado calcopirtico (c), utilizado en las pruebas de biolixiviacin en columnas. Imgenes del mineral de Ripio lavado del desecho lixiviacin de Planta Biocobre (a), de mineral de cuarzo lavado (b), del concentrado calcopirtico recibido (c). Vista superior del concentrado ya aglomerado sobre roca soporte (d), y cargado en la columna de biolixiviacin.

3 L /min

Agitacin 300 rpm

Aire CO2 2%

Reactor polipropileno

cinta calefactora Pulpa: 5 % slidos pH < 1,5 Volumen total 50 L Volumen operacin 35L aislante trmico

termocupla
controlador

Hlice Acero inoxidable Bafles polipropileno

burbujeador

12 L /hr/m2 Anlisis Gas Consumo O2 bolitas de polipropileno Concentrado Aglomerado Columna polipropileno Cinta calefactor Concentrado calcopirtico Termocupla Controlador Aislante

2 L / min. 1mm Roca Soporte bolitas de polipropileno Anlisis pH, Eh, Cu T, Fe T, cido

Aire CO2 2%

Solucin percolacin

Solucin riego

Ajuste pH =1,5

Bomba peristltica

Inoculacin de las experiencias

Protocolo de Inoculacin:

clonamiento

La inoculacin de las experiencias se realizo en dos etapas: 1.- Inoculacin primaria, en la etapa de aglomeracin en la pulpa de los concentrados agregada sobre las distintas matrices de roca soporte a una densidad de siembra de 1,5 X107 clulas por gramo de concentrado. 2.- En las soluciones de riego de las columnas a una densidad de inoculacin de 1,5 X108 Clulas por ml de solucin. En ambos casos la densidad celular fue determinada mediante conteo de microorganismos por microscopia de luz en una cmara de Petroff Houser.

Resultados

1. Pruebas de lixiviacin Batch: Reactor de tanque agitado 2. Pruebas en columnas

3. Anlisis moleculares

A)

C)

B)

D)

Resultados de las pruebas de biolixiviacin por Agitacin a 38, 49 y 69C. (valores promedio de pruebas en duplicado). A) % de disolucin de Cu en la pulpa; B) Concentracin de Fe (gr./l) en la pulpa, C) Variacin en el pH en la pulpa, D) Variacin del Potencial Electroqumico (Eh respecto al electrodo de platino) en la pulpa. Condiciones operacionales, de 5% slidos de concentrado calcopiritico 17,5 % Cu, 35 lts totales de operacin, agitacin (300rpm) y efectuadas a temperaturas Mesoflicas, Termoflicas Moderadas y Termoflicas Extremas ( 38, 49 y 69 C, respectivamente).

Oxidacin de Cu sulfurado (%), a partir de anlisis de slidos en columnas de biolixiviacin. Datos obtenidos a partir de muestras slidas a 38, 64, 84 y 96 das de operacin mediante digestin cida de minerales muestreados de pruebas realizadas a temperaturas de operacin de microorganismos Termfilos, Moderados y Mesfilos (70, 50 y 38 C respectivamente) de concentrado calcopirtico de flotacin aglomerado sobre matriz soporte de ripios de lixiviacin lavados o bien sobre mineral de cuarzo lavado.

A)

B)
Concentracin de Cu (A) y Fe (B) (gr./l) disuelto en las soluciones de biolixiviacin recirculadas por cada columna, medio mediante AAS. Concentraciones obtenidas mediante AAS de soluciones de percolacin obtenidas de pruebas de biolixiviacin de concentrado calcopirtico aglomerado sobre matriz soporte de ripios lavados de lixiviacin o sobre mineral lavado de cuarzo. Experiencias realizadas a temperaturas de operacin caractersticas de microorganismos Termfilos, Moderados y Mesfilas (70, 50 o 38C respectivamente).

