Cuestionario: Uso de herramientas enzimolgicas

Dra. Norma Elena Rojas Ruiz

INGENIERA GENTICA

Ingeniera en Biotecnologa 6to. Cuatrimestre Alumna: Grate Vlez Lorena Fecha de entrega: 26 - Sept- 2013

1. Qu aplicaciones tiene la DNasa? La DNasa I es una endonucleasa que genera rupturas no especficas en el ADN para liberar di-, tri- y oligonucletidos fosforilados con extremos terminales 5-fosforilados y 3-hidroxilados. Acta sobre hebras de ADN simple y doble, cromatina e hbridos de ARN:ADN. En laboratorio se utiliza principalmente en la degradacin del ADN molde en las reacciones de transcripcin y eliminacin de contaminacin de ADN genmico de muestras de ARN. Es una enzima capaz de degradar el ADN, usada en el tratamiento de la fibrosis qustica. La fibrosis qustica es una enfermedad gentica degenerativa, de diferente gravedad segn el rgano afectado. En los pulmones, el caso ms grave, genera el aumento de la produccin de mucosidad, taponando las vas respiratorias y favoreciendo las infecciones. Ante ello, el sistema inmune responde destruyendo las clulas, con la consiguiente liberacin de su ADN. ste aumenta la viscosidad y densidad de la mucosidad, crendose un crculo vicioso. La DNasa acta hidrolizando el ADN liberado, disminuyendo la viscosidad de la mucosidad. Los preparados comerciales son muy especficos y eficaces (Pulmozina de Genentech), pero sometidos apatentes farmacuticas 2. Cmo funciona la transcriptasa reversa? La transcriptasa inversa es una enzima usada para generar ADN complementaria a partir de una plantilla de ARN, un proceso denominado transcripcin inversa. La transcriptasa inversa es necesaria para la replicacin de los retrovirus, y sus inhibidores son ampliamente utilizados como frmacos antirretrovirales. Su actividad tambin se asocia con la replicacin del cromosoma y algunos elementos genticos mviles. Transcriptasa inversa. Sintetiza ADN utilizando como molde ARN. Tambin necesita un cebador que provea un extremo 3OH donde engancharse para iniciar la sntesis. Carece de actividad exonucleasa 3-5, que es la correctora de errores en otras polimerasas, por lo que acumula los fallos que produce; incorpora una base equivocada cada 500 bases aproximadamente. Posee actividad ARNasa H que puede degradar el ARN en forma de hbrido ARN-ADN. Durante mucho tiempo se emple la transcripatasa inversa aislada del virus que produce la mieloblastosis en las aves, pero su poderosa actividad ARNasa interfera muchas veces con la estabilidad del ARN molde antes de que se llegara a completar la copia del mismo. Actualmente se utiliza preferentemente la transcriptasa inversa obtenida por ingeniera gentica a partir del gen clonado del virus Molones que produce la leucemia de ratn; esta ltima enzima posee una ARNasa H mucho ms dbil.

Transcripcin inversa retroviral Sus genomas constan de dos molculas de ARN monocatenario de sentido positivo con una cola poliadenilado 5 'tapa y 3'. Ejemplos de retrovirus son virus de inmunodeficiencia humana y el virus linfotrpico T humano. Creacin de ADN de doble hebra se produce en el citosol como una serie de pasos: a) Un ARNt celular especfica acta como un cebador y se hibrida con una parte complementaria del genoma del virus llamado el primer sitio de unin o PBS El ADN complementario se une a la regin U5 y R de la ARN viral b) Un dominio de la enzima transcriptasa inversa llamada ARNasa H degrada el extremo 5 del ARN que elimina la regin U5 y R c) El cebador luego salta a la 3 extremo del genoma viral y las hebras de ADN recin sintetizadas se hibrida con la regin R complementaria en el ARN d) La primera hebra de ADN complementario se extiende y la mayora de ARN viral es degradado por la ARNasa H e) Una vez que la hebra se completa, sntesis de la segunda hebra se inici a partir del ARN viral f) Hay, pues, un nuevo salto en la PBS de la segunda cadena se hibrida con la cartilla complementaria de la primera cadena g) Ambas cadenas se extienden ms all y se pueden incorporar en el genoma de anfitriones por la enzima integrasa

3. Qu es la actividad estrella? Es el fenmeno que ocurre cuando la concentracin de la enzima es demasiado alta o si sta se incuba de manera prolongada con el ADN. Por lo que sta empieza a cortar en sitios diferentes a su secuencia de reconocimiento. 4. Cul es el mecanismo de accin de las enzimas de restriccin? Enzimas de Restriccin Las enzimas de restriccin, tambin conocidas como endonucleasas, son enzimas que cortan los enlaces fosfodiester del material gentico a partir de una secuencia que reconocen. Las mismas permiten cortar DNA de hebra doble, donde reconocen secuencias palindrmicas (secuencias que se leen igual en ambas direcciones). Son extradas de organismos procariticos (bacterias), donde actan como un mecanismo de defensa, para degradar material gentico extrao que entre en la clula. Las bacterias tienen la capacidad de metilar su DNA, lo cual sirve para distinguir entre el DNA extrao y el DNA propio. Las enzimas de restriccin no pueden cortar DNA metilado, de este modo solo afectan el DNA extranjero y no el DNA bacterial.

