La espectroscopa de fluorescencia en el anlisis estructural de protenas y de agregados amiloides

Introduccin
La luz puede ser absorbida y emitida por ciertos compuestos y a este proceso se lo denomina luminiscencia. Existen dos tipos de luminiscencia: la fluorescencia y la fosforescencia. En la fluorescencia el tiempo entre la absorcin y emisin de la luz es del orden de 10-8 segundos, mientras que el proceso de fosforescencia es mucho ms lento y toma alrededor de 10-3 a 1 segundo en ocurrir. As, la fluorescencia dura nicamente mientras dura el estmulo, es un fenmeno virtualmente instantneo, mientras que la fosforescencia puede durar hasta minutos luego de desaparecido el estmulo.

La Fluorescencia es un fenmeno fsico mediante el cual ciertas sustancias absorben energa en forma de radiacin electromagntica emitindola en una longitud de onda mayor en un perodo de tiempo muy corto.

La espectroscopa de fluorescencia es un mtodo muy utilizado en mediciones analticas y en la investigacin cientfica, especialmente en bioqumica y biomedicina. Las dos razones principales por las que se masific el uso de esta tcnica espectroscpica son: 1) su gran sensibilidad y 2) el alto nivel de evolucin alcanzado tanto por los instrumentos requeridos, como por los fluorforos diseados para aplicaciones especficas. An cuando una de las aplicaciones ms utilizadas de la fluorescencia es el marcaje de macromolculas (como una alternativa al marcaje con istopos radiactivos), puede ser usada por ejemplo para realizar estudios de dinmica molecular, anlisis estructural de protenas, cuantificacin de iones en compartimentos celulares, microscopa, anlisis de potencial de membrana, interacciones entre macromolculas, etc. Comparada con los mtodos de absorcin, la sensibilidad de los mtodos basados en fluorescencia es 10 a 10.000 veces mayor, esto significa que se pueden analizar nanogramos a picogramos de diversos analitos con muy buenos resultados. Otra ventaja de la fluorescencia es su especificidad, que permite identificar molculas especficas en matrices complejas. Como desventaja se puede distinguir que tiene menos aplicaciones que la espectroscopa de absorcin, ya que es relativamente limitada la cantidad de sistemas qumicos que exhiben fluorescencia. Sin embargo, an cuando el analito no exhiba fluorescencia natural, se pueden usar sondas fluorescentes que se unen a grupos funcionales especficos en la molcula en estudio.

Fluorforos
La fluorescencia es el resultado de una serie de procesos que ocurren en ciertas molculas llamadas fluorforos. Dichas molculas son generalmente orgnicas poliaromticas o heterociclos. Los tomos son generalmente no fluorescentes, pero una notable excepcin son los 1

lantnidos, por ejemplo europio o terbio, cuya fluorescencia resulta de la transnicin electrnica entre orbitales . Los fluorforos se pueden dividir en dos clases generales: extrnsecos e intrnsecos. Se denomina fluorforo intrnseco a aquel que por si mismo presenta fluorescencia. Por ejemplo el grupo indol del triptofano en las protenas. Fluorforo extrnseco es aquel que se agrega a una muestra que no presenta fluorescencia. Por ejemplo el 1,6-difenil- 1,3,5 hexatrieno (DPH) que se utiliza para medir fluidez de membranas, las cuales no presentan fluorescencia.

Fundamento
Cuando el fluorforo absorbe luz uno de sus electrones pasa a un estado excitado (de mayor energa) que es inestable y al retornar a su estado basal, el exceso de energa se libera en forma de luz pero de una longitud de onda mayor (menor energa) a la de excitacin. Este proceso es representado por el diagrama de Perrin-Jablonski (Figura 1).

