UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN AGUSTN DE AREQUIPA

FACULTAD DE INGENIERA DE PROCESOS ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERA QUMICA

AUTORES: Dr. Ing. Ral Omar Gallego !ara Ing. Mar"#a !$ana Q$e%$e&ana 'e(regal Ing. )ar#na Moran Me(#na

AREQUIPA PER

GUA DE PR*CTICA 'IOQUMICA APLICADA

PROLOGO

Se ha desarrollado la presente Gua de Prctica con el objeto de hacer llegar al interesado los alcances actuales de la bioqumica aplicada en el laboratorio. Los agigantados pasos del avance del conocimiento humano tienen como base el desarrollo de la biologa molecular, lo que a su vez ha generado el desarrollo de la bioqumica como consecuencia natural. La aplicacin de los nuevos conocimientos de la bioqumica han determinado el gran impulso que la bioqumica aplicada ha dado a la nueva tecnologa de los bioprocesos. odos los avances de la biotecnologa tienen como sustento el conocimiento previo de la biologa ! de la bioqumica aplicada. La presente Gua de Prcticas brinda a los estudiantes de "ngeniera #umica las destrezas bsicas para el empleo de los di$erentes instrumentos requeridos para el estudio prctico de la bioqumica.

Los %utores

NDICE

PROLOGO NDICE Pgs.

PR*CTICA

SEPARACI,N EN CAPA FINA DE UNA ME-CLA DE AMINO*CIDOS

PR*CTICA + SEPARACI,N EN CAPA FINA DE UNA ME-CLA DE AMINO*CIDOS

I.

O'!ETIVO: %plicar la t&cnica de cromatogra$a en capa $ina para la identi$icacin de aminocidos presentes en una muestra biolgica.

II.

FUNDAMENTO TE,RICO: AMINO*CIDOS Los aminocidos son las unidades estructurales de las protenas. Por lo tanto, si a una determinada protena se le somete a una hidrlisis !a sea cida o alcalina' &ste proceso rendir una mezcla de sus aminocidos constitu!entes, los cuales pueden ser susceptibles de ser analizados o identi$icados por m&todos cromatogr$icos.

odas las protenas son polmeros ! los monmeros que se cambian para $ormarlos son los a (aminocidos.

Los di$erentes aminocidos cadenas laterales.

se

di$erencian

por

sus

"n vivo el p) $isiolgico es pr*imo a la neutralidad. +l p,a de los grupos carbo*lo ! amino de los al$a (aminocidos es apro*imadamente ! ./ respectivamente. Por lo tanto, en la pro*imidad del p) neutro, el grupo carbo*ilato habr perdido un protn ! el grupo amino habr captado un protn para dar la $orma 01" +2"34. +n los genes, de todos los organismos estn codi$icados -/ aminocidos que se incorporan a las protenas. odos los aminocidos son enantimeros 5L6 +*isten otros aminocidos 5no proteicos6 ! tambi&n ha! aminocidos modi$icados que se hallan en las protenas. La variedad de las cadenas laterales 5hidro$licas, hidr$obas, cidas, bsicas, neutras6 permite una gran complejidad $uncional en las protenas.
7

CROMATOGRAFA 7&todo de Separacin

Permite separar, aislar e estrechamente relacionados complejas. +n estos m&todos se emplea8 ( 9ase estacionaria ( 9ase mvil

identi$icar presentes

componentes en mezclas

8 Slido:lquido 8 liquido:gas

;Los componentes de una mezcla se transportan a trav&s de una $ase estacionaria por medio de una $ase mvil que $lu!e<. Las separaciones se basan en las di$erencias de velocidad de migracin entre los componentes de la muestra. iene - partes8 9ase mvil ! 9ase estacionaria. +l soporte o 9ase +stacionaria. +s un slido poroso capaz de retener solvente ! slido pueden ser.

Croma.ogra/0a en Ca1a F#na

+l soporte poroso est adherido a la base, est pegado gracias a la presencia de S3=>a que a!uda a pagar el soporte. +n las le!endas de las placas de slica se encuentran como8

+l 0nS bajo luz ?@ la placa de silica gel se torna verde ! si ha! alguna marcha de la migracin de muestra o estndares esta marcha !a no es verde sino violeta.
III.

PROCEDIMIENTO: Pr#mer Pro"e o8 Sem2ra(o (e la m$e .ra

Se siembra los estndares ! la muestra con un capilar bastante $ino. ener precaucin de que en el sembrado se intenta tener una mancha entre . ! - mm de dimetro. La distancia entre las siembras puede ser no menor de A( Bmm apro*imadamente.

Seg$n(o Pro"e o: El$ #3n

?na vez sembrada la muestra se procede a la $ase mvil con la a!uda de un solvente de elusin. Para ello se coloca dentro de una cmara de elusin

;+l solvente debe estar por debajo del sembrado de la muestra<.

+l solvente comienza a subir por capilaridad. Las muestras se comportan di$erente segCn el solvente utilizado ! sus componentes algunos migrarn rpidamente otros no.

Ter"er Pro"e o8 V# $al#&a"#3n o Re4ela(o +l producto puede verse8

Por s mismo porque tiene color. Por incidencia de ?@ 5-D= nm:EAD nm6 porque no se ve a simple vista. ?tilizando vapores de iodo, el iodo se impregna dnde est la mancha dando coloraciones amarillas pro$undas. ?sando m&todos qumicos, usando una sustancia qumica como revelado, 5 en este caso ninhidrina en butanol6

10

C$ar.o Pro"e o8 2eporte de los 2esultados

Se describe la tra!ectoria de un soluto particular en $uncin de su $actor de retardo 29 que se de$ine como8

La distancia recorrida por un soluto se compara $recuentemente con la de una sustancia patrn en id&nticas condiciones. ;La razn de estas distancias se designa por 2$<
IV.

PARTE E5PERIMENTAL: Sembrado de estndares de aminocidos ! muestras >orrida cromatogr$ica. +lusin 7ezcla solvente entre $enol8 agua 5BD8-D6 apar herm&ticamente ! dejar que proceda el desarrollo de la separacin cromatogr$ica, hasta que el solvente ha!a alcanzado el $rente trazado en la parte superior de la placa.

2evelado del cromatograma

-

?na vez que ha!a alcanzado el $rente del solvente.

11

Festapar la cmara ! retirar con cuidado la placa de vidrio. ( Secar la placa con a!uda de una secadora de cabello.

>on la a!uda de un spra! aplicar 4inhidrina /..G en butanol sobre la placa. Secar la placa con una secadora. "denti$icacin Luego proceder a identi$icar las manchas e*istentes que debern corresponder a aminocidos para ello se debern hacer los clculos de los 2$ de los estndares ! luego los 2$ correspondientes a las manchas de las muestras. 2*. 4inhidrina es la reaccin que identi$ica aminocidos a trav&s de una coloracin azul violeta.
V. 5.1.

CUESTIONARIO: )aga un esquema de los resultados observados.

5.2.

>alcular los 2$ de los estndares ! muestras.

12

5.3.

"denti$icar que aminocidos estn presentes en las muestras problemas. HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH #u& es la cromatogra$a de e*clusin molecular ! la cromatogra$a de intercambio inico ! cules son sus aplicaciones. HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH
13

5.4.

HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH

5.5.

#u& m&todos e*isten para el anlisis de aminocidos de las protenas. HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH

5.6.

"ndicar tipos de solventes de elusin para la $ase mvil tanto para silica ! alCmina. HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHH

5.7.

)aga el mecanismo de reaccin de la 4inhidrina con los aminocidos.

14

5.8.

La cromatogra$a en capa $ina separa las sustancias segCn su peso molecular.I 9undamente. HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH

VI.

O'SERVACIONES HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH

15

HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH
VII.

CONCLUSIONES HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH

VIII.

'I'LIOGRAFA HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH

16

PR*CTICA

DETERMINACI,N DE LAS PROPIEDADES QUMICAS DE LAS PROTENAS

PR*CTICA 6 DETERMINACI,N DE LAS PROPIEDADES QUMICAS DE LAS PROTENAS

17

I.

