Universidad Politcnica de Pachuca DOCTORADO EN BIOTECNOLOGA PRODUCCIN Y PURIFICACIN DE XILANASAS EXTRACELULARES PRODUCIDAS POR Pleurotus opuntiae (Dur.

& Lv.) Sacc. I. INTRODUCCIN

Las enzimas son catalizadores biolgicos que acelera la velocidad de las reacciones bioqumicas con un elevado grado de especificidad, adems de requerir temperatura, pH, presin determinados; en su ausencia la mayora de las transformaciones qumicas requeridas para mantener activas a las clulas, tardaran mucho tiempo en efectuarse. Con base a estas caractersticas, las enzimas, se han aplicado a procesos biotecnolgicos que han venido a impulsar a la industria farmacutica para la obtencin de vitaminas, antibiticos, en anlisis clnicos (diagnstico); para curtir cuero, se han usado en sntesis orgnicas, en la industria textil; en industria de alimentos para la obtencin de jarabes glucosados y fructosados, produccin de aromas, sabores y manufactura de queso entre otros (Biely, 1993). Tradicionalmente las enzimas de uso prctico se han extrado a partir de vegetales y animales, pero actualmente se ha preferido el uso de microorganismos, porque es ms fcil manejar la produccin de enzimas mediante la estandarizacin de condiciones de cultivo, como pH, temperatura, concentracin de nutrientes, etc. que lleva a aumentar los rendimientos en la produccin de una enzima especfica (Ball et al., 1988). Los xilanos son componentes importantes de las hemicelulosas de las plantas y ellos estn compuestos de una cadena linear de residuos de D-xilosa con un tipo muy variado y nmero de sustituyentes dependiendo de la fuente de donde provengan (Bastawde, 1992). Debido a su compleja estructura, la degradacin del xilano requiere de la accin concertada de un nmero de enzimas (Christov y Prior, 1993). La degradacin de la cadena principal es llevada a cabo por las xilanasas, las cuales dan lugar a oligosacridos de diferentes tamaos (Biely, 1985). Estas enzimas son producidas por hongos y bacterias, un fenmeno interesante que existe en estos microorganismos xilanolticos, es la multiplicidad de las xilanasas (Wong, Tan, y Saddler,1988), es decir la produccin de isoenzimas con la misma actividad de endoxilanasa. La aparicin de mltiples xilanasas extracelulares en un mismo

Universidad Politcnica de Pachuca DOCTORADO EN BIOTECNOLOGA microorganismo, crea preguntas concernientes al origen y al papel que juegan las diferentes xilanasas en la degradacin de los xilanos (Biely, Markovik, y

Mislovicov,1985). El uso de los hongos tiene gran importancia en la produccin de enzimas debido a su metabolismo de digestin extracelular, estos procesos han sido aprovechados por la industria para diversas aplicaciones biotecnolgicas. Una de las estrategias utilizadas para la obtencin de las enzimas es el cultivo in vitro de estos organismos, lo que nos lleva a estudiar el medio ambiente donde se desarrollan de manera natural, para lograr la experimentacin en el cultivo de hongos silvestres saprtrofos con fines de obtencin de extractos enzimticos. Por otra parte, las relaciones que se establecen entre los hongos y otras especies por ejemplo con el Agave spp. (maguey), se han manifestado con un efecto mayor o menor en cada una de las etnias de nuestro pas, donde los agaves han establecido una relacin entre la diversidad biolgica y cultural dentro de una amplia perspectiva agroecolgica y econmica a travs de los que Gentry (1982) ha considerado la simbiosis hombre-agaves. Por ello, su conocimiento, usos, beneficios y

aprovechamiento por los diversos grupos humanos, se ha transformado conforme se desarrollaron las grandes culturas mesoamericanas hasta llegar a un aprovechamiento integral y racional de cada una de las partes que lo conforman. Entre ellas se encuentra el consumo de P. opuntiae que es conocido comnmente en Mxico como hongo de maguey u hongo blanco de maguey, entre otros nombres. En el presente trabajo tambin se realizar la evaluacin del potencial enzimtico de P. opuntiae que es un hongo comestible silvestre que crece en la base de magueyes cultivados en algunas regiones de Mxico y que adems pertenece a un gnero, donde la mayora de sus especies han logrado cultivarse en diferentes tipos de sustratos lignocelulsicos (Romero, 2002).