Decaimiento vibracional Cruce intersistema

Ac ti tr vaci mi n ca
Ex ci ta ci n

Decaimiento vibracional

ce nc ia Fl uo re s

sf Fo

ia nc ce s ore

S0 + hexc S1 S1 S0 + hem S1 T1 T1 S0 + hem

Excitacin Fluorescencia Cruce intersistema Fosforescencia

Figura 1. Diagrama de Perrin-Jablonski

Un fluorforo absorbe energa electromagntica pasando de un estado electrnico basal (S0) a un estado electrnico excitado (S1) luego de absorber un fotn (es decir, luz) de energa: E = h .ex donde E es la energa, h es la constante de Planck y ex es la frecuencia de excitacin. Esta energa es suministrada por una fuente de luz externa. La absorcin de luz produce una transicin electrnica en el fluorforo: un electrn es promovido desde el orbital molecular ocupado ms externo al orbital molecular desocupado ms cercano al mismo (Figura 1). Este proceso est dirigido por distintas reglas de seleccin y la probabilidad de que la transicin se produzca est reflejada por el coeficiente de absortibidad molar, (M-1. cm-1) que est determinado por la ley de Lambert y Beer para cada longitud de onda:

A = . l. c donde A es la absorbancia, l es el paso ptico y c la concentracin del fluorforo. En fosforescencia el electrn excitado sufre una transicin a un estado ms estable (T1), y la emisin con energa hem resulta mantenida por un tiempo prolongado. En fluorescencia el estado excitado dura un tiempo finito, normalmente entre 10-9 a 10-8 segundos. En este tiempo el fluorforo sufre cambios conformacionales y esta sujeto a mltiples interacciones con el medio ambiente molecular. Estos procesos tienen dos consecuencias importantes (Figura 1): 1) debido a la energa que se disipa durante el tiempo de vida del estado excitado, el fotn de energa emitido hem, es de menor energa que el fotn que el fluorforo absorbi previamente, por lo tanto la longitud de onda de emisin es mayor que la de excitacin; 2) no todas las molculas que se excitaron inicialmente por absorcin retornan al estado basal de energa por emisin de fluorescencia. Otros procesos como por ejemplo: quenching colisional, transferencia de energa de fluorescencia por resonancia (RET), conversin interna o desactivacin no radiativa y formacin de un fotoproducto pueden disminuir la cantidad de molculas en el estado excitado y por lo tanto disminuyen el rendimiento cuntico de fluorescencia (Figura 2). El rendimiento cuntico de fluorescencia, F es la razn entre la cantidad de fotones emitidos y la cantidad de fotones absorbidos por una molcula:

F = cantidad de fotones emitidos / cantidad total de fotones absorbidos

10-8 segundos

Estado basal

Estado excitado*

Quenching o transferencia de energa de fluorescencia por resonancia

Figura 2: Esquema del paso al estado excitado y de los posibles procesos de disipacin de energa

Espectro de fluorescencia
En espectroscopa de fluorescencia se registran espectros de excitacin y de emisin. El espectro de excitacin se corresponde con el espectro de absorbancia. Ambos espectros son una representacin de la intensidad de fluorescencia en unidades arbitrarias en funcin de la longitud de onda en nm. Para registrar el espectro de emisin se fija una longitud de onda de excitacin y para el de excitacin se fija una longitud de onda de emisin. Una caracterstica llamativa de los 3

espectros de excitacin y emisin de fluorescencia es que para algunas molculas estos son imgenes especulares uno del otro, a esto se llama regla del espejo (Figura 3). Alteraciones de esta regla se pueden deber a impurezas fluorescentes de la muestra o, en muestras muy diluidas, a una banda Raman que es la banda de vibracin del agua. Adems existen muchas sustancias que no siguen esta regla (Figura 4) y esto se debe a una diferencia de arreglos geomtricos del ncleo en el estado excitado si se compara con el estado basal.

Intensidad de fluorescencia

Figura 3. Imgenes especulares de los espectros de excitacin y emisin de fluorescencia del isotiosianato de fluorescena (FITC)

Figura 4. Espectros de excitacin y emisin de fluorescencia del p-terfenilo

Otra caracterstica de los espectros de fluorescencia es que el espectro de emisin es independiente de la longitud de onda de excitacin (exc), debido a la disipacin parcial de energa de excitacin que ocurre durante la duracin del estado excitado (Figura 5).

Intensidad de fluorescencia

El espectro de emisin de fluorescencia vara marcadamente con la estructura qumica del fluorforo y del solvente en el que esta disuelto.
Intensidad de fluorescencia

Figura 5. Independencia del pico de mxima emisin y la longitud de onda de excitacin. Espectro de excitacin de un compuesto y sus diversos espectros de emisin excitando a las longitudes de onda EX1, EX2 y EX3.