O'!ETIVOS: %l t&rmino de esta prctica, el alumno ser capaz de describir ! demostrar de manera cualitativa las propiedades qumicas de las protenas en base a los siguientes aspectos8 Solubilidad de las protenas. Las propiedades electroqumicas de las protenas. +l e$ecto cido(bsico en la solubilidad de las protenas.

II.

PRERREQUISITOS:
1. 2. 3. 4.

Salting "n ! Salting 3ut. %gentes precipitantes de protenas. Propiedades $isicoqumicas del agua. +cuacin de )enderson()asselbach.

III.

INTRODUCCI,N: Se considera a las protenas como polmeros biolgicos de aminocidos. +n las protenas e*isten -/ tipos de aminocidos di$erentes los cuales estn en un nCmero ! secuencia determinados por el cdigo gen&tico. >on respecto a su tamaJo, las protenas van desde un peso molecular de A/// Falton hasta varios millones de Falton con una considerable variacin de $ormas ! estructuras. Para su estudio se consideran cuatro niveles de complejidad estructural' siendo la ms simple la estructura primaria ! la ms compleja la estructura cuaternaria cu!a con$ormacin depende de di$erentes $uerzas qumicas de atraccin ! repulsin que son ejercidas sobre la estructura molecular de la protena ! por lo tanto son responsables de su estabilidad. Por convencin se acepta dividir a las protenas en dos grupos8 protenas simples ! conjugadas, las cuales presentan di$erencias en sus propiedades qumicas ! $sicas. Sin embargo, para los $ines que se persiguen en esta prctica se les mencionara en $orma general. Los $actores que pueden a$ectar la solubilidad de una protena son8 La $uerza inica del medio, el p). la temperatura ! la constante diel&ctrica del solvente. >uando ha! un cambio de cualquiera de estos $actores, la protena responde con una intensidad proporcional al cambio, esto es, que puede a$ectar la estructura proteica de una manera super$icial o lo hace tan drsticamente que desnaturaliza a la protena. Por $ortuna, en nuestro organismo, la variacin de tales $actores es mnima por lo que son imperceptibles los cambios en la protena.

18

IV.

MATERIAL: .E tubos de ensa!e de ./ K .D/ mm . pipeta de ./ ml D pipetas de D ml . pipeta de D ml . gradilla

V.

METODOLOGA: +n esta prctica se trata de provocar cambios de solubilidad en protenas que se encuentran en el organismo, mediante la modi$icacin las propiedades de los solventes, para establecer una relacin con los e$ectos que se pueden presentar en el organismo. F$n(amen.o Q$0m#"o8 Las protenas poseen cargas positivas ! negativas dependiendo del p) de la solucin en la cual se encuentran' cuando se neutralizan, se presenta precipitacin proteica. La adicin de una sal a una solucin proteica modi$ica la constante diel&ctrica del solvente permitiendo una ma!or solubilidad de la protena. Sin embargo, cuando se aJade e*ceso de una sal, se neutralizan las cargas de la protena ! &sta tiende a precipitar. +ste mismo e$ecto ocurre al aJadir sales metlicas cargadas electropositivamente. >on la adicin de un cido o una base a una solucin proteica se alcanza un estado en que ha! el mismo nCmero de aniones que de cationes. +ste e$ecto, neutraliza la carga de la protena ! tiende a precipitar. +l p) que determina el nCmero igual de cargas de signos opuestos se denomina punto isoel&ctrico.

E71er#men.o No. + De.erm#na"#3n (el 1$n.o I oel8".r#"o (e la "a e0na 1or a(#"#3n (e $n 9"#(o. Preparar una solucin de caseinato de sodio, tomando -D/ mg de casena, -/ ml de agua destilada ! D ml de 4a3) .4. >uando la solucin sea per$ecta, se agregan D ml de cido ac&tico . 4. 7ezclar bien, diluir a D/ ml con agua destilada. Si la solucin no est su$icientemente clara, se puede $iltrar. L Preparar los siguientes tubos como se indica a continuacin T$2 o + 6 = 1 : Ag$a (e .#la( a <.=< ?.?@ <.?@ A". A"8.#"o ;.;+N ;.>6 +.6@ ; A". A"8.#"o ;.+ ; ; ;.6@ A". A"8.#"o +.;N ; ; ; Ca e#n a.o (e So(#o +.; +.; +.;
19

A @ > ? < B +;

<.@ <.; ?.; @.; +.; ?.A @.<

; ; ; ; ; ; ;

;.@ +.; 6.; A.; <.; ; ;

; ; ; ; ; +.> =.6

+.; +.; +.; +.; +.; +.; +.;

7ezclar bien , esperar E/ minutos ! observar los cambios que presente la solubilidad de la casena en cada tubo. 2eportar el punto isoel&ctrico correspondiente al tubo donde se presenta la ma!or precipitacin. >alcular el p) de cada tubo utilizando la ecuacin de )endersosn( )asselbach. E71er#men.o No. + De.erm#na"#3n (el 1$n.o I oel8".r#"o (e la "a e0na 1or a(#"#3n (e $n 9"#(o.

20

T$2o + 6 = A @ > ? < B

1:

Sol$2#l#(a(

>ul es el punto isoel&ctrico de la protenaI HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH

VI.

CUESTIONARIO:
6.1.

Fe qu& $actores depende la solubilidad de una protena en el agua. HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH

6.2.

+*plique en t&rminos $isicoqumicos el e$ecto que provoca la adicin de un cido o una base $uerte. HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH
21

HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH +*plique cmo a$ecta un cambio en la constante diel&ctrica del agua a la solubilidad de una protena. HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH
6.3.

#u& es el Salting in ! qu& tipo de compuestos pueden promoverlo. HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH
22

HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH

6.4.

#u& es el Salting out ! qu& tipo de compuestos pueden promoverlo. HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH

6.5.

#u& relacin e*iste entre el punto isoel&ctrico ! la solubilidad de una protena. HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH
23

6.6.

#u& es la ecuacin de )enderson()asselbach ! en que casos est indicado utilizarse. HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH

6.7.

7encione que propiedades $isicoqumicas de la albCmina le permiten interaccionar ! transportar cualquier compuesto inclu!endo hidro$bicos a trav&s de un medio acuoso. HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH
24

HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH
VII.

O'SERVACIONES HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH
25

VIII.

CONCLUSIONES HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH 'I'LIOGRAFA HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH

IX.

26

PR*CTICA = DETERMINACI,N ESPECTROFOTOMCTRICA DE PROTENAS

PR*CTICA = DETERMINACI,N ESPECTROFOTOMCTRICA DE PROTENAS

27

I.

O'!ETIVO Feterminar la concentracin de una solucin de protenas mediante la reaccin de Miuret ! el espectro$otmetro.

II.

FUNDAMENTO:

La presencia de protenas en una mezcla se puede determinar mediante la reaccin del Miuret. +l reactivo Miuret contiene >uS3= en solucin alcalina. La reaccin se basa en la $ormacin de un compuesto de color violeta, debido a la $ormacin de un complejo de coordinacin entre los iones >u 5N-6 ! los pares de electrones no compartidos del nitrgeno que $orma parte de los enlaces peptdicos.

Los compuestos que contienen - o ms enlaces peptdicos producen un color violeta caracterstico con soluciones diluidas de sul$ato de cobre 5>uS3=6 en solucin alcalina.

28

+l color se debe al compuesto de coordinacin $ormado al e*istir enlaces qumicos entre los pares de electrones libres del tomo de nitrgeno presente en los enlaces peptdicos de las cadenas proteicas con el ion cobre.

Los espectros de absorcin de los complejos entre los iones de >uN- ! las di$erentes protenas son similares pero no id&nticas por lo tanto, se puede utilizar una protena como patrn de calibracin. La curva de calibracin obtenida por este m&todo, se har utilizando como patrn solucin de e*tracto de levadura, cu!a concentracin es de O mg:ml preparada con agua destilada.

E 1e".ro/o.ome.r0a. Pr#n"#1#o 29 #"o La reaccin de biuret es cuanti$icable, es decir a ma!or concentracin de protenas, ma!or intensidad de color violeta, estas reacciones en las que el color $ormado es proporcional a la cantidad de sustancia se llaman reacciones colorim&tricas.