A)

C)

B)

D)

Parmetros Cinticos de las solubilizacin de cobre y fierro en experiencias en columnas, en relacin a la variacin de pH y de Potencial electroqumico Eh del medio lixiviante. A) % de disolucin de Cu; B) % de disolucin de Fierro; C) Variacin del pH y D) Variacin de Potencial Electroqumico Eh en la solucin de biolixiviacin de cada columna. Datos generados partir del anlisis de las soluciones de biolixiviacin de cada una de las columnas mediante AAS ( A y B) y mediante medicin con electrodo de pH Ag/AgCl (para C) y electrodo de Platino ( para D). Muestras tomadas y o medidas de cada una de las soluciones percoladas provenientes de las columnas cargadas con concentrados calcopirticos aglomerados en torno a una partcula soporte de Ripios o de cuarzo y biolixiviadas a temperaturas propias de microorganismos Mesfilos, Termfilos Moderados y Termfilos Extremos

A)

C)

B)

D)

Resultados de proyecciones de la cinticas industriales de procesamiento de mineral a partir de los datos de consumos y de disolucin de Cu por columna. A) consumo de cido Total por columna; B) Proyeccin del consumo Neto de cido; C) Tasa (en % diario) de solubilizacin de cobre por columna. D) Proyeccin tasa diaria de consumo de cido por tonelada de concentrado al da. Proyeccin de consumos Netos en plantas de SX-EW a tres distintas temperaturas de operacin del proceso de biolixiviacin (Termo, Mod y Meso equivalentes a 70, 50 y 38C respectivamente), concentrados aglomerados sobre matriz de ripios de lixiviacin lavados o sobre mineral lavado de cuarzo. Calculado a partir de valores de consumo total de cido en pruebas de biolixiviacin menos los equivalentes cidos derivados del crdito estimado de cido generado en la etapa de electro depositacin del ctodo de cobre. (1,54 kg H2SO4 por kg de ctodo electro depositado).

LIAP Laboratorio de Investigacin Aplicada

Extraccin de DNA metagenmico

Termfilos Moderados (MoBio) Termfilos Extremos (Wizard)
6

Termfilos Extremos (MoBio)

4 semanas de cultivo

Cultivo precipitado durante 30 min.

Se toma solo el sobrenadante

Cultivo homogenizado
Se toma del Homogenizado

Mesfilos (MoBio)

5 gr. Calcopirita 5 gr. Rougher 1 gr. Azufre 400 ml Medio Basal + 25g/L sulfato ferroso

33C

1
50 ml por tubo 50 ml por tubo

Termfilos Extremos (Bao)

Consorcio de Cultivos Mesfilos (25-45C)

4000 rpm 90 min El pellet fue lavado con agua cida ( X3)

4000 rpm 90 min El pellet fue lavado con agua cida ( X3)

El pellet fue lavado con PBS-Tween 20 ( X3)

El pellet fue lavado con PBS-Tween 20 ( X3)

1500 pb 1000 pb 500 pb

Centrifugar 13.000 rpm 3 min

Centrifugar en Speed Vac para secar el pellet, 40 min

Pellet para Kit Wizard

Pellet para Kit MoBio

0.5 gr para Kit MoBio

OBTENCIN DNA GENMICO

Acidithiobacillus ferrooxidans Marcador

8

Marcador

Reaccin en cadena de la polimerasa PCR

Termfilos Moderados (MoBio)

Termfilos Extremos (Wizard)

Termfilos Extremos (MoBio)

Termfilos Extremos (Bao)

Marcador (100 pb)

Mesfilos (MoBio)

Una vez estandarizada las condiciones de PCR se procedi a amplificar el gen 16S rDNA para los distintos consorcios bacterianos mesfilos, termfilos moderado y termfilos extremo. Electroforesis en gel de agarosa 1%.

1500 pb 1000 pb 500 pb

Acidithiobacillus ferrooxidans aportado por C. Jerez

Acidithiobacillus ferrooxidans (MoBio)

Visualizacin de los patrones de RFLP de productos de PCR del 16s rDNA de mesfilos (M) y termfilos moderados (TM) extrados de pruebas de tanque agitado y digeridos con cuatro enzimas distintas
Hae III
MspI AluI HhaI

Leader (bp)

M
1 2

TM
3

M
4

TM
5

M
6

TM
7

M
8

TM
9

50
10

100
11

Gel de acrilamida teido con plata. Lneas (1) leader 50bp, 2) HaeIII mesfilo, 3) HaeIII t. moderado, 4) MspI mesfilo, 5) MspI t. moderado, 6) AluI mesfilo, 7) AluI t. moderado, 8) HhaI mesfilo, 9) HhaI t. moderado, 10) leader 50bp, 11) leader 100bp. En crculos rojos se muestran las bandas que parecieran ser compartidas entre los distintos tratamientos (mesfilas y termfilos moderados).