Existen 3 tipos de enzimas de restriccin:

1. Tipo I y Tipo III: a. Tienen actividad de restriccin (cortan) y modificacin (metilan). b. Cortan a cierta distancia de la secuencia de reconocimiento, las Tipo I cortan lejos de la secuencia de reconocimiento, ya sea ro arriba o ro abajo. Las Tipo III cortan de 5-8 bases antes o despes de la secuencia que reconocen.
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c. Necesitan ATP para moverse a travs de la molcula de DNA, desde el lugar de reconocimiento hasta el sitio del corte.

2. Tipo II: a. Slo tienen actividad de restriccin. b. Cortan de manera consistente y predecible dentro de la secuencia que reconocen. c. Slo requieren Mg++ como cofactor. d. No necesitan ATP. Aplicaciones de las enzimas de restriccin: 1. Hacer mapa de restriccin de un plsmido o bacterifago. 2. Fragmentar DNA genmico para separacin de electroforesis y Southern Blot. 3. Generacin de fragmentos para ser usados como sondas marcadas en Southerny Northern blotting. 4. Generacin de fragmentos para ser subclonados en los vectores apropiados, creacin de DNA recombinante.

5. Qu consideraciones se deben tomar en cuenta en una reaccin de restriccin? Que la eficiencia de las enzimas va en proporcin a la pureza del ADN que se va a digerir y la forma del ADN. EL adn substrato para las enzimas de restriccin tiene diferente forma y tamao dependiendo de su origen. El ADN de un plsmido es circular y tiene un peso molecular entre 3 y 10 kb; el ADN del bacterifago lambda o clones de lambda son lineales y con un tamao alrededor de 48 kb; el ADN genmico es lineal y de muy alto peso molecular; por lo que el manejo de enzimas de restriccin en cada caso tiene sus propios problemas y precauciones. Los contaminantes que se encuentren en una preparacin de ADN pueden inhibir la actividad de las endonucleasas de restriccin (fenol, cloroformo, etanol, SDS, alta concentracin de sales, nucleasas, etc.) la cantidad de estos contamianantes va de acuerdo con el mtodo de purificacin utilizado y el manejo de ADN. Los efectos de estos contaminantes pueden reflejarse en: ausencia de digestin, digestiones parciales, degradacin, actividad en estrellas, baja productividad. 6. Cmo funciona la ADN polimerasa? La principal reaccin qumica catalizada por una DNA polimerasa es la sntesis 53 de un polinucletido de DNA. Algunas polimerasas combinan esta funcin con por lo menos una actividad de exonucleasa, lo que significa que estas enzimas puedan degradar polinucletidos adems de sintetizarlos. Muchas DNA dependientes del molde bacterianas y eucariontes tienen actividad 3 a 5 exonucleasa. Esta actividad le permite a la enzima eliminar nucletidos del extremo de la cadena 3 que se encuentra recin sintetizada. Se la considera una actividad de correccin cuya funcin es subsanar el error de apareamiento de bases ocasional que podra ocurrir durante la sntesis de cadenas. Las bacterias y los eucariontes tienen otras DNA polimerasas que participan fundamentalmente en la reparacin de DNA daado. Estas enzimas comprenden las DNA polimerasas II, IV y V de Escherichia coli, y las DNA polimerasas , , y en eucariontes. Enzimas DNApol bacterianas DNA polimerasa I DNA Subunida des Actividades de exonucleasa 3 a 5 5 a 3 Funcin

1 Por

S lo S
6

S No

Reparacin, replicacin del DNA Principal enzima de

polimerasa III DNApol eucariontes DNA polimerasa DNA polimerasa DNA polimerasa DNA polimerasa

menos 10 4

No

No

replicacin Cebadura replicacin.

durante

la

2 2o3 1

Si Si

No No

Replicacin de DNA mitocondrial Principal enzima de replicacin. Requerida para la unin de protenas cohesinas que mantienen juntas las cromtides hermanas hasta la anafase de la divisin nuclear.