7idiendo la intensidad de color se podra conocer la concentracin de la sustancia que lo produce. Para ello se aplican t&cnicas $otom&tricas, empleando un aparato llamado colormetro 5si mide slo un determinado color6 o espectro$otmetro 5si realiza una medida de todo el espectro de colores6. La luz es parte de la radiacin electromagn&tica, que se propaga de $orma ondulatoria. Las distintas radiaciones luminosas se di$erencian unas de otras por sus longitudes de onda que se mide en nm. La luz visible engloba las radiaciones comprendidas entre EO/(BD/ nm, que corresponden a los colores del arcoris, de tal $orma que cada color corresponde a una radiacin con una longitud de onda espec$ica. +l espectro$otmetro dispone de una lmpara que emite luz monocromtica, de una longitud de onda determinada, que incide ! atraviesa la muestra coloreada a medir, ! de un detector, que medir la cantidad de luz que no es absorbida por la muestra. Para cada sustancia determinada, se utilizar la radiacin de longitud de onda a la que absorba ms cantidad de luz 5 a la longitud de onda de m*ima absorbancia6.

29

Su $uncionamiento se basa en la le! de Meer(Lambert8 la $raccin de luz incidente que es absorbida por una solucin es proporcional a la concentracin de soluto ! al espesor de la sustancia atravesada por la luz. La relacin entre luz incidente 5"o6 ! la re$lejada 5"6 dar una idea de la cantidad de radiacin que ha sido absdorbida por la muestra. +sto es lo que se denomina A2 or2an"#a DA2 E3Den #(aO1.#"a DDOE

Lale! de Meer(Lambert se $ormula como8 A2 DDOE Fe 7 C 7 + Siendo e el coe$iciente de e*tincin molar 5espec$ico para cada sustancia a una longitud de onda ! en unas condiciones determinadas 57(., cm(.6, > es la concentracin de la muestra a medir 576, . el espesor de la muestra. La ma!ora de los espectro$otmetros utilizan cubetas para la muestra de . cm de espesor, por lo que . se puede ignorar. %s la concentracin desconocida de la sustancia ser8 C F A2 Ge III.
IV.

MATERIALES H EQUIPO +spectro$otmetro Gradilla para tubos de ensa!o ubos de ensa!o @asos de precipitado Probetas, Pipetas 7ateriales8 e*tracto de levadura, reactivo biuret PROCEDIMIENTO Real#&a"#3n (e $na "$r4a 1a.r3n: >omo se desconoce el coe$iciente de e*tincin molar 5P6 de las protenas coloreadas con el reactivo biuret, se proceder a construir una curva patrn, midiendo la absorbancia de soluciones con concentraciones conocidas de protena, para sobre ella interpolar el valor de %bs de la solucin problema ! determinar su concentracin gr$icamente ! tambi&n por regresin lineal. Para ello se dispone de una solucin de ./ mg:ml de protena 5e*tracto de levadura6 a partir de ella se realizan diluciones conocidas aplicando la $rmula8

30

>i * @i Q Fnde8

>$ * @$

>i Q concentracin de la solucin madre inicial @i Q volumen a tomar de la solucin madre inicial >$Q concentracin $inal de la solucin a preparar @$Q volumen total $inal de la solucin a preparar +n O tubos de ensa!o se preparan, a partir de la solucin madre 5>iQ./ mg:ml6 las soluciones de la tabla.

31

Con". F#nal. Sol. a 1re1arar T$2o 'lan" o + 6 = A @ > ? < M$e . ra MgGml ;

Vol$m en Sol. Ma(re #n#"#al ml ;I; ;I@ +I; +I@ 6I; 6I@ =I; =I@ AI; AI;

Vol$m en ag$a

Vol$me Vol$m n R7. en '#$re. F#nal

A2 . @?;n m

ml AI; =I@ =I; 6I@ 6I; +I@ +I; ;I@ ;I; ;I;

ml A A A A A A A A A A

ml < < < < < < < < < <

%l aJadir el reactivo biuret dejar reposar ./ minutos ! leer la absorbancia. 7edicin de la absorbancia en el espectro$otmetro8
a) b)

Seleccionar la longitud de onda, DB/ nm 5 longitud de m*ima absorbancia para la reaccin del biuret6 Poner en la cubeta del espectro$otmetro el contenido del tubo blanco, secarla ! limpiarla bien por $uera e introducirla en el espectro$otmetro. %justar la lectura a .// de transmitancia ! / de absorbancia. Se devuelve el contenido al tubo original ! se mide la absorbancia de las soluciones de los otros tubos, comenzando por el de menor concentracin. Limpiar con agua la cubeta, secarla por $uera ! medir la %bs del tubo muestra. >on las medidas obtenidas de los tubos . al O ! el blanco 5%bsQ/6, se constru!e una recta en papel milimetrado,
32

) !)

") #)

representando las concentraciones en el eje de abscisas ! las %bs. en las ordenadas.

g) $)

"nterpolar la %bs de la protena problema en la gr$ica ! calcular su concentracin. >onsiderando que la absorbancia es directamente proporcional a la concentracin ! que la relacin es lineal8 R Q a N bK 5R Q % N M * >onc.6. ?tilizando regresin lineal se obtiene el valor de los coe$icientes % ! M ! se puede despejar concentracin que en este caso es de la muestra desconocida.

V.

CALCULOS E5PERIMENTALES:

33

TA'LA NJ+: RESULTADOS DE CONCENTRACION FINAL H A'SOR'ANCIA

CONCENTRACIO N FINAL DmgGmlE

A'SOR'ANC IA DnmE

O'TENCION DE LA GRAFICA

34

35

VI. 5.1

CUESTIONARIO S>ul es la concentracin de protenas de la muestraI HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH
5.2

SSe podra determinar la concentracin de cualquier muestra de protenas con esta curva patrnI HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH

5.3

SLos aminocidos ! los di p&ptidos daran positiva la reaccin del MiuretI

36

HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH

5.4

"nvestigue si e*iste alguna protena en la que no est& presente ninguna aminocido con anillo benc&nico en su cadena lateral, e indique que consecuencias tendra sobre la determinacin espectro$otom&trica HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH

VII.

O'SERVACIONES HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH
37

HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH
VIII.

CONCLUSIONES

HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH

IX.

'I'LIOGRAFA HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH

38

PR*CTICA A CONCENTRACI,N DE E5TRACTOS PROTEICOS POR DI*LISIS

PR*CTICA A CONCENTRACI,N DE E5TRACTOS PROTEICOS POR DI*LISIS

39

I.

O'!ETIVO %umentar la concentracin de las protenas en un e*tracto o solucin que las contenga.

II.

FUNDAMENTO La dilisis es una t&cnica que separa las mol&culas de acuerdo a su tamaJo usando membranas semipermeables que contienen poros de dimensiones menores que las macromol&culas que se deseen separar como las protenas, los poros permiten la di$usin de las mol&culas de solventes, sales ! otras mol&culas pequeJas, pero bloquean el paso de protenas por su gran tamaJo. Se usan membranas de celo$n 5acetato de celulosa6, nitrocelulosa, colodin, u otras de naturaleza semipermeable. Los mecanismos de transporte son8 osmosis, ! di$usin por di$erencia de concentracin.

III.

MATERIALES H EQUIPOS

/. pliego de papel celo$n.% .,g de azCcar. e*tracto

Solucin de proteico al /.DG. Pipeta de ./ ml.

@aso de precipitados. Piceta.

IV.

MCTODO Preparar una bolsa con el papel celo$n, de modo que no se presenten $ugas al llenarla con una solucin.

Preparar en el vaso de precipitados D/ ml de una solucin de protena al /.DG. >omprobar la concentracin espectro$otmetro a -O/ nm. de protena con el

Llenar la bolsa de celo$n con D/ ml de solucin proteica, usando para tal $in la pipeta de ./ ml., ! sellar luego la bolsa de modo que no presente $ugas. Preparar un tazn con azCcar, ! colocar all la bolsa de celo$n conteniendo la solucin proteica.

?ntar toda la bolsa de celo$n, con el azCcar, cubri&ndola por completo. +sperar .D a E/ min ! retirar la bolsa del azCcar, observando los cambios ocurridos.