Estudio de las comunidades biolixiviantes Clonamiento y secuenciacin.

Muestra de algunos de los patrones de RFLP digeridos con HaeIII de muestras de los 16S rDNA clonadas.

Los patrones de RFLP obtenidos fueron utilizados para determinar el factor de cobertura de la biblioteca de clones creada. Patrn leader de 50 pb en primera y ltima banda , imgenes muestran el nmero de placa de petri chequeada y nmero del clon de la respectiva placa , se incorpora letra que adjudica el patrn de corte a un ribotipo especfico de acuerdo a la placa chequeada.

TABLA VI: Caracterizacin de las secuencias de 16S rRNA clonales de acuerdo a su similitud con las secuencias de bases de datos para bacterias de NCBI.
INOCULOS Tratamiento Inoculo Inoculo Inoculo Inoculo Inoculo Inoculo Inoculo Inoculo Inoculo Inoculo Inoculo Meso Meso Meso Meso Meso Meso Meso Meso Meso T. Ext T. Ext N Clon 2-.28 2-.42 2-.43 2-.8 2-.82 2-.92 5-.17 5-.2 5-.44 9-.39 11-.17 Organismo Relacionado % Identidad 99,5 99,5 93,1 99,5 95,7 99,5 96,1 99,2 95,8 99,4 99,8
E

T_RFLP in silico N Acceso U34974 DQ909079 AB089844 CP001132 EF612379 CP001219 DQ529309 CP001219 DQ676505 AB089845 AB089844 Hae III 152 308 137 170 217 251 169 251 251 130 130 HhaI 225 262 71 206 149 203 204 203 203 140 140 AluI 232 289 239 275 318 232 276 232 232 178 177

Sulfobacillus disulfidooxidans Acidithiobacillus ferrooxidans Sulfobacillus thermosulfidooxidans Acidithiobacillus ferrooxidans Uncultured Sulfobacillus Acidithiobacillus ferrooxidans Acidithiobacillus ferrooxidans Acidithiobacillus ferrooxidans Acidithiobacillus ferrooxidans Sulfobacillus thermosulfidooxidans Sulfobacillus thermosulfidooxidans

Anlisis comparativo de secuencias de 16SrDNA obtenida de los clones mediante secuenciacin de los 16SrDNA amplificados a partir de muestras de DNA genmico de pulpas de experiencias de lixiviacin en matraces, 5% p/v concentrado calcopirtico.

TABLA VI: Caracterizacin de las secuencias de 16S rRNA clonales de acuerdo a su similitud con las secuencias de bases de datos para bacterias de NCBI.
TANQUE AGITADO Tratamiento Batch Batch Meso Meso N Clon 30A 33A Organismo Relacionado % Id 98,2 96,4
E

T_RFLP in silico N Acceso DQ470072 DQ 534052 Hae III 215 190 HhaI 563 376 AluI 231 218

Acidithiobacillus caldus Leptospirillum ferriphilum

Batch
Batch Batch Batch Batch Batch Batch Batch Batch Batch Batch

Meso
Meso Mod Mod Mod Mod T.Ext T.Ext T.Ext T.Ext T.Ext

34A
35A 15B 40B 50B 19B 46C 56C 58C 59C 68C

Thermophilic bacterium
Uncultured Leptospirillum Leptospirillum ferriphilum Sulfobacillus thermosulfidooxidans Curvibacter lanceolatus Cupriavidus metallidurans Cupriavidus metallidurans Leptospirillum ferriphilum Leptospirillum ferriphilum Leptospirillum ferriphilum Acidithiobacillus caldus

97
88,7 93,7 95,4 95,6 98,1 98,5 96,7 96,9 98,1 97,7

EF199989
FJ890907 DQ 534052 EU499919 GU368379 CP000352 CP000353 NR_028818 DQ534052 AF356830 EU499920

216
143 145 130 220 203 203 127 190 197 216

563
328 329 140 207 70 70 137 563 328 503

230
171 172 177 368 157 157 202 230 224 230

2,43E-120

Anlisis comparativo de secuencias de 16SrDNA obtenida de los clones mediante secuenciacin de los 16SrDNA amplificados a partir de muestras de DNA genmico de pulpas de experiencias de lixiviacin en tanques agitados 5% p/v concentrado calcopirtico.