Procesos de disipacin de energa

Quenching El quenching o atenuacin de fluorescencia puede ser definido como cualquier proceso que disminuye la intensidad de fluorescencia de un determinado fluorforo sin cambiar el espectro de emisin. Puede ser el resultado de interacciones del estado excitado con otras molculas, por ejemplo el solvente (quenching colisional) o por la formacin de complejos del estado basal no fluorescentes. El auto quenching (self-quenching) es la disminucin de la fluorescencia debida a la alta concentracin del fluorforo, el cual al disminuir su concentracin aumenta la fluorescencia, por ejemplo: calceina o carboxifluoresceina, los cuales se los emplea para medir perdida de contenido de liposomas o de organelas. Cuando el fluorforo se ha incorporado en el interior de vesculas en altas concentraciones, no fluoresce, pero si por alguna razn, se altera la permeabilidad de la membrana, sale al medio, se diluye y fluoresce.

Transferencia de energa de fluorescencia por resonancia (RET) La transferencia de energa de fluorescencia por resonancia (RET) se basa en la transferencia de energa entre un grupo donante y un aceptor. Deriva de la capacidad del donante fluorescente de excitar al aceptor, si ambos se encuentran a una distancia apropiada (entre 1 y 10 nm). La excitacin de molculas de aceptor puede ocurrir por transferencia directa de energa de las molculas donor excitadas y sta se manifiesta como una reduccin en la intensidad de emisin de la fluorescencia del donor y un correspondiente incremento en la intensidad de emisin del aceptor de fluorescencia (Figura 6). El fluorforo donante excitado presenta
fluorescencia a una determinada longitud de onda. La aproximacin estrecha de un segundo fluorforo con una banda de absorcin que se superpone con la banda de emisin del donante, conduce a la excitacin del aceptor por el donante y la fluorescencia resultante es de mayor longitud de onda.

Fuente luminosa
Longitud de onda de exitacion del donante

Fluorescencia del donante Donante excitado

RET Donante excitado Aceptor excitado

Fluorescencia del aceptor

Figura 6. Transferencia de energa de fluorescencia por resonancia

Anlisis estructural de las protenas

Hay slo tres aminocidos aromticos que absorben luz en la regin del ultravioleta cercano ( > 240 nm) y son: fenilalanina (Phe), tirosina (Tyr) y triptfano (Trp). El espectro de emisin de fluorescencia de las protenas est determinado por la presencia en la cadena proteica de dichos aminocidos. Adems existen cofactores como FMN, FAD, NAD y porfirinas que tambin presentan fluorescencia cuando estn presentes en las protenas. Los cambios de la fluorescencia intrnseca pueden ser usados para monitorear cambios estructurales en la protena. Los tres aminocidos aromticos tienen distinta absorcin y emisin de fluorescencia, como se resume en la tabla 1. ex (nm) 295 275 260 em (nm) 353 304 282 F 0,20 0,14 0,02

Trp Tyr Phe

Tabla 1. Caractersticas de fluorescencia de los aminocidos aromticos

La fluorescencia de una protena es una sumatoria de las fluorescencias de los distintos residuos aromticos que posee, pero generalmente se estudia entre 280-295 nm siguiendo la fluorescencia del triptfano. Generalmente, se mide la emisin de fluorescencia del triptfano por su mayor rendimiento cuntico y su vida media ms prolongada. Adems, la proximidad de estos tres aminocidos en la estructura de una protena permite que ocurra transferencia de energa por resonancia (RET) entre Phe y Tyr y entre Tyr y Trp, siendo la fluorescencia del Trp la nica que no se transfiere. Las protenas usualmente tienen un nmero limitado de Trp y ste est generalmente en el sitio activo de las protenas. La tirosina, como el triptfano, tiene una fuerte banda de absorcin a 280 nm. Es un emisor ms dbil que el triptfano, pero puede contribuir significativamente a la fluorescencia de