40

7edir el volumen de lquido que qued en la bolsa de celo$n ! comparar con el volumen inicial.

7ediar nuevamente la concentracin de protenas en el espectro$otmetro a -O/ nm.

VARIACION DE VOLUMEN

TA'LA NJ+: TU'O 'LANCO PROTEINA D#E PROTEINAD/

41

:6O DmlE

'IURET DmlE

PROTEINA DmlE

A'SOR'ANC IA

V.

CUESTIONARIO SeJale las principales t&cnicas de separacin de solutos por membrana, ! las principales aplicaciones de cada una de ellas. HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH

42

HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH

43

HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH

44

"nvestigue la composicin qumica de la membrana utilizada ! e*plicar las razones de su porosidad. HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH +$ectCe los clculos de variacin en el volumen ! la concentracin de la protena en solucin. HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH
45

HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH "ndique el principio ! la ecuacin bsica del transporte de solventes por osmosis. HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH "ndique el principio ! la ecuacin bsica del transporte de solutos por di$usin debida a di$erencias de concentracin. HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH
46

VI.

O'SERVACIONES HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH

VII.

CONCLUSIONES HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH

VIII.

'I'LIOGRAFA

47

HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH

48

PR*CTICA @ DETERMINACI,N DE PROTENAS POR MICROK)!ELDA:L

PR*CTICA @ DETERMINACI,N DE PROTENAS POR MICROK )!ELDA:L

49

50

I.

O'!ETIVO. Feterminar indirectamente el contenido de protenas totales en una muestra desconocida.

II.

FUNDAMENTO +l m&todo de micro(Tjeldahl es una simpli$icacin hecha por )%>) en el proceso ,jeldahl tradicional. 2ealizando el mismo anlisis en un tiempo corto ! con pequeJas muestras. Se $unda en la trans$ormacin del nitrgeno presente en las protenas a nitrgeno inorgnico. Para ello se siguen tres etapas claramente di$erenciadas +n la primera, se digiere el material por accin del cido sul$Crico en presencia de o*idantes $uertes 5per*ido de hidrgeno6, de esta manera todo el carbono presente se libera como >3- ! nitrgeno como 4)E, luego este se combina con el e*ceso de cido sul$Crico para dar sul$ato de amonio.
1.

+n la segunda se destila el amonio, previamente liberado por la accin de un lcali $uerte 4a53)6, el amoniaco liberado se recibe en una solucin de cido d&bil en presencia de colorante indicador.
2.

+n la tercera se titula la solucin con un cido $uerte cuanti$icando el nitrgeno presente.

3.

Luego se aplica la relacin siguiente8 G4 Q ml.4.$c.meq..// peso de muestra dnde8 ml.4.$c.meq Q peso de nitrgeno en la muestra ml Q gasto de cido sul$Crico en la titulacin 5ml6 4. normalidad del cido 9c. 9actor de correccin del cido meq.Q peso del miliequivalente del nitrgeno Suponiendo que la muestra solo contiene protenas simples con .AG de 4, el porcentaje de protenas ser8 Protena Q A.-D*4
III.

PROCEDIMIENTO +l proceso de determinacin se hace en tres etapas8 DIGESTI,N. 7edir = ml de muestra liquida 5o /.-D g si es slido6 ! colocar en el matraz de digestin

51

%gregar = ml de cido sul$Crico concentrado al matraz

@eri$icar que el control automtico del digestor este en ==/U> ! que ha!a succin en la columna de $raccionamiento. Figerir la muestra por = min despu&s de haber alcanzado la temperatura indicada.

%Jadir ./ ml de per*ido de hidrgeno al D/G a la muestra a trav&s de un embudo de la columna de $raccionamiento. Si el digesto no se torna incoloro, aJadir porciones adicionales de D ml hasta que el digesto se aclare. 2etirar el matraz del calentador ! dejarlo en$riar. #uitar la columna de $raccionamiento, ! colocar el matraz sobre un bloque ! tapar hasta que se ha!a en$riado.

Filuir el digesto con D/ ml de agua destilada.

DESTILACI,N +l digesto obtenido ! diluido a D/ ml se traslada a un baln de destilacin.

Preparar un vaso de .// ml que contenga .-.D ml de cido borrico al =G 5 en volumen6 adicionndole indicador azul de metileno ! rojo de metilo, dando una coloracin violeta.

52

+l baln de destilacin que contiene el digesto se aJade .E a .D ml de hidr*ido de sodio al D/G v:v ! - a E granallas de zinc.

>onectar el equipo de destilacin ! destilar el digesto durante unos ./ a -/ min 5hasta que el vaso receptor tenga una coloracin verdusca ! su volumen sea ms o menos E veces del volumen inicial6

TITILACI,N. Preparar una solucin de cido sul$Crico /.. 4 ! valorizarla.

itular el contenido del matraz receptor hasta que vire de verde a violeta

IV.

CUESTIONARIO +*plique la di$erencia entre protenas simples ! conjugadas. HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH

53

HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH

"ndique ejemplos ! estructuras primarias de dos protenas simples ! dos protenas conjugadas HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH

54

HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH

55

+scriba las ecuaciones de las reacciones de cada una de las etapas durante el proceso de determinacin del nitrgeno HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH
56

HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH +$ectu& los clculos ! determine el contenido de protenas en la muestra HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH "ndique que tipo de enlaces de una protena se rompen durante la etapa de digestin HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH +*plique el objetivo de la etapa de destilacin. HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH
57

HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH +*plique porque la titilacin se hace con cido sul$Crico ! no con un lcali. HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH
V.

O'SERVACIONES HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH

VI.

CONCLUSIONES HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH

58

HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH

VII.

'I'LIOGRAFA HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH

59

PR*CTICA >
REACCIONES DE IDENTIFICACI,N DE CAR'O:IDRATOS

PR*CTICA >
REACCIONES DE IDENTIFICACI,N DE CAR'O:IDRATOS

60

I.

O'!ETIVOS: 2econocer los principios inmediatos de los carbohidratos. Fi$erenciar e*perimentalmente monosacridos, disacridos ! polisacridos. 9amiliarizarse con la clasi$icacin de los hidratos de carbono en reductores ! no reductores. +studiar las propiedades del almidn.

II. FUNDAMENTO TE,RICO: Se denominan carbohidratos o glucsidos los derivados aldehdicos cetnicos, reales o potenciales de alcoholes polivalentes o sus productos de condensacin segCn la cantidad de glucsidos o azCcares sencillos que se obtengan por hidrlisis de los policarbohidratos. Se les clasi$ica como8 Polisacridos 5celulosa, almidn6 risacridos 5ra$inosa6 Fisacridos 5sacarosa, lactosa, maltosa6, ! 7onosacridos Los monosacridos por el grupo carbonilco pueden ser aldosas o cetosas por el. nCmero de tomos de o*igeno, pueden ser he*oaas 5glucosa, galactona, manosa, $ructosa6, pentosa 5arabinosa, *ilosa, ribosa, li*osa6, terrosas 5treosa ! eritrosa6. Los carbohidratos poseen algunas propiedades de las $unciones carbonilo ! o*hidrilo !, adems, algunas espec$icas. odos son ptimamente activos. Por el calor ! la accin de cidos $uertes se deshidratan, dando en algunos casos derivados del $ur$ural. Los hidratos de carbono ms abundantes de la bis$era estn constituidos por el almidn ! celulosa que son polmeros de glucosa presentes en plantas. +l almidn est distribuido ampliamente en las plantas que lo almacenan en granos ! en tub&rculos como reserva alimenticia para el momento de la germinacin. odos los tipos de almidn producen un color azul con el !odo, lo cual sirve de indicador cualitativo sensible, tanto para ensa!ar el !odo como el almidn. La hidrlisis del almidn catalizada por cidos lo convierte en varias clases de de*trinas, en maltosa ! por Cltimo en F 5N6 glucosa. +l ensa!o con !odo se utiliza para seguir la marcha de la hidrlisis puesto que la coloracin va cambiando de azul a rojo a medida que decrece el peso molecular delcompuesto orgnico. Los grupos $uncionales e*istentes en el almidn ! en la celulosa son los grupos hidro*ilo ! acetal. +stos polisacridos tienen di$erente con$iguracin, siendo el almidn un glucsido ! la
61