TABLA VI: Caracterizacin de las secuencias de 16S rRNA clonales de acuerdo a su similitud con las secuencias de bases de datos para bacterias de NCBI.
COLUMNAS CONCENTRADO CALCOPIRITICO Tratamiento Ripio Ripio Ripio Ripio Ripio Ripio Ripio Ripio Ripio Ripio Ripio Cuarzo Cuarzo Cuarzo Cuarzo Ripio Meso Meso Meso Meso Meso Mod Mod Mod Mod Mod Mod Mod Mod Mod Mod T. Ext N Clon 1-.29 1-.33 1-.38 4-.24 4-.39 14-.16 14-.23 14-.65 m75 m77 m78 3-.40 3-.41 8-.11 8-.41 12-.49 Organismo Relacionado % Identidad 97,5 100 99,9 99,5 99,9 99,4 99,4 98,8 99,8 99,3 100 97,2 99,8 99,6 99,9 97,7
E

T_RFLP in silico N Acceso FN400770 DQ676505 AM502931 CP001132 CP001219 CP001132 DQ909079 CP001219 DQ676505 NR_028982 AM502931 EU084706 EU084705 CP001219 NR_028982 AM502931 Hae III 251 251 251 170 251 170 308 251 251 251 232 226 226 251 251 251 HhaI 203 203 203 206 203 206 262 203 203 203 186 181 180 203 203 203 AluI 232 232 232 275 232 275 289 232 232 274 212 207 207 232 232 232

Acidithiobacillus ferrooxidans Acidithiobacillus ferrooxidans Acidithiobacillus ferrooxidans Acidithiobacillus ferrooxidans Acidithiobacillus ferrooxidans Acidithiobacillus ferrooxidans Acidithiobacillus ferrooxidans Acidithiobacillus ferrooxidans Acidithiobacillus ferrooxidans Acidithiobacillus albertensis Acidithiobacillus ferrooxidans Acidithiobacillus thiooxidans Acidithiobacillus thiooxidans Acidithiobacillus ferrooxidans Acidithiobacillus albertensis Acidithiobacillus ferrooxidans

Ripio

T. Ext

12-.64

Acidithiobacillus ferrooxidans

99,6

CP001132

170

206

275

Anlisis comparativo de secuencias de 16SrDNA obtenida de los clones mediante secuenciacin de los 16SrDNA amplificados a partir de muestras de DNA genmico de slidos de experiencias de lixiviacin en Columnas 20 % p/p concentrado calcopirtico.

T-RFLP Anlisis de los polimorfismos de los fragmentos Terminales por electroforesis capilar
Estudio de las comunidades biolixiviantes
2.- Amplificacin por PCR de genes 16S rRNA

1.- Toma de muestras y extraccin de DNA

3.- Digestin con enzimas de restriccin

5.- Ploteo de resultados

4.- secuenciacin y deteccin de fragmentos marcados

6.-Asignacin de acuerdo a TRFLP in Silico.

(a)
A. ferrooxidans 251 nt..

(b)
L. ferriphillum 376 nt.

(c)
A. ferrooxidans 232 nt.

A. ferrooxidans sp 170. L. ferriphillum 190 nt.

(d)

(e)
S. disulfooxidans 230 nt. A. albertensis 274 nt.