la proteena, ya que normalmente est en un nmero mayor. La fluorescencia de la tirosina puede ser fcilmente transferida si se encuentra cerca del triptfano. La fenilalanina, con slo un anillo bencnico y un grupo de metileno es dbilmente fluorescente. La sensibilidad experimental (el producto de rendimiento cuntico y absortividad molar) es especialmente baja para este residuo. La fluorescencia de la fenilalanina se observa slo en ausencia de tirosina y triptfano. Los espectros de fluorescencia y el rendimiento cuntico son generalmente ms dependientes del medio ambiente que los espectros de absorcin y los coeficientes de extincin molar. En las protenas los residuos de Trp se encuentran generalmente formando parte del ncleo hidrofbico de las mismas y por lo tanto est en regiones donde las molculas de agua tienen poco acceso, el espectro de emisin del mismo, se corre hacia el ultravioleta (corrimiento hacia el azul) con el mximo de emisin generalmente en 330 nm. Esto se debe a que la energa emitida es mayor que cuando la cadena lateral se encuentra en contacto con el solvente, donde parte de la energa absorbida es transferida a las molculas de agua y por lo tanto la longitud de onda del mximo de emisin es mayor (340-350). Esto tambin sucede cuando una protena se desnaturaliza. Por ejemplo, cuando al pptido MccJ25-Trp se lo resuspende en concentraciones crecientes de dioxano, se ve un corrimiento hacia menores longitudes de onda y un aumento de la fluorescencia (Figura 7).

100 %

80 %

40 % 20 % 0%

333 nm

351 nm

Figura 7. Efecto del solvente en la fluorescencia del triptofano de la MccJ25-Trp.

Los rendimientos qunticos de los tres aminocidos aromticos decaen cuando se incorporan a una protena. En la Tabla 2 se comparan las caractersticas de la fluorescencia de los aminocidos libres e insertos en una protena. Tambin contiene datos que muestran la sensibilidad de la fluorescencia de estos residuos a la polaridad de su entorno.

Aminocido) Solvente em (nm Trp Tyr Phe H2O DMSO H2O DMSO DMSO 340 340 303 306 282 F 0,12 0,81 0,21 0,27 0,02

Protena em (nm) 333 333 --309 284 F 0,02 0,67 --0,06 0,006

Tabla 2. Caractersticas de la fluorescencia de los aminocidos libres e insertos en una protena. DMSO = dimetil sulfxido, un solvente orgnico.

La fluorescencia de los residuos aromticos vara en forma un tanto impredecible entre las diversas protenas. Si se compara el estado plegado con el desplegado, el rendimiento quntico puede aumentar o disminuir. La intensidad de fluorescencia no tiene mucho valor en s misma, pero la magnitud de la intensidad, sin embargo, puede servir como una sonda de perturbacin del estado plegado. La longitud de onda de emisin es un mejor indicador del medio ambiente del fluorforo. Por otro lado la fluorescencia del triptfano es quencheada por iodo, acrilamida, grupos disulfuros, aminos y carboxilos y residuos de histidina cercanos.

Proceso patolgico de formacin de Amiloides

Se conoce como amiloidosis a una serie de patologas que se caracterizan por la formacin irreversible de agregados insolubles, denominados fibras amiloides. Como ejemplos de estas patologas podemos mencionar: la amiloidosis sistmica, la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, enfermedad de Creutzfeld-Jakob, la Encefalopata Espongiforme, Amiloidosis familiar, Tumor de clulas C de la Tiroides, las enfermedades prinicas y en algunas Diabetes tipo II. Los agregados se pueden forman a partir de pptidos no estructurados o de protenas globulares y se caracterizan por ser irreversibles, presentar estructura tipo cross y estructura fibrilar, cuando se los observa al microscopio electrnico. El modelo vigente sostiene que cada fibra presenta un dimetro entre 75-80 y se encuentra formada por protofibras de 25-35 (Figura 8). En esta estructura la cadena peptdica forma hojas cruzadas (paralelas o antiparalelas) que se disponen de forma perpendicular al eje fibrilar.

Figura 8. Modelo de una fibra amiloide.

La formacin de fibras amiloides pueden tambin ser inducidas in vitro bajo condiciones fisicoqumicas adecuadas, permitiendo el estudio de los mecanismos que gobiernan el proceso. Se sabe que ciertas protenas solubles a pH cido y en un entorno hidrofbico pueden formar rpidamente estos agregados. Tambin pueden ser formados en presencia de fosfolpidos cidos como fosfatidil serina (PS), cardiolipina (CL) o fosfatidil glicerol (PG). Estudios realizados in vitro demostraron que protenas como albmina, lisozima, insulina, gliceraldehido- 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), mioglobina, transtiretina, citocromo c, histona H1, y R-lactoalbumina forman fibras amiloides. La inhibicin o reversin de la formacin de fibrillas amiloides se insina como un posible mecanismo preventivo de las enfermedades amiloides y a la fecha, distintos compuestos orgnicos pequeos han demostrado capacidad de inhibicin del proceso in vitro.