Universidad Politcnica de Pachuca DOCTORADO EN BIOTECNOLOGA II. ANTECEDENTES

2.1 Estructura de los xilanos y su distribucin en la naturaleza La pared celular de las plantas terrestres en general esta constituida de: i) celulosa (40%), que es un polmero insoluble compuesto de residuos -D-glucopiranosil, ii) hemicelulosa (33%), que es una serie de heteropolisacridos que incluye xilanos, mananos, galactanos y arabinanos. En los pastos y cereales el arabinoxilano (GP de 70) est sustituido con grupos feruloil y/o p-coumaroil en el C-5 de la L-arabinofuranosa (Coughlan y Hazlewood, 1993). Cabe mencionar que tambin se han encontrado xilanos lineales no sustituidos en el Lygeum spartum (pasto de esparto) y en la planta de Tabacum (tabaco). Los xilanos no se acumulan en la naturaleza y juegan un papel significante en la integridad estructural de la pared celular de las plantas (Bastawde, 1992). 2.2 Importancia y clasificacin de las enzimas que degradan los xilanos Debido a la diversidad, complejidad y abundancia de los xilanos, son necesarias las enzimas xilanolticas para su degradacin, que adems tienen importancia biolgica porque participan en conjunto con otras enzimas en la reincorporacin del CO 2 al ciclo del carbono, el cual es fijado por las plantas durante la fotosntesis y posteriormente liberado a la atmsfera a travs de la accin microbiana sobre los residuos de vegetales (Wong et al., 1988; Biely et al., 1992; Coughlan y Hazlewood, 1993).

El sistema xilanoltico, es complejoy est formado por varios tipos de enzimas como las xilanasas y las enzimas accesorias, que cooperan en conjunto para la degradacin de los xilanos presentes en las hemicelulosas de las plantas (Biely, 1985; Christov y Prior, 1993).

Universidad Politcnica de Pachuca DOCTORADO EN BIOTECNOLOGA 2.3 Produccin de enzimas xilanolticas Las xilanasas estn ampliamente distribuidas en organismos procariotes y eucariotes que incluyen: plantas, insectos, caracoles, protozoarios (Bastawde, 1992), y en una gran variedad de microorganismos como: levaduras, hongos y bacterias que producen estas enzimas. Actualmente los ms estudiados son los hongos filamentosos del gnero Aspergillus y Trichoderma, ya que se utilizan a gran escala para la produccin de estas enzimas, pero un problema existente, es que estos hongos coproducen xilanasas y celulasas (Wong et al., 1988), lo cual no es conveniente para algunas aplicaciones de las xilanasas. Para producir sistemas xilanolticos libres de celulasas provenientes de hongos, los extractos deben ser sometidos a procesos de separacin de las celulasas como en el caso de las cepas Aspergillus y Trichoderma, otra posibilidad es el aislamiento de nuevas cepas mutantes no productoras de celulasas o la clonacin de genes de xilanasas en organismos no celulolticos. Tambin se puede inhibir la actividad de celulasas, adicionando mercurio a la preparacin enzimtica, pero este tratamiento es costoso y adems txico (Biely, 1991). Una de las ventajas de los basidiomicetos lo constituye su amplio espectro de actividades enzimticas, lo que conlleva a que estos microorganismos jueguen un papel importante en diversos sistemas biolgicos, por lo que resulta conveniente profundizar en el cultivo y manejo de estos microorganismos (Brizuela et al., 1998). Los hongos de pudricin blanca que pertenecen a los gneros Trametes, Pleurotus, Lentinus y Cerrena se han estudiado para la produccin de celulasas y xilanasas por cultivo slido, aunque se han enfocado en la produccin de lacasas y peroxidasas. La seleccin del sustrato debe realizarse de acuerdo al microorganismo y tipo de enzima que se requiera; para producir celulasas y xilasas, se seleccionar un sustrato con altos porcentajes de celulosa y hemicelulosa (Ordaz, 2008).