celulosa un $ (glucsido. ambi&n di$ieren en el tamaJo teniendo lacelulosa un peso molecular medio mucho ma!or que el del almidn. III. MATERIALES H REACTIVOS 2eactivo 7olisch 2eactivo 9ehling 2eactivo ollens 2eactivo SeliVano$$ 2eactivo Mar$oed Sol. glucosa .G Sol. $ructuosa .G Sol. sacarosa . Sol. lactosa .G Sol. almidn .G Sol. sacarosa DG Sol. )>l ./G Sol. 4a3) ./G Sol. !odo ( !odurado IV. PROCEDIMIENTO: Rea""#one gen8r#"a (e lo "ar2oL#(ra.o Rea""#3n (e Mol# "L +n A tubos de ensa!o ponga respectivamente . ml. de una solucin de glucosa al.G, . ml. de solucin de $ructuosa o levulosa al .G, . ml. de una solucin de sacarosa al .G, . ml. de una solucin de lactosa al .G, . ml. de una solucin de almidn al .G ! en el Cltimo . ml. de agua 5testigo6. % cada una agr&guele - gotas de reactivo de 7olisch' inclinando el tubo, deje resbalar por las paredes - ml. de cido sul$Crico concentrado. 3bserve el color violceo del anillo $ormado en la inter$ase entre los dos lquidos. %note aquellas soluciones que den positiva la prueba. Rea""#one E 1e"0/#"a Rea""#one (e FeLl#ng +n D tubos de ensa!o mezclar en cada uno /.D ml. de solucin % de 9ehling con /.D ml. de la solucin M de 9ehling, ubos de ensa!o Pipetas MaJo de agua hirviente Pinzas MaJo hirviente @aso de precipitados Luna de reloj

62

agr&gueles . ml. de la solucin de los carbohidratos utilizados en el e*perimento anterior. "ntroducir los tubos en un baJo hirviente, observe si ha! cambios de color, $ormacin de precipitados. Rea""#3n (e Tollen +n D tubos de ensa!o colocar a cada uno .. ml. de 2eactivo de ollens recientemente preparado, aJadir a cada uno - ml. de las soluciones de carbohidratos utilizados anteriormente. "ntroducir los tubos en un baJo hirviente, observe si ha! $ormacin de espejo de plata ! cuales carbohidratos dan negativa esta reaccin. 2ealice una comparacin de estos resultados con los de la prueba de 9ehling. Rea""#3n (e Sel#Mano// +n D tubos de ensa!o coloque . ml. del reactivo SeliVano$$, luego aJada E gotas de solucin de los carbohidratos utilizados anteriormente, luego lleve los tubos a baJo hirviente. %note el tiempo en que se colorea cadaa tubo ! el color adquirido. Rea""#3n (e 'ar/oe( +n D tubos de ensa!o coloque . ml. del reactivo Martoed luego aJada . ml. de solucin de los carbohidratos utilizados anteriormente, luego llevar los tubos a baJo hirviente ! observar la $ormacin de un precipitado de color rojo ladrillo, lo que indicar la presencia de monosacridos. Los disacridos tambi&n precipitan *ido cuproso, pero mu! lentamente. :#(r3l# # (e la Sa"aro a +n E tubos de ensa!o coloque D ml. de solucin de sacarosa al DG, ll&velos a baJo hirviente ! a cada tubo aJada volCmenes iguales de agua para el primer tubo, cido clorhdrico al ./G en el segundo tubo, e hidr*ido sdico acuoso al ./G en el tercero. >alentar los tubos durante cinco minutos ! ensa!e a continuacin la reaccin de una porcin de cada mezcla con la solucin de 9ehling. S#u& conclusiones deduceI En aNo (el Alm#(3n /ren.e al Io(o +n un tubo de ensa!o coloque A ml de solucin de almidn al .G, aJada una gota de solucin de "odo ( lodurada, observe el color de la solucin. Luego caliente la solucin coloreada a ebullicin ! observe el e$ecto, observe tambi&n qu& e$ecto produce el en$riamiento de la solucin. :#(r3l# # (el Alm#(3n
63

+n un vaso de precipitados coloque D/ ml de solucin de almidn al .G, aJada . ml de cido dorhdrico concentrado. )ierva la solucin ! retire muestras de R ml. a intervalos pr*imos, ensa!ando su reaccin $rente al iodo. %note el color en los di$erentes ensa!os. >uando la solucin !a no produzca coloracin con el iodo, neutralcela ! ensa!e la reaccin de una muestra $rente al 9ehling. 9ormule estructuralmente los productos $inales de la hidrlisis del almidn 5un disacrido ! un monosacrido6. V. CUESTIONARIO: 5.1. "ndique la composicin de los reactivos utilizados en la prctica 52. 7olish, 2. SeliVano$$, 2 Mar$oed, 2 9ehling6.

5.2. +labore un diagrama de $lujos del proceso de produccin de la glucosa a nivel industrial.

5.3. S% qu& se debe la coloracin azul del iodo sobre las muestras de almidnI HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH

64

HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHH 5.4. S>mo se utiliza el ensa!o del iodo para seguir la hidrlisis del almidnI HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHH VI. O'SERVACIONES HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH VII. CONCLUSIONES HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH
65

HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH VIII. 'I'LIOGRAFA HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHH

66

PR*CTICA ? META'OLISMO DE CAR'O:IDRATOS: FERMENTACI,N.

P2W>

">% B

7+ %M3L"S73 F+ >%2M3)"F2% 3S8 9+27+4 %>"X4.

67

I.

O'!ETIVOS 1) 3bservar e*perimentalmente los $enmenos de respiracin celular anaerbica 5$ermentacin6 en levaduras. 2) >omprobar el e$ecto de inhibidores de la gliclisis ! de la respiracin celular. 3) %plicar los conceptos de sustrato, inhibidores competitivos, inhibidores no competitivos, o*ido(reduccin, modi$icacin de p) e inhibidores en la interpretacin de sus resultados.

II. ACTIVIDADES 9ermentacin alcohlica en levaduras 5Saccharom!cescerevisiae6. La $ermentacin alcohlica en levaduras ocurre de acuerdo a la reaccin8 >A).-3A ->3- >-)D3) 5etanol6 +l etanol se acumula en el medio ! el >3 - es liberado como gas, por lo que se puede medir la $ermentacin por la produccin de >3-. III. PROCEDIMIENTOS. 3.1. >omplete la siguiente batera de tubos8 T$2o + 6 . ml = . ml A . ml

S$ 1en #3n . ml (e le4a($ra ?O Sol. Gl$"o a Sol. NaF Ag$a (e .#la(aDA =PCE Sol.RoQo Ne$.ro / / - ml

. ml / . ml

. ml . ml /

. ml / /

. ml

%gitar por inversin para homogenizar el contenido de cada tubo. 3.2. apar cada tubo con un $rasco de penicilina invertido, presionndolo girar rpidamente de manera que el tubo quede invertido dentro del $rasco. 7arcar el nivel de la
68

burbuja en la parte superior del tubo ! amarrando con un elstico los = $rascos, ponerlos a incubar en un baJo de agua a =EY>. 3.3. %l cabo de E/ min. 7arque el nivel $inal de la solucin en el tubo ! mida el volumen de gas producido con una pipeta con agua. 3.4. >ul es el objetivo del tubo =I @eri$ique el p) en el tubo - con papel p). 3.5. %note ! discuta sus resultados.

Sol$"#one : 1. Solucin de levadura8 disolver a homogeneidad B g de levadura en ./ ml de agua destilada a =EY> ! completar a .// ml con agua destilada a =EY>. Solucin de glucosa /,. 7 Solucin de 4a9/,. 7 Solucin rojo neutro /,/- 7

2. 3. 4.

Papel p). IV. O'SERVACIONES HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH

69

HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH V. CONCLUSIONES HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH VI. 'I'LIOGRAFA HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH

70

PR*CTICA. < INMO'ILI-ACION DE EN-IMAS H CELULAS. PRODUCCION DE ETANOL POR SACC:AROMHCES "ere4# #ae INMOVILI-ADA.