No se sabe con certeza porqu las DNA polimerasas no pueden comenzar la sntesis de un molde totalmente monocatenario, pero quiz se relacione con la actividad de correccin de stas enzimas, que es esencial para la exactitud de la replicacin. Un nucletido insertado de manera incorrecta en el extremo 3 de la cadena de DNA en crecimiento en que, por ende, no ha formado pares de bases con el polinucletido molde puede ser eliminado por la actividad 3 5 exonucleasa de una DNA polimerasa. La consecuencia es que la polimerasa puede extender un polinucletido de manera eficiente slo si el nucletido 3 est apareado por sus bases lo que a su vez, podra ser la razn por la cual un molde totalmente monocatenario que, por definicin, carece de un nucletido 3 apareado por sus bases no puede ser utilizado por una DNA polimerasa. 7. Cul es el fundamento de la PCR? El genoma humano consta de 3.1 x 109pb y 22,000 genes que representan el 5% del genoma. De estos genes el 30% contiene instrucciones para hacer protenas y el 70% instrucciones para regular la translacin a protenas de otros genes: Ribosomal (rRNA), transfer RNA (tRNA), small nucleolar RNA (snoRNA), micro RNA (miRNA). Con las tcnicas de amplificacin conseguimos hacer billones de copias de una secuencia corta de un gen concreto, con lo que deja de ser una fraccin insignificante de pares bases en nuestro tubo de ensayo y va a resultar mucho ms sencilla de analizar. Pero estas tcnicas no slo sirven para analizar el genoma sino tambin alteraciones epigenticas, como la cantidad de ARNm o incluso la metilacin de las regiones promotoras que regulan la expresin del gen. La PCR multiplica (amplifica) exponencialmente una secuencia especfica de ADN bicatenario, sintetizando grandes cantidades de un segmento especfico de ADN a
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partir cantidades inferiores a 1 g del ADN de muestra (y en teora a partir de una sola molcula de ADN). Comprende varios ciclos divididos en tres etapas (desnaturalizacin, hibridacin o anillamiento y extensin del cebador) que se resumen de la siguiente manera: primero se desnaturaliza el ADN por calor (90-94 C), y luego se deja bajar la temperatura de modo que los extremos 3 de las hebras ahora separadas se puedan aparear con oligodesoxinucletidos perfectamente complementarios (cebadores o primers), cuya longitud sea suficiente (20-30 nucletidos) para formar hbridos estables con la molcula que sirve de plantilla. Una polimerasa resistente a la desnaturalizacin por calor, la polimerasa Taq llamada as por la bacteria termfila Thermus aquaticus, de la que se haba aislado, extiende los extremos 3 de ambos oligonucletidos utilizando las hebras del ADN bicatenario como plantilla, proceso que se conoce como extensin del cebador (primer extension). Una ltima desnaturalizacin pone fin a un ciclo y da comienzo al siguiente. Al cabo del primer ciclo se obtienen dos molculas bicatenarias del cido nucleico original. El ciclo anterior se repite muchas veces (el nmero ptimo es de 20 a 50 veces en una PCR tpica), sin aadir ms enzima y usando las molculas obtenidas en el ciclo anterior como plantilla. De esta forma se produce un aumento exponencial del nmero de copias de la secuencia especfica igual a 2n, donde n es el nmero de ciclos.

8. Cul es el mecanismo de accin de las ligasas? Las ligasas o DNA ligasas desempean su funcin en las clulas durante el proceso de replicacin, entre otros. Su capacidad para catalizar la unin de cadenas de DNA es de particular importancia en la sntesis de la hebra retardada de DNA, cuyos fragmentos de Okasaki deben unirse entre s. Por otra parte, la experimentacin con cidos nucleicos aprovecha sta actividad enzimtica como herramienta de uso frecuente, para conectar molculas de DNA, en una actuacin formalmente opuesta a las nucleasas. La reaccin de las ligasas requiere la presencia de un grupo fosfato en el extremo 5 de una hebra de DNA y un grupo OH en el extremo 3 de la otra. Estas enzimas catalizan pues, la formacin de un solo enlace fosfodiester, parte del fosfodiester resultante. Unos organismos (animales, fagos) utilizan ATP como nucletido dador de energa, al tiempo que otros seres vivos (E. coli) utilizan NAD+ (que se desdobla en AMP y nicotinamida mononucletido: NMN+)

9. Qu consideraciones debemos tomar en cuenta en una reaccin en cadena de la polimerasa? El diseo de los cebadores tiene que ser lo suficientemente largos para ser especficos para la secuencia blanco, pero no tan largos que resulten demasiado costosos y tambin deben tener propiedades de enlace ptimas. La secuencia del cebador no debe conducir a estructuras secundarias dentro del cebador ni entre dos cebadores distintos; de lo contrario, los cebadores se enlazaran consigo mismos en vez que con el ADN que se est amplificando. Es crucial el control de la temperatura a la cual se calientan las cadenas para separarlas, ya que es la temperatura que se elige para que los cebadores se solden.

10. Describa el mecanismo de accin de 2 enzimas modificadoras de extremos. Enzima fosfatasa alcalina Enzima que cataliza la eliminacin de grupos fosfato de los extremos de un DNA/RNA. Las fosfatasas son enzimas que atacan las uniones ster, pero en este caso, toman su nombre del grupo vecino a la unin que van a atacar, de manera que se denominan fosfatasas (cuando quitan una molcula de monofosfato), pirofosfatasas (cuando quitan el cido fosfrico como esteres dobles (pirofosfatos), o triples, etc.). Es de notar que las subunidades catalticas de estas enzimas no poseen la secuencia de localizacin nuclear por lo cual es posible que sean transportadas hacia el ncleo en unin de alguna de sus subunidades reguladoras.

Quinasas de T4 Estos catalizan la transferencia e intercambio de un grupo fosfato de la rATP (nucletido de trifosfato de ribosa adenina) a la terminal 5' hidroxilo de doble trenzado y solo trenzado ADN o ARN, y nuclesidos 3' monophosphates. La enzima tambin eliminar fosforilado grupos de 3'.

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