Figura 9. Cintica de formacin de la fibra amiloide.

Los mecanismos moleculares relacionados con la formacin de los agregados amiloides no han sido an dilucidados, pero se acepta la existencia de un mecanismo general de formacin. La fibrilogenesis es dependiente de un proceso de nucleacin, ya que por diversos estudios se puso de manifiesto que generalmente presenta una cintica de tipo sigmoidal (Figura 9). La protena en estado monomrico establece un equilibrio lento con estructuras oligomricas (tiempo de induccin), las cules, una vez formadas, dan lugar rpidamente a fibras amiloides, ya sea mediante asociacin de unidades de monmeros o bien por fusin de oligmeros. Adems, el agregado de fibras preformadas provoca una disminucin del tiempo de induccin. La capacidad de la albmina de suero bovino (BSA) de formar fibrillas amiloides bajo ciertas condiciones experimentales, ha sido recientemente demostrada. Este proceso de fibrilacin ocurre minutos luego de la incubacin de la protena a pH fisiolgico y a temperaturas mayores de 60C. La cintica de formacin de agregados por la BSA sigue un patrn de tipo hiperblico en lugar de sigmoidal.

Instrumentos utilizados para detectar fluorescencia

Los elementos esenciales en los sistemas de deteccin de fluorescencia son cuatro: 1) una fuente de excitacin (luz blanca), 2) un lugar apropiado para poner la muestra, 3) monocromadores o filtros para discriminar entre los fotones de emisin de los fotones de excitacin y 4) un detector para registrar la emisin de los fotones, el cual produce una seal generalmente elctrica. Para mejorar la visualizacin de los resultados generalmente est acoplado al equipo un amplificador de la seal. Existen distintos tipos de equipos que utilizan los aspectos bsicos de la fluorescencia, entre ellos: Espectrofluormetro y detectores de microplacas: miden el promedio de la fluorescencia de la muestra (el volumen de muestra que mide ronda entre los L a mL). Microscopio de Fluorescencia: determina la fluorescencia como una funcin de las coordenadas espaciales en dos o tres dimensiones para objetos microscpicos (por debajo de ~ 0,1 mm de dimetro). Scanner de Fluorescencia: determina la fluorescencia en funcin de coordenadas en dos dimensiones de objetos macroscpicos como ser geles de electroforesis, blotting y cromatografas. Citometra de Flujo: incorpora un detector de fluorescencia para determinar la fluorescencia de clulas, en un flujo a travs de un capilar. Permite identificar y cuantificar subpoblaciones de clulas en una muestra compleja. Otros tipos de instrumentos que usan la deteccin por fluorescencia son los sistemas de electroforesis capilar, de HPLC y los equipos de secuenciacin de DNA.
Espectrofluormetro

Un espectrofluormetro (Figura 10) consta de una lmpara de arco de Xenn la cual emite luz blanca en un amplio rango de longitudes de onda que abarcan desde el UV, ~ 240 nm, hasta el infrarrojo, ~ 900 nm. Este rayo de luz es colectado por el monocromador primario o de excitacin (M1) el cual selecciona la longitud de onda (ex) que va a incidir sobre la muestra y es determinada por el espectro de absorcin de cada fluorforo. El rayo de luz con la longitud de onda ex incide sobre la cubeta que contiene a la muestra, la cual puede estar termostatizada. Las cubetas pueden ser de diferentes tipos (cuarzo, vidrio, etc.) dependiendo de la longitud de onda en la cual leamos. La emisin de fluorescencia generalmente es detectada a 90 del rayo de luz de excitacin. Es colectada por un sistema de lentes y pasa a travs de un Monocromador secundario o de emisin (M2) el cual separa la fluorescencia emitida por la muestra de la luz de

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excitacin, con una longitud de onda determinada (em). La luz incide en un fotodetector que convierte los fotones de fluorescencia en una seal elctrica. Otro componente muy importante es el canal de referencia que es un sistema que crea una seal electrnica proporcional a la intensidad de luz incidente en la muestra. En el espectrofluormetro se pueden colocar filtros en los trayectos pticos que impiden el paso de la luz de ciertas longitudes onda que interfieran con la medicin.