P2W>

">%. O

"473M"L"0%>"34 F+ +40"7%S R >+L?L%S. P23F?>>"34 F+ + %43L P32 S%>>)%237R>+S cerevisiae "473@"L"0%F%.

71

I.K O'!ETIVOS 1) 2) "nmovilizar S. cerevisiae en soporte de agar( agar. 3btener etanol a partir de levaduras inmovilizadas. el grado alcohlico del

3) +valuar por re$ractometra producto de la $ermentacin II.K ACTIVIDADES

9ermentacin alcohlica en levaduras 5Saccharom!cescerevisiae6. La $ermentacin alcohlica en levaduras ocurre de acuerdo a la reaccin8 >A).-3A ->3- >-)D3) 5etanol6 +l etanol se acumula en el medio ! el >3 - es liberado como gas, por lo que se puede medir la $ermentacin por la produccin de >3- ! por la concentracin del producto $ormado o por la disminucin de la concentracin del sustrato 5en grados Mri*6 III.K MATERIALES. ( 7aterial biolgico8 Levadura S. cerevisiae, mosto de uvas ( 2eactivos8 %gar(agar, solucin de glucosa DG ( 7aterial8 balones, probetas, pipetas, baguetas, hipod&rmicas de -/cc, esptulas, picetas, papel toalla. ( +quipos8 Malanza, re$ractmetro, baJo mara. IV.K PROCEDIMIENTO A"on(#"#onam#en.o (e ma.er#ale : Solubilizar la levadura comercial de pani$icacin en D/ ml de agua destilada. +n un matraz disolver Dg de agar(agar en -D/ ml de agua destilada, con calentamiento ! agitacin constante. >alibrar el baJo de mara a =/Z>, para mantener dentro del agar licuado. >olocar en una probeta de .//ml, D/ml de aceite vegetal ! ponerla en re$rigeracin 5apro*imadamente =Z>6, por E/ minutos. Inmo4#l#&a"#3n (e la en&#ma: 7ezclar D/ ml de la suspensin de levaduras ! D/ ml de agar agar licuado ! homogenizar. omar con una hipod&rmica de -/ ml un volumen de la mezcla ! dejar caer gota a gota en la probeta que contiene el aceite vegetal re$rigerado. 2epetir el paso anterior hasta agotar la mezcla. Fecantar los pellets ! lavarlos tres veces con agua destilada con movimientos rotatorios suaves. Secar los pellets en papel toalla. O2.en"#3n (el mo .o (e $4a:
72

3btener por prensado D/ml de mosto de uva. 9iltrar con una gasa el jugo obtenido. omar una alcuota ! leer los grados bri* o porcentaje de azCcar en el re$ractmetro. O2.en"#3n (e e.anol: >olocar los pellets en un vaso de precipitados con D/ml de mosto de uva, 5o D/ml de una solucin de glucosa al DG6. o/mar una alcuota, considerando la muestra a tiempo cero ! leer los grados bri* o porcentaje de azCcar en el re$ractmetro. %gitar la mezcla por =D minutos. omar alcuotas cada .D minutos. Leer los grados bri* en el re$ractmetro para cada alcuota. V .K CUESTIONARIO. ..("ndique la importancia de la inmovilizacin de enzimas !:o c&lulas.
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR

-( >ul es el $undamento de la inmovilizacin de levaduras en agarI.

RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR

E.( +*plique las caractersticas coagulantes del agar(agar.

RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR

=.( >omo e*plica que la glucosa llegue a tener contacto con las c&lulas de levadura, si estas estn atrapadas en la matriz de agar( agar.
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR

D( Presente al menos un caso detallado de aplicacin de la inmovilizacin de enzimas.

RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR 73

RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR

A( #u& otros m&todos para la inmovilizacin se utilizanI

RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR

VI.K O'SERVACIONES H COMENTARIOS HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH VI.K CONCLUSIONES HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH VIII.K 'I'LIOGRAFA
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR

74

PR*CTICA B E5TRACCI,N DE EN-IMAS VEGETALES

PR*CTICA B E5TRACCI,N DE EN-IMAS VEGETALES

75

76

I.

O'!ETIVO. +*traer la enzima ?reasa de la cscara de $rejol ! comprobar su actividad cataltica.

II.

FUNDAMENTO. Las enzimas son protenas con accin cataltica. Las protenas se encuentran en el interior de las c&lulas en un estatus particular, a p) $isiolgico, ! con estructura nativa estabilizada por diversas mezclas de sustancias. La e*traccin de enzimas debe realizarse de modo que conserven las caractersticas estructurales ! las propiedades $uncionales de las mismas. Las leguminosas son conocidas por su alta actividad uresica, debido a la enzima ureasa presente en la cscara. La enzima ureasa al actuar sobre el sustrato Crea provoca la hidrlisis de esta con la consiguiente liberacin de amoniaco ! anhdrido carbnico, segCn la siguiente reaccin.
3Q>

4)N

)-3 ((((((((((

-4)E N >3-

4)La actividad uresica se puede comprobar haciendo reaccionar el amoniaco liberado con el 2eactivo de 4essler 5, -)g.=6. +ste reactivo es el Roduro doble de 7ercurio ! Potasio, que al reaccionar con el amoniaco en medio alcalino da productos de color amarillo(anaranjado 5complejo cu!a $rmula se supone sea )g34)-"6, cu!a intensidad de color puede medirse a longitudes de onda de =/D a =-/ nm.
III.

MATERIALES H EQUIPOS .D/ gr. Fe cubierta de $rejol, solucin de Crea/.E 7, agua destilada

Mu$$er $os$ato /.//D 7 de p)QB.=, reactivo 4essler.

+spectro$otmetro, MaJo 7ara, Malanza, +quipo de $iltracin, papel $iltro, Gradilla de tubos, /- $iolas de .//ml,/= tubos de ensa!o de ./ ml. Maln de D//ml. @aso de precipitados de D// ml.
IV.

PROCEDIMIENTO. E7.ra""#3n (e la En&#ma. 2emojar -// gr. Fe $rejol en D//ml de agua destilada o 5agua hervida $ra6 , despu&s de -= horas remover la cscara por $riccin, ! proceder a escurrir el agua.
77

Preparar -// ml. Fe bu$$er $os$ato de sodio /.//D 7. 5 P3=)4a-6 , ! -//ml. Fe solucin +F % /.//. 7. ?sando en ambos casos agua destilada $ra, mezclar ambas soluciones, ! en$riar a =U>. +n un baln de D// ml.

Pesar -/ gr de cscara de $rejol ! colocarlo en un vaso de precipitados de D// ml.

%gregar [/ ml. Fe bu$$er $os$ato previamente preparado, ! licuar cuidando se mantenga baja la temperatura. 9iltrar la mezcla con una gasa ! enjuagar con ./ ml. Fe agua destilada.

>entri$ugar la suspensin a .=,/// g. Por ./ min. o pasar la solucin por un $iltro rpido ! enjuagar el papel $iltro con ./ ml. Fe agua destilada. Separar el sobrenadante ! medir el volumen $inal del e*tracto obtenido, llevar a re$rigeracin.

Preparar un cuadro de resultados. %G? % +K 2%> 3 9"4%L 5ml6

>%S>%2 M?99+ % 2

De.erm#na"#3n (e 1re en"#a (e e7.ra".o 1or e 1e".ro/o.ome.r0a.

1ro.e0na

en

el

Preparar tubo blanco8 tomar =ml de agua destilada ! = ml de reactivo biuret. Preparar tubo muestra8 tomar E ml de e*tracto decantado, . ml de agua ! = ml de reactivo biuret. >alibrar el espectro$otmetro ! leer la absorbancia a DB/ nm. Para comprobar la presencia de protenas. %notar la lectura de %bsorbancia. Com1ro2a"#3n (e La a".#4#(a( en&#m9.#"a. Preparar dos tubos de ensa!o ! rotular uno como tubo muestra ! el otro como tubo de blanco.

+n ambos tubos agregar /.- ml de solucin de Crea al /.E 7 ! ..D ml de bu$$er $os$ato. Llevar ambos tubos a pre(incubacin a EBU> por E min. %gregar al tubo muestra ../ ml. del e*tracto ! =.O ml de agua, al tubo blanco D.O ml de agua, agitar suavemente, para lograr mezclar.
78

Llevar ambos tubos a incubacin en baJo mara a EBU> por .D min.