Universidad Politcnica de Pachuca DOCTORADO EN BIOTECNOLOGA 2.4 El gnero Pleurotus 2.4.1 El cultivo de Pleurotus spp. Debido a un mayor conocimiento de la naturaleza biolgica de los hongos, as como a los avances en el desarrollo de tcnicas de cultivo, se han ido sumando nuevas especies para ser domesticadas. Se ha estimado, de acuerdo con diferentes datos, que los hongos comestibles podran representar el 50% de las especies totales de macromicetes que corresponden aproximadamente a 5,000 especies a nivel mundial. Alrededor de 80 especies, en su mayora saprobias, se han logrado cultivar en forma experimental y de stas, 40 han sido trasladadas a naves de cultivo, pero slo alrededor de 20 con fines comerciales y slo 6 han sido contempladas para la escala industrial (Chang, 1993). Es una actividad que se ha venido desarrollando en diferentes partes del mundo como Estados Unidos, Europa y el sureste de Asia. Particularmente, la produccin de hongos del gnero Pleurotus ha experimentado un crecimiento extraordinario en pases como Japn, Corea, Taiwn, Filipinas, Estados Unidos y Alemania. Ha estado condicionado por las ventajas que presenta en comparacin con otras especies como Agaricus bisporus (champin comercial). Algunas de estas ventajas son: simplicidad de la tecnologa de produccin; la posibilidad de utilizar una amplia gama de sustratos orgnicos; rendimientos que en algunas especies superan el 100% de eficiencia biolgica, en cortos periodos de tiempo; amplio margen de tolerancia del cultivo en climas fros, templados y tropicales; costos de produccin relativamente bajos en instalaciones econmicas con una biotecnologa sencilla provocando un bajo impacto ecolgico; obtencin de alimento con alto valor nutritivo que ha demostrado tener una buena aceptacin por parte de los consumidores, entre otros (Chang y Quimio, 1982). 2.5 Descripcin de Pleurotus opuntiae A continuacin se presenta la descripcin general de Pleurotus opuntiae realizada por Petersen y Krisal-Greilhuber (1999).

Universidad Politcnica de Pachuca DOCTORADO EN BIOTECNOLOGA 2.5.1 Pleurtous opuntiae (Durieu y Lv.) Sacc. El nombre de Pleurotus opuntiae ha sido utilizado para representar las ltimas tres interpretaciones: 1) un Pleurtous del Norte de frica; 2) basidiomas frescos con prominente estpite presentndose en la parte basal de un gran Agave en las tierras altas de Mxico; y 3) basidiomas con muy reducido estpite, reportados como parsitos de Cordyline (rbol de berza) en Nueva Zelanda. Despus del primer reporte sobre la incompatibilidad sexual entre variantes morfolgicas dentro de P. djamor, monocariontes, junto con aislamientos de otros basidiomas con similar morfologa, se estableci una sexualidad compatible dentro del grupo con aislamientos monocariticos de otras formas macromorfolgicas

representados por otros nombres, por ejemplo P. djamor de un blanco plido olivceo de P. ostreatoroseus, P. flabelatus, P. salmoneostramineus para las formas rosadas, resumi la situacin morfolgica y todas estas formas podran estar representadas por el viejo nombre P. djamor. A fin de probar el uso del nombre de P. opuntiae en trabajos mexicanos, es que fue necesario examinar el espcimen tipo y as compararlo con el material mexicano presentando una descripcin ms completa (Romero, 2002). III. OBJETIVOS