Monocromador primario de excitacin

Cubeta de muestra

ex Lmpara de arco de Xenn Monocromador secundario de de excitacin emisin em

Detector / amplificador

Fotomultiplicador

Figura 10. Representacin esquemtica de un espectrofluormetro.

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Parte experimental
Objetivo del Trabajo Prctico: *Determinar la fluorescencia intrnseca de distintas protenas y como dicha fluorescencia vara segn el medio en que se encuentran. *Estudiar in vitro la capacidad de formacin de fibras amiloides de la albmina. Determinacin de la fluorescencia intrnseca de protenas 1) Determinacin del espectro de excitacin y de emisin de albmina,

gammaglobulina, tripsina, lisozima, insulina y mioglobina: a) en buffer Tris-HCl 20 mM pH 7,4, b) en dioxano al 50% y c) en urea 8M y d) en cloruro de guanidina 6M. A partir de soluciones madres de la protena (2mg/ml) se realizaran diluciones 1/10 en los distintos medios con un volumen final de 1,5 ml. Se incuban durante 30 min a temperatura ambiente.

2)

Determinacin de RET entre tirosina y triptfano. A partir de una solucin madre

de 2mg/ml de TYR se realiza una dilucin 1/10, se mide la intensidad de fluorescencia cuando se la excita a 280 nm y fijando la longitud de onda de emisin en: a) 300 nm y b) 350 nm. Luego se le agregan 50 l de TRP (2mg/ml) y se repiten las lecturas de intensidad de fluorescencia.

3)

Quenching de la fluorescencia intrnseca del triptfano de la albmina con el

agregado de KI y hormonas tirodeas (T4). La albmina es la protena ms abundante del plasma sanguneo, y es un transportador inespecfico de una gran cantidad de sustancias, por ejemplo: hormonas. La albmina tiene un solo triptfano, el cual se encuentra en su sitio de unin a la hormona. Cuando sta se une a la BSA se quenchea la fluorescencia del triptfano. A partir de una solucin madre de 2mg/ml de albumina se realiza una dilucin 1/10, se mide la intensidad de fluorescencia cuando se excita a 300 nm y emite a 350 nm. Luego se le agregan 50 l de T4 (4mg/ml) y se repite la lectura de intensidad de fluorescencia.

Estudio in vitro de la capacidad de formacin de fibras amiloides de la albmina. La albmina forma fibrillas amiloides cuando se la incuba a temperaturas mayores de 60C y a pH fisiolgico. La formacin de estos agregados se pondr en evidencia con la sonda fluorescente Thioflavina T. La Thioflavina T (ThT) (Figura 11), es un fluorforo que cuando se encuentra libre se caracteriza por presentar una exc 415 nm y de em 482 nm. Sin embargo, al unirse a las fibras amiloides, su espectro de excitacin se modifica apareciendo un pico a exc 450 nm, sin modificar la longitud de onda de emisin.

Figura 11. Thioflavina T

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Determinacin: Se inducir la formacin de fibras amiloides de la albmina por calentamiento a 65C. Se estudiar la cintica de formacin de agregados de la albmina (2mg/ml) en buffer TrisHCl 20 mM pH 7,4. Se tomarn alcuotas a distintos tiempos: 0, 10, 30, 60 y 90 min. Para detener la agregacin se pondrn los tubos en bao de hielo. Para la lectura se diluye las protenas a una concentracin final de 0.1 mg/ml y se les agrega ThT a una concentracin final de 25 M.

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1) Protena:
exc 200 220 240 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 em Dioxano 100% Urea 8M Guanidina 6M

1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 260

280

300

320

340

360

380

400

2) RET: Tyr Trp y 3) Quenching

exc 275 em 300 Tyr Tyr-Trp em 350 KI -----

4)
Fluorescencia (UA) 0 10 30 60 90
1 0, 8 0, 6 0, 4 0, 2 0 0 20 40 60 80 100

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