Fespu&s de incubar los tubos, adicionar el 2eactivo 4essler a los tubos' 5/.D ml a cada tubo. @olumen total O ml. Fejar reposar por = min. Para atemperar al medio ambiente.

>alibrar el espectro$otmetro a =-/ nm.

7edir la absorbancia. La muestra de e*tracto dar coloracin ! un alta absorbancia por el amoniaco liberado.
V.

CUESTIONARIO. +*plique por qu& es necesario licuar la cscara durante la e*traccin de la enzima ureasa. HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH Figa que pruebas se tienen de haber e*trado realmente enzimas vegetales. HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH )aga los clculos de reactivos para las soluciones que se prepararon.

+*plique el papel que juegan en la e*traccin el bu$$er $os$ato ! la re$rigeracin.

79

HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHH )aga un diagrama de $lujo cuantitativo del proceso de e*traccin utilizado en laboratorio.

VI.

O'SERVACIONES HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH

VII.

CONCLUSIONES HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHH

80

VIII.

'I'LIOGRAFA HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHH

81

PRACTICA +; DETERMINACI,N DE ACTIVIDAD EN-IMATICA EN UREASA

PRACTICA +; DETERMINACI,N DE ACTIVIDAD EN-IMATICA EN UREASA

82

83

I.

O'!ETIVO Feterminar la capacidad cataltica o actividad enzimtica de la enzima ureasa.5enz. ?rea(amidohidrolasa +>.E.D...D6

II.

FUNDAMENTO. La actividad enzimtica 5?6 es la e*presin del poder cataltico de la enzima ! se obtiene midiendo la velocidad de la reaccin que cataliza. La actividad enzimtica 5?6 se de$ine como la cantidad de enzima contenida en . ml de solucin que trans$orma o produce . mg de sustrato producto por minuto medidas en las condiciones optimas de operacin de la enzima. La ureasa es una enzima que se encuentra en diversos organismos vivos, mas no en el organismo humano. %lgunas $uentes comunes son las bacterias, o la cscara de $rejol. La ureasa cataliza la descomposicin de la Crea segCn la reaccin8 4)>3 4)La velocidad de una reaccin enzimtica como la velocidad de cualquier reaccin puede ser determinada midiendo8 la cantidad de sustrato trans$ormado en un determinado tiempo de reaccin
1. 2.

N )-3

-4)E N >3-

la cantidad de productos $ormados. >ualquiera de ellos.

Para el caso de la reaccin catalizada por ureasa se puede hacer el ensa!o midiendo la cantidad de urea en el tiempo, o midiendo cualquiera de los productos 5>3- 4)E6 producidos en un tiempo determinado. Por $acilidad se medir la cantidad de amoniaco $ormado, lo cual se hace por medios espectro$otom&tricos utilizando el reactivo 4essler que es un ioduro doble de mercurio ! potasio que al reaccionar con el amoniaco en medio alcalino $orma un complejo de color anaranjado castaJo. -,-)g"= N 4)E N E,3) )g34)-" N B," N -)-3 La intensidad del color $ormado ser directamente proporcional a la cantidad de amoniaco presente en cada tubo ! se medir la absorbancia de cada tubo a =-/ nm 5$iltro morado6.
III.

DESARROLLO E5PERIMENTAL. Ma.er#ale .

Preparar D/ ml de solucin de urea /.E 7.

84

Preparar .// ml bu$$er $os$ato /./D7 de p)QB.=, con +F % /.//.7

2eactivo 4essler.

D/ ml de solucin de ureasa /.A mg:ml en bu$$er $os$ato p), B.= 5 a =U>6 .// ml de solucin de sul$ato de amonio al D*./(= 7 5D*./(=milimoles:ml6 Ma.er#al (e 4#(r#o.

/- $iolas de D/ ml. /- $iola de .//ml. /O tubos de ensa!o. /. gradilla para tubos. /. espectro$otmetro. baJo de hielo. "ncubadora a baJo mara.

De.erm#na"#3n (e la "$r4a (e "al#2ra"#3n. Se preparan en los tubos de ensa!o amonio segCn la tabla siguiente8 Patr n 4U >oncentra S3=54)E cin 54)E6 6mol:ml nmol:ml // /./ D./ ./ .D -/ -D E/ soluciones de sul$ato de

ml de Mu$$ S3=54)E er 65ml6 /./ /./. /.//./E /./= /./D /./A B.D/ B.=[ B.=O B.=B B.=A B.=D B.==

4essl er 5ml 6 /.D /.D /.D /.D /.D /.D /.D

@olum en $inal ml O./ O./ O./ O./ O./ O./ O./

%bsorban cia =-/ nm.

Mlan co . E = D A

>on los datos obtenidos se constru!e la curva de equivalencia o curva de calibracin. Me(#(a (e la a".#4#(a( $rea #"a. Preparar dos tubos de ensa!o ! rotular uno como tubo muestra ! el otro como tubo de blanco.

85

+n ambos tubos agregar /.- ml de solucin de Crea al /.E 7 ! ..D ml de bu$$er $os$ato. Llevar ambos tubos a pre(incubacin a EBU> por E min. %gregar al tubo muestra ../ ml. de solucin de ureasa ! =.O ml de agua, al tubo blanco D.O ml de agua, agitar suavemente, para lograr mezclar. Llevar ambos tubos a incubacin en baJo mara a EBU> por .D min. Fespu&s de incubar los tubos,Sacar el tubo de incubacin e introducir en baJo de hielo para detener la reaccin. %dicionar el 2eactivo 4essler a los tubos' tubo6. @olumen total O ml, agitar. Leer la absorbancia a =-/ nm. 5/.D ml a cada

Fejar reposar por = min. Para atemperar al medio ambiente.

IV.

CUESTIONARIO

..( +$ectCe los clculos para completar los datos de la tabla.

-.( >alcule la cantidad de 4)E producido en la reaccin enzimtica.

E.( >alcule la actividad enzimtica de la solucin de ureasa en nmol de 4)E producido:min.

=.( +*plique por qu& durante la reaccin debe incubarse a EBU>

86

D.( 2ealizar los clculos de micromoles de sul$ato, amoniaco, ! urea para cada tubo patrn usados en la construccin de la curva de calibracin.

A.( +ncontrar la equivalencia por el clculo del $actor de equivalencia ! por la determinacin analtica de la ecuacin de la curva.

B.( Figa si la curva de calibracin obtenida obedece a la le! de Meer. +*plique por qu&.

O.( +*plique por qu& es necesario contar con un blanco en las determinaciones de actividad enzimtica.

[.( +*plique la di$erencia entre actividad enzimtica ! actividad espec$ica.

87

V. O'SERVACIONES RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR VI. CONCLUSIONES RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR VII. 'I'LIOGRAFA RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR

88

PRACTICA ++ CINETICA EN-IMATICA EN UREASA

PRACTICA ++ CINETICA EN-IMATICA EN UREASA

89

I.

O'!ETIVO. @eri$icar la variacin de la velocidad de las reacciones enzimticas con la concentracin del sustrato.

II.

FUNDAMENTO. La Crea puede descomponerse por accin de la enzima ?reasa, para $ormarse amoniaco ! bi*ido de carbono segCn la siguiente ecuacin. 4)>3 N )-3 4)Luego el %moniaco liberado puede ser cuanti$icado por espectro$otometra a l Q =-/ nm, si previamente se le compleja con reactivo 4essler. >in&tica de 7ichaelis7enten. La velocidad de las reacciones enzimticas varan con la concentracin del sustrato segCn una cin&tica autosaturante que se describa por la +c. Fe7ichaelis(7enten. @ Q @ma*. \S] La representacin gr$ica de tal ecuacin tiene la $orma8 La ecuacin de 7ichaelis(7enten se puede resolver haciendo uso de la Linearizacin de LineVeaver(MurT, en cu!o caso toma la $orma. Fonde los parmetros anteriores se relacionan por la ecuacin de una recta. . Q . N \S] @@ma*,s -4)E N >3-

,s N \S]

III.

MATERIALES H EQUIPOS 7ateriales.