3.1 Objetivo General Realizar cinticas de produccin de enzimas (lacasa, manganeso peroxidasa, lignina peroxidasa, celulasa, xilanasa) de Pleurotus opuntie mediante la utilizacin de diferentes tcnicas para producir y purificar enzimas de importancia biotecnolgica. FASES DEL PROYECTO: 1. Realizar cinticas de produccin de xilanasa. -Evaluar diferentes medios de crecimiento (lquido y slido). -Evaluar diferentes fuentes de carbono a varias concentraciones. 2. Determinar el perfil enzimtico.

Universidad Politcnica de Pachuca DOCTORADO EN BIOTECNOLOGA IV. En medio lquido y slido. Por electroforesis.

3. Purificacin enzimtica. A partir del medio seleccionado.

4. Caracterizacin cintica (enzima pura). KM VMAX pH ptimo Temperatura ptima Energa de activacin

5. Secuenciacin de la enzima purificada. Estructura putativa. Establecer relaciones evolutivas de la protena.

JUSTIFICACIN

Una gran cantidad de microorganismos tienen la capacidad de excretar enzimas lignocelulolticas, no obstante, las bacterias y hongos son los microorganismos que las producen en mayor cantidad en condiciones de cultivo lquido y slido. Al respecto, el gnero Pleurotus es capaz de excretar dichas enzimas en ambos sistemas de produccin, pero la mayora de los estudios se enfocan a la obtencin de lacasas por cultivo lquido, porque son utilizadas en varias aplicaciones en biotecnologa ambiental. En medio lquido, el hongo slo se ha cultivado para la produccin de lacasas y, en medio slido para la produccin de celulasas, xilanasas y lacasas. Hasta ahora slo se sabe que Pleurotus opuntiae es capaz de producir enzimas lignocelulolticas, sin embargo, por las caractersticas antes mencionadas, es interesante la exploracin de esta cepa como fuente nueva para la obtencin de xilanasas que puedan ser usadas en algn campo de trabajo especfico, desde biotecnologa ambiental hasta en nutricin animal, a travs del uso de los extractos enzimticos obtenidos durante su cultivo.

Universidad Politcnica de Pachuca DOCTORADO EN BIOTECNOLOGA Teniendo en cuenta estos aspectos, en este trabajo se evaluarn los residuos agrcolas de aserrn y bagazo de diferentes especies de Agave, como sustratos para el crecimiento de Pleurotus opuntiae. Se evaluarn tambin los niveles de produccin de lacasa, manganeso peroxidasa, lignina peroxidasa, celulasa, xilanasa sobre el mejor sustrato, relacionando los niveles de produccin de enzimas con los niveles de produccin de protena extracelular y de pH, manteniendo la humedad del sustrato constante durante todo el cultivo.

V.

MATERIAL Y MTODOS

5.1 Microorganismo, propagacin y conservacin 5.1.1 Mantenimiento de la cepa de Pleurotus opuntiae La cepa de Pleurotus opuntiae se mantendr en placas de Agar Papa y Dextrosa (PDA). Las placas sern cultivadas a 37 C y se mantendrn a 4 C hasta su uso. 5.1.2 Propagacin de la cepa de Pleurotus opuntiae Se seleccionar una placa de donde se obtendrn fragmentos cbicos de 0.5 cm2 aproximadamente los cuales se colocarn en nuevas placas con PDA. Las placas se incubarn nuevamente a 37 C durante aproximadamente seis das (tiempo en el cual la cepa se desarrolla en toda la placa) y posteriormente se conservarn a 4 C hasta su uso). 5.1.3 Conservacin de la cepa de Pleurotus opuntiae La cepa fngica ser sistemticamente subcultivada despus de 4 semanas, almacenada y sellada con papel parafilm en placas de PDA, mantenindolas a 4 C hasta su resiembra posterior.