(f)

A. tiooxidans 226 nt.

(g)

A. ferrooxidans 203 nt.

(h)
C. matalidurans 157. nt

(i)

Representacin de los perfiles de T-RFLP de las secuencias de 16S rDNA extradas de los consorcios crecidos en las pruebas de biolixiviacin en columnas aglomeradas en torno a Ripios de biolixiviacin como roca soporte. Abundancia relativa (%) de T-RFLP de 16S rDNA obtenidos utilizando las endonucleasas HaeIII (a,d,g), Hha I (b,e,h) y Alu I ( c,f,i). Perfiles de T-RFLP obtenidos de experiencias en condiciones de operacin Mesoflicas (a,b,c) , Termoflicas Moderadas (d,e,f) y Termoflicas Extremas ( g,h,i). Flechas rojas corresponden a asignacin de Grupo segn TRFLP in silico con cada endonucleasa estudiara y fueron obtenidos mediante secuenciacin de 16S rDNA clonales.

(a)
A. tiooxidans 226 nt.
A. tiooxidans 232 nt. A. ferrooxidans 251 nt.

(b)

(c)
S. termosulfooxidans 130 nt. L. Ferriphillum 145 nt. A. ferrooxidans 170 nt.. L. ferriphillum 190 nt.

(d)

(e)
L. Ferriphillum 190 nt. C. metalidurans 203 nt.

(f)
A. caldus 215 nt.

Representacin de los perfiles de T-RFLP de las secuencias de 16S rDNA extradas de los consorcios crecidos en las pruebas de biolixiviacin. Abundancia relativa (%) de T-RFLP de 16S rDNA obtenidas de Tanques agitados (a,c,e) y de columnas aglomeradas en torno a Ripios de biolixiviacin como roca soporte (b,d,f). Perfiles de T-RFLP obtenidos utilizando endonucleasa Hae III. Perfiles de T-RFLP obtenidos a partir de experiencias en condiciones de operacin Mesoflicas (a,b) , Termoflicas Moderadas (c,d,) y Termoflicas Extremas ( e,f). Flechas rojas corresponden a asignacin segn TRFLP in silico para HaeIII obtenidos mediante secuenciacin de 16S rDNA clonales.

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

Imgenes (SEM) Muestras de cuarzo recubierto a 90 das de operacin. Micrografa electrnica de barrido (SEM) de la superficie de cuarzo recubierto en concentrado calcopirtico al final del periodo de biolixiviacin en columna (90 das). Imgenes obtenidas de los biofilms a distinta magnificacin ( de acuerdo a escala en cada imagen) generados en condiciones Mesoflicas 38 ( a,d), Termoflicas Moderadas 50 (b,e) y Termoflicas Extremas 69 C (c,f).

Recapitulando
Las recuperaciones de Cobre estn relacionadas con la temperatura de operacin de los reactores sean estos de tanque agitado o de concentrados aglomerados sobre distintas matrices minerales. En las pruebas de biolixiviacin en columna a temperaturas hipertermoflicas las recuperaciones de cobre se correlacionan con potenciales electroqumicos moderados en relacin a los alcanzados en condiciones mesoflicas y termoflicas moderadas. Las diferentes temperaturas de operacin pueden alterar significativamente tanto la riqueza de especies como su abundancia pero no causan una fuerte alteracin en la estructura de las comunidades bacterianas presentes, sobretodo al tratarse de experiencias en columnas.

Recapitulando
Independientemente de las temperaturas de operacin las comunidades que provienen de experiencias en columnas tienden a mantenerse estables, pero las comunidades provenientes de experiencias en tanques agitados y matraces presentan fuertes cambios en su composicin dependiendo de la temperatura de operacin. Las comunidades estaban mayormente dominadas por bacterias del genero Acidithibacillus y Sulfobacillus no importando la temperatura de operacin aplicada.

Los compuestos de iones frricos precipitados sobre las partculas de mineral en condiciones hipertermoflicas y termoflicas moderadas actan como estructurador de los biofilms efecto que no se aprecia al trabajar en condiciones mesoflicas.

pH 1,5 Temperatura 70C

SO4=

H+
O2

H2SO4 Fe2(SO4)3 + H2SO4

pH 7
O2

NAD(P)H H+ NAD(P) ATP H+ ADP + Pi

O2 H2O

Fe SO4

Fe3+
O2

SO4

pH 7
O2

O2 O2

Acidithiobacillus ferrooxidans

CuFeS2

H+

FeSO4+ CuSO4 + S

Muchas Gracias.

Dr. Juan Rivadeneira H LIAP SpA. jrivadeneira@liap.cl