-/ ml de solucin de sul$ato de amonio al D*./(= 7

D/ ml de solucin de ureasa /.A mg:l. +n bu$$er $os$ato de p)QB.=, con +F %, /.D n7.
90

%gua destilada. reactivo 4essler. MaJo de hielo. $iolas de D/ ! .// ml. /B tubos de ensa!o de ./ ml. /- matraz de .// ml. pipetas de ., -, D, ! ./ ml. +quipo de baJo mara. /. espectro$otmetro +spectronic -/FN /. termmetro de /( .// U>

+quipos ! material de vidrio.

IV.

PROCEDIMIENTO. )acer los clculos ! preparar la solucin patrn de sul$ato de amonio al D*./(= 7

Pre1ara"#3n (e m$e .ra .

)acer los clculos ! preparar la solucin de urea /.E 7

Cal#2ra"#3n (el E 1e".ro/o.3me.ro. % $in de trans$ormar los valores de intensidad de color en valores de concentracin del producto $ormado 54) E6, ! por tanto de actividad de la enzima se trazar una curva de equivalencia de Fensidad Xptica 5%bs6 vs. >oncentracin. >on ese $in se preparan soluciones de amoniaco de concentracin conocida, las que se neutralizan con reactivo 4essler, para obtener diversas intensidades de color. Por la di$icultad del uso del 4)E se usar soluciones de sul$ato de amonio.

Preparar solucin madre de S354)=6-, al D*./(= 7

Preparar A muestras que contengan de D a E/ nanomoles de Sul$ato de %monio, calcular las nmol de 4)E que liberan cada una ! su equivalencia con nmol de Crea. >ompletar la siguiente tabla.

91

abla 4U . P% 234 nU

Sol. de sul$ato5ml6

>ontenido nmol de sul$ato D/ .// .D/ -// -D/ E//

>ontenido +quivalencia nmol de 4)E en nmol de Crea

. E = D A

?tilizar los datos obtenidos de la curva de calibracin de la prctica anterior.

>ompletar la siguiente tabla. @olumen de 4)E en la %bsorbancia sul$ato tomado 5 muestra 5nmol6 ml6

abla 4U 7uestra 4U

Mlanco . E = D A >onstruir la curva de equivalencia ! encontrar la ecuacin que relaciona F3 vs \4)E], haciendo los tratamientos estadsticos que sean necesarios. Pr$e2a "#n8.#"a . % partir de la muestra madre de urea /.E 7. preparar A muestras ! un blanco para completar la tabla E como se muestra.

Preparar solucin madre de ureasa Agr:l en bu$$er $os$ato

92

abla 4U E ubo ?re a ^7 ol ?re a o.E 7 ml / /./.= /.A /.O ../ ..Mu$$e "ncub ?rea r ar sa $os$a EBY> ml to ml E min B./ A.O A.A A.= A.A./ D.O /.D /.D /.D /.D /.D /.D /.D "ncub ar EBY> MaJ o hiel .D o min 4essl er ml 2epos ar @olum en D min. $inal ml %b s =/ nm .

Mlan co . E = D A

/ A/ .-/ .O/ -=/ E// EA/

/.D /.D /.D /.D /.D /.D /.D

O O O O O O O

>alcular la cantidad de 4)E $ormado ! de urea que reacciona 5 de la curva de calibracin6, ! completar la tabla =

abla 4U = 7uestra

. E = D A Mlanco

\urea] en Fensidad nmol:ml *./( ptica 5%bs6 /.. ../ E./ =./ D./ A./ (

4mol de 4)E 4mol de producidos urea que reaccionan

Tra.am#en.o (e (a.o . Para cada muestra calcular la velocidad de reaccin mediante la relacin v Q P:t, donde 5p6 es nmol de 4)E producidos, ! 5t6 es el tiempo de reaccin enzimtica 5 .D min.6 ! completar la siguiente tabla.

93

abla D 7uestra . E = D A

\S] nmol:ml.

.:\S]

@5nmol:min.6 .:v

Gra$icar v vs. \S], ! ajustar a una curva autosaturante.

+stimar el valor de @ma*.

Gra$icar .:v vs. \S] ! ajustar a una lnea recta.

Feterminar gr$icamente los valores de @ma*. R ,s.

+scribir la ecuacin que representa a esta reaccin enzimtica.

94

V. O'SERVACIONES RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR VI. CONCLUSIONES RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR

VII. 'I'LIOGRAFA RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR

95

PRACTICA +6

E5TRACCION DE ADN DE :IGADO DE POLLO

PRACTICA +6

E5TRACCION DE ADN DE :IGADO DE POLLO

96

O'!ETIVO +*traer %F4 de un tejido animal II. MARCO TEORICO +l %F4 ! %24 son biomol&culas que intervienen en el almacenamiento ! la trans$erencia de la in$ormacin gen&tica. Son componentes $undamentales de la c&lula ! constitu!en en conjunto, entre el D ! el ./G del peso seco. 4ormalmente no se encuentran solos sino que se hallan $ormando nCcleo protenas, !a que suelen unirse a determinados tipos de estas, como las histonas. +l %24 se localiza tanto en el citoplasma celular como en el nCcleo , mitocondrias ! cloroplastos, mientras que el %F4 se sitCa $undamentalmente en el nCcleo de la c&lula ! tambi&n cloroplastos ! mitocondrias en pequeJas cantidades. Poseen una importancia mani$iesta por el hecho de que ellos dirigen ! llevan a cabo la sntesis de protenas, ! por tanto de las enzimas necesarias para el $uncionamiento celular. Por otra parte el %F4 es el vehculo de la herencia que se transmite de padres a hijos de generacin en generacin. III. FUNDAMENTO: +l %F4 se puede aislar mediante una t&cnica relativamente sencilla, consiste en primer lugar en romper las membranas celulares para liberar los nCcleos, para ello se tritura el hgado de pollo en un mortero. %l aJadir una solucin hipertnica, como el 4a>l -7, se produce el estallido de los nCcleos, el detergente $orma un complejo con las protenas ! las separa del %F4, +l alcohol tiene como $uncin precipitar el %F4 que se va agrupando para dar lugar a la $ormacin de unas $ibras blancas visibles a simple vista, que se pueden colorear mediante un colorante selectivo para %F4 como el anaranjado de acridina.
I.

97

IV.

MATERIALES

V.

)gado de pollo ./ gr >loruro de sodio -7 +tanol [A_Y SFS -/G %rena @arilla de vidrio vasos de precipitados 7ortero +mbudo Pipetas Probetas Gasa METODOLOGA ..( riturar ./ gr de hgado de pollo, dentro de un mortero, con la adicin de Dgr de arena lavada, para promover el rompimiento de las membranas celulares. -.( %Jadir al triturado de hgado D/ ml de agua destilada hasta obtener una papilla. E.( 9iltrar varias veces, en una probeta de .// ml, logrando separar los restos de tejido que quedaron sin romper membranas. =.( 7edir el volumen del $iltrado $inal. D.( %Jadir al $iltrado un volumen igual de 4a>l -7., verterlo todo a un vaso de precipitados. A.( %Jadir . ml de SFS -/G. B.( %Jadir mediante una pipeta -D a D/ ml de etanol $ro, por las paredes, logrando se $ormen dos capas, en la inter$ace precipita el %F4. O.( >on la a!uda de una varilla de vidrio, ir removiendo en la misma direccin tratando de hilar las $ibras de %F4' sobre la varilla se van adhiriendo unas $ibras blancas de %F4 visibles
98

a simple vista, que es el resultado de la agrupacin de muchas $ibras de %F4.

99

VI.
1. 2.

CUESTIONARIO SFe qu& est $ormada la cromatinaI Furante la e*traccin del %F4 S>ul es la razn de triturar el hgadoI, Spara qu& aJadimos arena al trituradoI SPor qu& crees que estallan los nCcleos al aJadir 4a>l -7I S#u& accin tiene el %F4 sobre la cromatinaI Furante la e*traccin del %F4 se utiliza un detergente ! etanol, con que $inalidad O'SERVACIONES

3. 4. 5.

VIII.

RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR IX.

CONCLUSIONES

RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR X.

'I'LIOGRAFA

RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR

100