Universidad Politcnica de Pachuca DOCTORADO EN BIOTECNOLOGA 5.2 Preparacin del preinculo para el cultivo en slido con Pleurotus opuntiae Para la preparacin del preinculo del cultivo en slido se tomar una placa de PDA con Pleurotus opuntiae, la cual ser seccionada en fragmentos cbicos de 0.5 mm aproximadamente, se adicionarn a un matraz Erlenmeyer de 250 mL con 100 mL de agua destilada previamente estril. El matraz se mantendr con agitacin rotatoria a 37C y 180 rpm durante 24 horas. Posteriormente se filtrar el sobrenadante con una coladera de acero previamente estril. El sobrenadante contendr las clulas fngicas de P. opuntiae, las cuales sern adicionadas a la matriz de residuos del sustrato slido (aserrn) para iniciar el proceso de deslignificacin. 5.3 Sistema de cultivo en slido para deslignificacin los residuos de aserrn 5.3.1 Preparacin del sustrato

La matriz de residuo lignocelulsico de aserrn con el tamao de partcula de inters seleccionado se colocar en un cristalizador de vidrio y se recubrir con aluminio para ser esterilizada en autoclave a 121C durante 15 min con al menos 24 horas de anticipacin (Mrquez-Araque et al., 2007). 5.3.2 Preparacin del material para el reactor

Las columnas de Raimbault para el proceso de deslignificacin sern empacadas con 2.5 cm de algodn en la parte inferior, se les adicionar en la parte superior un tapn de goma con un fragmento de tubo de vidrio como salida de aire para evitar el acmulo de presin. Despus estas sern envueltas en papel estao por los extremos y colocadas en bolsa de polietileno para su esterilizacin en autoclave a 121C durante 15 min con al menos 24 horas de anticipacin.

Universidad Politcnica de Pachuca DOCTORADO EN BIOTECNOLOGA 5.3.3 Inoculacin de la matriz de deslignificacin y preparacin de las

columnas de Raimbault con el material inoculado La matriz de crecimiento estril ser inoculada en la campana de extraccin con el sobrenadante obtenido en el apartado 5.2. Esta mezcla se agitar suavemente hasta que el inculo sea absorbido de manera uniforme y posteriormente a este paso se empacar cada columna tomando en cuenta la densidad de empaque. 5.3.4 Montaje del sistema de cultivo en slido para deslignificacin

Las columnas de Raimbault con la matriz a deslignificar sern ensambladas con el humidificador lleno de agua estril y la manguera de hule con conexin a un difusor de aire (Zhang et al., 2009). Obtencin del extracto enzimtico crudo del proceso de deslignificacin El material deslignificado se depositar en una bolsa con cierre hermtico (Zipoc) el cual se homogenizar durante 1 minuto. Despus se toma 1 g de muestra y se colocar en un tubo de polipropileno, al cual se le adicionar 3 mL de solucin amortiguadora de buffer de acetatos 10 mM (pH= 6.0). El tubo se agitar durante 1 minuto en vortex, inmediatamente se filtrar el lquido resultante y se colocar en un tubo Eppendorf, el cual se centrifugar durante 10 minutos a 14000 rpm. Posteriormente se separar el sobrenadante y este se depositar en una gradilla sumergida en hielo para evitar la desnaturalizacin de las enzimas. 5.5 Determinacin de la actividad enzimtica celuloltica (xilanasas y celulasas) 5.5.1 Xilanasas

La actividad xilanasa ser ensayada espectrofotomtricamente usando xilano de abedul como sustrato, segn Mrquez-Araque et al, (2007).

Universidad Politcnica de Pachuca DOCTORADO EN BIOTECNOLOGA 5.5.2 Celulasas

La actividad celulasa ser determinada espectrofotomtricamente usando como sustrato carboximetilcelulosa (CMC), segn Mrquez-Araque et al, (2007). 5.6 Cuantificacin de Azcares Reductores y Protena total 5.6.1 Azcares reductores

El ensayo se llevar a cabo espectrofotomtricamente usando xilano y CMC para las actividades de xilanasa y celulasa respectivamente, segn Mrquez-Araque et al, (2007). 5.6.2 Protena total

El ensayo se llevar a cabo espectrofotomtricamente utilizando un Kit enzimtico para la determinacin de protena por el mtodo de Bradford segn Bradford, (1976) y Len, (2008). 5.7 Determinacin de actividad enzimtica ligninoltica (Lacasa (Lcc), Manganeso peroxidasa (MnP) y Lignina peroxidasa (LiP)) 5.7.1 Lacasa (Lcc) La actividad Lcc ser ensayada espectrofotomtricamente con 2,2-azino-bisetilbentiazolina (ABST) como sustrato, segn Minako et al, (2008). 5.7.2 Lingina Peroxidasa (LiP)

La actividad LiP ser ensayada espectrofotomtricamente usando alcohol veratrlico como sustrato, inicializado por la adicin de H2O2, segn Len, (2008). 5.7.3 Manganeso Peroxidasa (MnP) La actividad MnP ser ensayada espectrofotomtricamente usando Rojo Fenol como sustrato, inicializado por la adicin de H2O2 (del apartado 5.3), segn Len, (2008).

Universidad Politcnica de Pachuca DOCTORADO EN BIOTECNOLOGA 5.8 Ultrafiltracin Las muestras obtenidas se concentrarn pasando el filtrado con una bomba peristltica a travs de un Pellicon Cassette System (Millipore Co. Massachusetts U.S.A.) de ultrafiltracin por flujo tangencial equipado con una membrana de filtracin con capacidad de corte de 10,000 daltones. 5.9 Liofilizacin Las muestras previamente filtradas (en gasa y algodn), as como clarificadas (por centrifugacin) y/o ultrafiltradas, se colocarn (200ml) en matraces Kitasato de 1 l. Luego las muestras se congelarn en un bao que contenga hielo seco ms acetona y despus se colocarn en una liofilizadora (previamente enfriada a 70C) de 12 a 14 horas. Terminado esto, el polvo obtenido, se resuspender en buffer acetato de sodio 100 mM pH 5.5 y se dializar en fro como se describi anteriormente. El filtrado ser dividido en alcuotas pequeas que tengan de 5 a 6 unidades de actividad por mililitro de filtrado y se almacenarn en tubos ependorff (1.5ml) a 20C para su uso posterior. 5.10 Electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE) 5.10.1 PAGE nativos y desnaturalizantes Se harn electroforesis en geles discontinuos (gel separador pH 8.8 y gel concentrador pH 6.8) de poliacrilamida (a distintas concentraciones) tanto nativos (no

desnaturalizantes) como desnaturalizantes como se ha descrito por Laemmli, (1970) para la separacin de protenas basndose en su peso molecular. 5.10.2 PAGE de gradiente Estos geles de poliacrilamida (en gradiente linear) sern usados para permitir una separacin amplia de protenas.

Universidad Politcnica de Pachuca DOCTORADO EN BIOTECNOLOGA VI. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES

cuatrimestre

Descripcin de las actividades a realizar Optativa I Probar diferentes medios de crecimiento (lquido y slido) para produccin de xilanasa. Probar diferentes fuentes de carbono con

diferentes concentraciones. Determinar perfil enzimtico en medio lquido y slido. Optativa II Determinar perfil enzimtico por electroforesis. Purificacin enzimtica. Examen TOFEL Publicacin de artculo cientfico Caracterizacin cintica (enzima pura) Clculo de Km, vmax, pH ptimo Clculo de temperatura ptima y energa de activacin. Tesis Secuenciacin de la estructura putativa de la enzima. Establecimiento de las relaciones evolutivas de la protena. Examen pre doctoral Seminario de investigacin

Universidad Politcnica de Pachuca DOCTORADO EN BIOTECNOLOGA VII. LITERATURA CITADA.

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